专利名称：一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。特别涉及一种抗肿瘤免疫活性细胞-寡核苷酸诱导的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的细胞群的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤是当前危害人类健康的主要疾病之一，在传染病得到控制的国家，心脑血管疾病和恶性肿瘤已分别成为死亡原因的第一和第二位。2005年统计，我国城市居民死亡第一位是恶性肿瘤，是农村居民的第二位死因。
在肿瘤的治疗方法中，免疫治疗已经成为手术治疗、化疗和放疗之外，最重要、最有希望的治疗手段。在过去的20多年里，肿瘤特异性主动免疫治疗和过继性免疫治疗两个方面都有很大的发展。在肿瘤过继免疫治疗中，先后出现了五种引人注目的免疫效应细胞淋巴因子诱导的杀伤细胞(LAK细胞)(Rosenuberg SA，et al，1985)；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)(Itohk，etal，1988)；抗白细胞分化抗原-3单克隆抗体(CD3单抗)和白细胞介素-2诱导的杀伤细胞(AK-T细胞)(Uberti JP，et al，1994)；细胞毒T淋巴细胞(CTL细胞)(Aruga A，et al，1991)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)(Schmidt-wolfIGH，et al，1991)。LAK细胞增殖性能不理想和细胞毒活性较低且维持时间较短而渐被淘汰。细胞毒T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞，从理论上看最被看好的免疫效应细胞，细胞毒T淋巴细胞但目前尚无有效的扩增手段，肿瘤浸润淋巴细胞来源受限。白细胞介素-2诱导的杀伤细胞细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞细胞都是用抗CD3单抗为刺激因子激发T淋巴细胞增殖，具相同的增殖活性。细胞因子诱导的杀伤细胞细胞还有赖于其他细胞因子的参与，故细胞因子诱导的杀伤细胞比白细胞介素-2诱导的杀伤细胞细胞细胞有更强的细胞毒活性。但是，细胞因子诱导的杀伤细胞和白细胞介素-2诱导的杀伤细胞及LAK细胞一样，也不具备特异性识别和杀伤肿瘤细胞的特性。
在众多肿瘤肿瘤特异性免疫治疗方法中，树突状细胞作为新一代疫苗的研究和应用，成为近年来主动免疫治疗研究中的热点，DC是已知的最主要的抗原提呈细胞，具有捕获、加工处理抗原和向T淋巴细胞提呈抗原分子，表达共刺激分子，释放细胞因子和白细胞介素等特性。因此，DC在肿瘤免疫应答中起主要免疫调节作用。
当DC与CIK共培养时，彼此能相互作用而诱导出比CIK细胞有更强增殖活性，更高的肿瘤细胞杀伤活性的细胞群。(Marten A et al，2001)，国内徐永华等研究用肿瘤抗原冲击树突状细胞后，与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得DCIK细胞毒性比CIK高出10-20％。
近年来的研究表明，细菌的CpG-ODN可以激活机体多种免疫细胞，诱生多种细胞因子，可以调节免疫应答向Th1型转化，并且人工合成的CpG寡核苷酸(CpG-oligodeoxy nucleotides，CpG-ODN)也可模拟上述反应。CpG-ODN与抗原刺激的DC细胞共同注射到患结肠癌的鼠体内，可明显提高DC的抗瘤活性，并且全身给药抑制肿瘤生长能力比5-FU和甲酰四氢叶酸强(Sipos B，Sting G，2002)，但是，寡核苷酸直接体内注射需要剂量较大而且连续注射一周有组织坏死，出血等副作用。
肿瘤抗原冲击的DCIK细胞的制备必须要经过手术等方法取得新鲜肿瘤组织标本来提取抗原，而临床上相当部分病人丧失了手术机会，以及经过放化疗后的病人，难于获取肿瘤抗原。而且为诱导更强的免疫效果大剂量注射CpG-ODN，副作用也较大。因此，改善现有技术中抗肿瘤免疫效应细胞在增殖性能和细胞毒活性以及对肿瘤细胞特异性识别和攻击活性的不足，从而开发出一种新的抗肿瘤免疫效应细胞及其制备方法，称为现实的需要。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高表达CD3-CD56、增殖活性高、释放细胞因子量大、细胞毒活性高的高效免疫活性细胞寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法。
本发明的技术构思是，在Maten，Peter，Sipos及徐永华等人研究的基础上，分别用细胞因子诱导树突细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞，在原有树突细胞的诱导中，加入人工合成的寡核苷酸2006诱导树突细胞，然后与同源细胞因子诱导的杀伤细胞混合培养，得到一种新的免疫效应细胞群，定名为寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的免疫细胞群。
由于寡核苷酸能够增强树突状细胞的抗原提呈能力，促进树突状的功能成熟，而树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养可以显著提高细胞因子诱导的杀伤细胞的增殖能力和细胞毒活性，故采用体外寡核苷酸联合细胞因子诱导树突状细胞，然后与同源细胞因子诱导的杀伤细胞共培养，以获得增殖活性和细胞毒活性更强的免疫效应细胞群。这对于丧失手术时机以及并称晚期等各种原因难于获取病人肿瘤抗原的病例，同样可以诱导和扩增出较高抗癌活性的免疫细胞群。
本发明的技术解决方案，步骤是(1)外周血单个核细胞的制备取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2-3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液F12/DMEM11或者AIM-V调节细胞密度秤3-5×10-6/ml的细胞悬液。
(2)外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离将前述细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2-3小时，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非黏附PBL悬液收集在50ml离心管中，田孔板留下的粘附细胞作诱导树突状细胞用。
(3)细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导和扩增在上述外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素，终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平撹厘米的培养瓶中，每瓶装量20毫升，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、白细胞介素-1和白细胞介素-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用细胞因子诱导的杀伤细胞细胞培养液调解细胞浓度为2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养；细胞因子诱导的杀伤细胞细胞培养液为完全F12/DMEM11，或者AIM-V，含白细胞介素-1和白细胞介素-2。此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次。培养至第8天收集细胞因子诱导的杀伤细胞细胞待用。
(4)树突细胞的诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入树突细胞培养液3毫升。树突细胞培养液为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4，终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升。置于6孔板与37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养3天，然后在各孔中加入寡核苷酸2006，终浓度3微摩尔/毫升，继续培养，至第5天，加入肿瘤坏死因子，终浓度为100单位/毫升。培养至第8天，用移液管冲洗和收集非粘附和半粘附树突细胞待用。
上述寡核苷酸2006为人工合成的寡核苷酸，其序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整个序列硫代化修饰，其中的CpG基序均为去甲基化的，合成及稀释过程均要求无菌。
(5)树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养制备寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群细胞细胞将经过寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调节细胞密度为6×10-5/ml和2×10-5/ml。等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次。
以上制备过程中所用吸管和离心管为聚丙烯材料，6孔板和培养瓶为聚苯乙烯材料。此外，若改用其他规格培养器皿，应根据培养面积大小调整上述细胞悬液接种量，细胞接种密度调整到2-5×10-6/ml。
使用高效免疫活性细胞群用于抗肿瘤的方法，裸鼠右耳皮下接种人源前列腺癌细胞Alva411×10-7/只，一周后成瘤率100％，14天后会阴部转移100％，开始连续腹腔接种寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞细胞悬液2-3×10-8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理盐水对照组生存率0％(0/4)，细胞因子诱导杀伤细胞治疗组20％(1/5)，树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞治疗组50％(3/6)，寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群治疗组为70％(6/8)，而寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重明显小于细胞因子诱导的杀伤细胞细胞组瘤重。与树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重差异不明显。
本发明的有益效果是，上述共培养得到的寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群细胞与淋巴因子诱导的杀伤细胞、细胞一样为非均质细胞群，其主要生物学特性有1.细胞组成寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群的细胞中T淋巴细胞占98％以上和少量树突细胞。T淋巴细胞中个亚群所占比例具有个体差异和印体外培养时间长短而有一定变化范围。一般为CD3+CD4+T细胞20-40％，CD3+CD8+T细胞50-80％，CD3+CD56+T细胞20-60％。
2.增殖活性高寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群的增殖活性比同源树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群和细胞因子诱导的杀伤细胞强大。体外扩增3周后，寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群比同源树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群和细胞因子诱导的杀伤细胞分别大1-1.5倍和4-8倍。
3.释放细胞因子量大寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群释放干扰素的量是同源细胞因子诱导的杀伤细胞的3-6倍，是同源树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群细胞的0.5-1倍。
4.细胞毒活性高与同源细胞因子诱导的杀伤细胞组比较寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群组体外对特异靶细胞的杀伤作用高出20-30％，略高于同源树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群，人癌动物模型治疗试验表明，较寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养获得的免疫细胞群组动物的平均存活期是细胞因子诱导的杀伤细胞组动物的3倍，是同源树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群组动物的0.5倍。
树突细胞与细胞因子共培养免疫细胞群主要用于自体瘤的治疗，术后即时施治有效防转移防复发。也能够作为化疗的辅助治疗，此外，寡核苷酸有道德树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的免疫细胞群也能够用于某些传染性疾病的免疫治疗。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明进一步说明。
1.外周血单个核细胞的制备取肿瘤病人抗凝外周血35ml，生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离PBMC，分离所用的离心机转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20分钟。然后用Hanks平衡液洗涤PBMC2次，再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液完全F12/DMEM11或者AIM-V调节细胞密度成4×10-6/ml的细胞悬液。
2.外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离将细胞悬液移入6孔板，每孔加4ml，置37C，5％CO2饱和湿度培箱温育2.5小时，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非粘附外周血淋巴细胞悬液收集在50ml离心管中，6孔板中留下的粘附细胞作诱导树突细胞用。
3.细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导和扩增在上述外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素终浓度为1000u/ml，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶装量20毫升，置于37C，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时。之后，每瓶添加鼠抗人CD3单克隆抗体，白细胞介素-1和白细胞介素-2，终浓度分别为50ng/ml、100u/ml和800u/ml。继续培养60小时后显微镜下细胞计数，然后用CIK细胞培养液调节细胞密度为3×10-5/ml，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，进行扩大培养；CIK细胞培养液完全F12/DMEM11或者AIM-V，含IL-1，IL-2，浓度分别是100u/ml、800u/ml。此后，每隔60小时按上述相同条件扩大培养一次。培养至第8天收集细胞因子诱导的杀伤细胞待用。
4.树突细胞的诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入树突细胞培养液3毫升。树突细胞培养液为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4，终浓度分别是1000u/ml和500u/ml。置于6孔板与37C，5％CO2饱和湿度培养箱中培养3天，然后在各孔中加入寡核苷酸2006，终浓度3微摩尔/毫升，继续培养，至第5天，加入肿瘤坏死因子，终浓度为100u/ml。培养至第8天，用移液管冲洗和收集非粘附和半粘附DC待用。
上述寡核苷酸2006为人工合成的寡核苷酸，其序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’，整个序列硫代化修饰，其中的CpG基序均为去甲基化的，合成及稀释过程均要求无菌。
5.树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养制备寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得免疫细胞群。
将经过寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调节细胞密度为6×7/ml和2×7/ml。等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，每隔60小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次。
使用高效免疫活性细胞群用于抗肿瘤的方法，裸鼠右耳皮下接种人源前列腺癌细胞Alva411×8/只，一周后成瘤率100％，14天后会阴部转移100％，开始连续腹腔接种寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞细胞悬液2×8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理盐水对照组生存率0％(0/4)，细胞因子诱导杀伤细胞治疗组20％(1/5)，树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞治疗组50％(3/6)，寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群治疗组为70％(6/8)，而寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重明显小于细胞因子诱导的杀伤细胞细胞组瘤重。与树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重差异不明显。
权利要求
1.一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，步骤是(1)外周血单个核细胞的制备取肿瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理盐水对倍稀释后，用比重为1.077的淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，分离所用离心机之转头为水平转头，离心速度为2000rpm，离心20分钟，然后用Hanks平衡液洗涤2-3次再进行显微镜下细胞计数，最后用淋巴细胞培养液调整细胞密度成3-5×10-6/ml的细胞悬液。(2)外周血淋巴细胞和粘附细胞的分离将前述细胞悬液移入6孔板，每孔3-5ml，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱温育2-3小时，然后用移液管轻轻冲洗细胞，将非黏附PBL悬液收集在50ml离心管中，田孔板留下的粘附细胞作诱导树突状细胞用。(3)细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导和扩增在上述外周血淋巴细胞悬液中添加重组人干扰素，终浓度为1000单位/毫升，然后移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶装量20毫升，置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中温育24小时，然后添加CD3单抗、白细胞介素-1和白细胞介素-2，终浓度分别为50纳克/毫升、100微克/毫升和800单位/毫升，继续培养48-72小时后，显微镜下细胞计数，然后用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调解细胞浓度为2×10-6/毫升，分配到75平方厘米培养瓶中，每瓶20毫升，进行扩大培养；细胞因子诱导的杀伤细胞培养液含完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白介素-1和白介素-2。此后，每瓶48-72小时按上述相同条件扩大培养一次。培养至第8天收集细胞因子诱导的杀伤细胞细胞待用。(4)树突细胞的诱导和扩增在前述留有粘附细胞的6孔板中，每孔加入树突细胞培养液3毫升。树突细胞培养液为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4，终浓度分别是1000单位/毫升和500单位/毫升。置于6孔板与37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养3天，然后在各孔中加入细胞因子诱导的杀伤细胞培养液；细胞因子诱导的杀伤细胞培养液为完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白细胞介素-1和白细胞介素-2。再加入寡核苷酸2006，终浓度3微摩尔/毫升，继续培养，至第5天，加入肿瘤坏死因子，终浓度为100单位/毫升。培养至第8天，用移液管冲洗和收集非粘附和半粘附树突细胞待用。(5)树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养制备寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群。培养液为完全F12/DMEM1∶1，或者AIM-V，含白细胞介素-1和白细胞介素-2。将经过寡核苷酸诱导的树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞，分别计数，离心弃上清后，分别用细胞因子诱导的杀伤细胞培养液调节细胞密度为6×10-5/ml和2×10-5/ml。等体积混合后移入75平方厘米培养瓶中，每瓶20ml，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每隔48-72小时按以上细胞密度分瓶扩大培养一次，培养至2-3周单次或分次回输体内。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，淋巴细胞培养液为完全F12/DMEM1∶1。
3.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，淋巴细胞培养液为完全PRMI-1640。
4.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，淋巴细胞培养液为完全AIM-V。
5.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，树突细胞的诱导和扩增，在培养到第3天，加入寡核苷酸2006，其序列为5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’，整个序列硫代化修饰，其中的CpG基序均为去甲基化的，合成及稀释过程均要求无菌。
6.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，所用吸管和离心管为聚丙烯材料，6孔板和培养瓶为聚苯乙烯材料。
7.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法，其特征在于，细胞培养接种密度为2-5×10-6/ml。
8.使用权利要求1所述的一种抗肿瘤高效免疫活性细胞群的制备方法制备的高效免疫活性细胞群用于抗肿瘤的方法，其特征在于，裸鼠右耳皮下接种人源前列腺癌细胞Alva411×10-7/只，一周后成瘤率100％，14天后会阴部转移100％，开始连续腹腔接种寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞细胞悬液2-3×10-8/只/次，隔日一次，共4次，至35天，生理盐水对照组生存率0％(0/4)，细胞因子诱导杀伤细胞治疗组20％(1/5)，树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞治疗组50％(3/6)，寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞群治疗组为70％(6/8)，而寡核苷酸诱导树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重明显小于细胞因子诱导的杀伤细胞细胞组瘤重。与树突状细胞与细胞因子诱导杀伤细胞共培养细胞组瘤重差异不明显。
全文摘要
一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法属于生物技术领域。是利用寡核苷酸及细胞因子诱导树突状细胞，用细胞因子诱导杀伤细胞，然后将树突细胞与细胞因子诱导杀伤细胞按一定比例混合培养，得到一种新的免疫效应细胞群寡核苷酸诱导的树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养所获得的细胞群。这种细胞与细胞因子诱导杀伤细胞细胞和树突细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养的免疫细胞群比较，增殖活性更强，细胞毒活性远高于细胞因子诱导杀伤细胞。寡核苷酸能够人工合成，对丧失手术时机以及难以得到肿瘤抗原的病人同样可以诱导和扩增出远高于细胞因子诱导杀伤细胞的抗癌活性的免疫细胞群。适用于自体瘤治疗、化疗和放疗的辅助治疗。
文档编号A61P35/00GK1869206SQ200610046748
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月27日 优先权日2006年5月27日
发明者李丽, 夏元化, 安利佳 申请人:大连理工大学