一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，属药品技术领域。 技术背景
[0002] 中国发明专利（ZL201210536161. 3) -种治疗过敏性鼻炎和支气管哮喘的药物， 由附子6~18份，甘草9~1份为原料制成(命名为"附甘药物")，对于过敏性鼻炎和支气管哮 喘有很好的疗效。
[0003] 现代研究表明附子中的单酯型生物碱（苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯 甲酰次乌头原碱）是有效成分，现公开的测定单酯型生物碱的含量测定方法很多，但都不 适合于本附甘药物的测定，无法在生产和使用中有效的保证产品的有效性和安全性。
[0004] 《中国药典》2010年版一部中采用的高效液相色谱法测定附子药材中单酯型和双 酯型生物碱，经过反复试验发现，该法测定"附甘药物"中单酯型生物碱含量，杂质分离效果 不好，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱分离度不理想，阴性存在明 显干扰。
[0005] 现有技术乌头总生物碱含量测定方法还有： 酸碱中和法：利用生物碱的碱性，用酸直接滴定或加入定量酸液及指示剂，用氢氧化钠 液回滴定，根据消耗碱液的体积计算出乌头类总生物碱的含量。此方法的优点是简单易行， 不需要很昂贵的仪器设备，容易普及；缺点是操作方法比较麻烦，如果操作的平行性不好， 会使误差较大。
[0006] 酸性染料比色法：利用生物碱和酸性染料(如溴甲酚氯）反应生成的络合物在紫外 光下有吸收，用乌头碱的标准液绘制标准曲线后，根据标准曲线法计算乌头类生物碱的含 量。此方法的优点是灵敏度高、简便、准确快速。缺点是干扰因素多，水相PH值或指示剂配 制、处理均影响呈色稳定性，颜色稳定时间较短，需用对照品绘制标准曲线，且专属性差。
[0007] 导数分光光度法：利用设定不同的求导阶数以清除干扰组分的吸收，直接进行测 定生物碱的含量。此法的优点是灵敏度很高、准确、简便。缺点是选择性差。
[0008] 薄层扫描法：薄层扫描法准确度高，专属性强，重现性好。缺点是精密度低。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是为了提供一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，本发明杂 质与附子生物碱分离效果好，阴性无干扰，苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次 乌头原碱分离度、回收率、重现性、精密度均良好。
[0010] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 本发明所述的一种附甘药物单酯型生物碱的含量测定方法，其特征在于：采用高效液 相色谱法测定，使用以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂的色谱柱(简称：苯基柱)。
[0011] 本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：色谱条件 与系统适用性试验，使用苯基柱，以乙腈：0. 1°/『〇. 2%的磷酸溶液=20~25 : 75~80为流动 相，检测波长为222~242nm，理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于5000 ; 对照品溶液的制备：取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照 品适量，精密称定，分别加乙腈制成每1ml含约0. 2mg的溶液，作为对照品贮备液；分别精密 量取上述对照品贮备液各l〇ml、5ml和5ml，置同一 100mL的量瓶中，用0. 1%~0. 2%的磷酸溶 液稀释至刻度，摇匀，作为固相萃取柱系统适用性试验用对照品溶液；分别精密量取上述对 照品贮备液各3~301111、1~51111、1~51111，置同一 2001111的量瓶中，加乙腈至401111，用0.1%~0.2% 的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，制备成每1ml含苯甲酰新乌头原碱3~30 μ g、苯甲酰乌头原 碱]-5 μ g、苯甲酰次乌头原碱]-5 μ g的对照品溶液； 固相萃取柱系统适用性试验：精密量取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰 次乌头原碱的对照品C备液各l〇ml、5ml和5ml，混匀，室温减压回收至干，用0. lmol/L盐酸 溶液适量溶解并定容至200ml，精密量取10ml，置于处理好的固相萃取柱（以混合型阳离子 交换反相吸附剂为填充剂，l〇〇~200mg，4~8ml，预先依次用乙腈、水各6ml洗脱）上，依次以 水3ml，1. 25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各5ml洗脱，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈 :浓氨试液=90 : 10的混合溶液IOml洗脱，收集洗脱液，于40°C以下减压回收溶剂至干， 残渣加入流动相5ml使溶解，滤过，取续滤液作为固相萃取柱系统适用性试验溶液； 分别精密吸取上述系统适用性试验溶液与对照品溶液各1〇~20μ 1，注入液相色谱 仪，测定，计算系统适用性试验溶液与对照品溶液中各相应成分峰面积的比值，不得小于 0. 95 ； 供试品溶液的制备：取检品研细，称取〇. 2~0. 6g，置具塞锥形瓶中，加入0. lmol/L盐酸 溶液25ml，密塞，超声处理40分钟并时时振摇，后4000转/分钟离心30分钟，滤过，量取续 滤液l〇ml，照固相萃取柱系统适用性试验，自"置于处理好的固相萃取柱"起，依法操作，制 备供试品溶液； 测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1~25 μ 1，注入液相色谱仪，测 定，即得。
[0012] 本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：理论板数 按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于10000。
[0013] 本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：制备供试 品溶液时取样量是〇. 5g。
[0014] 本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试 品溶液的制备过程中，所用固相萃取柱填料为混合型阳离子交换反相吸附剂，规格为 100~200mg，容积为4~8ml，并预先依次用乙腈、水各6ml洗脱处理。
[0015] 本发明所述的一种附甘药物附子生物碱的含量测定方法，其特征在于：供试品溶 液的制备过程中，固相萃取柱的洗脱过程依次为水3ml，1. 25%的氨溶液、水、甲醇、乙腈各 5ml，待洗脱液流尽后，放置5分钟，再用乙腈：浓氨试液=90 : 10的混合溶液IOml洗脱， 收集洗脱液。
[0016] 本发明提供了根据特定的处方制备的附甘药物中单酯型生物碱的含量测定方法； 本发明与现有技术的区别在于采用了苯基柱，相比于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的 色谱柱，其目标成分分离度、峰形、拖尾因子均有了显著改善，且专属性、回收率、重现性、精 密度均好。
[0017] 以下通过试验例和方法学研究进一步说明本发明的有益效果。试验例和方法学研 究旨在进一步说明本发明的有益效果，而非本发明的限制。
[0018] 一、制备样品 1、制备附甘颗粒剂 取附子15kg，甘草6kg，加水煎煮两次，第一次加8倍量水，煎煮2小时，第二次加6倍 量水，煎煮1小时，合并两次煎液，滤过，浓缩、减压干燥，粉碎，加入糊精适量，混匀，湿法制 粒，干燥，整粒，得附甘药物的颗粒剂。
[0019] 2、制备不含附子的阴性颗粒剂 取甘草300g，照制备附甘颗粒剂的方法制成不含附子的阴性颗粒剂