专利名称：夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途。
背景技术：
众所周知，血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是老年期痴呆的主要病因，综合各国资料，其65岁以上老年人发病率为1.2％-4.2％。随着社会人口的不断老龄化，患者人数必将进一步提高。现代研究认为其损伤性别可能为①神经递质变化；②自由基损伤；③血管内皮细胞损伤；④细胞因子和黏附分子的异常表达。目前，虽然已有许多具有不同作用机理的化学合成药物应用于临床，但这些药物不仅疗效局限，而且价格十分昂贵。
中药夏天无主要分布于中国的长江流域和台湾地区，很久以来民间就将其用于镇痉止痛、活血去瘀和降压行气。二十世纪七十年代以来，许多研究者利用现代实验手段，对夏天无的药化和药理进行了深入的研究，并取得了有价值的成果。
夏天无总生物碱中包括夏天无碱、比枯枯灵碱、药根碱、α-四氢掌业防已碱和原阿片碱等多种生物碱，其中主要是原阿片碱，含量约占总生物碱的50％以上。
发明内容
本发明目的是提供一种夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途。
本发明的技术方案是夏天无总生物碱提取物大、中、小剂量组灌胃14天后，制备大、小鼠VD模型，各剂量组和模型组进行比较，其学习、记忆能力均有显著提高。提示其对血管性痴呆有一定的预防治疗作用；同时测定模型大鼠大脑皮层AchE、SOD活力和Ach、MDA含量，结果提示其作用机制与提高大脑皮层Ach含量，降低AchE活力及减轻自由基对大脑皮层的神经和血管的损伤有关。
下面结合实施例对本发明作进一步描述具体实施方式
实施例一种夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途。
一、夏天无总生物碱提取物对缺血再灌致小鼠血管性痴呆模型的预防作用血管性痴呆(Vascular dementia，VD)是脑循环障碍所致的全脑或局灶性的脑缺血引起的脑功能低下综合症，本实验采用浅麻醉小鼠双侧颈总动脉反复结扎再灌，建立血管性痴呆模型，结合小鼠跳台实验检测模型小鼠的学习、记忆能力，初步观察夏天无总生物碱提取物对血管性痴呆的预防治疗作用。
材料与方法1实验材料1.1主要材料和药品夏天无总生物碱提取物由罂粟科植物提取，苏州中药研究所提供，总生物碱含量为62.12％。
尼莫地平片剂山东新华制药股份有限公司生产，生产批号0301050。
水合氯醛中国医药集团上海化学试剂公司，批号W200211281.2实验仪器电子精密天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司XZC-5T型跳台测定仪1.3实验动物昆明种雄性小鼠72只，体重28±3g，清洁级。由苏州大学实验动物中心提供，动物合格证号为苏动(环)98008，苏动(质)98018。
2实验方法2.1实验分组及剂量设计小鼠随机分为6组，每组12只，分别为1)正常对照组(control)组2)模型(model)组3)夏天无总生物碱提取物0.25mg/kg(低剂量)组4)夏天无总生物碱提取物0.50mg/kg(中剂量)组5)夏天无总生物碱提取物1.00mg/kg(高剂量)组6)阳性药尼莫地平20.00mg/kg组1)、2)组动物每日用蒸馏水灌胃，其余各组动物用相应药物灌胃，容积为0.1ml/10g体重，连续14天。
2.2动物模型制备[1]给药12天后，小鼠浅麻醉(0.07ml/10g，4％水合氯醛，ip)，行颈部正中切口，分离双侧颈总动脉，用0号缝线以活结结扎10min后再灌注20min，重复3次。假手术组只分离双侧颈总动脉，不阻断血流。实验过程中，温度保持37±0.5℃。术后24h进行学习能力、48h进行记忆能力检测。
2.3小鼠跳台实验行为学检测[2]置小鼠于跳台仪中，适应环境3min，通电，电压40伏，记录跳上平台潜伏期(EL，Escape latency)和5min内遭受的电击数(错误次数，NE)作为学习成绩；24h后，将小鼠置于平台上，通电，记录小鼠跳下平台潜伏期(stepdown latency，SDL)及5min内错误次数，作为记忆成绩。
3数据统计与分析统计学处理实验结果用均数±标准差
表示，组间显著性差异比较采用t检验。
4实验结果夏天无总生物碱提取物对VD小鼠模型学习记忆能力的影响模型组与阴性对照组相比，EL明显延长(P＜0.05)，SDL明显缩短(P＜0.01)，NE明显增加(P＜0.05)。与模型组比较尼莫地平组，夏天无总生物碱提取物各剂量组EL明显缩短(P＜0.05)、SDL明显延长(P＜0.05，P＜0.01)、NE明显减少(P＜0.05)。结果显示夏天无总生物碱提取物大、中、小剂量组学习、记忆成绩均显著提高。(结果详见表1-1)表1-1 夏天无总碱提取物对小鼠血管性痴呆模型行为学影响
n＝12)
P＜0.05，**P＜0.01.vs model group，△P＜0.05，△△P＜0.01.vs controlgroup。
讨论和小结实验结果提示夏天无总生物碱提取物大、中、小剂量组灌胃14天后，各剂量组小鼠学习记忆能力与模型组比较均有明著提高。提示其对血管性痴呆有一定的预防治疗作用。
二、夏天无总生物碱提取物对大鼠血管性痴呆的预防作用第一部分实验已证明夏天无总生物碱提取物对小鼠血管性痴呆模型有一定的预防作用，本实验旨在进一步观察夏天无总生物碱提取物对大鼠VD模型的作用并初步探讨其作用机制。
1实验材料1.1主要试剂和药品夏天无总生物碱提取物由罂粟科植物提取，苏州中药研究所提供，总生物碱含量62.12％尼莫地平片剂山东新华制药股份有限公司，生产批号0301050硝普钠针剂北京双鹤现代医药技术有限责任公司，批号031204三氯化铁国药集团化学试剂有限公司产品，批号QD20040311盐酸羟胺国药集团化学试剂有限公司，批号F20040625三氯乙酸国药集团化学试剂有限公司，批号F20040715氯化乙酰胆碱上海三爱思试剂有限公司，批号20030620氢氧化钠中国福利企业华东公司，批号981012AChE试剂盒南京建成生物工程公司，批号20040624考马斯亮蓝试剂盒南京建成生物工程公司，批号20040530MDA试剂盒南京建成生物工程公司，批号20040614SOD试剂盒南京建成生物工程公司，批号20040614总抗氧化能力试剂盒南京建成生物工程公司，批号200405081.2实验仪器Y型电迷宫张家港医学仪器设备厂产品721型光栅分光光度计江苏科达智能仪器厂生产5174R型冷冻高速离心机德国Eppendorf产品。
1.3实验动物Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠48只，体重260±20g，清洁级。由苏州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号XCYK(苏)2002-008，实验动物使用许可证号SYXK(苏)2002-0037。
2实验方法2.1实验分组及剂量设计大鼠随机分为6组，每组8只，分别为1)正常对照组(control)组2)模型(model)组3)夏天无总生物碱提取物0.125mg/kg(低剂量)组4)夏天无总生物碱提取物0.250mg/kg(中剂量)组5)夏天无总生物碱提取物0.500mg/kg(高剂量)组6)阳性药尼莫地平10.00mg/kg组1)、2)组动物每日用蒸馏水灌胃，其余各组动物用相应药物灌胃，容积为1ml/100g体重，连续14天。
2.2动物模型制备将实验大鼠灌胃给药5天后，按文献[3]以4％的水合氯醛(10ml/kg)腹腔注射麻醉后仰卧固定，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉(CCA)，模型组、夏天无总生物碱提取物各剂量组及阳性对照组在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射2.2％硝普钠的10％葡萄糖溶液(10ml/kg)，随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA10min后，打开血管夹再灌注10min后再夹闭，如此重复3次。缝合伤口，放回笼中置室温下饲养。阴性对照组的麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断CCA，不注射硝普钠。从实验开始至动物麻醉清醒期间保持动物体温在37±0.5℃，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。术后第2天用Y型电迷宫检测学习能力，第9天检测记忆能力。
2.3Y型电迷宫行为学检测Y型电迷宫行为学检测按文献方法进行[4-5]。Y型电迷宫为三等分辐射式反应箱，通过电刺激控制仪电击动物足部，电击电压为75V、延迟时间2秒。反射箱三个臂顶端有信号灯，信号灯亮时此臂无电，另外两臂通电，实验时据动物所在位置设计其起步区左侧为无电安全区。凡大鼠受电击后从起步区直接逃至不通电有信号灯的左侧臂为正确反应，否则为错误反应。测试前将大鼠放置于起步区的反射臂中，不通电，让其在三臂中进行探索，约2分钟后抓至起步区，灯亮后2秒，给予电刺激。直至大鼠最终逃到安全区30秒，熄灯，作为一次测验。在对大鼠进行训练时，记录达到10次测验9次正确的所需次数作为学习成绩。7天后，进行记忆能力检测，每只大鼠检测15次，记录正确反应次数作为记忆成绩。
2.4大脑皮层组织匀浆的制备将检测完记忆能力的大鼠立即处死取脑，分离大脑皮层，按1∶9(W/W)加入预冷的0.9％生理盐水中匀浆，得10％组织匀浆。将组织匀浆液4℃3000rpm离心15分钟，取上清液待测。
2.5生化指标测定方法AChE活力、T-AOC能力、SOD活力、MDA含量及蛋白含量测定，试剂配制及检测方法均按照试剂盒说明书要求进行。ACh含量按照碱性羟胺比色法测定[6-7]。
2.6大脑皮层组织匀浆ACh测定标本的制备取各组大脑皮层匀浆上清液0.7ml，加等量三氯乙酸沉淀蛋白后于4℃，3000rpm离心15分钟，取上清液待用。
3统计学处理数据用均数±标准差
表示，组间差异比较采用t检验4实验结果4.1夏天无总生物碱提取物对VD大鼠学习记忆能力影响模型组与阴性对照组相比，学习成绩和记忆成绩均明显降低(P＜0.05)。夏天无总生物碱提取物小、中剂量组与模型组比较，学习成绩明显提高(P＜0.05)。夏天无总生物碱提取物小、中、大剂量组与模型组比较，记忆成绩明显提高(P＜0.05)(详见表2-1)。
表2-1 夏天无总碱提取物对大鼠血管性痴呆模型行为学影响
n＝8)
△P＜0.05，△△P＜0.01vs control group，*P＜0.05vs model group。
4.2夏天无总生物碱提取物对VD模型大鼠大脑皮层AChE活力、ACh含量的影响与模型组比较，夏天无总生物碱提取物各剂量组可剂量依赖性地显著降低大脑皮层AChE活性(P＜0.05，P＜0.01)，及升高ACh含量(P＜0.05)(详见表2-2)。
表2-2 夏天无总碱提取物对大鼠血管性痴呆模型大脑皮层AChE活力和ACh含量的影响
n＝8)
*P＜0.05，**P＜0.01vs model group，△△P＜0.01vs control group。
4.3夏天无总生物碱提取物对VD模型大鼠大脑皮层总抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力和MDA含量的影响模型组与阴性对照组比较，SOD活力明显降低，MDA含量明显升高(P＜0.05)。与模型组比较，夏天无总生物碱提取物各剂量组可剂量依赖性的显著提高大脑皮层总抗氧化能力(P＜0.05)；升高中、高剂量组大脑内层SOD活力(P＜0.05)，降低MDA含量明显(P＜0.05)(详见表2-3)。
表2-3 夏天无总碱提取物对大鼠血管性痴呆模型大脑皮层(T-AOC)、SOD活力和MDA含量的影响
n＝8)
△P＜0.05vs control group，*P＜0.05vs model group讨论和小结在学习记忆的复杂生理过程中，ACh与记忆、思维和智能状态密切相关，是进行及维持高级神经功能的一种重要介质。已有资料表明，在血管性痴呆的发病过程中，大脑组织中的神经递质明显减少，尤其是大脑皮层的乙酰胆碱及单胺类递质与血管性痴呆的智力下降密切相关[8]，并且VD患者脑脊液中AChE活性亦见明显下降[9]。Tohgi[10]的研究表明，VD患者脑脊液ACh较对照组均降低49％，下降幅度与痴呆程度呈正相关。认为系由于低氧使葡萄糖氧化受阻，丙酮酸生成减少，造成ACh的合成原料乙酰辅酶A减少，从而导致ACh含量降低。
血管性痴呆是多种因素参与的复杂病理过程，而氧自由基引起的组织脂质过氧化损伤是其重要因素之一。冯加纯等[11]认为在大鼠脑缺血再灌注的急性期产生大量的自由基，消耗SOD而使其活性下降；并且自由基的大量产生是迟发性神经元损伤的重要原因。脑缺血后由于ATP生成减少，发生能量代谢障碍，ATP降解为次黄嘌呤，造成次黄嘌呤堆积，同时细胞内Ca2+升高激活蛋白水解酶，使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶；再灌注过程中黄嘌呤氧化酶在大量氧分子的供应下催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤再进一步转化为尿酸，在此过程中产生了大量自由基[12]。一方面，由于反复脑缺血再灌流，使缺血组织不断得到大量新的氧供，激活黄嘌呤氧化酶，产生大量超氧阴离子自由基，引发脂质过氧化“瀑布状”连锁反应和微循环障碍[13]；另一方面，又使缺血期间因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基转化，形成恶性循环。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜和血管，导致蛋白质变性失活，使膜屏障功能受到严重影响，导致脑神经、血管细胞死亡。故氧自由基及其引起的脂质过氧化反应，是缺血再灌注损伤的重要因素之一[14]。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的稳定代谢产物，可间接反应体内过氧化的程度[15]。测定MDA含量可以估计脑组织中氧自由基水平和脂质过氧化反应的强弱。而SOD活性的高低则可反应体内清除氧自由基的能力。
在本文实验条件下，夏天无总生物碱提取物可明显提高实验性VD大鼠的学习、记忆成绩，提示夏天无总生物碱提取物具有一定的预防VD大鼠行为障碍作用。与此同时，测定上述大鼠大脑皮层AChE活力和ACh含量，结果表明夏天无总生物碱提取物可明显提高VD大鼠大脑皮层ACh含量，抑制AChE活力。由此表明，夏天无总生物碱提取物改善VD大鼠行为障碍与其抑制AChE活力，提高大脑皮层ACh含量有关。另外，夏天无总生物碱提取物可明显提高VD大鼠大脑皮层总抗氧化能力SOD活力，并可明显降低MDA含量。由此提示夏天无总生物碱提取物亦可能通过提高脑内抗氧化能力和SOD活性，减少氧自由基的产生，减轻自由基对脑神经和血管细胞的损伤，从而发挥预防VD大鼠行为障碍的发生与发展。
参考文献[1]岑德意等清醒小鼠反复脑损缺血再灌注致学习、记忆障碍模型的建立。中国药理学通报。2000，16(2)220-223[2]张艳等安吉复的促智作用。中国药理学通报。1995，11(3)223-226[3]王蕊，杨秦飞，唐一鹏等 大鼠拟血管性痴呆模型的建立及中药9602防治作用初探 北京中医药大学学报，2000，23(5)30-32[4]徐叔云，卞如濂，陈修 药理实验方法学(M)(第三版) 北京人民卫生出版社。2002810-828。
龙大宏，姚志彬等 神经生长因子对老年痴呆大鼠学习记忆能力的影响中国行为医学科学2001，10(1)4-6[6]鲁祖荪，叶菲，都本业 碱性羟胺比色法测定全血乙酰胆碱 临床检验杂志，1992，10(2)84-85[7]杨会宣，王文学，柯金水等 碱性羟胺比色法测定全血乙酰胆碱 临床检验杂志，1995，13(3)125-126[8]O’Brein MD.The effect of M receptor on dementia[J]Dementia.1994，(5)133[9]Frederickson K，Brun A，Gustafson L. Pure subcorticalarteriosclerotic encephalopathyA clinicopathologic study[J]Cerebro VascDis.1992，282-86[10]Tohgi H，Abe T，Kimura M，et al.Cerebrospinal fluid acetylcholineand choline in vascular dementia of Binswanger and multiple small infarcttypes as compared with Alzheimeer-type dementia.Journal of NeuralTransmission，1996，1031211-1220 冯加纯，饶明俐，张淑琴 自由基在全脑再灌流损伤中的作用机理及保精增智液的保护作用 [J]中风与神经疾病杂志，1995，12(3)135[12]Chan PH.Role of oxidants in ischemic brain damage [J]Stroke.1996，27(6)1124-1129[13]曹仁存 反复性脑缺血与神经元易损伤 国外医学(脑血管疾病分册1995，3(6)293[14]Schmidley JW，Free radicals in central nervous system ischem.Stroke 1990，21(7)1086-90[15]Niki E，Yamato Y，Komouro E，et al.Membrane damage due to lipidoxidation.Am J Clin Nutr 1991，2375-8权利要求
1.一种夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种夏天无总生物碱提取物作为预防治疗血管性痴呆疾病药物的用途，夏天无总生物碱提取物大、中、小剂量组灌胃14天后，以反复脑缺血再灌注法制备大、小鼠VD模型。将各剂量组与模型组的行为学进行比较。发现夏天无总生物碱提取物可明显提高VD大、小鼠模型的学习、记忆能力。同时测定VD大鼠模型大脑皮层AChE、SOD活力和ACh、MDA含量，发现其机制可能与降低大脑皮层AChE活力，提高ACh含量，改善胆碱神经功能，以及提高大脑皮层SOD活力，减轻大脑皮层血管神经过氧化损伤有关，从而发挥对血管性痴呆的预防、治疗作用。
文档编号A61P25/28GK1985896SQ20061016149
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者顾振纶, 张慧灵, 陈伯文, 周文轩, 郭次仪 申请人:苏州中药研究所