专利名称：用电穿孔向细胞负载抗原的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及细胞生物学，4鼓生物学，癌症生物学，以及免疫学领 域。更具体地，本发明关注的是涉及用电穿孔法向抗原提呈细胞负载一个 或多个抗原的方法，以及经负载的抗原提呈细胞的组合物。用于本发明中 的抗原包括过度增殖细胞，受微生物感染的细胞，或微生物。本发明还关 注对治疗对象使用负载了一个或多个过度增殖细胞，受微生物感染的细 胞，或微生物的抗原提呈细胞来治疗和预防疾病如癌症或任何其他传染性 疾病的方法。
背景技术：
对外来抗原和肺瘤相关的抗原(TAA )的免疫响应通常始于免疫系统中 最为有效的抗原提呈细胞一树突状细胞(dendritic cell, DC)对抗原的 摄取。树突状细胞(DC)代表着体内功能最强的的抗原提呈细胞类型 (APC),能够吞噬外来抗原并将它们提呈给初始和记忆T细胞(Van Schooten等，1997; Mellman and Steinman, 2001)。其他类型的APC包 括巨噬细胞和B细胞。
树突状细胞(DC) —般通过微胞饮作用和/或吞噬作用来摄取抗原，然 后，它们在细胞内对抗原进行处理，并随后将抗原提呈给免疫系统的T细 胞。尽管这个过程通常在体内发生，但也可以将DC移出体内，在活体外 进行培养，在活体外向这些培养的树突状细胞提供抗原，然后使这些细胞回到体内，在此它们可以与T细胞相互作用而引发对兴趣抗原的增强的免
疫响应。这种将抗原提供给DC的方法通常被称作"沖击"或共培养，一 般通过将抗原加到DC上并使DC对抗原进行微胞饮和/或吞噬就能实现。 在活体外的DC和抗原的混合物增加了 DC对抗原的微胞饮和/或吞噬的机 会，并克服了活体内环境下的低效率。使用这种"共培养"而将肿瘤抗原 4是供给DC在Schnurr等，2002; Herr等，2000; Geiger等，2001中进行 了描述。
纯化的与肿瘤相关的抗原已对一些肿瘤进行了表征并在用作癌症疫苗 上获得了一定的成功(H61tl等，2002; Asavaroengchai等，2002 )。然 而，对肿瘤相关的抗原(TAA)的辨认仍然有限。此外，对纯化的和表征 过的TAA的使用并不是对所有的癌症都可行。在TAAs是已知的并被纯化 和负载进DC的情况下， 一种更有效的负载方法将降低所需的抗原量。因 此，人们对鉴别出一种可更有效地将TAA提呈给APC的方法产生了极大的 兴趣。
电穿孔被描述为一种将非渗透的分子引入活细胞中的手段(Mir, 2000 中综述)。还不能在整个细胞水平上完全理解细胞暴露于电脉冲的后果。 在外电场存在下，认为在冲黄跨膜电势差上产生了改变(Neumann等，1999; Weaver and Chizmadzhev， 1996; Kakorin等，1996 )。该电场叠力口于静 息横3争膜电势差上，并可由麦克斯韦等式在几个近似下(厚度大大降低的 细胞膜，零细胞膜导电率等)计算得出(Mir, 2000)。这些在横跨膜电势 差上的改变已在实验中观察到(Hibino等，1993; Gabriel and Teissi 6， 1999 )。细胞暴露于电脉冲的影响在悬浮液中孤立的细胞中得到了很 好地分析描述(Kotnik等，1998 )。
在分子水平的分析中，对在细胞膜水平产生的现象的解释是假设的。 假设在达到净横跨膜电势阀值之上时，膜结构的变化将足以使膜对于具有 给定物理化学特性(分子量，半径等)的本不可渗透的分子变得易于渗透 (参见Mir, 2000)。
电穿孔最常用于将DNA (Knutson and Yee， 1987)和RNA (Van Meirvenne等，2002; Van Tendeloo等，2001)引入细胞中。它被描述为一种可能够将其他大分子引入活细胞包括抗原提呈细胞的细胞质中的
方法(Zhou等，1995; Harding, 1992; Chen等，1993; Li等，1994; Kim 等，2002)。
然而，在将电穿孔用于治疗癌症，其他过度增殖疾病或由微生物引起 的疾病如感染性疾病时，缺乏有效的方法。具体来说，以前的研究还未描 述过使用电穿孔来产生对癌症抗原或其它致病抗原，特别是对未表征的抗 原产生免疫响应的方法。发展这类技术将给癌症疗法和其他疫苗方面带来 极大的进展。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种向抗原提呈细胞负载一个或多个 抗原的新方法，包括(a)制备一种包含有抗原提呈细胞和抗原组合物 的混合物，该抗原组合物包含一个或多个抗原；(b)以足够将一个或多 个抗原负载到抗原提呈细胞中的方式电穿孔混合物。尽管任何电穿孔的方 法均考虑在本发明内，但在某些实施方式中，采用的是在美国专利申请公 开号US20030073238A1中描述的电穿孔装置来对混合物进行电穿孔，该申 请公开在此全文并入。本发明用于负载抗原提呈细胞(APC)的方法可考 虑使用任何类型的APC。 在一些实施方式中，APC是树突状细胞。抗原组 合物可包括一个或多个任何类型的抗原，例如一个或多个来自过度增殖细 胞的抗原，受微生物感染的细胞的抗原或微生物的抗原。更具体地，来自 过度增殖细胞的抗原可以是与肺瘤相关的抗原或肿瘤限制性抗原。抗原组 合物可以是裂解物(lysate)。裂解物可通过本领域技术人员知道的任何 方法制备。例如，可采用洗涤剂或非洗涤剂处理来制备裂解物。在一些实 施方式中，裂解物是使用非洗涤剂处理制备的，这些非洗涤剂处理选自由 冻融法，超声波降解法，高压^齐出法，固体剪切法，液体剪切法，以及低 渗/高渗法组成的组。更具体地，作为制备裂解物方法中的一部分，对细 胞和/或微生物进行至少一次冻融循环。在其他实施方式中，是将细胞和/ 或微生物进行至少约2-5次冻融循环来制备裂解物。在另外的实施方式 中，在所述至少一次冻融循环后对裂解物进行离心分离。在本发明的一些方面，抗原提呈细胞与裂解物中代表的细胞的比例是在每个裂解的细胞中 多于1个抗原提呈细胞的比例。优选地，抗原提呈细胞与裂解物中代表的
细胞的比例在约2: 1-150: 1， 2:1-100:1, 2: l-50: 1,或2:1-20:1之间。 更优选地，抗原提呈细胞与裂解物中代表的细胞的比例在约5:1-150:1， 5:1-100:1， 5:1—50:1,或5:1-20:1之间。在本发明的一些方面，抗原 提呈细胞与裂解物中代表的细胞的比例约为10:1。在本发明的一些方面， 裂解物的蛋白质浓度小于5000 Mg/ml。在发明的一些实施方式中，裂解 物的蛋白质浓度在约5 jug/ml-5000 yg/ml， 5 ]Lig/ml-2500 ng/ml， 5 jig/ml-100G ug/ml,或5 |ag/ml—750 jug/ml之间。更优选地，蛋白质 浓度在约50 jag/ml—750 jug/ml之间或在约250 jug/ml-750 ju g/ml之 间。在本发明的其他方面，裂解物的蛋白质浓度约为50 jag/ml或更低。 在本发明的一些方面，每lx106个抗原:提呈细胞4吏用少于约100, 90， 80, 70， 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9， 8， 5, 4, 3， 2,或1 p g的裂解物 蛋白质。优选地，每lx106个抗原提呈细胞使用约l jag-10Q Mg的裂解 物蛋白质。更优选地，每lx106个抗原提呈细胞使用约1 jag-50 jug, 1 n g-40 jag， 1 jag-20 )ig，或1 iag-lO iag的裂解物蛋白质。
在一些实施方式中，裂解物是肺瘤细胞的裂解物。肿瘤细胞的裂解物 可由良性细胞，癌症细胞，研究对象的自体的肿瘤细胞，同种异体肺瘤细 胞，或这些细胞的混合物组成。尽管任何类型的癌症细胞均在本发明范围 之内，但癌症细胞的具体例子包括乳癌细胞，肺癌细胞，前列腺癌细胞， 卵巢癌细胞，脑癌细胞，肝癌细胞，宫颈癌细胞，结肠癌细胞，肾癌细胞， 皮肤癌细胞，头颈癌细胞，骨癌细胞，食道癌细胞，膀胱癌细胞，子宫癌 细胞，淋巴癌细胞，胃癌细胞，胰腺癌细胞，睾丸癌细胞，白血病细胞。 在一些实施方式中，本发明提供了向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原的 方法，包括制备一种包含有抗原提呈细胞和抗原组合物的混合物，该抗 原组合物包含一种具有一个或多个过度增殖细胞的抗原，受微生物感染的 细胞的抗原或微生物的抗原的裂解物，其中抗原提呈细胞的数目大于裂解 物中代表的细胞数；以足够将一个或多个抗原负载到抗原提呈细胞中的方 式电穿孔混合物。在进一步的实施方式中，裂解物是受微生物感染的细胞的裂解物或微 生物的裂解物。受微生物感染的细胞的裂解物是由任何类型的受微生物如 细菌，病毒，寄生虫，原生动物，真菌，或任何其他的致病颗粒感染的细 胞制备的。
本发明的另一目的是提供向APC负载一个或多个抗原的新方法，包括 (a)制备包含有抗原提呈细胞和抗原组合物的混合物，该抗原组合物包 含一个或多个抗原；(b)以足够将一个或多个抗原负载到APC中的方式 电穿孔混合物。这里使用的抗原可包括任何非APC本身的或获得APC的 有机体本身的抗原。任何的细胞和/或微生物菌可以作为抗原的来源。
本发明的另一目的是提供治疗研究对象疾病的方法，包括(a)使用 上面描述的任何方法向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原；(b)制备所述 抗原提呈细胞的组合物；以及(c)向有需要的研究对象施用有效量的组 合物。在一些实施方式中， 一个或多个抗原包括来自过度增殖细胞，微生 物和/或受微生物感染的细胞的抗原。在一些实施方式中，向抗原提呈细 胞负载一个或多个抗原的方法进一步包括使用描述于美国专利申请公开 号US20030073238A1中描述的电穿孔装置。疾病为过度增殖疾病或传染疾 病。在另一些实施方式中，治疗研究对象疾病的方法包括培养抗原l^呈细 胞。
治疗研究对象疾病的方法可包括使用相当纯化的抗原或使用未达到相 当纯化的抗原。本领域技术人员将熟练掌握纯化抗原的技术。在一些实施 方式中，待治疗疾病的研究对象是哺乳动物。在一些实施方式中，研究对 象是人。人可为任何患有疾病的人。在一些实施方式中，疾病是过度增殖 疾病，例如过度增殖疾病可以是肿瘤。肺瘤可以是良性的，或肿瘤也可以 是癌症。例如，癌症可以是乳癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌，脑癌，肝癌， 宫颈癌，结肠癌，肾癌，皮肤癌，头颈癌，骨癌，食道癌，膀胱癌，子宫 癌，淋巴癌(如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤)，胃癌，胰腺癌， 睾丸癌，黑素瘤，骨髓瘤，或白血病。肺癌例如可以是小细胞肺癌(SCLC) 或非小细胞肺癌(NSCLC)。白血病例如可以是急性骨髓性白血病(AML), 慢性骨髓性白血病(CML),急性淋巴细胞白血病(ALL),或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。 待治疗的研究对象可以是正在经历二级抗增生疗法的对
象。例如，二级抗增生疗法为化疗法，力文射疗法，免疫疗法，光疗法，冷 冻疗法，毒素疗法，荷尔蒙疗法，或手术。
任何输送组合物的方法均在本发明范围之内。本领域技术人员将熟悉 输送方法。例如，组合物可经全身性，静脉内，皮内，皮下，或局部输送 到肺瘤体内。本发明包括使用任何一种抗原提呈细胞。然而，在某些实施 方式中，抗原提呈细胞是树突状细胞。治疗研究对象的方法进一步包括在 对抗原提呈细胞进行负载后培养抗原提呈细胞的步骤。在其他的实施方式 中，治疗研究对象的方法还进一步包括对抗原提呈细胞进行负载后测量抗
原提呈细胞的免疫响应。免疫响应可通过ELISPOT, ELISA， PCR,肿瘤细 胞杀伤，或任何其他本领域技术人员知道的方法进行活体外监视。对免疫 响应的定量可通过测量肿瘤尺寸，以及在一些肺瘤模型中对转移瘤数目进 行计数来进行。
本发明的另一个目的是提供预防研究对象的疾病发展的方法，包括 (a)向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原；(b)制备所述抗原提呈细胞 的组合物；以及(c)向有需要的研究对象施用有效量的所述组合物。在 一些实施方式中，对抗原提呈细胞进行负载包括使用描述于美国专利申请 /〉开号US20030073238A1中描述的电穿孔装置。在一些实施方式中，研究 对象是哺乳动物或人。在其他的实施方式中，人是有病史的患者，例如有 过度增殖疾病的患者。本发明包括任何一种疾病。例如，过度增殖疾病可 以是良性肺瘤或癌症。例如，癌症可以是乳癌，肺癌，前列腺癌，卵巢癌， 脑癌，肝癌，宫颈癌，结肠癌，肾癌，皮肤癌，头颈癌，骨癌，食道癌， 膀胱癌，子宫癌，淋巴癌，胃癌，胰腺癌，睾丸癌，或白血病。
在一些实施方式中，研究对象正在经历二级抗增生疗法。二级抗增 生疗法的例子包括化疗法，放射疗法，免疫疗法，光疗法，冷冻疗法，毒 素疗法，荷尔蒙疗法，或手术。任何输送组合物的方法均在本发明范围之 内。例如，组合物可经全身性，静脉内，皮内，皮下，或局部输送到肿瘤 体内。
本预防疾病的方法包括使用任何一种抗原提呈细胞。然而，在某些实施方式中，抗原提呈细胞是树突状细胞。本发明的方法可进一步包括在电 穿孔混合物后，或在电穿孔后的对抗原提呈细胞的免疫响应测量后，培养 抗原提呈细胞的步骤。免疫响应可通过任何本领域技术人员知道的方法进
行测量。例如免疫响应可通过ELISPOT, ELISA， PCR,肺瘤细胞杀伤进行 活体外监视。对免疫响应的测量也可在活体内通过测量肺瘤尺寸和免疫监 一见治疗前和治疗后来进行。
本发明的再一个目的是提供含有抗原提呈细胞的组合物，其中用之前 描述于本发明内容和本说明书中其他部分的任何方法向抗原提呈细胞负 载了一个或多个抗原。在一些实施方式中，组合物是适合给予研究对象的 药物组合物。研究对象可以为人员就对象。尽管本发明包括任何一种抗原 提呈细胞，但在一些实施方式中，抗原提呈细胞是树突状细胞。
当冠词"一"与术语"含有" 一同出现在权利要求和/或说明书中时， 可表示"一个"，但也可表示"一个或更多"、"至少一个"和"一个或 多于一个"的意思。除非明确说明仅表示择一或替代物是相互排斥的，否 则权利要求中使用的术语"或"即表示"和/或"，尽管所公开的内容支 持该术语仅表示择一以及"和/或"的意思。
以上非常泛地概括出本发明的特征和技术优点，以便于更好地理解以 下对发明的详细描述。本发明的其他特征和优点将在下面描述，它们构成 了发明权利要求的主题。应当理解的是，可在公开的概念和具体实施方式
的基础上很容易地加以改变或设计出实现本发明相同目的的其他结构。应 认识到，这种等同构造并不脱离后附权利要求中限定的本发明。通过以 下描述和附图将更好地理解本发明所特有的新的特征的组织和运作方法 以及进一步的目的和优势。然而，应当特别理解的是，提供的每张附图仅 出于示例性和描述性目的，而不应当构成对本发明范围的限制。
以下附图为本说明书的一部分，并进一步展示本发明的一些方面。通 过参考这些附图中的一副或多幅并结合这里给出的具体实施方式
的详细 描述，可对发明有更好的理解。图1示出了使用电穿孔法将右旋糖苷摄入细胞内的FITC-右旋糖苷结果。
图2示出了使用电穿孔法将清蛋白摄入细胞内的FI TC-清蛋白结果。
图3示出了电穿孔介导的负载有全肿瘤细胞裂解物的DC比共培养的 DC引起更强的T细胞响应。由人单核细胞衍生的DC为共培养的，或者为 用肿瘤裂解物电穿孔的。然后，DC与含有T细胞的自体的外周血淋巴细胞 (PBLs)共培养。7天后，T细胞用改性的DC重新进行刺激。
图4示出了负载有全肿瘤细胞裂解物的树突状细胞引起的自动T细胞 响应。用电穿孔负载有全肿瘤细胞裂解物的DC与裂解物共培养的人单核 细胞衍生的DC作比较，以10: 1的DC对肿瘤细胞的比率，与人黑素瘤细 胞系A-375裂解物共培养30分钟(Co-CX 30 min)或过夜(Co-CX 0/N), 或者用电穿孔负载人黑素瘤细胞系A-375裂解物。然后用PBS (除了 0/N 组外)洗负载了的DC,并与TNFa， IL-1和PGE—同培育过夜使其成熟。 然后将成熟的DC与自体的外周血淋巴细胞(1 DC: 10 PBL细胞的比例) 在IL-2和IL-7的存在下培育。10天后，PBL用附加的改性的DC再次进 行刺激。重新刺激18小时后，收集调整组织培养基并用可通过商业渠道 获得的ELISA试剂盒(R&D System)分析IFNy产量。 PBL与PHA (10 pg/mL)过夜培育是IFN-Y产量的阳性对照。
图5示出了电穿孔介导的负载有全肿瘤细胞裂解物的DC比"沖击"或 裂解物与DC的共培养更好地防止了肿瘤激发。由BalbC小鼠骨髓CD34+ 细胞衍生的DC是共培养的(三角形)或者是用RENCA肿瘤裂解物电穿孔 的(圓形)。然后待DC得以成熟并将其皮下注射到同源的BalbC小鼠中。 两周后，通过在注射了 DC的不同的部位注射RENCA肺瘤细胞而对小鼠进 行激发。在肿瘤激发9天后开始测量肺瘤的尺寸。
图6示出了使用以全肿瘤裂解物电穿孔的DC在活体外主要的对肿瘤特 异的CTL响应的诱导。来自同源的C57B16小鼠的脾细胞用CD34+细胞衍 生的电穿孔的DC或与B16黑素瘤细胞裂解物(1 B16 : 10 DC)共培养的 DC,或未加入裂解物的电穿孔的DC进行刺激。对脾细胞进行3个回合的 再次刺激，然后在标准细胞毒性;险测中与51Cr标记的B16黑素瘤细胞进行培育。图7示出了用电穿孔负载了全肺瘤裂解物的DC降低了在治疗模型中Lewis肺转移瘤。将Lewis肺癌(LLC)细胞静脉(尾静脉)注射到C57BL6 小鼠中。分离的C57BL6DC与LLC全肿瘤细胞裂解物共培养，或者电穿孔， 并成熟。以在无任何裂解物(无裂解物)下电穿孔的DC作为对照。注入 LLC 3天后，通过尾静脉注入DC (—组8只小鼠)。 一组小鼠不给予任何 的DC (无DC对照)，并作为对照。再过3天后(第6天)，向相同的小 鼠第二次注入相同剂量的经负载的DC。在LLC注入后的第15天，杀死鼠， 解剖取出其肺并称重。无肺瘤对照组反映出未用LLC激发的小鼠的正常 肺重。施用LLC裂解物电穿孔的DC则导致LLC肺转移瘤的显著减少，这 由肺重量的显著降低可知。
具体实施方式
这里公开的方法克服了现有技术的局限性，提供了改进的用于过度增 殖疾病和其他由微生物导致的疾病如传染性疾病的免疫疗法的技术。发现 了可对抗原提呈细胞UPC)进行电穿孔来有效地向APC负载肿瘤抗原， 包括负载肿瘤裂解物和其他樣t生物。向患有癌症的研究对象施用这些APC 可提供有效的对抗癌症的免疫疗法形式。本发明表现出的对现有技术的 改进是，在一种实施方式中，由于裂解物含有基本上所有在肺瘤细胞表面 或其细胞质内或在微生物或受微生物感染的细胞内的抗原，因此无需确定 出特定的与肿瘤相关的抗原(TAA)或致病抗原。此外，还不需要对TAA 或致病抗原或它们在裂解物种的浓缩物的确切性质加以确定。使用全肺瘤裂解物来负载到APC克服了对确定的抗原表位的要求。在 早期疾病治疗或仅存在小肿瘤的情况下，作为制备细胞裂解物原材料的胂 瘤组织可能是有限的。用裂解物负载到APC与用单抗原负载相比的另一 优势是无需T细胞克隆，这是由于当用单抗原负载时，T细胞必须得到刺 激以首先识别抗原。全肿瘤裂解物方法还消除了 "一个抗原/抗原表位，， 的问题，由于许多肿瘤还没有很好建立起来的可用的TAA,所以更为可能 的是促进I类和II类MHC提呈。因此，本发明提供了癌症免疫疗法的新形式。A.疾病的治疗本发明可用于治疗和预防疾病，这些疾病包括^^不限于感染性疾病和/ 或过度增殖疾病。这里使用的术语"治疗，，及其相应的时态变化形式是指预防和/或治疗。 例如，当用在感染性疾病时，该术语的含义为预防性治疗，其增加了研究 对象对病原体感染的抵抗，或换句话说，降低了研究对象受病原体感染或 显示出由感染引起的疾病征兆的可能，以及减少了受感染的研究对象为战 胜感染如减少或消除感染或防止其恶化所需的治疗。当用于癌症时，治疗 能够例如通过杀死癌症细胞，包括癌症细胞中的凋亡，降低癌症细胞的生 长速率，减少转移瘤的发生或数目，减小肿瘤尺寸，抑制肿瘤生长，减少 对肿瘤获癌症细胞的血液供应，促进对癌症细胞或肿瘤的免疫响应，防止 或抑制癌症的进展，或延长患癌症的治疗对象的生命而对研究对象的癌症 产生负面影响。1.过度增殖疾病本发明可用于治疗和预防过度增殖疾病，这些疾病包括但不限于癌症。 过度增殖疾病在部分病理学上是一种在细胞数目上出现反常增加的疾病 或症状。这类疾病包括良性的如良性前列腺肥大和卵巢嚢肿。另外还包括 癌变前的病变，例如鳞片状增生。在过度增殖疾病的另一端是癌症。过度 增殖疾病可涉及任何细胞类型的细胞。过度增殖疾病与单个细胞相对于正 常细胞的尺寸增加可能有关也可能无关。另 一种类型的过度增殖疾病是过度增殖病变，这种病变表现为在细胞 数目上的反常增加。这种在细胞数目上的增加与病变尺寸的增加可能有关 也可能无关。考虑在治疗内的过度增殖损害的例子包括良性肿瘤和癌症前 的病变。例子包括但不限于，鳞片状细胞增生性病变，癌症前上皮病变， 牛皮裤病变，皮肤疣，曱周疣，肛门生殖器疣，疣状表皮发育不良，上皮 内肿瘤性病变，局灶性上皮增生，结膜乳突淋瘤，结膜癌，或鳞片状癌病 变。病变可涉及任何细胞类型的细胞。例子包括角化细胞，上皮细胞，皮肤细胞，和粘膜细胞。癌症是最主要的导致死亡的原因之一，在美国每年有约526， 000人死于癌症。这里使用的术语"癌症"定义为细胞无节制生 长或增殖的组织，例如肿瘤。癌症随着基因改变的累积而发展(Fearon and Vogelstein， 1990 ), 并获得相对于正常的周围细胞的生长优势。从正常细胞到肿瘤细胞的基因 转变要经历一系列的发展步骤。已在一些癌症，例如头颈癌肿研究了基因 改变的模型(Califano等，1996)。本发明提供了用于治疗和预防癌症的 方法。本发明包含了对任何类型的癌症的治疗和预防。本发明还包含了在 有癌症病史的研究对象中预防癌症的方法。癌症的例子已在上面概括出。2.感染性疾病在本发明的一些实施方式中，本发明在治疗和/或预防感染性疾病上有 用。感染性疾病包括病毒病原学的感染，如HIV,流感，疱疹，病毒性肝 炎，爱-巴(EpsteinBar)感染，脊髓灰质炎，病毒性脑炎，麻疹，水痘， 乳头淋瘤病毒感染等；或细菌病原学的感染，如肺炎，肺结核，梅毒等； 或寄生虫病原学的感染，如疟疾，锥虫病，利什曼病，滴虫病，变形虫病 等。B.抗原提呈细胞(APC)一般而言，术语"抗原提呈细胞"可以是任何帮助提高对抗原(如TAA ) 的免疫响应(如免疫系统的T细胞或 B-细胞)而实现本发明目的的细胞。 抗原提呈细胞的例子包括DC, B-细胞和巨噬细胞。这些细胞可由本领域技式中，APC是DC。DC是引起免疫响应的主要APC。由于DC的激活初始[CD4+ AND CD8+ T] 细胞的独特能力，它们在初免MHC [II]类和I类限制性，抗原特异性T 细胞响应中扮演着关键角色(Banchereau等，1998)。然而，外源引入的 抗原，例如那些在由抗原蛋白质或死亡的病原体组成的疫苗中的抗原绝大 部分是通过MHC II类途径加工来向[CD4+ T]细胞进行提呈(Moore等， 1988)。
这些类型的疫苗刺激潜在的体液免疫，但在刺激[CD8+ CTL]上相对没有无效。这一缺点致使人们对特异性靶向DC的疫苗设计展开研究，从而除了通过II类，还通过MHC I类来^是呈抗原。DC在加工外源抗原上 显示出具有独特的途径，特别是以特有的形式通过匪C I类途径进行提呈 (Rodriguez等，1999)。本领域技术人员可以理解，"抗原提呈细胞"是一般或优选采用II 类主要组织相容性分子或复合体向免疫细胞展示或提呈抗原的细胞。在一 些方面，细胞(如APC细胞)可融合入其他细胞，例如表达了期望抗原的 重组细胞或肿瘤细胞。用于制备两个或多个细胞融合的方法已为现有技术 所知，例如在Goding， 1986; Campbell, 1984; Kohler and Milstein, 1975; Kohler andMilstein, 1976, Gefter等，1977中公开的方法，这些均在 此经引用而并入。采用电穿孔融合抗原提呈细胞也已经有人描述过 (Scott-Taylor等，2000)。在一些情况下，接受抗原提呈细胞展示或提 呈抗原的免疫细胞是CD4+TH细胞。在APC或其他免疫细胞上表达的其他 分子可以帮助或改进对免疫响应的增强。分泌的或可溶的分子，例如细胞 因子和佐剂也可帮助或增强对抗原的免疫响应。这些分子式是本领域技术 人员所熟知的，这里将描述各种不同的例子。任何本领域技术人员所熟知的制备APC的方法均可用于本发明。 一些 可用于分离，识别，制备，和培养树突状细胞和其他APC的例子在美国专 利5, 851,756， 5,994,126， 6,274,378, 6， 051， 432, 6,017,527, 6,080, 409: 6，004，807中给出(这些专利均经引用而具体并入。)C.本发明实施中有用的抗原这里使用的术语"抗原"定义为激起免疫响应的分子。免疫响应可包 括抗体的产生，特异性免疫活性细胞的活化，或两者。抗原可来自有机物， 死亡的或未活化的全细胞，或裂解物。一4殳而言，可用于本发明实施中的 抗原包括任何与过度增殖细胞，微生物(例如，病毒，细菌，真菌，寄生 虫)和/或任何受^f敬生物感染的细胞相关的抗原。于是，本发明的一些实施方式包括向APC负载裂解物，例如"细胞裂 解物"和/或来自任何微生物(如病毒)的裂解物。"裂解物"在这里定 义为由实施一定步骤而使细胞和/或微生物的正常结构破裂所致的材料。更具体地，"细胞裂解物，，在这里定义为由实施一定步骤而使正常结构破 裂所致的细胞材料。任何制备裂解物的方法均在本发明范围之内。例如， 通过冻融技术制备裂解物是一种制备裂解物的途径。本领域技术人员将熟 悉各种可用于制备裂解物的技术。裂解物的制备可在用于向APC负载前包 括或不包括离心分离除去颗粒状物。细胞裂解物可以为肿瘤细胞裂解物， 其中细胞是良性肿瘤细胞，或者是癌(即恶性)细胞。1.过度增殖细胞在本公开的上下文中以及在这里使用的"过度增殖细胞的抗原，，定义 为包含在过度增殖细胞中的具有抗原特性的任何的蛋白质或其它物质。抗 原可以是也可以不是基本上分离的和纯化的抗原。如前面所提及，过度增 殖细胞可以是肿瘤细胞，其可以是良性肿瘤细胞或恶性(即癌)细胞。用于本发明的过度增殖细胞的抗原例如是与肿瘤相关的抗原。在本发明上下文中，"与胂瘤相关的抗原"(TAA)定义为含于肿瘤细胞中的具 有抗原特性的并与正常细胞表达显著不同的任何蛋白质或其它物质。例 如，TAA可以是膜蛋白质或在细胞表面的糖蛋白或糖脂类的改变的碳水化胞正常表达的物质。表达TAA的肿瘤细胞可^皮身体的免疫系统识别成外来 细胞。身体通常通过对这些抗原以及由它们表现的肿瘤细胞产生细胞免疫 响应开始响应。"肿瘤限制性抗原，，(TRA)包括那些在肿瘤细胞中相对正 常细胞向上调节的或仅由肿瘤细胞表达的抗原。因此，尽管本发明包含了 任何一种过度增殖细胞的抗原，但优选的抗原为TAA和TRA。然而，正如 所提及的，任何含在过度增殖细胞中的抗原均包含在本发明范围之内。一些目标的TAA均已得到了证实。例子包括gp100， Melan-A/MART， MAGE-A, MAGE (黑素瘤抗原E), MAGE-3， MAGE-4， MAGEA3,酪氨酸酶，TRP2 NY-ES0-1， CEA (癌胚抗原)，PSA， p53,乳腺珠-A，存活素，Mucl (粘液 素1)/DF3，金属泛激蛋白-1 (MPS-1),细胞色素P450异构体1B1， 90K/Mac-2结合蛋白，Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT) ， LEA, LAGE-1/CAMEL， TAGE-1， GAGE, 5T4， gp70， SCP-1, c-myc, cyclinBl， M画2SSX-4, H0M-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HDAC5， MBD2， TRIP4, NY-CO-45, KNSL6， HIP1R， Seb4D, KIAA1416, IMP1， 90K/Mac-2结合蛋白，MDM2， NY/ESO,和LMNA。尽管对TAA激起的免疫响应可延緩癌细胞的生长，但由于很难接近 TAA，通常不能完全抑制肿瘤生产。如果这种免疫响应可更为激烈或更特 异性地针对TAA,则癌症可得到更有效地治疗。于是，本发明的一些实施 方式包括向APC负载过度增殖细胞的细胞裂解物。2.微生物与微生物或受微生物感染的细胞相关的抗原也可用于本发明。这里使 用的术语"微生物"是指显微镜下可见的有机体，例如细菌，病毒，朊病 毒，真菌，寄生虫或原生动物。在一些实施方式中，由于微生物在其感染 宿主如人后可致病因此其是"致病微生物"或"病原体"。可预见的是微生物的裂解物能被负载到APC中。在一些实施方式中， 在生产微生物裂解物之前或之后对灭活和/或削弱微生物可能是有利的。 微生物可通过现有技术已知和使用的标准方法如化学处理，即甲醛和/或 戊二醛和/或加热来进行灭活和/或削弱。除了使用微生物的裂解物之外， 感染了微生物的细胞的裂解物也可用于本发明。使用微生物和/或感染了 微生物的细胞的裂解物的优点是它消除或克服了确认和/或分离特定抗原 或抗原表位的问题。因此，通过利用病毒自身或病毒感染的细胞，本发明可应用于病毒性 疾病的预防和治疗中。以下给出致病病毒的例子，流感A, B和C病毒， 副5充感病毒(parainfluenza)， 副粘病毒(paramyxoviruses) ， #斤;成疫 病毒(Newcastle disease virus)， 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus), 麻渗(measles)， 腮腺炎病毒(m卿s), 腺病毒(adenoviruses), 腺病毒伴随病毒(adenoassociated viruses)， 小 病毒(parvoviruses)， 爱-巴病毒(Epstein-Barr virus (EBV))， 鼻 病毒(rhinoviruses ), 柯萨奇病毒(coxsackieviruses), 埃可病毒(echoviruses ), 呼肠孤病毒(reoviruses )， 棒状病毒(rhabdoviruses ): '淋巴细月包性月永全各丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis),冠狀病毒(coronavirus)， 小儿麻瘠病毒(pol ioviruses )， 单纯疱渗病毒 (herpes simplex (HSV))， 人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency viruses (HIV)), 巨细月包病毒(cytomegaloviruses)， 乳突瘤病毒 (papillomaviruses), 人类乳突瘤病毒(human papi 1 lomavirus (HPV)), 乙型肝炎病毒(h印atitis B virus (HBV)),丙型肝炎病毒(hepatitis C virus (HCV))， 带状疱渗病毒(varicella-zos ter ), 痘病毒(poxviruses )， 风渗(rubella), 狂犬病病毒(rabies),樣i小核糖核酸病素 (picornaviruses )， 轮状病毒(rotavirus)和卡波济肉瘤相关疱渗病 毒(Kaposi associated herpes virus)。除了上述提及的病毒疾病外，通过利用细菌或细菌感染的细胞，本发 明还可用于细菌感染的预防，抑制或治疗。以下通过给出细菌的例子包括 但不限于肺炎球菌的血清型，链球菌，如化脓性链球菌(义/^^e/ ei")， 无乳链球菌(51柳/w〃ae),马链球菌(5. e一 )，犬链球菌(义譜Ay), 牛链球菌(义^r"),马肠链球菌(义e^///7M，)咽峡炎链球菌a，./7C^i/51),血链球菌(51 5^/ g〃7'51)， 唾液链球菌(51 5"W/raWi/50 , 緩症链球菌(i:肌'〃S),变异链球菌(51忠〃/N3/W)，其他草绿色链球菌(viridans streptococci), 消化链球菌(peptostreptococci )， 其他 4连3求菌的相关种，肠J求菌(enterococci ), 如类肠3求菌(^"ferococciA /aeca//^) ， ( ^Werococczis /ae"'咖)蜜蜂屎肠球菌，葡萄状球菌(Staphylococci), 如表皮葡萄球菌(S帥力;^/ococci/51 e/ 油，/^/s), 金黄色葡萄球菌(5Ys/7力/A C( ccw犯re^),特别是在鼻咽内的流感杆 菌(Zfe/z/c^//^ /77/7i/e"z<3e),假单胞菌(pseudomonas )属，如绿脓杆 菌 (/"s^i7cfo迈aoas1 aer〃g2'/2c^a ), 鼻疽邗支单月包菌 (/^ei^cwaoas ;weycto鹏i/ey )， 鼻疽假单胞菌(Ae油/z 。朋s鹏"e/), 布鲁氏菌(brucellas),如马尔他布鲁氏菌(》藩e7/s /z/e//^/ ^),猪布鲁氏 菌(j r〃ce/7a Siz/iO , 流产布鲁氏菌(s的r加)，百曰咳布 鲁氏菌 (^油""a ; erZ^^ ), 月亩膜炎奈瑟菌 (iVe2.5^eria 历e"/，7it/is), 奈瑟氏淋病双球菌(yVe/i^eris《aoorr力。eae)， 卡他 莫拉菌 (J/。rsxe"a c"3rr力3//^ )， 白喉杆菌 (C。r//7e6<2"ei7〃yz (//p力/^er/ae) , i责疡才奉4干菌(6biy"e6ac"r/"/w w/cera/751)， 々i寸生纟吉^t才奉^1犬才干菌 (6br7"e6acfer/d//ff ;we〃c^^w6ercw/c^/51 ) ， 4艮白4矣才奉#干菌 (C(9r7"e6aCer/y/z/^ew^^/z^/^er/f/ci/yz ) ，解脈 一奉 4干菌 (Co/y"e力a"er/〃/z wrea/y〃czM )， 溶血棒軒菌 (C(9/7/7eda"er/鹏 力e/zw/yf /c咖)，马棒杆菌等单核细胞增多性李斯特菌(0>r//7e& "er/咖 e《〃/， e,c. Z/i^er/<s 卿/ ( c;^(9^5/7(^ )， 星型奴卡菌 (#<9c<9/W/a M,e/w.^s0 , 类杆菌(Bacteroides )属,放线菌(Actinomyc.etes )属， 梅毒螺旋体(7ye，"e鹏，钩端螺旋体属(Leptospirosa )， 和相关的有机体。本发明对革兰氏阴性球菌如克雷白氏肺炎菌 (17e6s/e//3 i /7eiM ao/se)， 大肠4干菌(j5^c力er2.c力ia), 变形才干 菌(户rc^eiAsO , 沙雷氏菌(5fe/"r"/a)属，不动杆菌(爿"'/7e/^a"e/"), 鼠疫杆菌(Fer"'/22'a戸〃s ) , 土拉弗朗西斯菌(尸r腐/"7/s "/are"si51), 肠杆菌(j^ero&"er)属,拟杆菌(v9a"er/<%fes) 和 军团菌Uegi朋e/")属等也有用。另外，真菌的和其他真菌引发的病原体或感染了真菌的和其他真菌引 发的病原体的细胞也可用于本发明以预防和/或治疗以下疾病涉及皮肤， 头发，或粘膜的霉菌病，例如但不限于曲霉病，黑色毛结节菌病，念珠菌 病，广色霉菌病，隐球菌病，甲真菌病，或外耳炎(耳霉菌症)，暗色丝 孢霉病，藻菌病，花斑裤，金钱裤，须癣，发癣，体裤，股裤，黄癣，叠 瓦癣，手癣，黑癣(掌)，足癣，曱裤，隐球菌病，腋毛癣，白毛症。可 用于本发明的真菌的和其他真菌引发的病原体包括但不限于犁头霉菌属 (爿65^/a s萍)，马杜拉放线菌(爿c〃/70鹏^ra鹏(/i/rae)， 放线菌属 (爿c〃/7o/z /ces i"，)， 波伊德氏霉杆真菌(爿"esc力er/a ^j^'/), 交 《连孑包菌属(J/fei77ar/a ^/7/7. ) , X/7^力o/7i"/y (Ze/ZoA/ea, J; c^力j^c(/z7/ce51 e/e^3"s， J/72/w/z7 /e<9/ or//2m ， 曲霉属(y^pei^"///:^ 577/7. ) ， 4豆梗霉 (Ji/reo6a57fl7wz ， 虫i:粪霉(勘i"/o7c^/iAS1 ra朋r咖)，平 脐蠕孢属(》/一紹、卿.)，皮炎芽生菌(A/a"湖j^s1 &眉〃〃^)， 念珠菌属 (^3/ Wa i"巡),头孑包霉属 (fe/ As/6"i77or/鄉57 ; .)， fi^e/。c朋W咖属(CAge,oc。刀2V/咖57 / .)， 毛壳菌属(CZ ae/咖/咖51，.), 枝孑包属("a必6"",/鹏s巡),粗球孑包子菌(C。ccWo/fl^ i腳/〃i")， 耳霉属(Coq2'o7c^o/z751 57 ; .)，纟千纟田才奉^]大菌(Car7"e6acfer/〃/77 /e/m/s),隐、J求菌属(6Vy/^ciC(9ccw51 s;7p. ) ， C〃/7/ /n^/; a/He/7s 6e/"/^6>//e/7<3e, 弯 孑包菌属(C"rra/ar/a柳.)，指孑包霉属(/^"//ar/a卿.)，表皮齊菌 属()， 絮状表皮霉菌(f;7i"e/7z7。p力7"/7 /7occ。s咖)， 突脐蠕孢属(f環r一/7鹏卿.)，夕卜瓶霉属d。p力ia/a卿，)，著 色芽生菌属(i7 /7.)， 镰刀菌属(尸i/sar/咖i1，)， 地霉菌 属(6"eom'c力zM spp.)， 螺孑包菌属(#e//w'"Mc^; 。r/i//z/ 57 ; .)，纟且织iljt 菌属(〃/s鄉/^鹏577/7.)，暗色孑包属(Zecj^力o; 力(9ra 577/7.)，马桂拉分 枝菌属(胞o^re7/a ^; .)， 糠糸匕孑包子菌(他/ai^ez/a /Vr/Vr)， 小芽 孑包審菌属(577; ,)， 毛雾属(￥wc。r 57 ; .)， 械菌刺孑包 (妙coce"fms770ra aceW朋)，土壤丝菌属(#。c<3ro7a 5T p.)， 巴西拟 球孑包子菌(/^/^cc"cc/o7o/o^5"々/^"7/e/ s/i")， 青霉属(尸e刀ic/77/咖 5"，)， 尸力3e6^c/erscte鹏〃o/cfe51， 尸力3< <93朋<3//咖/(7(^ 属 (尸力aeoa/iae"。迈/ce51 51,)， 尸力ya7e/z ao/咖 oZw"咖，并瓦梗属 (戶力h/o/7力ors w，/ .)，福马线虫属(户力o鹏),黑色毛结节孢子菌 (/7edra/<3力or/^/)， 卡氏肺孑包子虫(i^e〃/z7(9cj^〃51 car/i /i) ， /y^力/iM7 2'i^/d/05"LM ，才番7jc口象冲支孑包審(<3《〃<3i7 er5\3 )， 孩￡小才艮毛 霉(A/ 2'2^/Z7〃CC^r /)iAS7//W50 ，才艮霉属(J 力/ZOi 〃S 577/7.)，月永管状并瓦霉菌
(5^i:seiL3ea i/asi/br/H/s) ， 5^/"c/z2cv^7ces /jAgecwi/r/Z^iTB/A 申克孑包子 丝菌 (5^orc^力r/义 scAewcir/i ), 总、^大共头霉 (5^7 ce; 力a/asZTw/w racems"LM ) ， T^e"i(9/e"a 6op/>//， 球拟酵母属(7brw/o/^c^ys1 )， 毛发裤菌属(7Wc力o; 力j^朋)， 毛孢子菌属(7Wc力o，r。" sp;7.)， 单格孑包(Woc/油'咖由rfar湖)，皮炎万氏霉(^/2^7e/7a <^7ra〃〃c7i0-木海扶真菌属(iy/。力"力a 5T7p.), 以及接合菌属(Z/go/s/e^ s,)。
此外，可证明本发明还可用于控制原生动物或有机体如隐孢子虫 (Cr7W卿0rW咖)，贝氏等孢球虫(i^卿固 6e"i ), 弓形虫 (7bjro/ /ai7ffa gooc7/), 阴道滴虫(7y/c/7C^o/^i1 rag/朋7/i1), 环孑包子 虫(C/c/o，ra)种，以及沙目艮衣原体(C力7，yo7a "a由鹏〃s)和其 他衣原体感染，如鹨鵡热衣原体(67 /a/z77力、；^/〃sc门或肺炎衣原体 (C力/(3，(i/a ;we咖o/ /ae)导致的宏观感染。D.裂解物的制备
本发明的裂解物可使用以下任何一种标准技术来制备。 1.洗涤剂
细胞被膜所束縛。为了释放出细胞的成分，需要将细胞破裂。根据本 发明，完成此项工作的最好的途径是用洗涤剂溶解膜。洗涤剂是两性分子， 具有非极性的脂肪族或芳香族性质的一端和可带电或不带电的极性端。洗 涤剂比脂质更为亲水，从而其水溶性大于脂质。它们使得不溶于水的化合 物可分散到水性培养基中，并用于在自然形式下分离和纯化蛋白质。
洗涤剂可以为变性的或非变性的。前者可以是阴离子型的如十二烷基 硫酸钠，或阳离子型的如乙基三曱基溴化铵。这些洗涤剂通过破坏蛋白质 -蛋白质相互作用而将膜完全破坏并使蛋白质变性。非变性的洗涤剂可分 为非阴离子洗涤剂，如Triton X-100，胆汁盐入胆酸盐，以及两性离子 洗涤剂，如CHAPS。两性离子在同一分子中含有阳离子和阴离子基团，正 电荷一皮相同分子或邻近分子上的负电荷所中和。
变性洗涤剂如SDS作为单体而结合到蛋白质上，且反应受平衡驱使直 至达到饱和。因此，单体的自由浓度决定着所需的洗涤剂的浓度。SDS结 合是协同性的，即一个SDS分子的结合将增加其他分子对蛋白质的结合的 可能性，并将蛋白质变为长度与它们的分子量成比例的棒。
非变性的试剂如Triton X-100既不结合到天然的构型上，也没有协 同性的结合机制。这些洗涤剂具有硬而体积庞大的非极性部分，该部分无 法穿透进入水溶性蛋白质中。它们结合到蛋白质的憎水部分。Triton X100 和其他聚氧乙烯非阴离子洗涤剂在破坏蛋白质-蛋白质相互作用上无效， 并可导致蛋白质的人为凝聚。然而，这些洗涤剂将破坏蛋白质-脂质的相 互作用，但此破坏非常温和，可保持蛋白质的天然形态和功能性。
洗涤剂的去除可按许多方式进行。透析对以单体存在的洗涤剂非常有 用。但透析对那些容易聚集形成胶束的洗涤剂却不太有效，这是由于形成 的胶束太大而无法通过透析之故。离子交换色i昝可用于防止这一问题。将 破裂的蛋白质溶液加入离子交换色谱柱中，然后用緩沖液洗柱而除去洗涤剂。随着緩冲液与洗涤剂溶液之间达到平衡，洗涤剂将被除去。或者也可 将蛋白质溶液通过梯度密度。随着蛋白质经梯度而沉淀，洗涤剂将由于化 学势而离开。
通常，单一的洗涤剂不足以溶解和分析在细胞中发现的蛋白质。可将 蛋白质溶解于一种洗涤剂中，然后置于另外的适合的洗涤剂中进行蛋白质 分析。在第一步中形成的蛋白质洗涤剂胶束应当从纯的洗涤剂胶束中分 离。当将这些加入到过量的洗涤剂中进行分析时，在两种洗涤剂的胶束中 均发现了蛋白质。对洗涤剂_蛋白质胶束的分离可通过离子交换或凝胶过 滤色谱，透析，或浮力密度进行分离而完成。
a) Triton⑧X-洗涤剂
这一类洗涤剂(Triton⑧X-100， X114 and NP-40)具有相同的基本特 性，但在它们具体的憎水-亲水性质上有所不同。所有这些不同种类的洗 涤剂均具有支化的8碳原子链连接到芳香环上。分子的这部分产生洗涤剂 的大部分憎水性质。Triton⑧X洗涤剂被用于在非变性条件下溶解膜蛋白 质。对溶解蛋白质的洗涤剂的选择将取决于需要溶解的蛋白质的憎水性。 憎水的蛋白质需要憎水的洗涤剂来有效地溶解它们。
Triton X-100和NP-40在结构和憎水性上非常类似，并在包括细胞 溶解，去脂蛋白质离解和膜蛋白质和脂质溶解在内的大多数应用中可互 换。通常使用2 mg的洗涤剂来溶解1 mg的膜蛋白质或以10 mg的洗涤剂 对1 mg脂质膜的比例。Triton⑧X- 114被用于从亲水的蛋白质中分离出 憎水的蛋白质。
b) Brij 洗、涤剂
这类洗涤剂由于具有连接于憎水链上的不同长度的聚氧乙烯链，故与 Triton⑧X洗涤剂在结构上类似。然而，与TrUon⑧X洗涤剂不同的是， Brij 洗涤剂不具有芳香环，且碳链长度可变化。Brij 洗涤剂难以用 透析而从溶液中除去，但可通过用洗涤剂除去凝胶而被除去。Brij 58是 在憎水/亲水性上与Triton X100最为接近的。Brij -35是在HPLC应用 中常用的洗涤剂。C) 可透析的非离子洗涤剂
"-辛基-^-D-葡糖苷(正辛基葡萄糖苷)和辛基-々-D-硫代葡萄 糖苷(正辛基硫代葡萄糖苷，OTG)是非变性的非离子洗涤剂，它们容易从 溶液中透析。这些洗涤剂用于溶解膜蛋白质，并在28G nm具有低的UV吸 收。正辛基葡萄糖苷具有的23-25 mM的高的CMC,并以1. 1-1. 2%的浓度 用于溶解膜蛋白质。
正辛基^L代葡萄糖苷首先被合成出来作为正辛基葡萄糖苷的替代。正 辛基葡萄糖苷制造起来昂贵，且由于它可被"-葡萄糖苷酶水解，因而在 生物系统中存在一些固有的问题。
d)Tween 洗涂剂
Tween 洗涤剂是非变性的，非离子洗涤剂。它们是脂肪酸的聚氧乙 烯山梨醇酯。Tween 20和Tween 80洗涤剂在生物化学应用中作为封 闭剂使用，并通常加入到蛋白质溶液中以防止非特异性结合到憎水材料如 塑料或硝化纤维上。它们已在ELISA和印迹法应用中用作封闭剂。通常， 这些洗涤剂在0. 01-1. 0%的浓度下使用，以防止非特异性结合到憎水材料 上。
Tween 20和其他非离子洗涤剂已显示出从硝化纤维的表面除去一些 蛋白质。Tween 80已被用于溶解膜蛋白质，以防止蛋白质的非特异性结 合到多孔的塑料组织培养皿上以及减少血清蛋白质和生物素化的蛋白质A 对ELISA中的聚苯乙烯盘的非特异性结合。
这些洗涤剂之间的区别是脂肪酸链的长度。Tween 80衍生自C 18 链的油酸，而Tween 20衍生自C 12链的月桂酸。较长的脂肪酸链使得 Tween 80比Tween 20亲水性更低。两种洗涤剂都非常溶于水。
Tween 洗涤剂.难以用透析而/人溶液中除去，但Tween 20可通过用 洗涤剂除去凝胶而被除去。这些洗涤剂中发现的聚氧乙烯链使得它们易于 发生氧化(形成过氧化物)，这在Triton X和Brij⑧系列的洗涤剂确 实如此。e) 两性离子洗涤剂
两性离子洗涤剂CHAPS是一种胆酸的硫代甜菜碱衍生物。当蛋白质活 性是重要时这种两性离子洗涤剂对溶解膜蛋白质是有用的。这种洗涤剂可 在宽范围的pH (pH 2-12)内使用，由于它的高的CMC (8-10 mM)可供过 透析而容易地从溶液中除去。这种洗涤剂在280 nm有低的吸收度，从而 在需要以该波长对蛋白质进行监控时可使用。CHAPS与BCA蛋白质测定(BCA Protein Assay)相容，并可通过洗涤剂除去凝胶而从溶液中除去。蛋白 质可在CHAPS存在下被》典化。
CHAPS已成功地用于溶解固有的膜蛋白质和受体，并保持蛋白质功能 性。当细胞色素P-450溶解于Triton X-100或胆酸钠中时，形成凝结 物。
2.非洗涤剂法
除了上述的洗涤剂法外，各种非洗涤剂法也可应用来制备本发明的裂 解物
a) 冻融
这是一项广泛应用的以温和和有效的方式溶解细胞的技术。细胞通常 被迅速冷冻，例如在干水/乙醇浴中直至完全冷冻，然后转移到37。 C浴 中直至完全融化。重复这一周期数次以获得完全的细胞裂解物。
b) 超声波降解法
高频的超声振荡被发现对破碎细胞有用。这种通过超声波破裂细胞的 方法还未得到完全的理解，但已知当悬浮液受到超声振荡时会产生高的瞬 时压力。这项技术的主要缺点是会产生相当大的热量。为使热效应降至最 小，使用了经特殊设计的玻璃器皿来容纳细胞悬浮液。这种设计使得悬浮 液循环离开超声^果头到器皿外部的悬浮在冰中的烧瓶中冷却。
c) 高压挤出
这是一种经常用于破裂生物细胞的方法。高压破裂仪(French pressure cell )采用10.4 x 107 Pa (16,000 p. s. i)的压力来破裂细胞。该装置由通过针阀向外部开放的不锈钢室构成。用针阀将细胞悬浮液 在关闭的位置注入室中。倒转室后，打开阀，推进活塞压出室内的空气。 当阀处于关闭位置时，将室恢复到其原始位置，置于固体基板上并通过水 压器向活塞施加要求的压力。当获得压力后，将针阀部分打开以稍微释放 压力，细胞在膨胀的同时发生破裂。当维持压力时阀处于开放状态，这样 可收集滴出的破裂的细胞。
d) 固体剪切法
可在500 nm直径的玻璃珠存在下剧烈振荡悬浮液(300- 3000次/分 钟)的Mickle混合器中用研磨剂实现机械剪切。这种方法可导致细胞器 官损害。另一种更可控的方法是使用Hughes压力机，其中活塞迫使大多 it细月包和研磨剂或深层冷冻的细^^浆通过压力室内的0. 25 mm直径的口而 聚集在一起。可采用最大为5.5 x io' pa (8000 p. s. i.)的压力来裂解 细菌制剂。
e) 液体剪切法
这些方法应用了使用高速往复或旋转叶片的搅拌机，使用向上/向下运 动活塞和球的均质器，以及使用以高速通过小直径管或高速沖击的两股流 体的微流化器或碰撞射流。搅拌机的叶片以不同角度倾斜以进行有效混 合。均质器通常在几秒钟内的短暂高速脉冲下操作以使局部热量降至最 低。这些技术通常不适用于微生物细胞，但即使是非常温和的液体剪切一 般已足以破碎动物细胞。
f) 低渗/高渗法
将细胞暴露于具有非常低(低渗)或非常高(高渗)溶质浓度的溶液。 溶质浓度的差别产生了渗透压梯度。在低渗环境中流入细胞的水导致细胞 肿胀并破裂。在高渗环境中流出细胞的水导致细胞收缩并随后破裂。
E电穿孔装置
本发明的一些实施方式包括使用电穿孔来帮助抗原进入细胞。这里使 用的"电穿孔，，是指向细胞施加电流或电场而帮助抗原或抗原组合物进入 细胞。电穿孔装置可分为至少两类，静态和流式形式。电穿孔装置的静态形 式包括特制的小玻璃管，其含有压制于其内的与固定体积的目标细胞流体 接触的电极。感兴趣分子被置于两个电极之间并受到高电压的脉沖。
本领域技术人员将能够理解任何电穿孔的方法和技术(即静态和/或流 式)均包含在本发明之内。然而，在本发明的一些实施方式中，电穿孔可
按照美国专利申请7>开US20030073238A1中的描述进行。该申请的全部公 开内容在此经引用而并入。在本发明的其他方面，电穿孔可按照美国专利 5,612, 207 ( 1997年3月18日受权，在此经引用而具体并入)；美国专利 5, 720,921 ( 1998年2月24日受权，在此经引用而具体并入)；美国专利 6,074,605 ( 2000年6月13日受权，在此经引用而具体并入)；美国专利 6， 090, 617 ( 2000年7月18日受权，在此经引用而具体并入)；以及美国 专利6, 485,961 ( 2002年11月26日受权，在此经引用而具体并入)中的 描述进行。
本发明可使用流式电穿孔装置来对特别是包含活细胞的颗粒悬浮液进 行电处理，该装置包括一流式电穿孔细胞组件和一对电极，该流式电穿孔
细^i且件具有一个或多个流动入口 ， 一个或多个流动出口 ，以及一个或多 个流动通道，该流动通道由两面或多面墙构成，该流动通道进一步设置成 接受和短暂地容纳来自流动入口的悬浮液中颗粒的连续流动；成对的电极 相对流动通道被i殳置使得每一电极形成流动通道的至少一面墙，电极进一 步包括使电极处于与电源电通讯的位置，从而使流经通道的颗粒悬浮液处 于电极之间形成的电场。
应当理解的是，用于实施本发明的电穿孔系统可与由商业渠道获得的 细胞分离装置联合使用。这些装置包括但不限于Haemonetics Cell Saveo 5自体的血液回收系统，Haemonetics OrthoPAT⑧系统，Haemonetics MCS + Apheresis系统，Cobe Spectra Apheresis系统,Tr ima 自动血液成分采 集系统，Gambro BCT系统，以及Baxter Healthcare CS- 3000 Plus血液 细胞分离器。
F 电穿孔和抗原摄取
电穿孔可将非渗透性分子引入活细胞中(参见Mir, 2000综述)。分子通过细胞膜的电渗透的区域而扩散。DNA电穿孔最初被描述为使用筒单的 产生指数衰减脉沖的发生机(Mir, 2000)。此后，开发出了正方形波电脉 冲发生机，从而在一方面可给出各种电参数(脉冲强度，脉冲长度，脉沖 数)(Rols andTeissi6, 1990),并在另 一方面获得^艮大比例的细胞同 时渗透并存活的电穿孔条件(Mir等，1988 )。对参数的选择取决于被电 穿孔的细胞类型以及被细胞摄取的分子的物理性质。下面的实施例描述了 用于帮助APC摄取癌症细胞裂解物的特定的电穿孔设置的一些实施方式。
本发明也涉及将一个或多个抗原负载到抗原提呈细胞中的方法。本发 明包括任何一种APC。然而，在一些实施方式中，APC是树突状细胞。在 全胂瘤裂解物中假设的低浓度的TAA要求在活体外采用现有的共培养方法 负载APC时需要相当大量的肿瘤裂解物。通常，全肿瘤裂解物与DC的比 例为1:1 (即，对需要加入全肺瘤裂解物而形成具有一个树突状细胞的裂 解物，要使用具有一个肿瘤细胞的肿瘤组织来形成该裂解物)(Chang等， 2002)。在一些情况下，该比例为1:3，即要制备出更多的全肿瘤裂解物来 负载期望量的DC。然而，本发明中允许每一抗原提呈细胞使用较少的裂解 物。这些方法在当抗原材料含量有限的情况下，如在疾病或感染早期时特 别有利。对于治疗癌症而言，釆用传统的共培养法负载APC时通常需要1 克的肿瘤。对于许多类型的癌症而言，并不存在l克的肿瘤，或者不容易 获得。而本发明提供了使用少于l克的肿瘤来负载APC的方法。例如，在 本发明的一些实施方式中，APC可使用1/10克或更少的肿瘤或甚至1/100 克或更少的肿瘤来负载。
G.细胞疫苗
在本发明的一些实施方式中，负载了一个或多个抗原的APC可包含疫 苗。APC可从培养物，组织，器官或有机体中分离出来并作为细胞疫苗施 用于研究对象。因此，本发明包含了 "细胞疫苗"。这里使用的术语"疫 苗"是指一种含有本发明组合物(负载的APC)的制剂，且其釆用的是可 向研究对象施用的剂型。通常，疫苗包含悬浮了或溶解了本发明组合物的 传统盐水或緩冲水溶液培养基。在这种形式下，本发明的组合物可方便地 用于预防，改善，或治疗病症。在向研究对象或宿主引入后，疫苗可激起免疫响应，这些免疫响应包括但不限于抗体，细胞因子和/或其他细胞响 应的产生。本领域技术人员也可意识到本发明的疫苗可包含所有的或部分 的细月包。
在一些实施方式中，APC可从注射了疫苗的研究对象中分离出。可采
用本领域^支术人员熟知的^支术来分离APC。例如，APC可随后用癌症细胞 裂解物^t电穿孔，在活体外成熟，然后培养。此后，APC可作为细胞疫苗 向研究对象施用。
本发明的疫苗也可选择地另外包括佐剂，其含量相对于本发明化合物 而言可以是占很少的比例，或可占很大的比例。这里使用的术语"佐剂，， 是指非特异性的免疫响应的刺激物或能够在宿主中产生存儲从而在与本 发明的疫苗结合时提供更为增强的免疫响应的物质。可使用许多不同的佐 剂。例如不完全的弗氏佐剂，氬氧化铝和改性的胞壁酰二肽。这里使用的 术语"佐剂"也是指典型的特异性免疫响应的刺激物，其能够在与本发明 的疫苗结合时提供更为增强的以及典型的特异性免疫响应。例子包括但不 限于GM-CSF， IL-2， IL-12, IFNoc。其他例子是在本领域技术人员的知识 之内。
目前需要的是刺激T细胞，特别是刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL))-介导的免疫力以对抗与细胞相关的抗原或内源性抗原的的改进的疫苗。这 些疫苗的目标可包括受微生物感染的细胞(即被病毒，细胞内细菌和寄生 虫感染的细胞)，以及癌症。要引发CTL-介导的免疫力需要抗原肽与主要 组织相容性(顧C) I类分子联合提呈到APC的表面，特别是在DC的表面 (Ridge等，1998)。 DC与抗原的共培养调节了抗原的噬菌作用，形成MHC II类的提呈。电穿孔可将抗原直接传送进DC的细胞质，形成I类提呈。 因此，本发明提供了刺激T细胞介导的免疫力的改进的疫苗。
H.免疫检测方法
在一些实施方式中，本发明关注的是用于测量APC的免疫响应的免疫 检测方法。本领域技术人员对可获得的多种不同的免疫检测技术是熟悉 的。免疫检测方法的几个例子包括酶联免疫吸附检测(ELISA) , ELISpot, 放射性免疫测定(RIA)，免疫放射分析，荧光免疫分析，化学发光分析，生物发光分析，以及免疫蛋白印迹。各种有用的免疫检测方法的步骤描述
在科学文献如Doolittle and Ben-Zeev， 1999; Gulbis and Galand， 1993; De Jager等，1993; and Nakamura等，1987中,它们在此经引用而并入。
抗原;险测中，分析的生物样品可以是任何怀疑含有抗原，例如树突状 细胞，均质的组织提取物，或甚至是与细胞接触的包括血液和/或血清在 内的生物流体的样品。
其他已知的免疫检测方法利用了免疫-PCR (聚合酶链反应)方法。PCR 方法就与生物素化的DNA —同培育而言与Cantor方法类似，但用到释放 抗体的低pH或高盐緩冲液来将DNA/生物素/链霉亲合素/抗体复合物洗掉， 而不是进行多轮的链霉亲合素和生物素化的MA培育。所得洗液然后被用 于与具有合适的对照的适合引物进行PCR反应。至少在理论上，PCR的巨 大扩增能力和特异性可被用于检测单个抗原分子。
如上面所详细描述的那样，从最筒单和/或最直接的角度看，免疫碎企验 即为结合检验。 一些优选的免疫检验是现有技术已知的各种类型的酶联免 疫法检测(ELISA)和/或放射性免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组 织化学才企测也是特别有用的。然而，应当容易理解的是检测并不限于这些 技术，和/或免疫蛋白印迹，点印迹，FACS分析，和/或其他类似的可使用 的方法。
I. 细胞培养
在本发明的一些实施方式中，细胞培养可用于APC的制备中。在真核 细胞培养系统中，细胞的培养通常是在可控的pH，温度，湿度，同渗容摩， 离子浓度，以及气体交换的条件下进行。对于后者而言，氧和二氧化碳对 细胞培养而言尤其重要。在典型的真核细胞培养系统中，在提供的培养器 中注入二氧化碳而在培养器中维持约5%的二氧化碳的气氛。二氧化碳与组 织培养基，特别是与緩冲系统相互作用来维持pH在生理水平。现有的细 胞培养容器包含组织培养烧瓶，组织培养瓶，以及组织培养皿。此外，对 于DC的培养，使用过无菌特氟纶涂层袋来防止细胞附着。在二氧化碳由 培养器中的气氛进入组织培养亚的过程中通常涉及一不密实的盖，该盖悬 于盘之上以用来阻止颗粒污染物进入盘室内，但允许在培养器中的气氛和组织培养盘内的气氛之间进行气体交换。类似的，对于组织培养烧瓶或瓶 来说， 一不密实的盖阻止颗粒污染物进入烧并瓦或瓶的室内，但允许在培养 器中的气氛和烧瓶或瓶内的气氛之间进行气体交换。最近，又提供了具有 气体可透过的膜或过滤器的盖，从而使得在密实的盖中进行气体交换。
除了 二氧化碳外，细胞的培养还取决于向细胞提供细胞呼吸和代谢功 能所需的足量氧气的能力。在传统的细胞培养容器中为细胞呼吸而提供的 氧容纳于容器的头部，例如在组织培养基表面之上的容器的空余空间。增 加培养的细胞中氧浓度的尝试包括机械搅拌，培养基注射或通风，提高氧 气分压，和/或提供环境气氛压力。因此，在传统的细胞培养容器中，用 于气体交换的体积或表面积相对于全部容器的体积或表面积而言，或者是 低效率地使用和/或导致限制气体交换速率或气体平衡。这在小试培养物
(15 ml或更少)中尤为突出，其中，由于空间，表面积，以及气体交换 的限制，细胞生长速率，细胞密度，以及总的细胞数目通常较低。
任何本领域技术人员所熟知的培养APC的方法均可用于本发明。用于 培养树突状细胞的技术的一些例子在美国专利5,851,756, 5, 994, 126, 6, 274, 378， 6,051,432, 6,017,527, 6,080,409， 6,004,807中提供(这 些均经引用而并入)。
J.药物制剂
1. 制剂
本发明包含了用于向研究对象施用负载了癌症细胞抗原或微生物抗原 或受微生物感染的细胞的抗原的APC的药物制剂。本领域技术人员将熟 悉向研究对象施用细胞例如APC的技术。如前面所提及，APC可以是生长 在细胞培养物中的细胞。本领域技术人员将熟悉向研究对象施用之前制备 这些细胞所必需的药物制剂的技术。
在本发明的一些实施方式中，药物制剂为水性组合物，其包含负载了 裂解物如癌症细胞裂解物，；徵生物裂解物或受^i:生物感染的细胞的裂解物 的APC。在一些实施方式中，裂解物是用从研究对象获得的细胞(即癌症 细胞)制备的。然而，任何来源的细胞均包含在本发明内。在一些实施方式中，癌症细胞可以是从对研究对象先前进行的癌症手术中获得，而手术 是作为对特定患者所具体制定的整个癌症治疗方案中的一部分。
本发明的水性组合物包含有效量的APC在药学上可接受的载体或水性 培养基中的溶液。这里使用的"药物制剂"或"药物组合物"包括任何的 和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌制剂、等压和吸收延迟试 剂和类似物。使用这些介质和试剂作为药学活性物质以为本领域熟知。除
了那些现已知的与APC不相容的那些传统介质或试剂之外，在治疗组合物 中的使用这些介质和试剂均是可能的。也可在组合物中添入辅助的活性成 分。用于人类施用时，制剂必须满足FDA制剂局(FDA Office of Biologies ) 标准要求的无菌测试，热原测试，整体安全以及纯净标准。
根据情况，生物材料必须严格地经过透析而除去不期望的小分子量的 分子和/或经冻干而更易于配制到期望的载体之中。然后，APC通常会按照 已知的途径，例如肠胃外施用而进行配制。本领域技术人员将能够确定施 用的细胞数目，且这也部分取决于癌症的程度和严重性，APC的施用是否 是为了治疗已有癌症或预防癌症和/或治疗或预防由微生物导致的疾病。 本领域技术人员按照本公开将知道如何制备含有这里公开的本发明的APC 的药物组合物。
本发明的试剂或物质可在适合pH下配入组合物中。本领域技术人员将 会熟悉用于制备APC施用的技术，这些技术包括那些与在溶液中在合适的 pH下以及选用合适的试剂来维持细胞活性的APC的制备相关的技术。
本发明包含负载了裂解物(即肺瘤裂解物)的APC,其为药物制剂形 式且是用于皮下注射，肌肉注射，血管内注射，输尿管内注射，或通过任 何其他途径施用的无菌溶液。本领域技术人员将会熟悉用于制造注射或其 它途径施用的无菌溶液的技术。
配制完后，将按照与剂型相符合的方式施用治疗有效量的溶液。试剂 可在各种剂型下，例如通过上面描述的可注射溶液的形式轻松地加以施 用。对于肠胃外施用，包含APC的溶液应当合适地得到緩冲。就此而言， 本领域技术人员才艮据本公开将知道采用何种无菌水性介质。这里描述的活 性试剂可配入治疗剂混合物，其中所含的APC的适当量可由本领域技术人员确定。APC可与作为研究对象的治疗方案，例如免疫疗法或化疗法中一 部分的其他试剂一同施用。
2.剂量
本发明包含了向研究对象施用负载了裂解物(即癌症细胞裂解物，微 生物裂解物，或受微生物感染的细胞的裂解物)的APC来治疗和预防癌症 或任何由孩i生物导致的疾病，例如传染性疾病。在一些实施方式中，负载 了癌症细胞裂解物的APC的有效量是根据预期目标，例如肿瘤衰退而确定 的。例如，在处于治疗中的已有癌症的情况下，施用的细胞数目可大于为 预防癌症所施用的APC的情况下施用的数目。本领域技术人员将能够根 据本公开确定施用的细胞数目和施用频率。根据治疗次数和剂量所定的施 用量还将取决于待治疗的研究对象，研究对象的状态以及期望的保护。治 疗组合物的精确量还取决于医生的判断，且对不同患者因人而异。施用频 率可由1-2天，到2-6小时，到6-10小时，到1-2周或更长的范围，这 由医生判断。
当以预防为目的时，可采用较长间隔的施用和较低数目的细胞。例如， 每剂施用的细胞数可为活跃疾病治疗中施用剂量的50%,且隔周施用。本 领域技术人员将能够根据本公开确定有效的细胞数目和施用频率。这一确 定将部分取决于当时特定的临床环境(例如疾病类型(即癌症，传染病等)，
疾病的严重程度(即癌症，感染等)。
在一些实施方式中，希望向患者提供连续供应的治疗的APC组合物。 可优选采用的是对兴趣区域(如肺瘤，感染部位)的连续注射。注射进行 的时间可由临床医生对具体患者视具体情况选择，但时间可在大约由1-2 小时，到约6-10小时，到约10-24小时，到约1-2天，到约1-2周或更 长之间。 一般而言，连续注射施用的治疗组合物的剂量在对施用剂量的时 间做出调整后将与通过单次或多次注射给予的剂量相同。
K.组合治疗
为了增强负载了癌症细胞抗原或微生物抗原或受微生物感染的细胞的 抗原的APC (这里也称作负载的APC)的效力，可能希望将使用这些负载的APC的治疗与其他能有效治疗癌症和/或传染疾病的试剂组合。 1.癌症
抗癌症制剂能够对研究对象的癌症产生负面影响，例如通过杀死癌症 细胞，包括癌症细胞中的凋亡，降低癌症细胞的生长速率，减少转移瘤的 发生或数目，减小肺瘤尺寸，抑制肿瘤生长，减少对肿瘤获癌症细胞的血 液供应，促进对癌症细胞或肺瘤的免疫反应，防止或抑制癌症的进展，或 延长患癌症的治疗对象的生命。在更广的意义上，这些其他组合物可以与 能够杀死或抑制细胞增殖的有效组合量提供。该过程可包括将细胞与负载
的APC以及制剂或多种因素同时接触。这可以通过将细胞与单一组合物 或包括两种试剂的药理学制剂接触而实现，或通过将细胞与两种截然不同 的组合物或制剂同时接触而实现，其中一种组合物包括负载的APC,而另 一种包括第二种试剂。
在临床肿瘤学中，肿瘤细胞对化疗和放疗试剂的抵抗性是一主要问题。 目前癌症研究的一个目标是通过与免疫疗法结合而找出提高化疗和放疗 效果的方法。在本发明上下文中，APC疗法可类似地与化疗，放疗，或其 他免疫治疗的干涉联合使用。
或者，免疫疗法与APC可在其他试剂治疗之前或之后在数分钟到数周 的间隔内进行。在其他试剂和负载的APC分别地向肿瘤细胞或研究对象 施用的实施方式中， 一般应当保证在施用每种之间的间隔不会过长，从而 其他试剂和负载的APC仍将能够对肿瘤细胞产生有利的组合效果。在这种 情况下，可将肿瘤细胞与两种形式的制剂在分别在约12-24小时内，更优 选的在6-12小时内接触。然而，在一些情况下，需要显著延长治疗时间， 从而各自施用的间隔为数天(2， 3, 4, 5, 6或7)或数周(1， 2, 3， 4, 5， 6， 7或8)。
可采用以下各种组合，其中APC疗法为"A",第二种试剂，如放疗或 化疗试剂为"B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/AA/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B
A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A
A/B/A/A A/A/B/A
将本发明的负载的APC向患者施用将遵从化学疗法的通用协议，并要 考虑到可能存在细胞毒性。预期在需要的情况下将重复治疗周期。另外， 各种标准疗法以及外科干涉也可与描述的过度增殖细胞疗法组合应用。
a) 化疗法
癌症疗法也包括各种与基于化学和放射治疗组合的疗法。本领域技术 人员对熟悉化疗试剂的范围以及可能的组合。化疗试剂包括如顺铂 (CDDP)，卡铂，丙卡巴肼(procarbazine) , 二氯曱基二乙胺，环磷酰胺， 喜树碱，异环磷酰胺，苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，曱磺酸丁二醇二酯， 亚硝脲(nitrosurea)，更生霉素，道诺霉素，阿霉素，博来霉素，普卡 徽素(plicomycin),丝裂霉素，依托泊甙(etoposide (VP16)),它莫 西芬(tamoxifen)，雷洛西芬(raloxifene ),雌激素受体结合剂，紫 杉醇(taxol ),耶西i荅宾(gemcitabien ),长春瑞滨(navelbine), 法呢基(farnesyl)-蛋白质转移酶抑制剂，反式铂(transplatinum), 5-氟脲嘧啶，长春新碱，长春碱和曱氨蝶呤，或任何的类似物或上述药物 的衍生变体。
b) 放射疗法
其他导致DNA损伤并被广泛使用的因素包括那些通常被称作迦马-射线，X-射线，和/或向肝瘤细胞直接输送放射性同位元素。其他形式的 DNA损失因素例如微波和紫外辐射也包含在本发明内。最有可能的是，所 有的这些因素在大范围内对DNA， DNA前体，DNA复制和修复，以及染色体 的组装和维护上造成损伤。X-射线的剂量范围由在延长期间(3-4周)内 的50-200伦琴的日剂量到2000 - 6000伦琴的单一剂量范围内。放射性同位元素的剂量范围变化很大，并取决于同位素的半衰期，发射的辐射的 强度和类型，以及癌细胞的摄取量。
术语"接触的"和"暴露的"当用于细胞时，是用于描述治疗构建和 化疗或放疗试剂被输送给目标细胞或置于与目标细胞直接毗邻处的过程。 为获得细胞伤亡或停滞，两种向细胞输送的试剂均釆用了能有效杀死细胞 或防止其分化的结合量。
C) 免疫疗法
本发明的APC可与其他形式的免疫疗法结合施用。免疫疗法一般是基 于《吏用以癌症细胞为目标并将其摧毁的免疫效应物细胞和分子。免疫效应 物可以是例如某些紳瘤细胞表面的标记物的特异性抗体。抗体本身可作为 治疗的效应物，或其也可聚集其他细胞来对细胞杀伤产生实际影响。抗体 也可与药物或毒素(化疗法，放射性核，蓖麻毒素A链，霍乱肠毒素，百 日咳毒素等)连接而仅作为目标试剂。或者，效应物可以是携载与肿瘤细 胞目标直接或间接作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应物细胞包括细胞 毒素的T细胞和NK细胞。
d) 基因
辅助治疗可以为基因疗法。例如，基因疗法可以是编码肺瘤细胞抗原 全长或截耳又部分的载体。
e) 手术
大约60%的癌症患者会经历某种类型的手术，它们包括预防类型的， 诊断类型的或分段的，治疗的或减轻的手术。治疗的手术是一种可与其他 疗法如本发明的疗法，化疗，放疗，荷尔蒙疗法，基因疗法，免疫疗法和 /或替换疗法联合使用的癌症治疗方法。
治疗手术包括将癌症组织全部或部分物理移除，切离，和/或摧毁的切 除术。胂瘤切除术是指物理除去至少部分肺瘤。如上面提到的，切除的肺 瘤用于生产癌症细胞裂解物以用于负载到对癌症患者治疗中使用的APC 上。除了肺瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术，冷冻手术，电手术， 以及显微(miscopically )控制的手术(莫式手术)。本发明进一步还可组合用于与表面皮癌，初癌或伴随量的正常组织的除去。
在部分切除所有癌症细胞，组织或肺瘤后，可在体内形成空腔。这可 通过向该区域注射，直接注射或局部使用额外的抗癌症疗法来进行治疗。
这种治疗例如可每l, 2, 3， 4, 5, 6,或7天，或每l, 2， 3, 4,和5 周，或每1， 2， 3， 4, 5， 6, 7， 8， 9， 10， 11，或12个月重复进行一 次。这些治疗同样也可采用不同的剂量。
f) 其他试剂
预期其他试剂也可与本发明组合使用以提高治疗效果。这些附加试剂 包括其他的免疫调节试剂，影响细胞表面受体和GAP连接向上调节的试剂， 抑制细胞生长和分化的试剂，细胞附着抑制剂，或增加过度增殖细胞对凋 亡诱导物敏感性的试剂。免疫调节试剂包括肺瘤坏疽因子，干扰素oc， p， 和Y; IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1 oc, MIP-1P, MCP-l, RANTES,以及其他细胞激素。进一步预期细胞表面受体 或它们的配体例如Fas / Fas配体，DR4或DR5 / TRAIL的向上调节将通 过在建立对过度增殖细胞的自体分泌或旁分泌影响而加强本发明的凋亡 诱导能力。通过提高GAP连接数而增加细胞内信号的发送将会增强对临近 过度增殖细胞数目的抗增殖效果。在另外的实施方式中，抑制细胞生长和 分化的试剂可与本发明组合使用以提高治疗的抗过度增殖效果。细胞附着 抑制剂，例如整合素和钧粘附素阻断抗体，均预期可提高本发明的效果。 细胞附着抑制剂的例子有粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他丁 (Lovastatin)。进一步预期其他增强过度增殖细胞对凋亡的壽丈感性的试 剂，例如抗体c225，可与本发明组合使用以改善治疗效果。
荷尔蒙疗法也可与本发明组合使用或与前面描述过的任何其他的癌症 疗法组合。荷尔蒙的使用可在某些癌症如乳癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫 颈癌的治疗中被用于降低某些荷尔蒙如睾丸激素或雌激素的水平或阻断 它们的作用。这种治疗通常与至少一种其他癌症疗法组合使用作为选择性 治疗方案或降低转移的危险。
2. 抗菌剂在一些实施方式中，"抗菌剂，，可用于与负载了微生物的APC组合以 增进疫苗的效力。抗菌剂可包含抗生素，抗真菌剂，以及抗病毒剂。
抗生素抑制^f效生物的生长，但对宿主无损害。例如，抗生素可抑制细
胞壁合成，蛋白质合成，核酸合成，或改变细胞壁功能。可能与APC组合 使用的抗生素的类别包括但不限于大环内酯物(即红霉素)，青霉素(即 萘夫西林)，头孢菌素(即头孢唑啉)，碳青霉烯类(即亚胺培南，氨曲 南)，其他的P -内酰胺抗生素，|3 -内酰胺抑制剂(即舒巴坦)，噁啉(即 利奈唑酮)，氨基糖香类(即庆大霉素)，氯霉素，磺酰曱胺(即磺胺曱 噁唑)，糖肽(即万古霉素)，查诺酮(即环丙沙星)，四环霉素(即二 曱胺四环素)，褐霉菌酸，曱氧千啶，曱硝唑，克林霉素，莫匹罗星，利 福霉素(即利福平)，链阳霉素(即奎奴普汀和达福普汀)，脂蛋白(即 达托霉素)，多烯类(即两性霉素B)，氮杂茂(即氟康唑)，以及l束球 白素(即醋酸卡泊芬净)。
抗病毒剂也可与负载的APC组合使用来治疗和/或预防病毒感染或疾 病。这类抗病毒剂包括但不限于蛋白酶抑制剂(例如沙奎那维，利托那韦， 安普那韦)，逆转录酶抑制剂(例如叠氮胸苷(AZT) , lamioridine (3TC)， 地丹诺辛(ddl),双脱氧胞嘧咬核苷(ddC)，齐多夫定)，核苷类似物(例 如阿昔洛韦，喷昔洛韦)。
在一些实施方式中，抗真菌剂可与负载的APC组合^f吏用以治疗和/或预 防真菌感染。这类4元真菌剂包4舌两斗生審素B (Amphocin , Fungizone ), 布康哇(Femstat ),克霉峻(Mycelex , Gyne-Lotrimin , Lotrimin , Lotrisone ),氟康唑(Diflucan ),氟胞嘧咬(Ancobon )，灰黄霉素 (Fulvicin P/G ， Grifulvin V ， Gris-PEG ),伊曲康哇(Sporanox ), 酮康唑 (Nizoral ), 咪康唑 (Femizol-M , Monistat ), 制霉菌素 (Mycostatin ),特比萘芬(Lamisil ),特康喳(Te razol ), 或漆康 峻(Vagistat⑧)。
L.实施例
以下实施例用于说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理技术，因此被认为是优选的实施模式。然而，本领域技术人员应当在本公 开的基础上认识到，可对公开的具体实施方式
作出许多变化，而这些变化 在不脱离本发明的精神和范围之下仍将产生类似的结果。
实施例1
鼠DC的分离
从8-12天大的Balb/C鼠中分离出由DC产生的鼠骨髓。除去鼠的胫 骨和大腿骨并洗净。用组织培养介质冲洗骨而收集骨髓细胞。通过离心分 离使细胞形成沉淀物，并重新悬浮于红血球溶解緩冲液(ACK， Sigma)中。 用PBS洗细胞两次，然后以5 x 106细胞/ml置入含AIM-V培养基的培养 皿中，AIM-V介质中补充有L-谷酰胺，青霉素和链霉素，0. 2°/。的人类血清 蛋白，30 ng/ml的鼠GM-CSF，以及10 ng/ml的鼠IL-4。 培养三天后， 向培养基中加入GM-CSF和IL-4分别达到25 ng/ml和10 ng/ml的最终 浓度。再经过3天培养(第6天)后，介质用新鲜的含GM-CSF和IL-4 分别为25 ng/ml和10 ng/ml以及先前使用的其他补充物的介质替代。 再经过2-4天后，汇集悬浮液中的细胞和所有贴壁细胞并计算数目，贴壁 细胞通过胰蛋白酶化收集。用焚光激活细胞分选(FACS)分析汇集的细胞 中以下标记物的存在CD3, CD14， MHC II类标记物，CD80， CD86，和 CDllc。基于表达这些标记物的细胞的百分比例，汇集细胞中大约85%为
实施例2 人DC的分离
采用标准步骤通过离心分离从人外周血中分离出由人单核细胞产生的 DC。清洗分离的巨噬细胞(约5xl()8个)，并以5 x 106/ml置入含AIM-V 介质(Invitrogen)的培养皿中，AIM-V介质中补充有组织培养用的标准 浓度的L-谷酰胺，青霉素和链霉素，0. 2%的人类血清蛋白，2.0%的自体 血浆，30 ng/ml的人GM-CSF,以及10 ng/ml的人IL-4 (后两种生长因子 来自R&D系统)。单位表面积的平均细胞数为107185 cm2。
培养三天后，向培养基中加入GM-CSF和IL-4分别达到25 ng/ml和
3910 ng/ml的最终浓度。再经过3天培养(第6天)后，介质用新鲜的含 GM-CSF和IL-4分別为25 ng/ml和10 ng/ml以及先前使用的其他补充 物的介质替代。再经过2-4天后，汇集悬浮液中的细胞和所有贴壁细胞并 计算数目，贴壁细胞通过胰蛋白酶化作用收集。用荧光激活细胞分选 (FACS)分析汇集的细胞中以下标记物的存在:CD3, CD14, MHC II类标 记物，CD80， CD86,和CDla。基于表达这些标记物的细胞的百分比例， 汇集细胞中大约85%为DC。
此时用低温存储器将细胞冷冻起来。使用时， 用37°C的水浴快速融化细胞，并收集在AIM-V介质中。在1000 x g下旋 转细胞1G分钟并计数，得到在EP緩沖液的5xl07细胞/ml (EP緩冲液 125mM KC1， 15mM NaCl, 25mM HEPES， 1. 2mM MgCl2, 3mM葡萄糖)。通过 电穿孔向收集到的DC负载全细胞裂解物，或用作对照样品而进行电穿孔 但不负载全细胞裂解物，并以5xl07细胞/ml的浓度重新悬浮于EP緩沖 液中。
实施例3
由RENCA， B16-FIO， LLC或A375肿瘤细胞制备裂解物
将小鼠肾癌细胞系(RENCA)，黑素瘤(B16-F10), Lewis肺癌(LLC) 或A375人黑素瘤细胞在活体外培养，生长并通过胰蛋白酶化作用收集， 在磷酸緩冲盐水(PBS)中清洗，然后将1 00 x 1 06个细胞重新悬浮于lml 的最终体积中得到1 00 x 106细胞/ml。然后使用干水/乙醇浴和37°C的 水浴，将细胞进行5次快速冷冻和融化循环，通过冷冻/融化裂解细胞。 也可通过向鼠注射1 x 106这些肿瘤细胞，等1-2周使肿瘤在皮下生长， 然后解剖所得肿瘤体，进行与上面描述相同的冷冻/融化周期来制备肿瘤 裂解物。在冷冻-融化后，裂解物在室温下以13,000 x g离心分离10分 钟，然后将上清液转移到1.5 ml的塑料离心试管(Eppendorf)中。除去 上清液并在-8(TC下冷冻供日后使用。从起始数目的细胞和最终回收到的 裂解物，计算出每毫升的细胞等同物材料的浓度。该计算没有对在冷冻/ 融化过程后的离心分离中间减少的形成沉淀物的细胞材料进行校准。
实施例4
用于抗原负栽的DC的制备通过电穿孔向收集到的DC负载细胞裂解物，或用作对照样品而进行电
穿孔但不负载细胞裂解物，并以5x10'细胞/ml的浓度重新悬浮于EP缓 沖液中，总体积为200|ul。加入肿瘤细胞裂解物并与上述悬浮于EP緩沖 液中的DC混合，提供每10个DC对应肿瘤细胞裂解物的一个细胞等同物。
实施例5
使用A375人黑素瘤裂解物的人DC的细胞负载方法
\以每一个肿瘤细胞裂解物的细胞等同物对应10个DC的比例，向EP 緩沖液中的细胞中加入按上面描述的方法由A375人黑素瘤细胞制备的全 肿瘤裂解物，在后面的情况下是每一个肺瘤细胞裂解物的细胞等同物对应 1个DC。 在装配有间隔3 mm的镀金电极的比色皿中对DC和肺瘤细胞裂 解物进行电穿孔，电穿孔采用的是间隔为1秒的四次脉冲，每次脉冲电压 为600伏特并持续400微秒。电穿孔后，细胞在37°C培育20分钟。在 上述条件下对未加入肿瘤裂解物的DC悬浮液进行电穿孔。经电穿孔的DC 一皮置于含5 ng/ml TNFa, 1 pg/ml PGE和1 ng/ml IL-ip的培养皿中过 夜(24小时)， -使DC成熟。次日，收集DC并再次计数，用AIM-V洗一 次。
来自与分离出DC同一供体的外周血淋巴细胞(PBL)被分离出，并在 补充了 2%的自体血浆的AIM-V介质中培养。收集T细胞并计数。将上述 PBL重新悬浮于含20 U/ml IL-2和10 ng/ml IL-7的AIM V中，得到 浓度为5 x 106 /ml。向标准的96孔微量滴定板中加入100微升的经电穿 孔或与全肺瘤裂解物共培养的DC或经电穿孔但未加入全肺瘤裂解物的DC, 使每孔中含5 x 104个细胞。向含有DC的每个孔中加入以上制备的PBL 悬浮液，使每孔中含5 x 105个细胞。向剩余的孔中仅加入PBL,或仅加入 DC，或者制备出用10 |ug/ml PHA (植物血凝素)刺激的PBL作为对照。
将未用于以上步骤中的DC低温冷冻起来。上述DC和PBL的混合物(或 在对照中的向孔中加入的单一类型的细胞)在标准的细胞培养条件下培育 7天。7天后，融化上述冷冻的DC并计数。将这些细胞转移到含5 x 105细胞/ml的IL-2和IL-7的AIM-V介质中。向以前接受过DC的每一个孔中 加入IOO微升的这些融化的DC。这些细胞再额外培育两天。然后在2400 x g下离心分离细胞5分钟，收集上清液。将沉淀物重新悬浮于含IO ng/ml IL-2的200 |a 1 AIM中。
实施例6
使用活体外eli spot检验测量抗原负载后的电穿孔的细胞
按厂家说明，将重新悬浮的细胞转移到含有涂布了抗-IFN y抗体的过 滤器的ELISPOT培养皿中，并在37。C下培育过夜。ELISPOT ;f企验的剩余 步骤按厂家说明的标准步骤进行，用解剖显微镜检测和计数产生的点。
上述结果表明，用电穿孔在肿瘤裂解物存在下刺激DC产生的对T细胞 的刺激比无电穿孔而将DC与肿瘤裂解物共培养时更高，这可通过ELISPOT 和ELISA得到i正实。
实施例7
对dc负载fitc-清蛋白和fitc-右旋糖苷
可向DC负载异硫氰酸焚光素(FITC)连接的清蛋白(分子量约68 kD) 和FITC标记的右旋糖苷(分子量250 kD),并可对培养不同时期的共培养 与电穿孔进行比较。DC (由CDla和II类MHC表达确认)与lmg/ml FITC-右旋糖香在电穿孔緩沖液中约2 x 107细胞/ml的细胞浓度下培育。细胞 或者在37°C下培育或者经电穿孔(15 jul/EP)。 EP后，在37°C回收细 胞。在不同长度的时间后(30分钟，1小时，2小时)，用温热的PBS 洗细胞3次，然后在完全培养基中培育。在最后的时点之后，收集细胞并 用流式细胞仪分析FITC-右旋糖苷摄入和细胞活性。细胞活性在评价的所 有时点均不受EP影响(图1)。在无EP时("无EP")未观察到摄入， 而对EP ( "EP，，后)观察到55-60%的摄入。
使用FITC-清蛋白的实验与使用FITC-右旋糖苷的实验是相似，不同之 处在于^f吏用了 0.5 mg/ml的FITC-清蛋白，且包括了 4个小时的时点。细 胞活性未受到电穿孔的显著影响(图2) 。 FITC-清蛋白的摄入对于电穿孔 的细胞在1小时趋于平緩并摄入达80% (图2)。共培养的细胞在4小时达到可比较的摄入。
实施例8
肿瘤细胞裂解物负载的人DC引起的T细胞响应
如上所述分离出由人单核细胞得到的DC。用细胞因子(人GMCSF,人 IL-4)处理DC七天，对DC标记物(MHC, CDla, CD80/CD86)以及缺乏表 达的其他标记物(CD3, CD14)进行FACS。 A375黑素瘤的肿瘤裂解物用上 面描述的技术制备及冷冻储存待用。然后将DC与肿瘤裂解物在EP緩冲液 中共同培育，釆用DC:肿瘤细胞等同物为10:1和1: 1的比例。然后对细 胞或者进行电穿孔或者简单地在37°C下共同培育。
30分钟后，将所有细胞离心分离并用PBS洗。然后将DC与含有TNFoc， IL-1，和PGE的培养基置入培养皿中使DC成熟。24小时培育后，收集DC 和包括T细胞的自体的PBL,并在96孔中以不同的的比例与IL-2和IL-7 进行共同培养。DC的一部分冷冻用于后面的再刺激。DC与T细胞的使用 比例为1:100。 l周后，加入先前在IL-2存在下冷冻的抗原负载了 DC对 T细胞进行再刺激。总共过2周后，收集上清液用于ELISA以产生IFNY, 而T细胞被转移到ELISP0T检测培养i。 DC不产生任何的IFNy。实验对 照仅包含T细胞以及仅包含DC,用佛波醇酯刺激的T细胞作为阳性对照。 其他对照包括与DC共同培育的并未与任何其他肿瘤裂解物混合的T细胞。 图3中的结果显示出电穿孔介导的负载了全肿瘤细胞裂解物的DC比共同 培育的DC引起了更强烈的T细胞响应。图4表明负载了全肿瘤细胞裂解 物的DC比共同培育的DC引起了更强烈的自动T细胞反应。
实施例9
使用抗原负载的鼠DC的鼠的免疫疗法
按前面所述进行鼠骨髓DC的分离。对分离的DC负载了前面描述鼠肾 癌细胞(RENCA)肿瘤裂解物。电穿孔后，细胞在37。C培育20分钟。同时， 按为进行电穿孔那样准备DC和黑素瘤裂解物的混合物，但将它们在37°C 共同培育30分钟而非进行电穿孔。将每种混合物中的DC转移到2 ml的补充了 50 ng/ml的鼠GM-CSF, 50 ng/ml的鼠TNFcx, PGE (1 pg/ml)和 hIL-ip (1 ng/ml) (人IL-1与鼠交叉反应)的AIM-V培养基的培养 皿中，并在37°C培育过夜。次日，通过胰蛋白酶化作用收集上述DC计数 及用PBS洗一次，并重新悬浮于PBS中得到1 x 107细胞/ml的浓度。将 100微升的上述细胞的细胞悬浮液(1 x106个细胞)皮下注射到Balb/C 鼠背部左侧。
总共对20只鼠进行注射，其中5只鼠未接受DC, 5只鼠接受了在无肿 瘤细胞裂解物存在下进行了电穿孔的DC, 5只鼠接受了与无肿瘤细胞裂解 物共培养但未电穿孔的DC，和5只鼠接受了在肿瘤细胞裂解物存在下进行 了电穿孔的DC。 12天后，向所有的20只鼠的背部右侧注射在培养基中生 长的lx 105 RENCA细胞(每一注射的总体积是100微升)。在注射RENCA 细胞后10天，每两周对肿瘤测量一次，利用机械测距尺在RENCA细胞注 射部位处或附近测量肺瘤的垂直轴(给出面积或mm2)。每个肿瘤的肿瘤 体积按以下标准公式计算体积=兀 x长度x宽2/6 (Heller等， 2002)
10天后，接受通过电穿孔而负载肺瘤裂解物的DC的鼠中肿瘤平均尺 寸比接受通过共同培育而负载肿瘤裂解物的DC或接受未负载肿瘤细胞裂 解物或未接受任何DC的鼠中肿瘤小50%。这些研究表明，这种电穿孔负载 的DC具有增强的提高对生长的肿瘤细胞的免疫响应的能力，因而通过电 穿孔负载DC比通过共同培育负载更为有效。10天后，这些缩小的肿瘤面 积(或体积)还持续了几天(图5 )。
实施例10
用DC分离和刺激脾细胞
如上所述从C57BL6雄性鼠中分离出DC。分离出的DC用鼠黑素瘤 (B16-F10)裂解物按之前的描述以1个肿瘤细胞IO个DC的比例进行电 穿孔。向C57鼠的DC负载不相关物或对照物(例如肝)的裂解物作为对 照。经过电穿孔后，细胞在37 C培育20分钟。同时，按为进行电穿孔 那样准备DC和黑素瘤裂解物的混合物，但将它们在37。C共同培育30分钟 而非进行电穿孔。将每种混合物中的DC转移到2 ml的补充了 25 ng/ml的鼠GM-CSF, 25 ng/ml的鼠TNF cx ， 25 ng/ml的鼠干扰素y , 5 pg/ml 的脂多糖(LPS)和PGE (1 pg/ml)的X-VIVO 15培养基中。细胞植入低 附着培养亚中，并在37°C培育过夜。次日，收集DC计数及用PBS洗一次， 并重新悬浮于X-VIVO 15培养基中得到2 x 106细胞/ml的浓度。将500|aL 的上述细胞的细胞悬浮液(1 x 106细胞)植入24孔低附着组织培养孔的 培养皿中。多余的DC以2 x 1 06 - 4 x 1 06细胞/冷冻小瓶进行冷冻储存 用于重新刺激。
从正常C57BL6鼠的切开的脾中分离出脾细胞。切开的脾用PBS洗一次。 然后，用无菌槌强制使脾通过金属筛网过滤器。筛网过滤器用PBS洗两次。 收集细胞悬浮液，在200 xg下离心分离10分钟，然后重新悬浮在10mL ACK红血球裂解溶液中，并在200 x g下再次离心分离IO分钟。用PBS 洗细胞一次，重新悬浮于补充了 10。/。FBS的RPMI培养基中并在37 C在 培养皿中培养2小时。培养2小时后，收集悬浮的细胞并计数；抛弃任何 粘附的细胞。将脾细胞(悬浮细胞)重新悬浮在X-VIVO 15 (Cambrex)培 养基中，得到浓度为2 x 107细胞/ml。如上面的描述，向含有DC的各24 孔中加入500 (il (10 x 106细胞)的脾溶液(经电穿孔的，或与B16黑 素瘤细胞裂解物共同培育的或在无裂解物下电穿孔的DC)。所得细胞比例 是1个DC: 10个脾细胞。向各孔中加入鼠IL-2，鼠IL-7和鼠GM-CSF, 使最终浓度为25 ng/ml。
每隔7天，将一个裂解物负载的DC小瓶在37 C下迅速融化并重新 悬浮于X-VIVO培养基中。DC计算并重新悬浮得2 x 106DCs/ml。向含有 DC和脾细胞的24孔中加入500 |liL的每种DC样品(1 x 106个DC)。在 每次重新刺激时加入鼠IL-2，鼠IL-7和鼠GM-CSF (各25 ng/ml )。 在最初的DC和脾细胞的共培养后每个7天进行一次重新刺激，总共进行3 次。
在第三次重新刺激后的7天之后，从标准24孔盘的各孔中收集脾细胞， 用PBS洗并计数。流式细胞分析表明>95%的细胞为CD3阳性T细胞。在 不同细胞浓度，将脾细胞再次悬浮在补充了 10% FBS的RPMI培养基中。实施例11
全肿瘤裂解物电穿孔的DC在活体外导致毒害细胞的淋巴细胞并引起
肿瘤特异性杀伤
对肺瘤细胞进行标记。通过胰蛋白酶化作用收集B16-Fl G黑素瘤细胞， 用PBS洗一次并重新悬浮于补充了 5% FBS的RPMI培养基中，最终细胞 浓度为1 x 107细胞/ml。 将100 |Lil的B16-F10黑素瘤细胞(1 x 106)转 移到新的1.5ml塑泮牛樣史离心分离管(Eppendorf)中。向这些细胞中加入 100 ml的存储浓度为1 m居里/ml的铬-51 (51Cr)水溶液(最终浓度为 100微居里)。在37 C下细胞用51Cr标记1小时。然后，用完全培养基 洗"Cr标记的细胞5次，并重新悬浮于补充了 10%FBS的RPMI培养基中， 得最终细胞浓度为1 x 105细胞/ml。
为引起特异性细胞介导的杀伤，在标准U-形底的96孔培养亚中的每 一个孔中植入10,000个标记的肺瘤细胞(100 iliL的1 x 1 05 51Cr-标记 的B16细胞)。上面得到的脾细胞与标记的肿瘤细胞在以下比例下共培 养1个肿瘤细胞10 (1 x 1G5)个脾细胞；1个肿瘤细胞50 (5 x 105) 个脾细胞或1个肿瘤细胞100 (1 x 106)个脾细胞。如上描述的共培 养的细胞在37C下培育4小时。此后，对96孔培养皿以200 x g短 暂旋转，将各样品中100 pl的上清液加入含2 ml闪烁液的闪烁小瓶中。 通过分析孔中仅含标记的肿瘤细胞(无脾细胞)的上清液来确定5ICr的自 发释放。51Cr从标记的肿瘤细胞中的最大释放是通过加入100 pL的2% Triton X-100洗涤剂到多余的仅含标记的肺瘤细胞的孔中确定的。用闪 烁计数器对每个样品读数1分钟。结果根据以下公式进行更正，其中ER 是实验释放；SR是自发释放；而MR是最大释放
%特异释放=[(ER—SR) / (MR-SR) ] x 100。
其中，实验释放(ER)是由96孔培:^中每个孔的结果得到。在不同 的孔重复测试样品。测试样品的统计显著性由学生成对T检验确定。
如图6中所示，仅在电穿孔的DC组观察到了肺瘤的杀伤，而在共培养 组或无裂解物组中未观察到。以前的报道中显示，肺瘤裂解物的共培养可为CTL响应作准备，但需要较高的肿瘤/DC比例。尽管以前的报道对每个 DC使用了 1个肿瘤细胞，或对每个DC使用了 3个肿瘤细胞，这里给出的 数据证明对每10个DC用1个肿瘤细胞就足以引起CTL响应。这种用于 每个DC的肿瘤裂解物的量比先前使用的肿瘤裂解物少10或30倍。
实施例12
全肿瘤裂解物电穿孔的DC在治疗的鼠模型中防止肺转移瘤
首先对C57BL6鼠静脉注射(尾静脉)5 x 105Lewis肺癌(LLC)细胞。 已知静脉注射这些细胞以S1起迅速的肿瘤生长并伴有快速的肺转移瘤的 形成。
如上所述/人C57BL6雄性鼠中分离出DC。如先前在RENCA裂解物中描 述的那样，通过电穿孔向分离的DC负载鼠Lewis肺癌(LLC)裂解物。用 不相关的(全肝)裂解物负载的DC作为对照。经过电穿孔后，细胞在37 C培育20分钟。同时，按为进行电穿孔那样准备DC和黑素瘤裂解物的 混合物，但将它们在37°C共同培育30分钟而非进行电穿孔。将每种混合 物中的DC转移到2 ml的补充了 25 ng/ml的鼠GM-CSF, 25 ng/ml的鼠 TNFa,25ng/ml的鼠干扰素Y, 5 |ig/ml的脂多糖(LPS)和PGE (1 pg/ml) 的X-VIVO 15培养基中。细胞植入低附着盘中，并在37。C培育过夜。次 曰，收集上述DC计数和用PBS洗一次，并重新悬浮于X-VIVO 15培养基 中得到1 x 107细胞/ml的浓度。
对鼠注射LLC三天后，向接受了 LLC的鼠尾动脉中注入IOO |al (1 x 106) 的裂解物负载的DC。再过3天后(第6天)，第二次给予鼠l x 106裂解 物负载的DC。 一组鼠未给予任何的DC (无DC对照)作为对照。在LLC 注入后的第15天，杀死鼠和解剖其肺并称重。肺的重量被用作每组肺转 移瘤程度的指标。没有用LLC激发的鼠被用于测量这些鼠的正常(无肿瘤) 的肺的重量。如图7中所示，与无DC对照组(p<0. 01)相比，施用了用 LLC裂解物电穿孔的DC导致在LLC肺转移瘤上的约5W的显著降低。相反， 用肝裂解物电穿孔的DC或与LLC裂解物共培养的DC却没有显示出对肺转 移瘤有任何影响。实施例13
使用癌症裂解物负栽的人抗原提呈细胞治疗人为研究对象的癌症。
该实施例描述了使用负载了癌症细胞裂解物的人APC促进对人癌症患 者治疗的实验方案。在一些实施方式中，APC是人的DC。 患者可以但无 需在事先接受化学，放射或基因疗法治疗。最理想的是患者表现出足够的 骨髓功能(定义为外周绝对粒细胞数〉2，000/mm3以及血小板数为 100, 000/腿3)，足够的肝功能(胆红素1.5mg/dl)，以及足够的肾功能 (肌氨酸酐1. 5mg/dl )。本领域技术人员将在本说明书基础上将能够明白 如何分离和负载APC。
组合物可经肠胃外以含标准的已知无毒的生理上可接受的载体，佐剂， 和赋形药的单位剂量形式施用。这里使用的术语肠胃外包括皮下注射，静 脉内，肌肉内，动脉内注射，肿瘤内或注射技术。组合物可单独施用或与 包含其他免疫疗法的其他疗法组合。当所指的是组合疗法预期时，组合物 可在其他抗癌试剂施用之前，之后或同时施用。
在一例中，治疗过程可包含在7-21天内输送的六次剂量。在临床医 生的选择下，可每三周或以更小的频率(每月，二个月， 一季度等)继续 六次剂量的治疗。当然，这些仅是对治疗时间给出的例子，本领域技术人 员将分容易认识到也可用其他的时间。
临床响应可通过本领域技术人员知道的可接受的测量来定义。例如， 完全响应可由在至少一个月内所有可测量疾病的消失来定义。而部分响应 可由所有可评^T的肺瘤结的垂直直径乘积的和减小50%或更多，或在至少 一个月内无肿瘤部位显示出增大来定义。类似地，混合响应可由所有可测 量的病变的垂直直径乘积的和减小50%或更多，并且病变在一处或多处有 发展来定义。本领域技术人员将能够根据本说明书中公开的信息来对治疗 方案加以最佳化。
实施例14
癌症裂解物负载的人DC在治疗癌症中的临床试验
本例关注的是使用负载了肿瘤裂解物的人的DC在治疗人类癌症中的治疗方案的发展。鉴于本发明本领域技术人员将能掌握包括对患者的治疗 和监控在内的临床试验的各项要件。以下信息作为使用负载了癌症裂解物
的人APC如DC在与癌症治疗相关的临床试验中的一般通则。
被选择进行临床研究的癌症患者通常是对至少 一种传统治疗无响应。 所得疾病不需要是可测量的。
组合物可单独施用，或与其他化疗试剂组合施用。施用例如可以是通 过导管的静脉施用。
DC和/或抗癌试剂组合可在短的注射时期内施用，或在超过7-n天的 时期内以稳定的速率注射。注射可单独施用，或与抗癌药物组合施用。以 任何剂量水平进行的注射都将取决于每次注射后产生的毒性。增加向患者
组施用的与抗癌药物组合使用的剂量直至在约60%的患者中显示出不可接 受的毒性为止。
应当在治疗之前以及治疗之后每隔约3-4周内进行体岸企，肿瘤测量， 以及实马全室才企测。实验室研究应当包括CBC，微分和血小板计数，免疫水 平，尿分析，SMA-12-100 (肝和肾功能测试)，凝结水平，以及任何其他 的化学研究以确定疾病的程度，或决定导致存在症状的原因。并且也可 监控血清中适当的生物标记物。
为了监控病程以及评价抗肿瘤响应，在起初不正常的情况下，应当对 患者每隔4周检查一次适当的肿瘤标记物。实验室研究如CBC,微分和血 小板计数，凝结水平，和/或SMA-12-IOO应当每周都进行。适合的临床研 究，例如放射学研究和免疫研究应当每隔8周进行一次来评价肿瘤响应。
临床响应可由可接受的测量来定义。例如，完全响应可由在至少一个 月内所有可测量疾病的消失来定义。而部分响应可由所有可评价的肿瘤结 的垂直直径乘积的和减小50°/。或更多，或在至少一个月内无肿瘤部位显示 出增大来定义。类似地，混合响应可由所有可测量的病变的垂直直径乘积 的和减小50°/。或更多，并且病变在一处或多处有发展来定义。
这里公开的和要求保护的所有组合物和方法均可在本公开基础上得以
49实施而无需进行过度实验。尽管本发明的组合物和方法已经以优选的实施 方式进行了描述，但在不脱离本发明的概念，精神和范围之内可对组合物 和方法以及方法的步骤及步骤顺序的改变对本领域技术人员将是显而易 见的。更具体地，显然某些在化学和生理学上相关的试剂可用于替代这里 描述的试剂而获得相同或类似的结果。在后附权利要求来定义，所有这些 对本领域技术人员显而易见的类似替代物以及变化均应包含并限定的在 本发明的精神，范围和概念之内。参考文献
以下参考文献所提供的补充这里所描述内容的示例性步骤或其它细节 经引用而并入。
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权利要求
1.一种向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原的方法，包括a)制备一种包含有抗原提呈细胞和裂解物的混合物，该裂解物具有一个或多个过度增殖细胞的抗原，受微生物感染的细胞的抗原或微生物的抗原，其中抗原提呈细胞的数目大于裂解物中代表的细胞数；以及b)以足够将一个或多个抗原负载到抗原提呈细胞中的方式电穿孔混合物。
2. 权利要求1的方法，其中抗原提呈细胞是树突状细胞。
3. 权利要求l的方法，其中微生物是病毒，细菌，真菌，或原生 动物。
4. 权利要求l的方法，其中受微生物感染的细胞是被病毒，细菌， 真菌，或原生动物感染的细胞。
5. 权利要求1的方法，其中裂解物是使用非洗涤剂处理制备的。
6. 权利要求5的方法，其中非洗涤剂处理选自由冻融法，超声波 降解法，高压挤出法，固体剪切法，液体剪切法，以及低渗/高渗法组成 的组。
7. 权利要求l的方法，其中一个或多个抗原为与肿瘤相关的抗原。
8. 权利要求7的方法，其中与肿瘤相关的抗原是重组的与肺瘤相 关的抗原。
9. 权利要求1的方法，其中过度增殖细胞是肿瘤细胞。
10. 权利要求9的方法，其中肿瘤细胞是自体的肿瘤细胞。
11. 权利要求9的方法，其中肿瘤细胞是同种异体肿瘤细胞。
12. 权利要求9的方法，其中肿瘤细胞进一步被定义为癌细胞。
13. 权利要求12的方法，其中癌症细胞为乳癌细胞，肺癌细胞，前列腺癌细胞，卵巢癌细胞，脑癌细胞，肝癌细胞，宫颈癌细胞，结肠癌细 胞，肾癌细胞，皮肤癌细胞，头颈癌细胞，骨癌细胞，食道癌细胞，膀胱 癌细胞，子宫癌细胞，淋巴癌细胞，胃癌细胞，胰腺癌细胞，睾丸癌细胞， 或白血病细月包。
14. 权利要求3的方法，其中微生物是病毒。
15. 权利要求3的方法，其中微生物是细菌。
16. 权利要求3的方法，其中微生物是真菌。
17. 权利要求3的方法，其中微生物是原生动物。
18. 权利要求4的方法，其中受微生物感染的细胞是被病毒感染的 细胞。
19. 权利要求4的方法，其中受微生物感染的细胞是被细菌感染的 细胞。
20. 权利要求4的方法，其中受微生物感染的细胞是被真菌感染的 细胞。
21. 权利要求4的方法，其中受微生物感染的细胞是被原生动物感 染的细胞。
22. 权利要求1的方法，其中裂解物是使用洗涤剂制备的。
23. 权利要求13的方法，其中癌细胞是肾癌细胞。
24. 权利要求13的方法，其中癌细胞是皮肤癌细胞。
25. 权利要求13的方法，其中癌细胞是肺癌细胞。
26. 权利要求13的方法，其中癌细胞是乳癌细胞。
27. 权利要求13的方法，其中癌细胞是白血病细胞。
28. 权利要求13的方法，其中癌细胞是前列腺癌细胞。
29. 权利要求l的方法，其中抗原提呈细胞的数目与由裂解物代表 的细胞的数目之比在2:1到150:1之间。
30. 权利要求1的方法，其中抗原提呈细胞的数目与由裂解物代表的细胞的数目之比在5:1到100:1之间。
31. 权利要求1的方法，其中电穿孔混合物包括静电穿孔。
32. 权利要求l的方法，其中电穿孔混合物包括流式电穿孔。
33. —种治疗或预防研究对象中的疾病的方法，包括a ) 使用电穿孔向抗原提呈细胞负载裂解物，该裂解物 一个 或多个过度增殖细胞的抗原，微生物的抗原，或受微生物感染 的细力包的抗原；b) 制备所述抗原提呈细胞的组合物；及c) 向有需要的研究对象施用有效量的所述组合物。
34. 权利要求33的方法，进一步包括培养抗原提呈细胞。
35. 权利要求33的方法，其中研究对象是哺乳动物。
36. 权利要求33的方法，其中研究对象是人。
37. 权利要求33的方法，其中疾病是过度增殖疾病。
38. 权利要求37的方法，其中过度增殖疾病是肿瘤。
39. 权利要求38的方法，其中肿瘤是癌症。
40. 权利要求39的方法，其中癌症是乳癌，肺癌，前列腺癌，卵巢 癌，脑癌，肝癌，宫颈癌，结肠癌，肾癌，皮肤癌，头颈癌，骨癌，食道 癌，膀胱癌，子宫癌，淋巴癌，胃癌，胰腺癌，睾丸癌，或白血病。
41. 权利要求33的方法，其中研究对象正在经历二级抗增生疗法。
42. 权利要求41的方法，其中二级抗增生疗法为化疗法，放射疗法， 免疫疗法，光疗法，冷冻疗法，毒素疗法，荷尔蒙疗法，或手术。
43. 权利要求33的方法，其中组合物经全身性，静脉内，皮内或皮 下输送。
44. 权利要求33的方法，其中組合物局部输送至肿瘤体内。
45. 权利要求33的方法，其中抗原提呈细胞包括树突状细胞。
全文摘要
公开了向抗原提呈细胞负载一个或多个抗原的方法。采用了一种经电穿孔而具有一种含有一个或多个抗原的组合物的抗原提呈细胞来治疗和预防研究对象中的疾病的方法。还公开了一种含有一个或多个抗原的组合物，该组合物包含一个或多个过度增殖细胞，微生物或受微生物感染的细胞的抗原。此外，还公开了用电穿孔而负载了一个或多个过度增殖细胞，微生物或微生物感染的细胞的抗原的抗原提呈细胞的组合物。
文档编号A61K39/00GK101316609SQ200680041193
公开日2008年12月3日 申请日期2006年9月1日 优先权日2005年9月2日
发明者乔纳森·外斯, 琳达·N·刘 申请人:麦克斯塞特公司