专利名称：HIV－1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及HIV-1 gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是一种由艾滋病病毒、即人类免疫缺陷病毒(human imunodeficiencyvirus，简称HIV)侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。直至目前，医学界尚未找到对付这种疾病的最佳解决办法，仍然正在努力寻找着该病毒自身防御中的弱点，以便抑制或杀死该病毒。其中一个重要的目标就是HIV的衣壳蛋白—gp120。
gp120是HIV的衣壳蛋白，为env基因编码的糖蛋白。gp120包含5个可变区(V1～V5)和5个保守区(C1～C5)。多数研究显示gp120的4个区如V3区、CD4结合区、V1区、V2区与HIV的中和作用有关。gp120包含有很多抗原决定簇，具有很强的免疫原性，而且，在HIV侵入人体的过程中，表达在病毒表面的gp120使HIV病毒轻易地结合于特定的T淋巴细胞上，然后通过病毒蛋白外壳与T细胞膜的融合，从而达到侵袭T细胞的目的。此外，游离于体内的gp120通过其特殊的超抗原作用激活过量的T细胞，并且刺激体内其他免疫细胞发生一系列反应，大大降低了人体的免疫功能。但是，序列对比分析表明，不同HIV-1株中gp120的变异程度很高，这使得HIV-1很容易逃避gp120抗体的中和作用。
国内外许多研究发现，gp120全长约1.5kbp不能得到稳定和高效的表达，其原因尚不清楚。研究者借助一些软件如Prosis等对蛋白进行亲水性分析，推测出gp120N端抗原位点较多，于是将HIV-1 gp120基因的3’至5’切短到500多个bp(gp120N端约三分之一，包含V1区和V2区)，然后进行表达，结果表达的蛋白很稳定，没有被降解。间接ELISA及Western blot证实，表达产物具有良好的抗原性及特异性，而且该段基因序列相对保守。研究已经证实，gp120的基因突变位点主要位于V3高变区，而其余序列变异率很低。
联系到在乙肝、肿瘤和其他疾病的免疫学研究和治疗中得到广泛应用的细胞因子的免疫佐剂作用现象——主要通过构建抗原-细胞因子的DNA重组体，来增强和改变免疫应答反应。并且此方法简便、有效，一次免疫可诱导强烈的细胞免疫应答。不仅如此，这种DNA重组方式可以避免细胞因子以非重组形式作为佐剂存在的一些缺陷，如在体内的半衰期较短，细胞因子活性易受内环境如PH值、各种水解酶及血浆蛋白的影响等。因此，我们设想选择一个合适的细胞因子，与可以得到稳定表达且包含HIV部分主要抗原位点的gp120部分糖蛋白(gp120N端560bp的基因片段表达产物)组成重组体，来观察重组体是否增强了机体针对gp120抗原的细胞免疫应答反应。如果实验表明增强了特异性细胞免疫反应也即CD8+T细胞的杀伤作用(CTL)，无疑将为临床治疗HIV感染奠定有价值的研究基础。
目前已发现具有免疫佐剂效应的细胞因子多属于淋巴因子(如IL-2)、单核因子(如IL-1、肿瘤坏死因子)和干扰素(包括α-和γ-干扰素)。我们选择γ干扰素(IFN-γ)作为构成重组体的细胞因子。这主要是基于IFN-γ自身的特点以及国内外文献未见将IFN-γ与gp120融合表达来进行免疫学研究的缘故。另外，在IFN-γ-gp120融合蛋白表达后，通过软件分析，其各自的空间构象没有发生改变，结合位点仍然存在，为线性中和表位。这为进一步的动物免疫实验研究提供了可行性保障。
IFN-γ属于II型干扰素，由激活的T细胞和NK细胞分泌，具有免疫调节、抗肿瘤和抗病毒的功能。IFN-γ属于Th1型细胞因子，因而促进CD8+T细胞的增殖、分化和成熟，发挥上调细胞免疫反应的功能。同时，IFN-γ可抑制Th0细胞向Th2细胞分化而下调体液免疫应答。IFN-γ可以促进巨噬细胞和NK细胞的活性，有助于受病毒感染细胞的尽快清除。IFN-γ还可以阻断病毒颗粒的复制，有助于减少病毒量，使显性病毒感染变成不显性病毒感染。在HIV感染中，IFN-γ也发挥着重要作用。临床认为，艾滋病人易于发生机会性感染而死亡的原因之一与患者体内缺乏CD4+T细胞，不能充分激活巨噬细胞和NK细胞发挥吞噬和杀伤作用有一定关联。HIV感染中的细胞免疫反应与IFN-γ也有一定的关系。研究发现，HIV感染早期IFN-γ合成增加，其增加的高峰恰与CDg+T细胞的增殖相一致，而此类细胞是IFN合成的主要细胞。在临床方面，在没有发生机会性感染的HIV-1病人体内可以检测到较高浓度的IFN-γ。在治疗方面，虽只有星星点点的研究发现，但学者们认为这些结果还是很有希望的。
通过文献检索，国内外有关HIV-1 gp120的研究很多，但未见针对HIV-1 gp120包含主要抗原位点的N端三分之一片段与IFN-γ融合蛋白的表达以及免疫学作用检测的文献。
发明内容
我们通过构建HIV-1 gp120N端的三分之一片段与IFN-γ(gp120N/IFN-γ)融合基因的原核表达质粒pet44b-gp120N/IFN-γ，然后将pet44b-gp120N/IFN-γ在大肠杆菌(DE3)细胞中进行低温诱导表达和纯化、鉴定。通过在体外刺激Balb/c小鼠，检测出融合蛋白与单纯gp120蛋白在诱导小鼠免疫反应特别是细胞免疫反应有显著的差异，验证了本发明的制备方法所获得的HIV-1 gp120与人γ干扰素融合蛋白有很好的增强特异性细胞免疫反应(包括CTL作用)和Th1型细胞因子分泌水平的效果。
具体方案如下
(1)根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5’端和3’端分别引入Ecor I和Hind III识别位点A/ATTCT和A/AGCTT，用PCR法高保真扩增gp120N端566bp片段，并纯化PCR产物，备用；(2)参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA polymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物回收、纯化后用T-A克隆的方法插入TOPO T-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，作ECOR I单酶切鉴定，得到IFN-γ片段；(3)对gpl20片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定，用gp120酶切位点酶切IFN-γ+pet44b质粒，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，并鉴定所得重组质粒；(4)制备BL21(DE3)感受态细胞，取连接产物加入感受态细菌中，转化成功后复苏培养细菌，取菌液，在含氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选单个菌落，摇菌、抽提质粒；(5)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证；(6)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达；(7)冷冻、浓缩并纯化细胞培养上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白。
上述gp120/pEGFP-N1的一对引物序列如下hIFN-γsenseTCTCTTGGCTGTTACTGCCAantisenseACCTCGAAACAGCATCTGACgp120 sensecggA/ATTCTATGAGTGCTACAGAAAAATTGTGGantisensecccA/AGCTTAATTGGCTCAAATGATAC上述方案进一步描述如下(1)根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5’端和3’端分别引入Ecor I(A/ATTCT)和Hind III(A/AGCTT)识别位点，用Pyrobest DNApolymerase高保真扩增gp120N端566bp片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化，-20℃保存；(2)参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA polymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下进行胶回收，把IFN-γ用T-A克隆的方法插入TOPO T-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，作ECOR I单酶切鉴定，酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将阳性克隆进行测序；(3)对gp120片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定，用gp120酶切位点酶切IFN-γ+pet44b质粒，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，进行Ecor I/Hind III、Xhol I/Hind III和EcorI/Xhol I双酶切鉴定，并将酶切阳性的质粒进行核酸测序；(4)制备BL21(DE3)感受态细胞，取连接产物加入感受态细菌中，冰浴30min，42℃热休克2min后置冰上2min，加入LB液体培养基，37℃摇床复苏45min。取菌液，在含氨苄青霉素的LB平板上涂布均匀，37℃培养12-16h。次日挑选单个菌落，摇菌、抽提质粒；(5)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证，结果有多个菌株阳性，证明pet44b-gp120和pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化成功；(6)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达。并鉴定gp120和gp120/IFN-γ融合蛋白的表达。
(7)将培养上清冷冻浓缩后，用BPER 6×His Spin Purification Kit纯化上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白，于Beckman DU640蛋白核酸分析系统进行定量，-80℃保存。
所述gp120/pEGFP-N1的一对引物序列如下表1Table 1List of Primers of PCR
图1为质粒pet44b(+)的物理图谱。
图2为Pet44b-gp120重组质粒构建流程图。
图3为Pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒构建流程图。
图4为本发明方案的融合蛋白诱导表达流程图。
具体实施例方式
1、各质粒的构建(1)PCR扩增携带Ecor I/Hind III酶切位点的gp120
根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5‘端和3’端分别引入Ecor I(A/ATTCT)和Hind III(A/AGCTT)识别位点。用Pyrobest DNA polymerase高保真扩增gp120N端566bp片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化，-20℃保存。
(2)聚合酶链反应(PCR)扩增IFN-γ参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA polymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下胶回收。把IFN-γ用T-A克隆的方法插入TOPO T-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞。抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，具体操作参照试剂盒说明书，作ECOR I单酶切鉴定，酶切产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将阳性克隆进行测序。
(3)构建pet44b-gp120N/IFN-γ克隆载体对gp120片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接。连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定。酶切IFN-γ+pet44b质粒(用gp120酶切位点)，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，进行Ecor I/Hind III、Xhol I/Hind III和EcorI/Xhol I双酶切鉴定，操作同前。并将酶切阳性的质粒进行核酸测序。
2、在原核细胞株DE3表达gp120/IFN-γ融合蛋白以及表达gp120蛋白(1)制备BL21(DE3)感受态细胞。
(2)pet44b-gp120以及pet44b-gp120/hIFN-γ重组质粒转化入DE3细胞。
取连接产物10L加入感受态细菌150L中，冰浴30min，42℃热休克2min后置冰上2min，加入LB液体培养基800L，37℃摇床复苏45min。取菌液200L，在含氨苄青霉素的LB平板上涂布均匀，37℃培养12-16h。次日挑选单个菌落。摇菌，然后抽提质粒，进行初步验证。
(3)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证，结果有多个菌株阳性，证明pet44b-gp120和pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化成功。
(4)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达。
(5)鉴定gp120和gp120/IFN-γ融合蛋白的表达①SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)法检测电泳鉴定表明，gp120-IFN-γ已经表达。
②Western-blot检测gp120和gp120/IFN-γ分别在预期的部位出现特异、单一条带。说明gp120和gp120N/IFN-γ融合蛋白已得到成功表达。
(6)gp120以及gp120N/IFN-γ融合蛋白的纯化将培养上清冷冻浓缩后，用BPER 6×His Spin Purification Kit纯化上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白，具体操作参照说明书。于Beckman DU640蛋白核酸分析系统进行定量，-80℃保存。
为验证本发明所制备的gp120/hIFN-γ融合蛋白的应用效果，进行以下动物试验HIV-1gp120N/IFN-γ融合蛋白的动物免疫实验选用6周龄雌性Balb/C小鼠，随机分对照组(C)、gp120组(G)和gp120N/IFN-γ(G+I)三组，每组20只，各组小鼠皮下注射各种蛋白0.5mg/只，共3次(每次间隔3天)。于2周时分别采取60只小鼠尾静脉血进行Ig亚类检测(IgG/IgM)、CTL活性试验、IFN-γ活性试验、脾淋巴细胞增殖反应(gp120刺激)、脾淋巴细胞CKs诱导试验(gp120刺激，检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等)等一系列免疫活性试验。于4周时再次皮下注射各种蛋白0.5mg/只1次，3天后采取60只小鼠尾静脉血再次进行Ig亚类检测(IgG/IgM)、和脾淋巴细胞CKs诱导试验(gp120刺激，检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10等)。
免疫方法同前，免疫方案见下表2。
表2融合蛋白免疫小鼠方案
结果分析1、对pet44b-gp120N和pet44b-gp120N/IFN-γ进行酶切鉴定和测序分析，结果与预期一致，说明成功构建了pet44b-gp120N/IFN-γ原核表达质粒。
2、用纯化后的gp120N和pet44b-gp120N/IFN-γ分别刺激balb/c小鼠，结果表明①IFN-γ发挥了细胞因子的免疫调节作用，增强了机体的特异性抗体分泌水平。IgG在再次免疫应答时分泌的抗体水平要高于初次免疫应答6～8倍。融合组和gp120组要高于对照组，有显著性差异。IgM在初次免疫应答时，融合组和gp120组要高于对照组，有显著性差异，但在再次免疫应答时，分泌量没有显著增加。
②在针对gp120的细胞特异性杀伤作用(CTL)方面，IFN-γ发挥了明显的免疫佐剂作用。gp120N/IFN-γ融合组的CTL杀伤活性要显著高于单独的gp120组，更显著高于对照组。LDH释放法检测CTL％分别为0.48±0.12、0.22±0.09和0.09±0.01，有显著性差异，P＜0.05。
③在gp120抗原诱导的脾淋巴细胞增殖反应方面，IFN-γ也发挥了明显的免疫佐剂作用。表现在融合组高于gp120组，gp120组高于对照组。用OD560值代表，分别为0.93±0.06、0.68±0.06和0.40±0.05，有显著性差异，P＜0.05。
④在Th1型(IFN-γ和IL-2)和Th2型(IL-4和Il-10)细胞因子表达方面，无论是从血清还是上清检测结果看，IFN-γ作为免疫佐剂，均增强了细胞免疫反应，对体液免疫反应则没有显示出调节作用。也即刺激和诱导机体增加了Th1型细胞因子的分泌水平。融合组高于gp120组，又高于对照组，有显著性差异，P＜0.05。而Th2型细胞因子的分泌水平在融合组和gp120组和对照组之间没有显著性差异，P＞0.05。
结论1、成功构建了pet44b-gp120N/IFN-γDNA重组体并成功在原核细胞中进行了蛋白表达。
2、IFN-γ在pet44b-gp120N/IFN-γDNA重组体中发挥了免疫佐剂的作用，增强了特异性抗体的产生，更为显著的是，增强了特异性细胞免疫反应包括CTL作用和Th1型细胞因子分泌水平。
本发明所述gp120/pEGFP-N1的一对引物序列如下表序列表IFN-γ-1TCTCTTGGCT GTTACTGCCAIFN-γ-2ACCTCGAAAC AGCATCTGACgp120-1 ATTCTATGAG TGCTACAGAA AAATTGTGGgp120-2 AGCTTAATTG GCTCAAATGA TAC
权利要求
1.HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于下述步骤(1)根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5’端和3’端分别引入Ecor I和Hind III识别位点A/ATTCT和A/AGCTT，用PCR法高保真扩增gp120N端566bp片段，并纯化PCR产物，备用；(2)参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA po1ymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物回收、纯化后用T-A克隆的方法插入TOPOT-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，作ECOR I单酶切鉴定，得到IFN-γ片段；(3)对gp120片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定，用gp120酶切位点酶切IFN-γ+pet44b质粒，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，并鉴定所得重组质粒；(4)制备BL21(DE3)感受态细胞，取连接产物加入感受态细菌中，转化成功后复苏培养细菌，取菌液，在含氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选单个菌落，摇菌、抽提质粒；(5)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证；(6)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达；(7)冷冻、浓缩并纯化细胞培养上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白。
2.根据权利要求1所述HIV-1 gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于所述gp120/pEGFP-N1的一对引物序列如下hIFN-γsense TCTCTTGGCTGTTACTGCCAantisense ACCTCGAAACAGCATCTGACgp120 sense cggA/ATTCTATGAGTGCTACAGAAAAATTGTGGantisense cccA/AGCTTAATTGGCTCAAATGATAC。
全文摘要
本发明公开了HIV－1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法。通过构建HIV－1gp120N端的三分之一片段与IFN－γ(gp120N/IFN－γ)融合基因的原核表达质粒pet44b－gp120N/IFN－γ，并将该质粒在大肠杆菌(DE3)细胞中进行低温诱导表达和鉴定，本发明成功构建了pet44b－gp120N/IFN－γDNA重组体并成功在原核细胞中进行了蛋白表达。通过在体刺激Balb/c小鼠，检测融合蛋白与单纯gp120蛋白在诱导小鼠免疫反应特别是细胞免疫反应的差异，证明了IFN－γ在gp120N/IFN－γ融合蛋白中发挥了免疫佐剂的作用，增强了特异性抗体的产生，更为显著的是，增强了特异性细胞免疫反应包括CTL作用和Th1型细胞因子分泌水平。
文档编号A61K39/125GK1944644SQ20061005205
公开日2007年4月11日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者吴南屏, 赵刚, 靳昌忠 申请人:浙江大学