专利名称：治疗炎性肠病的制作方法
治疗炎性肠病发明领域本发明涉及治疗炎性肠病的方法和实施该方法的手段。 发明背景缺少对炎性肠病(IBD)，例如克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的永久性治愈 方法。在瑞典，每年有1400位新患者诊断患有IBD，其发病率峰值出现在20岁， 从而导致终身要用副作用严重的肾上腺皮质素和/或免疫抑制药物治疗。此外，IBD 常导致外科肠切除术和永久的小孔(stoma)，这是主要的不利之处。溃疡性结肠炎 还增加了大肠癌症的风险。据认为，IBD是针对通常无害的粘膜抗原的免疫应答异常所致的自身免疫疾 病。根据其中涉及的细胞因子，CD炎症被鉴定为丁Hl细胞介导的免疫应答。有人 提出UC具有th2细胞介导的应答，虽然这尚未清楚地证实(Fuss I J等，1996. J. Immunol. 157:1261-70; MullinGE等，1996. Inflamm. Bowel Dis. 2:16-26)。细胞因子用作免疫应答的调节剂，因为它们刺激所涉及的细胞元件分化和增 殖。CD4+辅助T细胞可分化成两种主要的效应细胞亚群，用IL-12刺激时的TH1 和用IL-4刺激时的TH2。 TH1细胞分泌IFN-y从而刺激了抵御胞内微生物，例如 病毒或胞内细菌的吞噬细胞和溶细胞性T细胞依赖性反应。TH2细胞分泌IL-4 和IL-5从而刺激了抵御寄生虫的嗜曙红细胞/肥大细胞介导的防御机制和IgE 产生。th2还起到下调TH1应答的功能。发明目的本发明的一个目的是提供治愈炎性肠病或至少长期控制该病的方法。 本发明的另一目的是提供该方法中所用的手段。通过以下发明概述、说明本发明的许多附图、其优选实施方式描述以及随附 的权利要求书可了解其它目的。发明概述本发明基于这样一种发现，即，给予从患者的前哨淋巴结(sentinel lymph node) 收集并体外扩增的调节性T细胞(Treg)能永久性治愈(permanently cure)炎性肠病， 特别是克罗恩病和/或溃疡性结肠炎，或至少将其维持在不活动或不活跃的状态。 从而能减轻，甚至完全抑制肠炎症，而不用求助例如皮质类固醇等药物。将免疫系统对口服给予的抗原无反应定义为口服耐受。很明显，该机制防止 了针对肠道内含物的不适当免疫反应，据信该机制由至少两种途径介导第一，作 为T辅助细胞家族(CD4+)成员的调节性T细胞(Treg， CD4+CD25+)的活化；第二， 诱导T细胞的克隆排除或无反应性。推测负责低剂量抗原接触耐受的第一种途径 发生在局部肠道淋巴系统，其依赖于细胞因子TGF-p的产生。推测第二种(排除) 途径发生在系统淋巴组织中，由滤过性抗原(filtered antigen)激发，并与对没有免 疫佐剂存在下静脉内给予的抗原的诱导耐受的机制相似。后一种耐受机制看来在接 触高剂量抗原后更突出。T细胞活化受到严格调节，从而通过避免如自身免疫中所见的过分和错误导向 的免疫应答而能在免疫系统中维持平衡。在克罗恩病患者中，肠系膜淋巴结极度增 大是T细胞活化不受控的标志。因为IBD是一种炎症，毗邻炎性部位的肠系膜淋巴结主要负责该部位的引流。 处于沿炎性区域的直接途径上的第一批淋巴结称为前哨淋巴结。按照本发明的第一优选方面，从引流IBD肠节段的患者淋巴结(前哨淋巴结) 收集活化状态的调节性T细胞，体外扩增并重新输注入该患者中。按照本发明的第二优选方面，从引流健康肠节段，即未受IBD影响的肠节段 的患者淋巴结收集非活化状态的调节性T细胞，体外扩增并重新输注入该患者中。 如此收集的活化以及非活化的调节性T细胞可以被合适的物质，例如细胞因子在 体外(进一步)活化。按照本发明的第三优选方面，分别从引流患或未患IBD的肠节段的淋巴结收 集活化状态或非活化状态的调节性T细胞并体外扩增。扩增可以是连续或有间隔 的，例如间插有休息期的阶段。联用一种或多种细胞因子和炎性肠节段的抗原提取 物来活化(剌激)扩增的调节性T细胞。或者，在扩增前或各扩增阶段之间以这种方式活化(刺激)从引流患或未患IBD的肠节段的淋巴结收集调节性T细胞。选自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-P、 TSLP的一种细胞因子，优选两种或多种细胞因子，例如 含有IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-P，特别是TGF-)31、 TSLP的细胞因子混合物可 与炎性肠节段的抗原提取物联用以获得Treg活化。还优选利用抗-CD3、抗 -CD28和雷帕霉素提供补充Treg活化(additional Treg activation)。扩增后，将扩 增和活化的调节性T细胞重新输注入该患者中。用自体调节性T细胞的优点在于副作用低，甚至没有副作用而且疗效高。按照第三优选方面的第一种改变形式，从引流患或未患IBD肠节段的克罗恩 病患者淋巴结收集活化状态的调节性T细胞，联用炎性部位的抗原提取物和用于 扩增的低剂量细胞因子IL-2来活化，优选再联用抗IFN-Y和/或TNF-a的抗体，从 而能抑制Th1偏移(skewing)和TH2扩增。还优选以一定间隔，例如每天到每5 天，特别是在1周或更长时期内，特别是在3-4周时期内每天条件化(condition)培 养基。由此获得了 TH2细胞群，该细胞群可用于自身输血从而在患者中建立 TH1/TH2平衡。用CD3抗体补充活化可支持扩增。为改善TH2偏移，扩增中还可 联用抗CD28抗体和抗IL-12抗体。按照第三优选方面的第二种改变形式，从引流患或未患IBD肠节段的溃疡性 结肠炎患者淋巴结收集活化状态的调节性T细胞，联用炎性部位的抗原提取物和 用于扩增的细胞因子IL-2、 IL-12及IFN-ot中的一种或多种(优选再联用抗IL-4和/ 或抗IL-10抗体)来活化。还优选以一定间隔，例如每天到每5天，特别是在1周 或更长时期内，特别是在3-4周时期内每天条件化培养基。可以提供额外的刺激， 例如CD3和CD28，特别是接近扩增期结束时。本发明的第四优选方面提供了用药学上可接受的载体配制的一种或多种细胞 因子，来体外活化从IBD患者，特别是受IBD影响的前哨淋巴结收集的调节性T 细胞。本发明的第五优选方面提供一种获得引流IBD肠节段的前哨淋巴结的方法， 该方法包括将淋巴染色试剂，例如专利蓝(patent blue)注射入IBD患者肠道的病损 区域，鉴定该试剂染色的淋巴组织，任选用缝线标记该染色组织并切除该染色组织。 仔细研究切除的组织(例如用显微镜检查)，继而将引流IBD肠节段的前哨淋巴结从 组织上切下。本发明的第六优选方面提供一种从引流IBD肠节段的前哨淋巴结分离调节性 T细胞的方法，该方法包括对该淋巴结施加压力，收集由此被挤出该淋巴结的细胞 混悬液，并分离该混悬液的调节性T细胞。本发明的第七优选方面提供从引流IBD肠节段的前哨淋巴结分离的调节性T 细胞。随附的权利要求书包括了本发明的其它优选方面。下文将参考由许多
的本发明优选但非限制性的实施方式来更详细地 解释本发明。附图简述图1显示通过两种表面标记的表达鉴定了 Treg样品中活化的Treg; 图2显示了功能性Treg试验；图3显示了提取自扩增的Treg的mRNA的RT-PCR试验； 图4显示了扩增前后Treg群的调节能力。图5显示了发炎的肠切片的内源性提取物对人免疫细胞的活化作用。 图6显示源自前哨淋巴结的类似活化的Treg的剂量响应。 图7显示了作为TH2标记的CCR5的表达。 图8显示了 UC患者的Treg中IL-4的分泌。 图9显示了 CD患者的Treg中IFN-y的分泌。优选实施方式描述实施例l.鉴定引流炎性肠节段的前哨淋巴结前哨淋巴结技术已应用了十年，其对恶性肿瘤，主要是恶性黑色素瘤和乳 腺癌进行疾病分期(staging)。利用注射入肠道中病损区域的淋巴染色试剂，例 如专利蓝(CAS 129-17-9)和专利蓝V (CAS 3536-49-0;常以钙螯合的二聚体提 供)描绘癌症的淋巴引流液，从而在外科手术期间鉴定前哨淋巴结。利用缝线或 其它手段标记如此鉴定的前哨淋巴结。然后以常规方式切除肠道病损以及未受 影响的边缘区和肠系膜，包括血管和局部淋巴结。仔细研究切除的组织，鉴定并除去前哨淋巴结。该方法应用于溃疡性结肠炎或克罗恩病患者中引流发炎和未受影响肠道 的前哨淋巴结。此外，收集患者的静脉血样品。然后在实验室中处理外周血样 品、淋巴结和炎性病损的样本以及未受疾病影响的肠道节段的样本以进行免疫学分析和T细胞扩增。利用菲科尔-泛影钠(Ficoll-Hypaque)(法玛西亚安玛山姆 公司(Pharmacia， Amersham))纯化外周血白细胞(PBL)。利用松散配合的玻璃匀 桨器(loose fit glass homogenizer)轻柔施压以获得淋巴结细胞的单细胞悬液。用 杜恩斯(Do皿ce)匀浆器匀浆组织片段，97'C变性5分钟来制备肠道样品的抗原 提取物。然后对这些细胞进行功能分析。实施例2.分离T细胞群利用瑞典乌普萨拉市安玛山姆生物科技公司(Amersham Biosciences, Uppsala， Sweden)的菲科尔-泛影钠正(Ficoll-Hypaque Plus)纯化血液样品或暗黄 层的淋巴细胞和单核细胞。用PBS稀释所研究的暗黄层或血液样品，将其小心 地层叠在菲科尔-泛影钠溶液上，然后以400 g离心该两相系统30分钟。在菲 科尔溶液和血浆之间的中间相收集淋巴细胞和单核细胞，而红细胞和粒细胞在 试管的底部获得。利用巴斯德移液管(Pasteurpipette)取出淋巴细胞层，用HBSS 洗涤这些细胞以除去过量的菲科尔-泛影钠正、血浆和血小板。不立即使用这些 细胞时，将它们37i:保存在含有10 % HuS、 1% PeSt和1%谷氨酰胺的RPMI 培养基中。利用德国伯格施格拉德巴赫市米尔泰尼生物科技公司(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)的自动MACS分离器(autoMACS Separator) 纯化常规的CD4+Th细胞和CD4+CD25+细胞。计数细胞，300 g离心10分钟， 完全吸出上清液，按照每107个细胞用90pLMACS缓冲液(PBS配制的0.5。/。 BSA、 2mMEDTA、 0.01 %叠氮钠)和10 pL生物素-抗体混合物来溶解细胞。 这样所有非CD40+细胞群均被标记。4。C培育10分钟后，每107个细胞加入20 抗-生物素微珠，4"C再培育15分钟。用约20体积的MACS缓冲液洗涤细 胞，300 g离心10分钟，完全除去上清液，按照每108个细胞用500 |iL MACS 缓冲液来重悬细胞。用自动1\4八€8分离器进行磁性分离以消除样品中的非004+ 细胞。为分离CD4VCD25+细胞与CD4+细胞群，计数CD4+细胞，300 g离心10分钟，完全除去上清液，按照107个细胞用90nLMACS缓冲液和10pLCD25 微珠来溶解沉淀物。4。C培育15分钟后，如上所述洗涤细胞，用自动MACS分 离器进行正向选择来分离CD25+细胞。通过流式细胞术分析所有细胞群的等份 试样。实施例3.通过流式细胞术表征细胞采用流式细胞术(FACS)研究分离的细胞群上不同表面标记的表达。将细胞 分配入4 mL FACS试管，用2 mL FACS缓冲液(用PBS配制的2% FCS、0.05% 叠氮钠)洗涤，30Og离心10分钟，倒去上清液，将沉淀物重悬在100pLFACS 缓冲液中。加入7 pL待用的各抗体，4'C培育至少30分钟，进而再用FACS 缓冲液洗涤细胞一次，如上所述离心并重悬在1 mL用于细胞固定和红细胞裂 解的FACS裂解溶液中，混合，4'C培育10分钟，然后再次如上所述洗涤和离 心一次。倒去上清液，按每试管用500)nLFACS缓冲液重悬细胞，然后利用美 国新泽西州富兰克林湖市(Fmnklin Lakes, NJ， USA)的贝克坦迪金森公司FACS 校验仪(Becton Dickinson FACSCalibur instrument)进行分析。实施例4.增殖试验研究了纯化的CD4+CD25+细胞的抑制能力。37。C用25 PBS配制的5 pg/mL抗-CD3 IgG温育圆底96-孔板90分钟。用200 fiL PBS洗涤各孔3次， 然后加入3种不同的细胞群。每孔加入用25 Gy照射的100 500,000细胞/mL CD4-细胞连同30 000 CD4+CD25-应答细胞和1 pg/mL可溶性CD28 (终浓度)。 将不同数量的CD4+CD25+细胞加入各孔，从而产生许多不同的CD4+CD257 CD4+CD25+细胞比例。将相同数量的CD4+CD25'细胞加入一组额外孔中的应答 细胞作为对照。将各板维持于37'C 4或5天，然后向各孔中加入1 ^Ci[3H]胸腺嘧啶，各 板温育18小时，然后在-2(TC冷冻。融化细胞，用美国康涅狄格州哈姆登市汤 姆技术公司(TOMTEC， Hamden， CT， USA)的细胞收集器将孔内含物转移至芬 兰土尔库市华莱士公司(Wallac， Turku， Finland)的玻璃纤维滤膜。将芬兰土尔 库市华莱士公司的MeltiLex A-融化闪烁器片(Melt-on scintillator sheet)置于该滤膜的顶端，85。C融化。利用芬兰土尔库市华莱士公司的1205贝塔普雷特液 体闪烁计数器(1205 Betaplate Liquid Scintillation Counter)检测放射性。实施例5. FoxP3的TGF-J31诱导如上所述从暗黄层制备CD4+CD25'细胞。制备不同供体的PBMC，并照射 (25Gy)。然后在含或不含lng/mLTGF-pi的6-孔板中，按照2mL/孔的体积用 1.25X1()6个PBMC同种异型活化(allo-activate)3Xl()6个CD4+细胞。各板维持 于37"C。取细胞样品进行流式细胞术分析，在第2、 5和7天提取RNA。实施例6. RNA提取和cDNA合成如下所述从不同细胞群提取RNA用于随后的PCR试验。按照每5-6X106 个细胞用lmL美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市英杰公司(Invitrogen， Carlsbad， CA， USA)的TRIzol来裂解细胞，然后立即于-70。C冷冻保存样品，或在室温培 育5分钟，再按照每mLTRIzol试剂0.2mL的用量加入氯仿，剧烈振荡试管。 2-3分钟后，在4。C以12,000 g离心15分钟。将透明的水相转移至新试管，第 一步骤中每用1 mL TRIzol，则用0.5 mL异丙醇沉淀RNA,室温下培育RNA 10 分钟，然后在4。C以12,000 g离心IO分钟。除去上清液，第一步骤中每用lmL TRIzol，则用1 mL75。/。的乙醇洗涤沉淀物。旋振各试管，4°C以7,500 g离心5 分钟，随后短时风干沉淀物(5-10分钟)，溶解于不含RNA酶的水中，55"C培育 10分钟。按照生产商的方案利用美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市拜尔雷得公司 (Bio-Rad， Hercules， CA， USA)的艾斯克利普特cDNA合成试剂盒(iScript cDNA Synthesis Kit)合成cDNA。实施例7.聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCRPCR利用不同细胞群的合成的cDNA。 PCR的目的是检测FoxP3、 GAPDH 和RNA聚合酶II CRPII)的表达。引物购自瑞典胡丁厄市赛博基因AB公司 (Cybergene AB， Huddinge， Sweden)。其序列为FoxP3，正向誦CAGCACATTCCCA GAGTTCCTC ，反向-GCGTGTGAACCAGTGGTAGATC; GAPDH ，正向-GAAG GTGAAGGTCGGAGTC ，反向-GAAGATGGTGATGGGATTTC; RPII ，正向-GCACCACGTCCAATGACAT，反向-GTGCGGCTGCTTCCATAA。常规PCR使用 德国法兰克福市新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs， Frankfurt am Main, Germany)的ThermoPol反应缓冲液和Tag DNA聚合酶，而定量实时PCR 使用美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市拜尔雷得公司的iQSYBR绿超级混合物 (iQSYBR Green Supermix)。按照以下方案分别用美国加利福尼亚州赫拉克勒斯 市拜尔雷得公司的麦萨克勒尔热循环仪(MyCycler Thermal Cycler)和艾萨克勒 尔iQ实时PCR检测系统(iCycler iQ Real-Time PCR Detection System)进行反应 95°C、 30秒，48-65°C、 30秒和72。C、 30秒，至少重复循环40次。对于定量 实时PCR反应，采用如Ginzinger D G， Exp. Hematol. 2002 30:503-12所述的相 对定量方法。用2n/。琼脂糖凝胶分离PCR产物，利用紫外光激发掺入的溴化乙锭来检测各条带。实施例8.研究从IBD患者的前哨淋巴结获得的Treg通过外科手术收集总共20位IBD患者的前哨淋巴结并研究。前哨淋巴结 获得的淋巴细胞(SEAL)的特征在于表达了表面标记CD4、 CD8、 CD3、 T细胞 受体(TCR)、 CD25、 CD69、 CD45RA、 CD45RO和CD14。检领U 了 CD4+CD25高 Treg群的数量(图1)。发现与引流未受影响肠区域的前哨淋巴结中Treg数量相 比，引流炎性肠节段的前哨淋巴结中Treg细胞数量正常。然而，从引流炎性节段的前哨淋巴结纯化的Treg(CD4+CD25 "和从无炎症 的肠节段纯化的Treg(CD4+CD25 "在对T细胞的调节性活化中存在实质性不 同引流炎性部位的前哨淋巴结的Treg在调节T细胞活化中表现不理想(图2)。 换言之，引流受影响区域的前哨淋巴结的Treg的T细胞应答调节能力明显受 损。实施例9.调节性T细胞的扩增对于Treg诱导和扩增，用IL-2、 CD28、同种异体词养细胞和TGF-|3刺激 外周血的CD4+CD25-T细胞。扩增后，如FACS所检测，超过85%的CD4+T 细胞表达高水平的CD25，表明了 Treg表型(未显示)。RT-PCR证明扩增的(细 胞)群含有Treg标记转录物FoxP3，扩增之前的CD4+CD25-细胞群中不含该转录物(图3)。检验诱导并扩增的Treg细胞群的功能以证明其抑制T细胞活化的能力。 1: 10比例便能抑制T辅助细胞增殖(图4)，证明扩增的CD4+CD25+FoxP3+细胞 群(图3)显示出Treg调节特性。引流炎性肠节段的IBD患者前哨淋巴结中Treg 的数量看来正常；它们显示不足以抑制受刺激T细胞的应答。通过刺激和扩增 原初T细胞，可以提供高效的T细胞调节特性。实施例10.利用从前哨淋巴结获得的调节性T细胞识别从炎性部位获得的抗原将从前哨淋巴结、负淋巴结(negative node)获得的调节性T细胞、肠道上 皮细胞和外周血白细胞在浓度不同的肠道细胞匀浆液中培育5-7天。用炎性区 域的抗原提取物刺激前哨淋巴结的Treg观察到增殖(图5)。然而，当用从非炎性部位获得的抗原提取物刺激从前哨淋巴结获得的调节 性T细胞时，未见或仅有极其微弱的应答(未显示)。克罗恩病患者的结果与溃 疡性结肠炎患者的相似。盲肠和乙状结肠中，引流受影响区域的前哨淋巴结均识别从炎性部位获得 的同一抗原提取物并增殖(图6)。这些结果表明共同的抗原负责T细胞的克隆 扩增。观察到的高度自发增殖是前哨淋巴结中体内克隆性T细胞扩增(clonal T cell expansion)所致。从前哨淋巴结获得的调节性T细胞显示细胞因子表达提高。在UC患者中， 前哨淋巴结的CD4+ T细胞是CD45RO+/CCR5+,这提示针对炎性粘膜的Th2炎 性应答状态增大(图7)。用炎性部位的抗原提取物活化后，UC患者的前哨淋巴结分泌的IL-4(一种 Th2细胞因子)数量增多(图8)。抗原特异性活化后，从克罗恩病患者获得的调节性T细胞的反应是TH1细 胞因子IFN-Y的产量增加(图9)。如CCR5表达增加(图7)和TH2细胞因子，例如IL-4产量增加(图8)所示， 这些结果表明，从UC患者前哨淋巴结获得的T细胞针对炎性部位抗原的增殖 性应答增大，从前哨淋巴结获得的调节性T细胞的反应是TH2应答。从克罗恩病患者前哨淋巴结获得的T细胞显示相反的活化模式，其主要产生THl细胞因子，例如IFN-y。UC溃疡、或UC或克罗恩病患者的肠道炎性部位的内皮细胞经历凋亡或 坏死，然后被专职抗原呈递细胞(APC)内吞。APC内吞分解的内皮细胞，经淋 巴管迁移至引流淋巴结(前哨淋巴结)，在该处APC加工源自内皮细胞的蛋白质 (抗原)并将其呈递至T细胞。T细胞得到活化，经历克隆扩增并离开淋巴结以 找寻炎症区域，在该区域它们变为效应细胞并导致炎症。实施例11.治疗IBD可通过以下步骤治疗IBD，特别是克罗恩病和/或溃疡性结肠炎收集引流 炎性区域的患者前哨淋巴结的调节性T细胞，体外扩增它们并活化，通过输注 将它们送回该患者体内。具体地说，以抗原特异性方式体外扩增调节性T细胞 的优点在于克隆扩增的Treg累积在前哨淋巴结中。在GMP条件下扩增IBD患 者前哨淋巴结的Treg，利用含有IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-卩的细胞因子混合物 连同炎性肠节段的抗原提取物活化以实现Treg的抗原特异性扩增。采用所述的 RT-PCR、 FACS和体外抑制试验评估活化效力(图4)。可利用抗-CD3、抗-CD28 和雷帕霉素的补充活化以优化mDTreg的扩增和功能性。或者，如果引流炎性 肠节段的前哨淋巴结的Treg的数量和/或功能不令人满意，可以考虑采用相同 方案扩增引流非炎性节段的前哨淋巴结的Treg。该备选方法的原理是非炎性节 段可以视作经适当调节，因此Treg是有功能的，虽然其数量太少以致于不能在 毗邻肠节段中维持调节作用。将任一种类的扩增Treg作为自身输血输回以有序 地恢复免疫调节。
图1.通过表面标记CD4+的表达和IL-2受体CD25的高水平表达 (CD4+CD25 s)，鉴定Treg。图2.功能性Treg试验。用从外周血纯化并用抗CD3和抗CD28活化的 CD4+CD25-T辅助细胞培育引流炎性肠节段(空心圆圈)和非炎性节段(实心圆圈) 的前哨淋巴结的纯化Treg。在最后16小时期间向培养液中加入3H胸腺嘧啶。图3.扩增Treg细胞。用IL-2、TGF-P、抗-CD28和饲养细胞活化CD4+CD25' 细胞以剌激Treg细胞扩增。采用RT-PCR证明从扩增的CD4+CD25+Treg提取 的mRNA和FoxP3转录物，显示扩增的细胞群是Treg。图4.调节经刺激的应答T辅助细胞。含有CD4+CD25—细胞的预扩增细胞 群不能调节(实心圆圈)，而扩增的CD4+CD25+细胞可以获得足够的调节(空心圆 圈)。图5.活化人免疫细胞。利用从溃疡性结肠炎患者的发炎肠切片获得的内 源性抗原提取物活化从前哨淋巴结、非前哨淋巴结、肠道获得的细胞以及外周 血淋巴细胞。图6.剂量反应图。显示了从引流盲肠和乙状结肠的前哨淋巴结获得的调 节性T细胞被从同一炎性肠切片获得的内源性抗原提取物活化的的剂量反应。图7. CCR5表达作为TH2的标记。从UC患者前哨淋巴结获得的调节性T 细胞中CD4+ CD45RO+记忆细胞上CCR5的表达升高是TH2活化的标志。图8. UC患者的调节性T细胞中TH2细胞因子IL-4的分泌。用炎性抗原提 取物刺激从非前哨淋巴结(nSLN)和前哨淋巴结(SLN)获得的细胞48小时。釆用 夹心ELISA检测培养上清液中分泌的IL-4。图9.从克罗恩病患者的前哨淋巴结获得的调节性T细胞分泌THl细胞因 子IFN-y。用炎性抗原提取物刺激从非前哨淋巴结(nSLN)和前哨淋巴结(SLNl 和SLN2)获得的细胞48小时。采用夹心ELISA检测培养上清液中分泌的IFN-y。
权利要求
1.一种治疗炎性肠病的方法，其包括(a)从引流患或未患IBD的肠节段的患者前哨淋巴结收集活化或非活化状态的调节性T细胞，(b)体外扩增所收集的T细胞，和(c)将扩增的T细胞重新输注回该患者。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述炎性肠病是克罗恩病。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，收集活化状态的所 述调节性T细胞。
5. 如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，从引流患IBD肠节段的 淋巴结收集所述T细胞。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，联用一种或多种细胞因子与从 发炎肠节段获得的抗原提取物来补充活化所收集的T细胞。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，先活化再扩增。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，活化与扩增同时进行。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，先扩增再活化。
10. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一种或多种细胞因子选 自IL-2、 IL陽7、 IL-IO、 TGF-卩1、 TSLP。
11. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括用抗-CD3、抗-CD28和 /或雷帕霉素再活化所收集的T细胞。
12. 如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，收集非活化状态 的所述调节性T细胞。
13. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，从引流未患IBD肠节段的 淋巴结收集所述调节性T细胞。
14. 如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，联用一种或多种细胞 因子与从发炎肠节段获得的抗原提取物来活化所收集的T细胞。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，先活化再扩增。
16. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，活化与扩增同时进行。
17. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，先扩增再活化。
18. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述一种或多种细胞因子选 自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-(31、 TSLP。
19. 如权利要求14-18所述的方法，其特征在于，包括用抗-CD3、抗-CD28 和/或雷帕霉素再活化所收集的T细胞。
20. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，从引流患或未患IBD肠节段 的淋巴结收集调节性T细胞，将它们与从炎性部位获得的抗原提取物和低剂量 细胞因子IL-2接触使之活化，并扩增。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，还包括将所述调节性T细胞 与抗IFN-y禾B/或TNF-a的抗体接触来活化，从而抑制TH1偏移和TH2扩增。
22. 如权利要求20或21所述的方法，其特征在于，包括以一定间隔，例 如每天到每5天，特别是在l周或更长时期内，特别是在3-4周时期内，每天条件 化培养基。
23. 如权利要求20-22中任一项所述的方法，其特征在于，包括联用抗CD28 抗体和抗IL-12抗体来活化，从而改善Th2偏移。
24. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，从引流患或未患IBD肠节段 的淋巴结收集调节性T细胞，将它们与从炎性部位获得的抗原提取物和细胞因 子IL-2、 IL-12和IFN-a中的一种或多种接触来活化，并扩增。
25. 如权利要求24所述的方法，其特征在于，将调节性T细胞与CD3和/ 或CD28接触以提供补充活化。
26. 药学上可接受的载体配制的一种或多种细胞因子在体外活化从IBD患 者收集的调节性T细胞中的应用。
27. 如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述IBD是克罗恩病。
28. 如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述IBD是溃疡性结肠炎。
29. —种获得引流受炎性肠病(IBD)影响的肠节段的前哨淋巴结的方法，该方 法包括(a)将淋巴染色试剂注射入IBD患者肠道的病损区域，(b)鉴定该试剂染色 的淋巴组织，(c)任选用一根或多根缝线标记该染色的组织，(d)切除该染色组织， (e)检査染色的组织以鉴定引流IBD肠节段的前哨淋巴结，将所鉴定的前哨淋巴结 从该组织上切下。
30. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述IBD是克罗恩病。
31. 如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述IBD是溃疡性结肠炎。
32. —种从引流IBD肠节段的切离前哨淋巴结分离调节性T细胞的方法，该 方法包括(a)对该前哨淋巴结施加压力，(b)收集被挤出该前哨淋巴结的细胞混悬 液，(c)分离该混悬液的调节性T细胞。
33. —种调节性T细胞，其从引流受炎性肠病(IBD)影响的肠节段的前哨淋巴 结分离。
34. 如权利要求31所述的调节性T细胞，其特征在于，所述IBD是克罗恩病。
35. 如权利要求31所述的调节性T细胞，其特征在于，所述IBD是溃疡 性结肠炎。
36. —种扩增用于治疗IBD的调节性T细胞的方法，其包括(a)用合适培 养基提供从IBD患者的前哨淋巴结收集的调节性T细胞，(b)将它们与细胞因 子接触来活化这些细胞，(c)扩增所活化的细胞。
37. 如权利要求36所述的方法，其特征在于，扩增期间进行一些或全部的 活化。
38. —种在克罗恩病患者中重建THl/TH2平衡的方法，其包括(a)从引流 患或未患克罗恩病的肠节段的患者前哨淋巴结收集活化状态的调节性T细胞， (b)联用炎性部位的抗原提取物和低剂量细胞因子IL-2来活化如此收集的T细 胞，(c)扩增这些细胞，(d)任选在扩增期间将这些细胞与抗IFN-Y和/或TNF誦a 的抗体接触来抑制TH1偏移和TH2扩增。
39. 如权利要求38所述的方法，其特征在于，包括以一定间隔条件化培养基。
40. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，每天到每5天进行条件化。
41. 如权利要求39所述的方法，其特征在于，包括使这些细胞与CD3抗 体接触来刺激扩增。
42. 选自以下的细胞因子对于活化调节性T细胞的应用，所述调节性T细 胞从IBD患者的前哨淋巴结获得IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-pl、 TSLP。
43. 抗原提取物连同细胞因子对于活化调节性T细胞的应用，所述抗原提 取物从IBD患者的发炎肠节段获得，所述调节性T细胞从该患者的前哨淋巴结获得。
44. 如权利要求43所述的应用，其特征在于，所述细胞因子选自IL-2、 IL-7、 IL-IO、 TGF-(31、 TSLP。
45. 分别如权利要求42和43-44所述应用的组合。
全文摘要
一种治疗炎性肠病(IBD)的方法，包括从引流患或未患IBD的肠节段的患者前哨淋巴结收集活化或非活化状态的调节性T细胞，通过将这些细胞与细胞因子和从发炎肠节段获得的抗原提取物接触从而任选活化这些细胞，体外扩增这些T细胞，和将扩增的T细胞重新输注回该患者。还披露了获得前哨淋巴结、扩增T细胞、在克罗恩病患者中重建T<sub>H</sub>1/T<sub>H</sub>2平衡的方法，和扩增的T细胞、细胞因子和抗原提取物以及由此活化和扩增的T细胞的相应应用。
文档编号A61P37/06GK101252941SQ200680031306
公开日2008年8月27日 申请日期2006年8月22日 优先权日2005年8月31日
发明者M·瑟恩, O·温维斯特 申请人:Ith免疫治疗控股股份公司