专利名称：一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物果仁中提取药用活性成分的绿色化工制备方法，更具体涉及一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法。
背景技术：
苦杏仁苷(Amygdalin，C20H27O11)是传统中药苦杏仁的有效成分，广泛存在于杏、桃、李、枇杷、苹果、山楂等多种蔷薇科植物的果仁中，尤其在苦杏仁中含量较多，约为2～3％。
苦杏仁苷具有明显的止咳、平喘、镇痛、抗炎、抗肿瘤、促消化等功效，传统中医临床常以苦杏仁原药入药，但往往由于储藏和熬制过程中，药效成分苦杏仁苷易被酸和酶所催化水解，得到的α-羟基苯乙腈苷元很不稳定，易分解生成苯甲醛和氢氰酸，从而降低了苦杏仁原药的疗效。
苦杏仁苷是由苯甲醛、氢氰酸和葡萄糖组成的芳香族氰苷，易被苦杏仁酶(amygdalase)、樱叶酶(prunase)等葡萄糖糖苷酶水解成野樱皮苷(prunasin)和杏仁氰(mandelonitrile)，后者不稳定，遇热易分解生成苯甲醛和氢氰酸。适量的氢氰酸对呼吸中枢可产生一定的抑制作用，使呼吸运动趋于安静而达到止咳、平喘、镇痛、抗炎的作用。但大量口服苦杏仁或苦杏仁苷均易产生中毒现象，其作用机理主要是口服的苦杏仁苷可在体内被肠道微生物水解成氢氰酸和苯甲醛，过量的氰氢酸会与细胞线粒体内的细胞色素氧化酶的活性中心三价铁起反应，抑制酶的活性，从而引起组织细胞呼吸抑制而导致死亡。
苦杏仁苷可溶于乙醇、甲醇、丙酮和水等极性溶剂中，常温时，水中溶解度约为8～10％，几乎不溶于乙醚、正己烷等脂溶性有机溶剂。苦杏仁苷在冷乙醇中的溶解度很小，在热乙醇和沸水中溶解度很大。高纯度苦杏仁苷的三水合物为斜方柱状结晶，熔点200℃，无水合物熔点约220℃。
枇杷为蔷薇科枇杷属[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]植物，是我国亚热带地区的大宗特产水果。中国是世界上最主要的枇杷生产国，栽培面积和产量约占全球2/3，其主产区为福建莆田、浙江塘栖和江苏洞庭山，现有枇杷栽培品种354个，主要高产品种为早钟6号、解放钟、长红3号和太城4号等。
福建省莆田市的枇杷为“三大兴化名果”，为福建省重要的“名、优、特”水果。全市现有枇杷种植面积16万亩，约占全球枇杷种植面积的1/6、全国的1/4和福建省的1/2。福建省莆田市常太镇的枇杷种植面积达7万亩，被农业部评为“亚热带作物名优基地”，并被授予“中国枇杷第一乡”的称号，生产的枇杷被授予“绿色食品”、“福建省名牌农产品”和“原产地标记产品”等称号。
枇杷核系枇杷的果仁部分，干果仁约占鲜果重的10％，其中苦杏仁苷含量约为1.64％。作为“山区林业综合开发”项目重点发展的树种，枇杷是近年来发展最快的经济树种之一。目前，每年全国枇杷鲜果产量已达16～20万吨，有数以万吨的枇杷核悉数舍弃而未加利用，不仅污染了环境，也浪费了宝贵的资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法，该制备方法直接采用亲水性有机溶剂从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷，不仅工艺简单、提取效率高、容易工业化生产，而且制备的苦杏仁苷纯度高、生产成本低。
本发明的一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法步骤为(1)苦杏仁苷粗提物浸膏的制备以枇杷核为原料，采用10～20倍枇杷核干重(W/W)的30～65％的亲水性有机溶剂水溶液，50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏；(2)苦杏仁苷粗品的分离在苦杏仁苷粗提物浸膏中加入乙醇使体系中乙醇终浓度≥80％，60～80℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品；(3)苦杏仁苷晶体的纯化50～75℃条件下，用无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，室温条件下，用无水乙醇和无水乙醚洗涤结晶去除杂质，得苦杏仁苷白色晶体。
本发明的显著优点是一本发明采用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂作为亲水性有机溶剂从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷，优点1甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂的溶解性能好，对枇杷核植物细胞的穿透能力强，更容易渗透到枇杷核内部组织结构中，大大提高了枇杷核中苦杏仁苷药用活性成分的溶出速率和提取效率；优点2采用热的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂提取，可避免提取过程中苦杏仁苷被酸和酶催化水解成苯甲醛和氢氰酸，从而大大提高了药用成分苦杏仁苷的提取效率和收率；优点3热的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂对枇杷核中苦杏仁苷的溶解度很大，而对蛋白质、多糖等杂质的溶解度较小，易于获得高纯度苦杏仁苷产品，明显增加产品的市场竞争力。
二本发明优先选用甲醇或丙酮作为亲水性溶剂的优点为虽然甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇等亲水性有机溶剂的提取效果相当，但相对于其它亲水性有机溶剂而言，甲醇或丙酮的沸点更低、溶剂回收时能耗更小、回收率更高，能显著降低产品的制备成本。
三充分利用了枇杷核中苦杏仁苷活性成分与蛋白质、多糖等杂质成分在亲水性有机溶剂水溶液中溶解度的明显差异，真正达到了枇杷核中苦杏仁苷药用活性成分与杂质成分的高效分离。
四充分利用了苦杏仁苷在冷乙醇中的溶解度很小、在热乙醇中溶解度很大、几乎不溶于乙醚等脂溶性有机溶剂的特点，不采用柱层析技术，而直接采用亲水性有机溶剂从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷，不仅原料价廉易得、制备工艺简单高效、容易放大生产，而且制备的苦杏仁苷纯度高、生产成本低。
五从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷入药，解决了长期以来使用苦杏仁原药入药时，药效成分苦杏仁苷易被酸和酶水解而降低疗效的弊端，具有现代中药产品的“三高”、“三小”和“三便”等优点，能适应和满足现代中医临床用药需求，符合国家倡导的中药现代化及国际化的产业政策。
具体实施例方式
按照本发明内容所述的方法步骤实施从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷。
其中，所用的亲水性有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂，优先选用甲醇或丙酮。
最终分离纯化的苦杏仁苷白色晶体纯度≥98.7％。
本发明各制备物的理化参数测定方法如下苦杏仁苷含量测定采用高效液相色谱法，以苦杏仁苷标准品(购自中国药品生物制品检定所)为对照。色谱条件色谱柱选用Waters Nova-Pak C18柱(Φ3.9×15mm，4μm)，预柱C18(3.9mm×15mm)，紫外检测器，流动相为甲醇∶0.01％磷酸水溶液(20∶80)，流速1.0mL/min，柱温34℃，检测波长215nm，进样量20μL。经测定，实验所用的莆田产枇杷核干粉(含水量2.3％)中苦杏仁苷含量为16.8～22.3g/kg。
苦杏仁苷熔点测定取自制苦杏仁苷白色晶体，干燥、研细、装入毛细管，采用YRT-3熔点测定仪测定其熔点，以苦杏仁苷标准品为对照。经测定，自制苦杏仁苷白色晶体的熔点范围212.3～218.6℃。苦杏仁苷标准品的三水合物熔点200℃，无水合物熔点220℃。
本发明制备方法的实施例陈述如下实施例1以福建莆田产枇杷核为原料，将新鲜枇杷核水洗、干燥、粉碎、过10～30目筛，得枇杷核粉末，将3.0kg枇杷核粉末放入提取罐中，用枇杷核粉末10倍重量(W/W)的48％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液，于63℃条件下提取3次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度为81％，80℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
50℃条件下，用12倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，10℃条件下，用6倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(1∶2)洗涤结晶1次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.4％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为62.6％。
实施例2将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末20倍重量(W/W)的30％甲醇水溶液，于50℃条件下提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度88％，75℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
68℃条件下，用5倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，25℃条件下，用5倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(7∶3)洗涤结晶1次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为98.8％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为61.3％。
实施例3将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末17倍重量(W/W)的65％甲醇水溶液，于80℃条件下回流提取1小时，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入无水乙醇，使体系中乙醇终浓度90％，60℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
75℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，30℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(9∶1)洗涤结晶3次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.8％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为62.3％。
实施例4以福建莆田产枇杷核为原料，将新鲜枇杷核水洗、干燥、压榨脱油、粉碎、过10～30目筛，得枇杷核粉末，将3.0kg枇杷核粉末放入提取罐中，用枇杷核粉末20倍重量(W/W)的65％乙醇水溶液，于80℃条件下提取1小时，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度80％，80℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
55℃条件下，用10倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，12℃条件下，用5倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(1∶4)洗涤结晶2次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.3％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为61.3％。
实施例5将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末15倍重量(W/W)的42％乙醇-异丙醇(2∶1)水溶液，于78℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度84％，72℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
70℃条件下，用4倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，20℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(3∶1)洗涤结晶2次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.6％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为62.0％。
实施例6将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末10倍重量(W/W)的30％乙醇水溶液，于50℃条件下提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度88％，60℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
75℃条件下，用4倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，25℃条件下，用2倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(4∶1)洗涤结晶3次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为98.7％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为60.9％。
实施例7以福建莆田产枇杷核为原料，将新鲜枇杷核水洗、干燥、6#溶剂脱油、粉碎、过10～30目筛，得枇杷核粉末，将3.0kg枇杷核粉末放入提取罐中，用枇杷核粉末14倍重量(W/W)的30％丙酮水溶液，于50℃条件下提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度81％，80℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
58℃条件下，用8倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，13℃条件下，用2倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(1∶3)洗涤结晶3次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.5％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为61.6％。
实施例8将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末10倍重量(W/W)的65％丙酮水溶液，于80℃条件下回流提取2次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入95％乙醇，使体系中乙醇终浓度86％，78℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
65℃条件下，用5倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，24℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(3∶1)洗涤结晶2次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.2％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为61.9％。
实施例9将10～30目枇杷核粉末2.5kg放入提取罐中，用枇杷核粉末20倍重量(W/W)的60％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液，于75℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液经滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏。
往浸膏中加入无水乙醇，使体系中乙醇终浓度92％，60℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品。
75℃条件下，用4倍量(W/W)的无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，18℃条件下，用3倍量(W/W)的无水乙醇-无水乙醚(1∶3)洗涤结晶2次。经测定，苦杏仁苷白色晶体纯度为99.8％，枇杷核中苦杏仁苷的回收率为62.8％。
以上阐述的本发明部分实施例，旨在详细描述本发明的制备方法，但不限于此。
本发明从中国大宗特色水果枇杷的废弃物枇杷核中分离纯化苦杏仁苷，不仅原料价廉易得、制备工艺简单高效、容易放大生产，而且解决了长期以来临床使用苦杏仁原药入药时，药效成分苦杏仁苷容易被酸和酶水解导致疗效下降的难题，具有较大的推广意义。
权利要求
1.一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法，其特征在于方法步骤为(1)苦杏仁苷粗提物浸膏的制备以枇杷核为原料，采用10～20倍枇杷核干重(W/W)的30～65％的亲水性有机溶剂水溶液，50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成苦杏仁苷粗提物浸膏；(2)苦杏仁苷粗品的分离在苦杏仁苷粗提物浸膏中加入乙醇使体系中乙醇终浓度≥80％，60～80℃条件下充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液在-0.06～-0.09MPa、50～75℃条件下，经减压回收乙醇至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤得米黄色苦杏仁苷粗品；(3)苦杏仁苷晶体的纯化50～75℃条件下，用无水乙醇充分溶解苦杏仁苷粗品，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出苦杏仁苷、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，室温条件下，用无水乙醇和无水乙醚洗涤结晶去除杂质，得苦杏仁苷白色晶体。
2.根据权利要求1所述的一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法，其特征在于亲水性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。
3.根据权利要求2所述的一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法，其特征在于所述的亲水性有机溶剂优先选用甲醇或丙酮。
4.根据权利要求1所述的一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法，其特征在于所述的苦杏仁苷白色晶体纯度≥98.7％。
全文摘要
本发明提供一种从枇杷核中分离纯化苦杏仁苷的方法。该方法为采用亲水性有机溶剂水溶液，从枇杷核中提取苦杏仁苷制成浸膏；乙醇充分溶解浸膏，过滤，滤液减压脱醇、低温结晶，制成苦杏仁苷粗品；乙醇充分溶解苦杏仁苷，过滤，滤液低温重结晶，用乙醇－乙醚洗涤，得纯度不低于98.7％的苦杏仁苷白色晶体。本发明从中国特色水果枇杷的废弃物枇杷核中分离纯化苦杏仁苷，不仅原料价廉易得、制备工艺简单高效、容易放大生产，而且解决了长期以来中医药临床使用苦杏仁原药入药过程，药效成分苦杏仁苷易被酸和酶水解导致疗效下降的难题，具有较大的推广性。
文档编号A61K36/185GK101037459SQ200710008760
公开日2007年9月19日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者陈剑锋, 陈浩, 郭养浩 申请人:福州大学