利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法

专利名称：：利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法利用脂肽抵抗细胞凋亡的保护方法发明领域化合物可与辐射防护剂耳笑合给药。辐射防护剂可以是抗氧化剂，例如氨磷汀或维生素E。辐射防护剂也可以是细胞因子，例如干细胞因子。辐射防护剂也可以是鞭毛蛋白、潜在TGF(3(latentTGF卩)或TLR活化剂。附图简述图4表示在用CBLB601或PBS预治疗后，暴露给13Gy总体Y辐射量之后的脾脏大小变化。左图是用PBS和CBLB601治疗的小鼠的脾脏重量图，右图是对照或治疗小鼠的脾脏照片。图9表示不同剂量辐射和不同剂量CBLB601之后的存活率。显示辐射前24小时经肌内给予PBS或0.3、1、3、10或30吗CBLB601/小鼠之后，暴露给IO、11或12GyTBI的小鼠存活百分率图。图14表示在最佳辐射防护条件下，在30天对CBLB601的剂量修饰因子(DoseModificationFactoratday30,DMF30)W判定。表明在辐射前24小时，经肌内给予PBS或3吗CBLB601/小鼠之后,暴露给不同辐射剂量的小鼠存活百分率图。图21表示CBLB612、CBLB614和CBLB615的辐射防护活性。显示辐射前24小时，经肌内给予PBS或不同剂量CBLB612、CBLB614或CBLB615之后，暴露给10GyTBI的小鼠存活率图。术语"给药"当用于描述NF-KB活性的诱导物剂量时，是指诱导物的单剂量或多剂量。本文所用的术语"脂族基"是指非支链、支链或环状烃基，可以是取代或未取代的，也可以是饱和或不饱和的，但是不为芳族基。术语脂族基还包括烃主链中含有一个或多个碳原子被氧、氮、硫或磷原子置换的脂族基。术语"片段"当用于肽或多肽的情况下，可指长度约6个至约10个氨基酸的肽。片段长度可以是6、7、8、9或10个氨基酸。0049j术语"同源物"当用于肽或多肽的情况下，是指共享共同进化祖先的肽或多肽。本文所用的术语"取代"是指从碳上去掉一个或多个氢或其它原子并被额外基团取代的基团。本文的取代基可以被1-5个或1-3个取代基取代。这类取代基的代表性实例包括但不限于脂族基、芳族基、烷基、烯基、炔基、芳基、烷氧基、卣素、芳氧基、羰基、丙烯基、氰基、氨基、硝基、含磷基团、含硫基团、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷硫基羰基、酰基氨基、脒基、亚氨基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯基、烷基亚磺酰基、三氟曱基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、杂芳基、脲氨基、硫代脲氨基、马来酰亚胺基、肟基、亚胺酸酯基(imidate)、环烷基、环烷基羰基、二烷基氨基、芳基环烷基、芳基羰基、芳基烷基羰基、芳基环烷基羰基、芳基次膦酰基、芳基烷基次膦酰基、芳基环烷基次膦酰基、芳基膦酰基、芳基烷基膦酰基、芳基环烷基膦酰基、芳基磺酰基、芳基烷基磺酰基、芳基环烷基磺酰基、其组合及其取代基团。其它增殖性细胞毒剂是诺维本(navelbene)、CPT-ll、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑(letrazole)、卡培他滨、雷洛昔芬(reloxafine)、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)。可治疗的癌症包括4旦不限于以下癌症膀胱癌(包括加速和转移性膀胱癌)、乳癌、结肠癌(包括结肠直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、口腔癌、咽喉癌、食管癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkinslymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burkettslymphoma);髓系造血系统肿瘤，包括急慢性骨髓性白血病、骨髓异常增生综合征、骨髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤(schwannomas);间充质细胞起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横紋肌肉瘤和骨肉瘤；和其它胂瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenodermapigmentosum),角化棘皮瘤(kemtoactanthoma)、精原细胞瘤、曱状腺滤泡癌和畸胎癌。b.对癌症治疗副作用的治疗在分子和细胞水平上，辐射粒子可导致DNA断裂以及DNA、蛋白质、细胞膜和其它大分子结构之间的交联。电离辐射也可通过产生自由基和活性氧中间体(ROS)而导致对细胞组分的再次破坏。多种修复系统抵抗这类破坏，例如可恢复DNA的完整性和保真性的若干DNA修复途径，以及清除自由基和ROS并使氧化蛋白质和脂质还原的抗氧化化学物质和酶。存在细胞关卡系统，以检查DNA缺陷并延迟细胞周期进程，直到修复破坏或达到让细胞生长停滞或程序性细胞死亡(细胞凋亡)的决定。在生物体水平上，中低水平辐射的速效大部分是由细胞死亡引起的，导致辐射引起的炎症。在较高辐射水平上，所谓造血综合征和胃肠综合征导致短期辐射？1起的死亡。造血综合征的特点是造血细胞及其祖细胞的损失，因而使其不能更新血液和淋巴系统。死亡通常是感染(因为免疫抑制)、出血和/或貧血的结果。胃肠综合征的特点是肠上皮大量细胞死亡，尤其是在小肠，继而肠壁破裂并因菌血症和脓毒病而死亡。造血综合征在低辐射剂量时就可表现出来，导致比胃肠综合征更迟发的死亡。极高剂量的辐射可通过诱发神经变性而导致几乎立即死亡。在细胞水平上，NF-KB诱导物具有强烈促生存活性，可用于治疗天然辐射事件、低剂量辐射暴露、作为癌症治疗组成部分的辐射给予或核事故所带来的效应。此外，因为NF-kB诱导物是通过与所有现在已知辐射防护剂都不同的机制起作用，所以它们可用于与其它辐射防护剂联用，因而极大提高了对机体免遭电离辐射的保护程度。从历史上看，辐射防护剂一直是抗氧化剂和自由基清除剂，无论是合成的还是天然的。最近，已将细胞因子和生长因子添加到辐射防护剂的列表中；认为其辐射防护机制是因为它们对敏感组织再生的促进作用。两组辐射防护剂之间并无明确的功能上的区别，然而，因为某些细胞因子诱导细胞抗氧化蛋白(例如锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和金属硫蛋白)的表达，所以它们的使用是有利的。辐射防护剂可以是治疗辐射暴露效应的任何药物，包括但不限于抗氧化剂、自由基清除剂、细胞因子、鞭毛蛋白和潜在TGF卩。可以使用的抗氧化剂和自由基清除剂包括但不限于硫醇类，例如半胱氨酸、半胱胺、谷胱甘肽和胆红素；氨磷汀(WR-2721);维生素A;维生素C;维生素E;和黄酮类，例如印度圣罗勒(Oc/^wm^""ww)、荭草素和葫，巴苷(vicenin)。细胞因子和生长因子通过补充和/或保护辐射敏感干细胞群体而赋予辐射防护作用。可使用的细胞因子包括干细胞因子(SCF,c-kit配体)、Flt-3配体、白介素-1片段IL-lb-rd和角质形成细胞生长因子(KGF)。一些其它因子(而不是天然细胞因子)可刺激免疫细胞增殖，因此也可以使用。这些因子包括5-AED(5-雄烯二醇)和合成化合物，前者是刺激细胞因子表达的甾体，后者例如三氯(二氧代亚乙基-O，O'-)碲酸铵(AS-lOl)。潜在TGF(3、鞭毛蛋白和鞭毛蛋白衍生物是NF-kB活性的强诱导物，参见国际专利申请号PCT/US2004/040656和PCT/US2004/040753，以及美国专利申请号60/693,826，所述文献的内容都通过引用结合到本文中。4.组合物本文所提供的组合物可以是液体制剂，包括但不限于水性或油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂和酏剂。组合物也可以配制成干产品，在临用前用水或其它合适溶媒进行配制。这类液体制剂可含有添加剂，包括但不限于悬浮剂、乳化剂、非水溶媒和防腐剂。悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧曱基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂。乳化剂包括但不限于卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯和阿拉伯胶。非水溶媒包括但不限于食用油、杏仁油、分馏椰子油、油脂、丙二醇和乙醇。防腐剂包括但不限于对羟基苯曱酸甲酯、对羟基笨曱酸丙酯和山梨酸。治疗用所需药物的治疗有效量因所治疗疾病的特性、诱导NF-kB活性的所需时间长短、患者年龄和疾病的不同而异，最终由主治医师来判定。然而，一般而言，用于成人治疗的通常剂量范围为0.001mg/kg/天至约200mg/kg/天。剂量可以为约1pg/kg/天至约100吗/kg/天。所需剂量可以按单剂量方便地给予，或者按多剂量以合适时间间隔给予，例如每天2、3、4或更多次分次剂量。通常需要多剂量，因为一旦不再给药，正常细胞内NF-kB活性会下降。为了进一步检查p53在GI综合征中的作用，将野生型和p53缺陷型小鼠暴露给低(I0Gy)和高(15Gy)剂量的y辐射。如图lb所示，p53缺陷型小鼠对能因HP综合征杀死的低剂量辐射具有抗性，但是对能因GI综合征杀死的较高剂量辐射却敏感得多。在15Gy剂量的y辐射之后O、24、48、72和96小时，用苏木精-伊红染色的野生型和p53失效型小鼠小肠石蜡切片示于图ld。p53缺陷型小鼠表现出加速上皮细胞损伤。24小时的隐窝TUNEL染色表明细胞凋亡在野生型中是明显的，但在p53缺陷型上皮却不明显。为了进一步检查，使野生型小鼠暴露给11Gy总体辐射量，然后在12小时后注射1.5x107来自同基因型C57B1/6J的野生型或p53失效型小鼠的骨髓细胞。(该辐射剂量在非再生对照小鼠中引起100%致死率)。两个月后，当造血系统完全恢复，这两组动物用15Gy总体y辐射量进行治疗。如图lc所示，这两组骨髓p53状态不同的小鼠之间的死亡率没有差异(两者都具有野生型肠细胞)。进一步检查了野生型和p53失效型小鼠的小肠的细胞增殖和细胞存活动力学。4周龄野生型和p53失效型小鼠经腹膜内注射MC-胸苷(10fiCi/动物)，然后将每组中的半数动物暴露给15Gy丫辐射。总体切片的方文射自显影表明，24小时后p53缺陷型小鼠中肠隐窝细胞继续增殖，而野生型小鼠中肠隐窝细胞却是静息的(图2a，左)。4周龄野生型和p53失效型小鼠用15Gyy辐射治疗，并在处死前2小时给其注射BrdU(50mg/kg)，对肠进行免疫染色。辐射后24小时，p53失效型小鼠中有许多增殖细胞，但是在野生型小鼠中却几乎没有。相比之下，在96小时，在p53失效型小鼠中几乎没有增殖细胞，而野生型小鼠则表现出更多标记细胞。通过改变给药和辐射间的时间，确定肌内给予CBLB601的最佳计划。在TBI之前24小时、6小时、3小时和1小时以及在TBI之后+1小时、+3小时、以及在TBI之前48小时、36小时、24小时、12小时和6小时,ICR小鼠经i.m.注射3吗CBLB601/小鼠(图12A)(图12B)。这些实验表明，类似于腹膜内给药途径，肌内给予CBLB601的最佳时间为10GyTBI之前24小时。在10GyTBI之后(lh和3h)经肌内给予3吗CBLB610/小鼠没有保护效果(图12A)。此外，在10GyTBI之后1小时，经i.m.注射更高剂量的CBLB601(10和30ng/小鼠)导致联合毒性水平增加(图13C)。这些数据概述于图13。为了确定DMF(剂量修正系数(dosemodificationfactor)),在辐射之前24小时经i.m.注射3吗CBLB601/小鼠，而对照小鼠注射PBS。注射药物组和对照组都接受单剂量TBI，剂量范围包括在所选时间间隔内(对于胃肠综合征死亡为7天，而对于造血综合症死亡为30天)引起10-90%死亡率的剂量。绘制死亡率-辐射剂量图，用概率单位(probit)或对数单位(logit)统计学分析求出LD50/7和LD50/30(分别为7天和30天的LD5())。计算DMF(也称为剂量换算系数(dosereductionfactor),DRF),为所选存活时间点(7天或30天)的辐射CBLB601治疗组小鼠的辐射LDso和溶媒治疗组小鼠的辐射LDso的比率。为了求出DMF3o(辐射后30天的DMF),测定用PBS治疗小鼠或用3|igCBLB601治疗小鼠的辐射1^)50/30值。为此，注射PBS组接受6、6.5、7和7.7Gy剂量的TBI辐射，而注射CBLB601组接受10、10,5、11、11.5和12Gy剂量的TBI。用ProBit分析求出CBLB601的LD50/30,估计范围在11.07-11.61Gy，平均为约11.32Gy(参见图14)。然而，在对照小鼠中与对某些辐射剂量反应有矛盾(在30天7Gy看来无毒，而6.5Gy却引起60。/。死亡率)，无法准确计算CBLB601的DMF30。然而，预期ICR小鼠的LD，3。约为7Gy[大多数小鼠品系的平均值；Monobe等,RadiotherOncology73增刊2:S12709，2004)]。因此，对CBLB601而言的DMF犯值粗略估计为约1.6。实施例4CBLB601从致死剂量TBI中拯救出来的小鼠的免疫状态0119!给予CBLB601而从10GyTBI中拯救出来的小鼠可具有受损的免疫系统，因此不能"正常，，生活。为了检查它们的免疫系统状态，给ICR小鼠注射(i.m.)3jagCBLB601/小鼠或PBS之后24小时，使其暴露给致死(IOGy)或非致死(6Gy)剂量的TBI。正好在第3天处死每种条件的一组5只小鼠，取出它们的脾脏和胸腺并称重。脾脏重量按相应动物的体重标准化，结果见图15。暴露给6Gy辐射并经PBS治疗的小鼠需要约13-14天才能使其脾脏恢复到正常重量，而暴露给6Gy辐射并经CBLB601治疗小鼠到第8天就具有正常脾脏重量。暴露给10GyTBI的注射PBS的动物不能存活，而注射CBLB601的小鼠不仅在暴露给致死辐射后可以存活，而且在辐射后13-14天还可以完全恢复脾脏重量。需要更长时间(约30天)使其胸腺恢复到正常重量(未显示)。[0120在辐射后3、10和30天，经显微镜检查对照和CBLB601注射小鼠脾脏和胸腺的形态变化。辐射之后3天，10Gy总体辐射量的对照和CBLB601治疗小鼠的脾脏和胸腺显示辐射引起的损害，包括脾脏和胸腺的中重度或重度淋巴耗竭，以及脾脏的重度红髓萎缩。在辐射后10天，与对照动物相比，CBLB601治疗动物在脾脏红髓萎缩方面表现出改善；所有CBLB601治疗动物都表现出轻中度多灶性骨髓外造血(EMH)，而对照则都没有表现出EMH。在第10天，这两组都未表现出明显的脾脏白髓耗竭恢复。在第10天，这两组的胸腺再生淋巴增生都很明显，CBLB601治疗小鼠中的再生比对照稍快一些。在辐射后30天，所有动物都有正常脾脏红髓，大多数动物的淋巴元件都完全或几乎完全恢复，所有动物都有基本正常的胸腺。[01211为了检测由CBLB601从致死剂量丫辐射(IOGyTBI)中拯救的d、鼠的免疫应答，几组这样的'J、鼠接受强抗原(即沙门氏菌鞭毛蛋白)的免疫。辐射后8、18或20周，小鼠接受初次免疫，在此时它们分别为18、25和33周龄。29周龄的未经辐射的首次用于实验的小鼠用作免疫应答的阳性对照。小鼠在初次免疫后l周接受鞭毛蛋白加强免疫，而且小鼠在第2次加强免疫后3周接受再次加强免疫；测定小鼠血清中的抗鞭毛蛋白抗体效价。为了检测第二次免疫应答，在l月后再次给小鼠放血，以确保抗体效价下降。接着再进行第3次抗原加强注射，并在10天后测定抗鞭毛蛋白抗体效价。在第3次加强免疫时，辐射小鼠为38、30和23周龄，而对照小鼠为34周龄。[0122初次免疫后1个月(初次加强免疫后3周)的免疫应答见图16A。CBLN601治疗的辐射小鼠建立了针对鞭毛蛋白的强化体液免疫应答，但无法与首次用于实验的对照小鼠的免疫应答区分开。看来免疫应答水平也不依赖于辐射后的时间，因为所有组都表现出良好应答。尽管在辐射后20周组中有某些个别变异，但是众所周知，在年龄较大的动物中免疫应答可能受损。在第一次放血后1个月再次检查抗体效价，它们在免疫后7周仍然升高(图16B)。第二次免疫应答(图16C)比第一次应答更强烈(图16A)。这些数据充分表明，CBLB601不仅从致死TBI中拯救了小鼠，而且还让功能性免疫系统完全恢复。实施例5其它脂肽对NF-KB的活化和辐射防护作用[0123合成额外脂肽并检测对NF-kB的活化作用以及对接受致死剂量辐射的小鼠的保护能力。化合物的名称及其关键性成分见表4。对于某些化合物而言，也合成相应的游离肽并对其进行了测试。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>0124在表达TLR2/YLR6异型二聚体的293细胞中测定了NF-kB依赖性报道分子的活性。比较了CBLB613与CBLN601对NF-kB的体外活化作用(图17)。化合物CBLB614和CBLB65都具有CBLB612肽的连续短衍生物(参见表4)。所有3种化合物都活化NF-kb报道分子，而且所有3种都是比CBLB601更好的活化剂(图18A,B)。非棕榈酰化相应肽都不能活化NF-kB报道分子(图18B)。CBLB617的肽组分具有(-4)电荷，可阻止其与带负电荷的细胞表面标记相互作用。比较了CBLB617与CBLB601对NF-kB的活化作用(图19)。表5概述了所有化合物的体外活性和溶解度。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>[01251也测定了某些化合物的体内辐射防护活性。ICR小鼠经肌内给予不同剂量的试验化合物，然后在24小时后，使小鼠暴露给10GyTBI。监测存活率达30天。图20显示CBLB613的保护活性。10、30和82.5|ig剂量的CBLB613/小鼠与辐射联用时提供100%的保护性，而且无毒(与CBLB601相比)。也测定了相关化合物CBLB612、CBLB614和CBLB615针对10GyTBI的辐射防护活性。辐射前24小时，将l、3、10和30吗剂量/小鼠(也测定了60吗CBLB612/小鼠)经i.m.注射ICR小鼠。如图21所示，所有3种化合物当给予最高剂量时都提供90-100%辐射防护作用。辐射防护作用明显是剂量依赖性的，与辐射联用无毒。化合物的效力为CBLB612>CBLB614>CBLB615。目前使用标准方法评价CBLB617的辐射防护活性。13天后，在最高剂量没有可见毒性(87.5吗/小鼠)，而在10-87.5吗/小鼠剂量时存活率分别为7-90%。总之，与CBLB601相比，CBLB612和CBLB613明显是更好的辐射防护剂，它们的治疗指数更高(对于CBLB612和CBLB613为约20，而对于CBLB601为3)。[01261也检查,了CBLB612作为低剂量辐射损伤緩和剂的能力。为此，在暴露给8.5、9或10GyTBI之后1小时经肌内注射50昭CBLB612/小鼠。用CBLB612治疗，能提高各剂量辐射的存活率(图22)。例如，在8.5Gy时，90%CBLB612治疗小鼠和50%PBS治疗小鼠存活27天&=0.03)，并且，在9Gy时，70%CBLB612治疗小鼠和50%PBS治疗小鼠存活27天&=0.0006)。CBLB612治疗组与对照组之间在更低辐射剂量时没有差异，因为对照小鼠存活率低(未显示)。这些数据表明，CBLB612可用作辐射緩和剂以及辐射防护剂。权利要求1.一种保护哺乳动物免受一种或多种触发细胞凋亡的治疗或条件影响的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物包含药用有效量的下式化合物的组合物id="icf0001"file="A2006800293360002C1.gif"wi="50"he="61"top="53"left="70"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，R1代表H或-CO-R4，R2、R3和R4独立地为H或任选取代的C8-C16脂族基；X为肽；和Z为S或CH2。2.权利要求1的方法，其中所述条件选自辐射、创伤、中毒、感染和温度休克。3.权利要求2的方法，其中所述条件是辐射。4.权利要求l的方法，其中所述治疗是癌症治疗。5.权利要求4的方法，其中所述治疗是化疗或放疗。6.权利要求l的方法，其中所述肽是SEQIDNO:21。7.权利要求l的方法，其中所述肽包括SEQIDNO:1-52中的任一序列。-8.权利要求l的方法，其中所述肽的前5个氨基酸选自表2中所示位置上的氨基酸。9.权利要求l的方法，其中所述肽包括选自SEQIDNO:8、16、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>17、18、20和21的序列及其取代序列。10.权利要求9的方法，其中R,为H,112和113为ds脂族基或其取代基团。11.权利要求l的方法，其中所述化合物为RR立体异构体或RS立体异构体或其混合物。12.权利要求1的方法，其中所述化合物具有下式结构、N13.权利要求3的方法，其中所述组合物与辐射防护剂联合给药。14.权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是抗氧化剂。15.权利要求14的方法，其中所述抗氧化剂选自氨磷汀和维生素E。16.权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是细胞因子。17.权利要求16的方法，其中所述细胞因子是干细胞因子。18.权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是鞭毛蛋白。19.权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是潜在TGF卩。20.权利要求13的方法，其中所述辐射防护剂是TLR活化剂。21.权利要求1的方法，其中在选自以下的组织中触发细胞凋亡脾、胸腺、胃肠道、肺、肾、肝、心血管系统、血管内皮、中枢神经系统、周围神经系统、造血祖细胞(骨髓)、免疫系统、毛囊和生殖系统。OOS.S6H似25全文摘要描述了脂肽作为NF-κB诱导物在保护哺乳动物免受细胞凋亡影响中的用途。文档编号A61K38/10GK101242852SQ200680029336公开日2008年8月13日申请日期2006年6月13日优先权日2005年6月13日发明者A·N·沙克霍夫,A·古德科夫申请人:克里夫兰生物实验室公司;克里夫兰诊所基金会