一种含n的制作方法

专利名称：一种含n的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)的药物组合物以及其脂质体制剂的制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术：
阿托氟啶是正在研究开发中的一个5-Fu前体药物，对晚期胃癌、大肠癌、食管癌疗效肯定，是新一代氟尿嘧啶类抗肿瘤药物。根据该化合物的临床前药效、药理和毒理学实验表明，该化合物的抗瘤活性高，抗瘤谱广，毒性小，安全性高，尤为突出的是其无免疫抑制作用，为新一代氟尿嘧啶类抗肿瘤药物，应用的前景非常广阔。然而，临床前和临床试验都表明，该药稳定性很差，非常容易分解，在体外暴露空气中即可部分分解。根据杨玉彬等，阿托氟啶在肿瘤患者体内的药代动力学研究，中国新药杂志2001，10(3)196-198，该药在体内的主要代谢产物为3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)，其能在体内进一步缓慢代谢成5-Fu。
1980年，Tetsuji Kametani在J.Med.Chem.1980，23，1324-1329中报道了一系列氟尿嘧啶衍生物(其中包括N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶)的合成并测试了这些化合物的活性。据该文献中表IV的报道，N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的抗肿瘤活性太低，从而否定了N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶作为抗肿瘤药物的前景。现有技术中也并没有将N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶作为药物应用的研究。本发明人针对TFu进行了大量体外和体内试验，确定了TFu作为药物活性成分用于治疗癌症的有效性，并确定了其在药物组合物中适宜的剂量，而且针对该化合物水溶性差、生物利用度低的特点设计并制备了其脂质体制剂。

发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)的药物组合物、该组合物中活性成分的剂量及其脂质体制剂的制备方法和应用。
本发明的技术方案如下一种药物组合物，包含N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)和药物上可接受的赋形剂。
上述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶含量为1～150mg/g或0.1～15mg/ml。
上述的赋形剂可以是任意药学上的常规剂型的赋形剂，包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、喷雾剂、注射剂或输液的赋形剂。
治疗性N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质体组合物，包括含有N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)和脂质成分。其中N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)与脂质成分的摩尔比在1∶40～1∶5的范围。
上述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质体组合物，其中包载N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)的脂质体包含具有5μm或5μm以下大小的囊泡。
上述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质体组合物，其中所述的包载N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)的脂质体包含具有0.1μm或0.1μm以下大小的囊泡。
上述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质体组合物，其中所述的脂质成分包括胆固醇、磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸中的一种或组合。优选的，所述的脂质成分还包括维生素E。
上述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质体组合物，其中所述的磷脂酰胆碱选自二硬脂酰磷脂酰胆碱，氢化大豆磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，氢化卵磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二反油酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或组合。
本发明的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)在制备抗肿瘤药物中的用途。
N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)动物实验结果表明如果剂量高于130mg/kg，动物将不能耐受，出现明显中毒症状，实验不合格。低于50mg/kg，抑制率可能低于30％，不符合抗肿瘤药物(化学药物)的基本要求，所以，选择剂量是130～50mg/kg。
一般来说，临床上人用剂量是根据最佳的动物有效计量，并结合长期毒性实验综合推算出来的。我们的动物(小鼠)实验有效剂量是130～50mg/kg，根据这些数据，按照通行的人与小鼠体表面积折算系数(70公斤为例)，小鼠以20g为标准，人的体表面积是小鼠的大约383.5倍。所以，130～50(mg/kg)/50＝2.6～1mg/小鼠，2.6～1mg×382(倍)＝997～382mg/人。50的意思是将130～50mg/kg中的kg(1000g)变成20g小鼠体重，所以，除以50。最后计算结果，人拟用剂量是997～382mg/人或1000～380mg/人，或按照公斤体重计算为14.24～5.46mg/kg，即约15～5mg/kg。
本发明的药物组合物可以是任意药学上的常规形式，比如片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、喷雾剂及注射剂和输液。
TFu脂溶性强，其混悬液口服生物利用度仅40～45％，不适于直接注射给药。TFu为脂溶性药物，可分散于脂质体双分子层的疏水集团的夹层中。以卵磷脂及胆固醇为原料制备脂质体。脂质体可明显改善药物性状，提高溶解度，可供口服或注射。该剂型可增加药物的靶向性及组织细胞相容性，降低其毒性，提高稳定性。本发明提供了这类组合物和方法。另外，与游离药物相比，作为抗肿瘤制剂，脂质体具有改良的药物动力学和增强的功效。脂质体、其制备方法及其在治疗诸如癌症、特别是哺乳动物、尤其是人体内癌症这样的疾病中的应用。该方法包括将治疗有效量的、药物可接受赋形剂中的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶药物组合物包括脂质体给予哺乳动物。本发明的脂质体包括N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体制剂，其中所述的脂质体可以含有任意各种中性或带电荷的脂质体形成物质。所述的脂质体形成物质可以是两亲分子，诸如磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，胆固醇等，它们在极性溶剂中形成脂质体。该脂质体中的磷脂可以来源于天然来源或是合成的。随该脂质体组成的不同，该脂质体可以携带负电荷或正电荷或者可以是中性的。优选的脂质体还可以含有维生素E。
脂质体中使用的“赋形剂”指的是有助于药物产品的稳定性的物质，包括但不局限于pH的稳定性，脂质体的胶体性质的稳定性，和药物及磷脂的化学稳定性。赋形剂的实例包括但不局限于酸，一价阴离子的钠或铵形式如氯化物，乙酸盐，乳糖酸盐和甲酸盐；二价阴离子如天冬氨酸盐，琥珀酸盐和硫酸盐；和三价离子如柠檬酸盐和磷酸盐。
“磷脂”指的是能形成脂质体的任何一种磷脂或磷脂的组合。磷脂酰胆碱(PC)，包括那些获自卵，大豆或其它植物源的磷脂酰胆碱，或那些部分或全部合成的磷脂酰胆碱，或具有可变的类脂链长和不饱和度的磷脂酰胆碱，是适于在本发明中使用的。合成的、半合成的和天然产品的磷脂酰胆碱是适于在本发明中使用的，包括但不局限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)，大豆磷脂酰胆碱(PC)，卵磷脂酰胆碱(卵PC)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)，二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二反油酰磷脂酰胆碱(DEPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，和二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。
本发明考虑了任何有效的磷脂∶N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶比率。优选的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶∶磷脂摩尔比是1∶40～1∶5，更优选是1∶20～1∶10。优选的脂质体制剂包括磷脂∶胆固醇摩尔比超过18∶1～2∶1的范围。最优选的脂质体制剂是大豆磷脂酰胆碱(PC)∶胆固醇摩尔比为15∶1。在优选的实施方案中，脂质体是具有小于450nm中值粒径的泡囊，其中磷脂是大豆磷脂酰胆碱(PC)，并且以15∶1的摩尔比包含胆固醇。
尽管在本制剂中可以使用宽浓度范围的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶，但是最有用的浓度在1～10mg/ml的范围。N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶与脂质成分的摩尔比也可以广泛改变，但最有用的范围约为N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)脂质成分1∶40～1∶5(摩尔比)的范围。如果需要，可以使该脂质体通过不同大小的滤膜以控制其大小。有利地，可以将该脂质体组合物与不同于N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的第二种治疗剂一起联用，所述的第二种治疗剂包括抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素以及其它活性剂。如果需要，本发明的脂质体可以是多层脂质体、单层脂质体或其混合物。
通常，制备本发明的制剂的方法是最初制备形成脂质体的溶液。例如通过称出一定量磷脂酰胆碱和胆固醇，并将它们溶解在有机溶剂优选乙醚或溶剂的混合物优选氯仿和乙醚的混合物中来实施。例如用旋转式汽化器、喷雾干燥器或其它工具蒸发该溶液以形成固态类脂相如薄膜或粉末。优选的干燥方法是使用旋转蒸发器。然后用含活性药物、含有或不含赋形剂的水溶液水合薄膜或粉末，以形成脂质体分散体。优选除了酸或碱以外，不使用赋形剂来调整药物溶液的pH。根据所使用的磷脂，将分散于药物溶液中的类脂薄膜或粉末加热至约25℃～70℃的温度。
通过搅拌、优选通过摇动或混合分散体，形成多层脂质体。例如通过超声处理或使用微流化装置、或挤出装置、或均化器或French挤出仪对类脂固相的含水分散体施以能量如剪切力或空穴以形成多层泡囊。也可使用注射，冷冻并融化，从类脂中渗析掉洗涤剂溶液，或用于制备脂质体的其它已知方法制备脂质体。使用各种已知技术(包括持续施用能量)可控制脂质体的尺寸。
使用渗析、尺寸排阻色谱法(Sephadex G-50树脂)或超滤(50,000～300,000分子量)，通过缓冲液与水溶液的交换，从脂质体分散体中去除未包埋的赋形剂和/或药物。
脂质体的治疗用途可包括传递游离形态通常有毒的药物。在脂质体中，可使有毒药物远离可导致毒性的敏感组织，并导向可发挥它们的治疗作用的选定区域。脂质体也可以治疗方式使用以经过一段延长期缓慢释放药物，从而通过增强的药物动力学分布降低给药频率。另外，脂质体可提供一种形成适于静脉内输送的疏水药物含水分散体的方法。
脂质体的输送路线也可影响它们在体内的分布。脂质体的被动输送涉及给药的各种路径如口服给药的应用，尽管其它有效给药形式如注射剂，吸入剂，透皮制剂或栓剂也是被考虑的。每种路径在脂质体定位上都有差异。


图1胆管癌FRH-0201细胞加入不同浓度TFu后细胞形态学观察结果。a、b为未加TFu药的对照组，细胞贴壁伸展良好；cTFu浓度为0.016μmol/ml，dTFu浓度为0.063μmol/ml，eTFu浓度为0.25μmol/ml，fTFu浓度为1μmol/ml，gTFu浓度为2μmol/ml，hTFu浓度为4μmol/ml，i、jTFu浓度为大于4μmol/ml，细胞全部死亡。由图中可见，随TFu浓度升高细胞伸展变差，生长密度降低，间隙增加，胞浆内出现颗粒。浓度再升高细胞变圆，悬浮，继而死亡。
图2胆管癌FRH-0201细胞加入不同浓度TFu后吉姆萨染色结果，对照组a，实验组b-g细胞出现皱缩，浓染，出芽，形成凋亡小体。
图3胆管癌FRH-0201细胞加入不同浓度TFu后吖啶橙染色结果。对照组a，未加药细胞伸展良好，大部分细胞呈梭形，胞浆染色淡，细胞核染为黄绿色，核仁清晰；实验组b.TFu作用后细胞变圆皱缩，胞浆不清，细胞核染成较深的黄绿色，核固缩，核仁不清。
图4不同浓度TFu作用后的FRH-0201细胞生长曲线。
图5TFu抑制体外培养的FRH-0201细胞，该抑制作用具有时间依赖性(a)和剂量依赖性(b)。
图6不同药物对FRH-0201细胞抑制率比较。图中的药物DDP是顺铂，ADM是阿霉素，VCR是长春新碱，MMC是丝裂霉素，TAXOL是泰素。
图7集落形成能力检测结果。a是对照组，克隆形成率为(35.33±4.16)％，b是0.0156μmol/mlTFu组，克隆形成率为(16.67±2.31)％。
图8DNALadder检测细胞凋亡结果。MMarker，C1～C54、1、0.25、0.063、0.016μmol/mlTFu作用72h，对照组为未加药的同期生长细胞。
图9小鼠血浆TFu含量HPLC测定标准曲线图。
图10正常小鼠灌胃TFu混悬水溶液组血药浓度-时间曲线图(n＝3)。
图11正常小鼠灌胃TFu脂质体组血药浓度-时间曲线图(n＝3)。
图12正常小鼠静脉注射TFu溶液组血药浓度-时间曲线图(n＝3)。
图13正常小鼠静脉注射TFu脂质体组血药浓度-时间曲线图(n＝3)。
发明详述本发明提供了用本发明提供了包含N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)的药物组合物、该组合物中活性成分的剂量及其脂质体制剂的制备方法和应用。本发明的药物组合物可以是任意药学上的常规形式，尤其是其脂质体制剂具有如下优点避免了N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的溶解问题、N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和脂质体稳定性、能够作为以高浓度快速浓注或短期输注方式给予N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶、N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶毒性降低、N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的治疗功效提高。
优选地，本发明的组合物是含有N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体制剂。一般来说，可以通过公知技术制备脂质体制剂。例如，在一种优选的技术中，将所有的亲脂组分溶于适宜溶剂，然后可以对该体系进行蒸发而形成亲脂膜。随后将诸如含水溶剂这样的极性溶剂加入到所述脂质膜上并将所得混合物剧烈匀化成本发明的脂质体。
理想的情况是，一旦脂质体形成，则将其通过适宜滤膜过滤以控制其大小。合适的滤膜包括那些可以用于从滤液中获得所需范围大小的脂质体的滤膜。例如，可以形成脂质体且此后通过5微米滤膜过滤而得到具有约5微米或5微米以下直径的脂质体。或者，可以通过使用1μm、500nm、200nm、100nm或其它滤膜来获得具有相应大小的脂质体。
为了制备N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶制剂，将N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶溶于适宜溶剂。合适的溶剂是那些N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。例如，可以使用非极性溶剂诸如乙醚、氯仿等。
可以将任意合适的磷脂用于本发明。例如，磷脂可以纯化自天然来源或可以以化学方式合成，可以将磷脂溶于适宜溶剂，所述的溶剂包括磷脂可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。可以将磷脂溶液与N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶混合。或者，可以将磷脂与N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶直接溶解。还可以将磷脂衍生物用于本发明的脂质体制剂，只要所得的脂质体制剂对治疗应用而言足够稳定且对N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶具有适宜的容量。
可以将任意合适的脂质体形成物质用于本发明的脂质体制剂。合适的脂质体形成物质包括合成的、半合成的(天然改性的)或天然出现的具有亲水部分和疏水部分的化合物。这类化合物是两亲分子且可以带有净正、负或呈中性电荷。形成脂质体的化合物的疏水部分可以包括一个或多个非极性的脂族链，例如棕榈酰基。合适的形成脂质体的化合物的实例包括磷脂类、甾醇类、脂肪酸类等。优选的形成脂质体的化合物包括磷脂酰胆碱、胆固醇、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和维生素E。
可以将脂质体形成物质溶于它在其中可以溶解的适宜溶剂，该溶剂可以是诸如氯仿这样的低极性溶剂或诸如乙醚这样的非极性溶剂。合适的溶剂仅包括脂质体形成物质可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。在该溶液中可以混有包括N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶在内的其它成分以形成溶液，其中所有组分在该溶液均是可溶的而且随后可以将该溶剂蒸发而得到一种均匀的脂质膜。可以通过保持N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和其它亲脂组分稳定性的任意适宜方式来进行溶剂蒸发。
合适的脂质体可以是中性的、带负电荷或带正电荷，该电荷是脂质体成分电荷和脂质体溶液pH的函数。例如，在中性pH下，带正电荷的脂质体可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和硬脂胺的混合物形成。带负电荷的脂质体例如可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰丝氨酸形成。在一个优选的实施方案中，N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体制剂含有注射用大豆磷脂酰胆碱和胆固醇。
更一般的情况是，可以使用任意形成脂质体的适宜方法，只要此方法引起N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶脂质体产生。因此，可以使用不涉及干脂质膜形成的溶剂蒸发法。例如，可以通过在水和有机相中形成乳剂并蒸发有机溶剂来制备脂质体。本发明意图包括不管用何种方法制备的N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶的脂质体制剂。
优选的N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶脂质体制剂含有适当相对摩尔量的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和脂质。其中N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶(TFu)与脂质成分的摩尔比在约1∶1～100的范围、更优选约1∶2～80、更优选约1∶5～50、更优选约1∶15～30，且最优选约1∶28。
该脂质体制剂还含有适当相对摩尔量的磷脂酰胆碱和胆固醇。合适的相对摩尔量包括约1～99∶0.1～50的磷脂酰胆碱∶胆固醇。更优选相对摩尔量范围在2～50∶1～25、更优选4～25∶2～15且更优选的用量范围在5～15∶4～10、最优选的比例为15∶1。优选的脂质体制剂还含有适量的诸如维生素E这样的抗氧化剂或其它合适的抗氧化剂。适量范围为5wt.％或5wt.％以下。
可以通过将极性溶液、优选水溶液诸如盐水溶液加入到脂质膜上并通过剧烈混合分散该膜面形成脂质体。该溶液可以是纯水或者其可以含有盐、缓冲液或其它可溶性活性剂。可以使用任意混合方法，条件是所选择的方法诱导脂质膜与极性溶剂之间产生足够的剪切力以便剧烈匀化所述混合物并形成脂质体。例如，可以通过涡旋、磁性搅拌和/或超声波处理来进行混合。可以单纯通过涡旋所述溶液而形成多层脂质体。如果需要单层脂质体，那么在该方法中可以包括超声波处理和/或过滤步骤。
可以通过在水溶液中将所述脂质体制剂的等分部分透析过夜并随后将该脂质体溶于甲醇且通过使用高效液相层析(HPLC)的标准方法分析该样品来测定N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶的包载效率。或者，在用50,000×g离心1小时后收集脂质体，而后将其溶于甲醇用于HPLC分析。通常，N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶在脂质体中的包囊效率高于投药剂量的80％。
本发明包括药物制剂，此制剂除了含有无毒性的、惰性的药物上适宜的赋形剂之外还含有N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶的脂质体制剂，本发明还包括这些制剂的生产方法。可以理解的是所谓药物上的适宜赋形剂指的是各类固体、半固体或液体稀释剂、填充剂和配制助剂。本发明还包括单位剂型的药物制剂。这意味着所述制剂是个体部分的形式，例如小瓶、注射器、胶囊、丸剂、栓剂或安瓿，在它们中的脂质体包载的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶含量相当于一部分单位剂量或多个单位剂量。例如，该单位剂型可以含有1、2、3或4个单位剂量或1/2、1/3或1/4个单位剂量。单位剂量优选含有在一次给药中给予的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶用量，而且其通常相当于全部每日剂量、半数每日剂量或每日剂量三分之一或四分之一的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶用量。
片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、喷雾剂及注射剂和输液可以是合适的药物制剂。栓剂除含有N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体外还含有合适的水溶性或水不溶性赋形剂。合适的赋形剂是那些本发明脂质体N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶在其中充分保持稳定以用于治疗应用的赋形剂，例如聚乙二醇、某些脂肪类和酯类或这些物质的混合物。软膏、糊剂、霜剂和凝胶也可以含有N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体在其中保持稳定的合适的赋形剂。
按照公知的方法、例如通过将脂质体N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶与赋形剂或多种赋形剂混合而以常规方式制备上述药物制剂。
可以经局部、静脉内、非肠道、腹膜内和/或直肠、优选经非肠道给予所述的活性化合物或其药物制剂，不过，优选口服给药。
实施例表明N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶给药对没有被脂质体制剂中的包含物所消弱的哺乳动物肿瘤产生了药理学功效。此外，当作为脂质体制剂给药时，动物可以耐受较高剂量的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶，而且它们具有正如半数存活时间所测定的较好效果或者具有比给予常规N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的动物更小的肿瘤体积。在小鼠体内显示了较高的化合物血浆浓度且在小鼠体内显示了较长的化合物消除半衰期。在相差无几的剂量下，小鼠体内的峰值血浆浓度在1.5倍以上。在动物中，较高剂量的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体更有较好的耐受。不过，毒性分布看起来相似。
已经对本发明进行了描述，现在参照一些实施例进行描述，这些实施例仅用于解释目的而不是用来限定本发明。实施例1描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的合成路线和结构确证。实施例2描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的抗癌活性的发现。实施例3描述剂量的确定。实施例4描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的体外抑瘤效果。实施例5描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的普通胶囊制剂。实施例6描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的微丸胶囊制剂。实施例7描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的普通片剂。实施例8描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体制剂。实施例9描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的另一种脂质体制剂。实施例10描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体制剂的抑瘤效果。实施例11描述小鼠LD50试验。实施例12描述游离的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体制剂口服后和静注后的药物动力学研究。
具体实施例方式
实施例1本实施例表示一种N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的合成路线和结构确证。
1.1吡啶加氢氧化钠干燥24小时以上，然后常压蒸馏，收集115～116℃的馏分。
1.2三乙胺使用前常压蒸馏，收集88～89℃的馏分。
1.3苯加氯化钙干燥24小时后，常压蒸馏，收集80～81℃的馏分。
1.4乙醚加入金属钠回流2小时后常压蒸馏，收集35～36℃的馏分。
1.5二氧六环常压蒸馏，收集101.32℃的馏分。
1.6邻甲苯甲酰氯的制备称取邻甲苯甲酸176.8g(1.3mol)，加入氯化亚砜200ml(过量)，搅拌，加热回流5小时，至不再冒出白烟。减压蒸馏去除过量的氯化亚砜，得195.5g黄色油状物邻甲苯甲酰氯(1.27mol)。收率97.7％。
1.7N3-邻甲苯甲酰基-5-Fu(TFu)的合成称取5-Fu 2.6g(0.2mol)溶于48ml无水吡啶中，慢慢滴加到12ml无水吡啶与7.8ml的邻甲苯甲酰氯(约0.06mol)中，低温(10～15℃)搅拌3小时后，倒入冰水中，振摇。加入苯充分振摇，分三次萃取，收集三次萃取液，用水洗涤后用硫酸钠过夜干燥，过滤。滤液减压蒸馏去除苯，剩余油性残渣用正己烷充分洗涤后，用乙醚结晶，用氯仿重结晶，得白色片状结晶TFu，收率为76％。熔点为156.5～157.5℃。
1.8目标化合物的结构确认对所合成的目标化合物以FT-IR红外光谱、核磁共振氢谱以及单晶衍射图谱进行结构确证，结果及峰位归属见表1。

表1目标化合物FT-IR红外光谱及核磁共振氢谱

实施例2本实施例证明了N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的抗癌活性。
2.1.1细胞形态学观察将处于对数生长期，状态良好的胆管癌FRH-0201细胞接种于24孔板中，每孔1×104个细胞，24h后细胞贴壁，弃去原来的培养液，对照组加入培养液继续培养，实验组分别加入含不同浓度TFu(8、4、1、0.25、0.063、0.016μmol/ml)的培养液，继续培养，于倒置显微镜下动态观察细胞形态变化并摄片。72h后行吉姆萨染色。
将高压灭菌的盖玻片放入6孔板中细胞培养，药物作用3d后取出制作好的细胞飞片，PBS洗2次，95％乙醇固定5min，用0.01％丫啶橙染色5min，PBS临时封片，荧光显微镜下观察并摄片。
结果1.细胞形态学观察倒置显微镜下观察，对照组细胞生长旺盛，贴壁伸展良好，细胞透光度好，几无悬浮细胞；0.016-4umol/mlTFu组贴壁细胞密度逐渐减小，细胞伸展逐渐变差，胞浆内颗粒增多，细胞间隙增加，悬浮细胞增多，并见细胞碎片；TFu浓度大于4umol/ml时，细胞变圆不再伸展，部分细胞悬浮于培养液内，继而细胞崩解死亡，台盼兰染色无活细胞。见附图1。
2.1.2吉姆萨染色实验组细胞皱缩，浓染，出芽，形成凋亡小体，结果见附图2。
2.1.3吖啶橙染色荧光显微镜观察对照组FRH-0201细胞染色后可见细胞伸展良好，细胞核被染成黄绿色，可见核仁，胞浆均质，立体感强；在不同浓度TFu作用后，可见细胞变小变圆，细胞皱缩，胞质致密，细胞核被染成黄绿色，核染色质边集，无核仁，呈现凋亡细胞的特征。结果见附图3。
2.2MTT实验2.2.1不同浓度TFu对胆管癌细胞增殖能力影响以每孔2×103个细胞(200ul)接种于5块96孔培养板；培养24h使细胞贴壁后小心吸去培养液，对照组加入培养液继续培养。实验组分别加入含有不同浓度TFu的培养液(使终浓度为4、1、0.25、0.0625、0.015625umol/ml)，对照组及实验组每种浓度每块板设有3个复孔，继续孵箱培养。第1～5d，每隔24小时检测一块板内的细胞，每孔分别加人MTT(5g/L)20ul，温箱继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul的二甲基亚砜低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪540nm处测量各孔的吸光值(OD值)；以时间为横轴，OD值为纵轴，绘制细胞生长曲线。计算抑制率抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，并以时间及浓度为横轴，抑制率为纵轴，绘制曲线。
结果TFu抑制体外培养的FRH-0201细胞，该抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性。见附图4、附图5。
2.2.2药物敏感性检测选择种化疗药物，分别是TFu，5-Fu，顺铂(DDP)，阿霉素(ADM)，长春新碱(VCR)，丝裂霉素(MMC)，VP-16，泰素(TAXOL)，根据文献(当代肿瘤内科治疗方案评价)及临床常用的剂量，按照公式计算出实验浓度。公式药物浓度(ug/ml)＝药物剂量(mg)×平均体表面积×100÷平均体重÷60。结果见附图6。
2.3集落形成能力检测每孔50个细胞接种于24孔板；细胞贴壁后对照组更换培养液继续培养，试验组加入不同浓度的TFu，使终浓度为4、1、0.25、0.0625、0.0156、0.004、0.001umol/ml；静置孵箱内培养7-12天，期间根据培养液pH值酌情更换培养液；PBS洗涤两次；甲醇固定10分钟；瑞氏-吉姆萨液染色3分钟；显微镜下观察细胞克隆形成情况并摄片，计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率，重复三次。
结果对照组克隆形成率为(35.33±4.16)％，0.0156umol/ml组克隆形成率为(16.67±2.31)％，0.004umol/ml组克隆形成率为(4.67±4.16)％大于此浓度组无克隆形成。见表2、附图7。
对照组及实验组克降形成情况

2.4 DNA Ladder检测细胞凋亡收集不同浓度药物作用72h的细胞，按常规实验步骤裂解细胞提取DNA进行电泳。结果见附图8。不同浓度TFu作用后，随浓度升高，出现的DNA Ladder条带越明显。各浓度组均出现典型的凋亡ladder条带。
2.5流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡收集＞1×106个细胞，试验组为0.0625umol/mlTFu及5-Fu作用24、48h的细胞，对照组为同期生长细胞，分为两组，细胞凋亡组及周期组；凋亡组取大约1×105个细胞，按试剂盒步骤操作，在流式细胞仪上作细胞凋亡检测；剩余细胞离心后用-20℃预冷的80％乙醇固定；1mlPI染色30min；在流式细胞仪上作细胞周期分析，测定细胞增殖指数(PI＝(S+G2/M)％×100)，G0/G1期细胞比例，S期细胞比例的变化来检测不同组细胞的增殖状态及细胞活性。(Backman counter cytomics FC 500)结果细胞周期检测可见，随着作用时间延长，G1期细胞增加，S期细胞减少，实验组细胞生长被阻滞在G1期，同时相TFu组细胞周期阻滞情况高于5-Fu组。细胞凋亡可见，随作用时间延长各组细胞凋亡率升高，同时相比较，TFu组凋亡率高于5-Fu组。
细胞凋亡检测发现24h未出现明显的凋亡，48h开始出现凋亡，至72h凋亡率明显升高。同时相比较，TFu组凋亡率高于5-Fu。见表3。
各组细胞不同时相细胞周期及凋亡率

2.6 CA19-9，CA125的检测收集TFu浓度为0.0625umol/ml作用72h的细胞培养液及同期正常细胞培养液各1ml，离心取上清；按照试剂盒步骤进行实验；在酶联免疫检测仪420nm处测量各孔的吸光值。绘制标准曲线并求出试验组及对照组的值，见表4。
对照组及不同实验组肿瘤标志物表达情况比较

结论TFu能有效抑制FRH-0201细胞增殖，该抑制作用具有时间、剂量依赖性；TFu可能通过阻滞细胞周期，进一步诱导细胞凋亡发生作用；TFu对FRH-0201细胞抑制率明显高于5-Fu，可作为临床胆管癌化疗的新药参考。
实施例3描述剂量的确定。
动物实验剂量的确定结果表明如果剂量高于130mg/kg，动物将不能耐受，出现明显中毒症状，实验不合格。低于50mg/kg，抑制率可能低于30％，不符合抗肿瘤药物(化学药物)的基本要求，所以，选择剂量是130～50mg/kg。实验结果见表5、6、7和表8。
表5 TFu对S180小鼠肉瘤的生长抑制作用

与对照组比较，**P＜0.01，*p＜0.05 n＝3.
表6 TFu对H22小鼠肝癌的生长抑制作用

对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3表7 TFu对裸鼠移植性人SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3表8 TFu对裸鼠移植性人NKM-45细胞的生长抑制作用

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3一般来说，临床上人用剂量是根据最佳的动物有效剂量的确定毒性实验综合推算出来的。我们的动物(小鼠)实验有效剂量是130～50mg/kg，根据这些数据，按照通行的人与小鼠体表面积折算系数，(70公斤为例)，小鼠以20g为标准，人的体表面积是小鼠的大约383.5倍。所以，130～50(mg/kg)/50＝2.6～1mg/小鼠，2.6～1mg×382(倍)＝997～382mg/人。50的意思是将130～50mg/kg中的kg(1000g变成20g小鼠体重，所以，除以50。最后计算结果，人拟用剂量是997～382mg/人或1000～380mg/人，或按照公斤体重计算14.24～5.46mg/kg，即约15～5mg/kg。
实施例4本实施例证明TFu体内外对肿瘤细胞生长的抑制效果。
N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)体外实验时以DMSO溶解，培养基稀释至需要浓度。动物实验时，以5％淀粉制成TFu混悬液。卡培他滨(Capecitabine，Cap)，上海罗氏制药厂有限公可产品，批号SH0040。胎牛血清与RPMI1640培养基，购于Gibco BRL公司；四甲基偶氮唑兰(MTT)，Sigma公司产品；96孔培养板，美国Costar公司产品，产品号3599。
4.1大鼠肝微粒体混合功能氧化酶(S-9)用多氯联苯对雄性Wister大鼠进行酶诱导，取肝，匀浆，9000r/min离心，取上清为S-9。10ml S-9混合液含1ml S-9，0.2ml 0.4mmol/L氯化镁，0.2ml 1.65mmol/L氯化钾，4ml 0.2mmol/L磷酸缓冲液(pH7.4)，0.014g 6-磷酸葡萄糖，0.0314g辅酶II(NADP)，4.6ml蒸馏水。
4.2肿瘤细胞株及培养低分化人胃腺癌细胞SGC-7901、人上皮样胃腺癌细胞NKM-45，细胞生长于RPMI1640培养基+10％胎牛血清中，以0.02％EDTA+0.25％胰酶消化传代，由中国科学院上海细胞生物学研究所提供。小鼠肉瘤细胞株S180，小鼠肝癌细胞株H22，以昆明种小鼠腹水传代保存，由山东省医学科学院药物研究所提供。
4.3动物昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄兼用，山东大学实验动物中心提供。Balb/c裸鼠，体重19-21g，雄性，中国医学科学院实验动物研究所动物繁育场提供。
4.4实验方法4.4.1细胞生长抑制实验分别取指数生长期SGC-7901和NKM-45细胞，经Hank’s液洗涤后，以0.02％EDTA+0.25％胰酶消化分散成单个细胞，台盘蓝染色计数活细胞在95％以上。取细胞接种于96孔培养板中，细胞数5000/well/0.2ml，置37℃，5％CO2孵箱中培养12小时。细胞贴壁后，加入不同浓度TFu，终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100，1000μg/ml，每个浓度设三个复孔，继续培养，每隔24小时取培养板，检测细胞生长抑制率，至120小时。
4.4.2肝微粒体酶混合液(S-9)对TFu抑制肿瘤细胞生长作用的影响同上方法，接种细胞，加入化合物，再加入S-9混合液2μl/孔培养，每隔24小时取培养板，测定细胞生长抑制率。
4.4.3MTT法测定细胞生长抑制率将96孔培养板生长的细胞，经PBS洗涤后，每孔加入无血清培养基(含MTT 5mg/ml)200μl，继续培养4小时后弃上清，PBS洗涤，再加入200μl DMSO振摇5分钟，酶标仪570nm处测OD值。
4.4.4动物移植性肿瘤生长抑制实验分别抽取接种5天的S180和H22小鼠肿瘤腹水，生理盐水稀释后制成肿瘤细胞悬液，调整细胞数至1×107/ml，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2ml。随机分组，每组10只。次日灌胃给药，0.8ml/只，剂量分别为50，100，200mg/kg，连续给药12-15天。末次给药后24小时，处死动物，取瘤称重，计算化合物对肿瘤生长抑制率。抑瘤率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重。每个肿瘤株实验重复3次，计算平均值。
4.4.5人胃癌细胞裸鼠移植实验分别取SGC-7901和NKM-45细胞107混悬于200μlmatrigel(Collaborative Biomedical，Bedford，MA)，接种于裸鼠右侧腋部皮下。随机分组，每组8只。第7天，当肿瘤体积生长至0.2-0.3cm3时，灌胃给药，剂量分别为0.20，0.40，0.80mmol/kg，设立对照组，每周给药5-6次，连续4周。取瘤称重，同上计算肿瘤生长抑制率。
4.4.6统计学数据以x±s表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，不同组间参数比较采用非配对t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
4.5实验结果
4.5.1 SGC-7901和NKM-45细胞的正常生长曲线以5000/well/0.2ml接种96孔板，观察无药物处理时细胞生长曲线。当细胞生长至120hrs时(5天)，细胞生长曲线呈平台状态，第6天，生长曲线开始下降，说明本实验条件下，细胞生长至120小时前仍然表现为指数生长状态，生长曲线的末次测定时间点应该在120小时。
4.5.2 TFu对SGC-7901和NKM-45细胞生长抑制作用(1)不同浓度TFu与SGC-7901细胞接触不同时间，细胞生存曲线表现剂量依赖性和培养时间依赖性抑制作用关系。以72h时间点为例，比较各剂量组细胞生存率，组间比较，P＜0.05；10μg/ml剂量组，测得TFu对各时间点细胞的抑制率，24h，13.09％；48h，15.69％；72h，22.24％；96h，28.93％；120h，36.86％，组间比较，P＜0.05。120小时出现最高抑制率，1000μg/ml，抑制率为48.68％。当TFu和S-9同时与细胞孵育，各剂量组和时间点均明显增加对SGC7901生长抑制作用，各检测点肿瘤细胞生存率下降29.24-42.57％。(2)TFu与NKM-45细胞孵育不同时间，细胞生存曲线也显示浓度和接触时间依赖性作用关系。以10μg/ml剂量处理细胞，24-120h各时间点，TFu对细胞的生长抑制率为10.28-34.99％。72h时间点，0.1-1000μg/ml剂量，对细胞的抑制率10.01-32.97％。1000μg/ml与细胞接触120小时，抑制率为42.11％。当TFu、S-9与细胞共同孵育时，显著提高对NKM-45的生长抑制作用。在72h时间点，0.1-1000μg/ml剂量，对NKM-45生长抑制率达到65.11-93.03％。计算10μg/ml剂量点，培养时间24-120h，抑制率为31.28-94.11％。1000μg/ml，120小时，抑制率达到96.09％。与不加S-9比较，增加抑制率53.98-66.19％，表9。
表9在肝微粒体酶(S-9)存在下促进TFu对SGC7901和NKM-45细胞生长抑制作用(％)(检测时间为72小时，n＝3)

4.5.3 TFu抑制小鼠S180肉瘤和小鼠H22肝癌细胞生长作用以0.20，0.40，0.80mmol/kg，对S180肉瘤和H22肝癌细胞生长均有较强的抑制作用。对S180肉瘤的抑制率在41.81-59.55％之间，对H22肝癌的抑制率为39.77-87.65％。实验过程中，TFu对动物体重增长有抑制作用。其中，以0.80mmol/kg连续给药，对体重增长抑制作用明显，p＜0.05，表10，11。
表10 TFu对S180小鼠肉瘤的抑制作用

与对照组比较，**P＜0.01，*p＜0.05 n＝3，表11 TFu对H22小鼠肝癌的抑制作用

对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝34.5.4 TFu对裸鼠移植SGC-7901和NKM-45人胃癌细胞生长抑制作用以0.20，0.40，0.80mmol/kg，连续口服给药，对SGC7901细胞生长抑制率为43.55％，60.30％和71.07％，对NKM-45细胞生长抑制率为33.21％，47.96％和60.44％。治疗过程中，0.80mmol/kg剂量对裸鼠体重的增长有明显抑制作用，p＜0.05，表12，13。
表12 TFu对裸鼠移植性人SGC-7901细胞的抑制作用

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3表13 TFu对裸鼠移植性人NKM-45细胞的抑制作用

与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝3实施例5本实施例制备一种N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶普通胶囊剂。
将N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)、淀粉均匀混合，按N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶含量为100mg，淀粉200mg，加入淀粉浆适量，不断搅拌如通过制粒机即可制得湿颗粒。50℃烘干后，胶囊机装胶囊即可。
实施例6本实施例制备一种N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶微丸胶囊剂。
将N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)100mg，微晶纤维素400mg均匀混合，加入适量的黏合剂，得软材，通过微丸机即可制得微丸。50℃烘干后，胶囊机装胶囊即可。
实施例7本实施例制备一种N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶普通片剂。
将N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶(TFu)100mg，淀粉200mg及崩解剂(5％重量)均匀混合，加入适量的淀粉浆，不断搅拌如通过制粒机即可制得湿颗粒。50℃烘干后，加入润滑剂压片即可。
实施例8本实施例制备了一种N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶脂质体制剂。
将N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶(TFu)溶于氯仿中，大豆磷脂酰胆碱(PC)∶胆固醇摩尔比为15∶1溶于氯仿中，N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶∶大豆磷脂酰胆碱摩尔比是1∶15，然后将混合溶液在约30℃或30℃以下的真空中蒸发溶剂而得到薄的脂质和药物的干脂质膜。再加入PBS缓冲液，不断搅拌如通过涡旋剧烈混合即得脂质体。这样制得的脂质体为多层脂质体，经超声波处理后，可得到粒径更小的单层脂质体。
实施例9本实施例制备了一种N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶脂质体制剂。
将大豆磷脂酰胆碱(PC)∶胆固醇摩尔比为15∶1溶于氯仿或乙醚中，然后将混合溶液在约30℃或30℃以下的真空中蒸发溶剂而得到薄的干脂质膜。再加入N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)(TFu∶PC摩尔比是1∶15)的乙醚溶液，加入适量的PBS缓冲液，不断搅拌如通过涡旋剧烈混合即得脂质体。这样制得的脂质体为多层脂质体，经高压乳匀机处理后，可得到粒径更小的单层脂质体。
实施例10本实施例证明了TFu脂质体的抑瘤效果。
S180肿瘤接种选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的荷瘤小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用酒精消毒小鼠皮肤，无菌条件下剥取肿瘤，所用器械经煮沸消毒。按1∶2加入无菌生理盐水，用组织匀浆器制成细胞悬液，于掖窝皮下接种0.2ml。接种肿瘤前用酒精消毒接种部位的皮肤。
动物移植性肿瘤生长抑制实验抽取接种5天的S180小鼠肿瘤腹水，生理盐水稀释后制成肿瘤细胞悬液，调整细胞数至1×107/ml，每只小鼠右侧腋部皮下接种0.2ml。随机分组，每组10只。次日灌胃给药，0.8ml/只，剂量分别为50，100，200mg/kg，连续给药12-15天。末次给药后24小时，处死动物，取瘤称重，计算化合物对肿瘤生长抑制率。抑瘤率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重。试验结果如表14所示。
表14 TFu脂质体的抑瘤效果

注1、Cap阳性对照组的剂量与TFu 200mg/kg的剂量组摩尔数相当；2、本次体重、瘤重统计数据中，未将试验结束前死亡的小鼠计算在内3、TFu各剂量组死亡的小鼠体重12.9～16.9g，瘤重均为0实施例11本实施例描述N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶(TFu)小鼠LD50试验。
11.1动物选择 昆明系小鼠44只，体重18～22g，雌雄各半山东大学试验动物中心提供。
11.2药物配制 称取样品3340mg，阿拉伯胶0.4g，在研钵中研磨至细粉，加少许0.5％的羧甲基纤维素钠溶液继续研磨至均匀后续加至20ml，搅匀，即得浓度为167mg/ml的混悬液。
11.3小鼠分组 小鼠44只，雌雄各办，随机分为4组，每组小鼠11只，各组间的剂量间距为0.7。
11.4给药方法 按各组剂量的不同分别给予口服灌胃0.6ml、0.42ml、0.29ml、0.21ml，给药后即观察小鼠死亡情况，连续观察9天。
11.5试验结果 试验结果见表15，Bliss法计算。
表15 TFu小鼠LD50试验结果

半数致死量LD50＝3165.77mg/kg，95％可信限＝2543.69～3939.98mg/kg11.6在试验条件下，给定脂质体中药物浓度，增加给药体积至最大量，未观察到脂质体给药组的死亡情况。
实施例12本实施例描述描述游离的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体制剂口服后和静注后的药物动力学研究。
12.1.动物实验方法12.1.1体内分析方法的建立12.1.1.1紫外检测波长的选择标准储备液的配制精密称取TFu标准品适量(约10mg)置100ml容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为100μg/ml的标准储备液，备用。在200～400nm波长处扫描，样品在258nm处有最大吸收，空白辅料无干扰。
12.1.1.2色谱条件色谱柱venusi lXBP C-18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相乙腈-蒸馏水(50∶50，V/V)；流速1.0ml/min；检测波长258nm；柱温室温；进样量20μl。
12.1.1.3血浆样品的处理精密吸取血浆样品1mL，置离心管中，加入0.5mol·L-1NaH2PO4溶液0.2ml，乙酸乙酯0.3ml，混悬震荡3min，离心5min(3000r·min-1)，取上清液0.1ml转移至5ml离心管中，在50℃水浴中氮气吹干，将残留物准确用0.5ml流动相溶解，取20μl进样。
12.1.1.4标准曲线的建立12.1.1.5小鼠血浆标准曲线的建立精密量取标准储备液适量至离心管中，N2吹干，加小鼠空白血浆0.5ml，涡旋混匀，配成浓度为0.5、1、4、6、20、40μg·ml-1的系列含药血浆样品，按前述血浆样品处理方法进行预处理后，进样20μl，记录色谱图，求得峰面积A，以峰面积A对浓度C进行线性回归处理，得回归方程A＝12271C+5444.4(r＝0.9995)，标准曲线图见附图9。
由附图9可知，TFu血浆浓度在0.5～40μg·ml-1范围内线性关系良好(r＝0.9995)，定量下限为0.5μg/ml。
12.1.1.6小鼠血浆方法回收率试验精密量取TFu标准溶液适量置离心管中，N2吹干，加小鼠空白血浆0.5ml，配成低、中、高(1、4、40μg·ml-1)三种浓度的血浆样品，按1.1.3项下血样处理方法处理后，进样20μl，求得峰面积A，求得方法回收率。结果见表16。
表16 小鼠血浆方法回收率试验结果

12.2.小鼠体内药物动力学试验12.2.1正常小鼠灌胃给药取正常小鼠66只，雌雄各半，体重27±1g，随机分为2组，每组33只。灌胃给药，每只小鼠分别灌胃0.5ml，剂量100mg/kg(按TFu计算)，给药前禁食12h，自由饮水。第1组为TFu混悬水溶液组，第2组为TFu脂质体组，分别于口服前、口服后5min、15min、30min、45min、1、2、4、6、12、24、48h于眼底静脉丛取血，加入肝素化离心管中，3500r·min-1离心15min取上层血浆，-20℃冰箱保存待测。按血浆样品预处理方法和测定方法进行处理和测定；将血药浓度测定结果用DAS ver1.0(Drug And Statistics for Windows)药代动力学程序进行处理，求得药物动力学参数。可用双室模型来拟合，权重系数w＝1/c2。血药浓度测定结果见表17；绘制对照组和脂质体组平均血药浓度-时间曲线，结果见附图10、附图11。
表17 正常小鼠灌胃给药血药浓度测定结果(n＝3)

用双室模型来拟合，权重系数w＝1/c2，原料药组t1/2为17h，药时曲线下面积AUC为18.4862μg/ml*h，Cmax为15.6900(mg/L)；脂质体组t1/2为20h，药时曲线下面积AUC为26.6145μg/ml*h，Cmax为24.0000(mg/L)；
12.2.2正常小鼠静脉注射给药取正常小鼠66只，雌雄各半，体重27±1g，随机分为2组，每组33只。尾静脉注射给药，每只小鼠分别注射0.1ml，剂量100mg/kg(按TFu计算)，给药前禁食12h，自由饮水。第1组为TFu溶液(50％乙醇)组，第2组为TFu脂质体组，分别于注射前、注射后5min、15min、30min、45min、1、2、4、6、12、24、48h于眼底静脉丛取血，加入肝素化离心管中，3500r·min-1离心15min取上层血浆，-20℃冰箱保存待测。按血浆样品预处理方法和测定方法进行处理和测定；将血药浓度测定结果用DASver1.0(Drug And Statistics for Windows)药代动力学程序进行处理，求得药物动力学参数。可用双室模型来拟合，权重系数w＝1/c2.血药浓度测定结果见表18；绘制对照组和脂质体组平均血药浓度-时间曲线，结果见附图12、附图12。
表18 正常小鼠静脉注射给药血药浓度测定结果(n＝3)

用双室模型来拟合，权重系数w＝1/c2，原料药组t1/2为18h，药时曲线下面积AUC为40.5624μg/ml*h，Cmax为19.0000(mg/L)；脂质体组t1/2为103h，药时曲线下面积AUC为36.3720μg/ml*h，Cmax为8.10000(mg/L)；由上可知，口服原料药，口服脂质体，注射脂质体的绝对生物利用度分别为45.6％、65.61％、89.67％。
权利要求
1.一种药物组合物，其特征在于包含N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶和药物上可接受的赋形剂。
2.N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶在制备抗肿瘤药物中的用途。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的赋形剂可以是任意药学上的常规剂型的赋形剂，包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂、喷雾剂、注射剂或输液的赋形剂。
4.治疗性N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，包括含有N3-邻甲苯甲酰基-氟尿嘧啶和脂质成分。
5.如权利要求4所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶与脂质成分的摩尔比1∶40～1∶5。
6.如权利要求4所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，包载N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体包含具有5μm或5μm以下大小的囊泡。
7.如权利要求4所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，所述的包载N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶的脂质体包含具有0.1μm或0.1μm以下大小的囊泡。
8.如权利要求4所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，所述的脂质成分包括胆固醇、磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸中的一种或组合。
9.如权利要求8所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，所述的脂质成分还有维生素E。
10.权利要求4所述的N3-邻甲苯甲酰基氟尿嘧啶脂质体组合物，其特征在于，所述的磷脂酰胆碱选自二硬脂酰磷脂酰胆碱，氢化大豆磷脂酰胆碱，大豆磷脂酰胆碱，卵磷脂酰胆碱，氢化卵磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二反油酰磷脂酰胆碱，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱中的一种或组合。
全文摘要
本发明涉及将5－Fu前体N
文档编号A61K9/00GK1875973SQ20061004224
公开日2006年12月13日 申请日期2006年2月10日 优先权日2006年2月10日
发明者徐文方, 张娜, 曲显俊, 刘健 申请人:山东大学