专利名称：栀子苷的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物中分离纯化药用活性成分的绿色化工生产方法，更具体涉及栀子苷的分离纯化方法。
背景技术：
栀子为栀子属(Gardenia)茜草科(Rubiaceae)常绿灌木栀子的果实，为我国大宗传统中药材，入选中国卫生部首批药食两用中药材名录，为国家中药保护品种清开灵注射液、龙胆泻肝片和茵胆平肝胶囊的主要药效成分，是中医临床治疗黄疸型肝炎的首选药物和提取栀子天然色素的原料，盛产于闽、浙、赣、徽、湘等省山区。
栀子从《本草纲目》到《中国药典》等历代医药名著均有记载。栀子内服具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功用，外用能治疗扭伤、挫伤，在我国临床用药史长达1600年。
迄今为止，从栀子中分离鉴定出的化合物主要有水溶性类胡萝卜素、环烯醚萜苷类化合物、绿原酸、黄酮类、醇类化合物、栀子多糖等。其中，以栀子苷为主要成分的环烯醚萜苷类化合物具有利胆护肝、清热解毒功能，广泛用于中医临床治疗黄疸型肝炎。栀子黄色素是从栀子果实中提取的自然界唯一存在的水溶性类胡萝卜素类天然色素，以藏红花素(Crocin)和藏红花酸(Crocetin)为主要成分、还含有部分绿原酸和栀子苷等杂质。
栀子苷(Geniposide)的分子量为388，外观为白色针状结晶，熔点为148～150℃，易溶于水和甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂，难溶于乙醚、氯仿、四氯化碳等疏水性有机溶剂。纯度超过98％的结晶栀子苷非常稳定，且不易吸潮。
以栀子苷为原料，采用微生物转化技术还可以生产栀子京尼平。栀子苷水溶液在苦杏仁酶和β-葡萄苷酶的作用下，在pH 4.5～5.5、40～55℃时，易被水解为栀子京尼平和葡萄糖。在此基础上，利用栀子京尼平与氨基酸反应，还可生产栀子蓝色素。栀子蓝色素溶解性好，着色力强，属于水溶性天然色素。在生产天然栀子蓝色素的过程中，控制不同的转化条件还可生产出天然栀子红色素。由栀子黄、蓝、红三元色，可以调制出诸如栀子绿、栀子紫等色素。因此，进行栀子的精深加工开发，制备高纯度栀子苷，具有广阔的市场前景。
由于栀子苷、绿原酸和栀子黄色素均易溶于热水以及甲醇、乙醇、丙酮等亲水性溶剂中，难溶于乙醚、氯仿、四氯化碳等疏水性有机溶剂。因此，可采用热水、不同pH值缓冲溶液或甲醇、丙酮等亲水性溶剂进行提取。另外，栀子苷和绿原酸具有在热的乙酸乙酯中可溶、放冷后会析出的特点，而栀子黄色素在乙酸乙酯中难溶。因此，可直接采用热的乙酸乙酯萃取、冷却结晶的方式来纯化栀子苷。
在中国，栀子资源丰富，价廉易得，药效明确，民间广泛用于食物和药物中，为不可多得的大宗天然药用植物资源。但每年全国有数以万吨的栀子未加以合理利用，浪费了宝贵的资源。为实现栀子资源的高效利用和天然色素生产的可持续发展，研究高纯度栀子苷的分离纯化集成技术，对于栀子的综合利用和系列产品开发具有一定的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供栀子苷的分离纯化方法。该制备方法采用亲水性溶剂提取、大孔吸附树脂吸附除杂和乙酸乙酯萃取结晶的集成技术，从栀子中分离纯化栀子苷晶体，不仅制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产，而且制备的栀子苷晶体纯度高、生产成本低。
本发明的栀子苷的分离纯化方法步骤为(1)栀子苷的溶剂提取以栀子为原料，采用5～20倍栀子干重(W/W)的25～75％亲水性溶剂水溶液，于50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
(2)栀子苷的树脂分离浸膏经大孔吸附树脂吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
(3)栀子苷的结晶纯化50～70℃条件下，栀子苷粗品用不低于3倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得栀子苷结晶。
本发明的显著优点是一本发明采用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂作为亲水性有机溶剂从栀子中提取栀子苷，优点1甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂的溶解性能好，对栀子细胞的穿透能力强，更容易渗透到栀子内部组织结构中，大大提高了栀子中栀子苷的溶出速率和提取效率；优点2热的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂对栀子中栀子苷的溶解度很大，而对蛋白质、多糖、精油、无机盐等杂质的溶解度较小，更利于后续进一步的分离纯化获得高纯度栀子苷。
二本发明优先选用甲醇或丙酮作为亲水性溶剂的优点为虽然甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇等亲水性有机溶剂的提取效果相当，但相对于其它亲水性有机溶剂而言，甲醇或丙酮的沸点更低、溶剂回收时能耗更小、回收率更高，能显著降低栀子苷产品的制备成本。
三本发明充分利用大孔吸附树脂对栀子黄色素的吸附力比对栀子苷吸附力大的特点，采用大孔吸附树脂吸附栀子黄色素，达到栀子黄色素与栀子苷的高效分离。
四与已有的文献采用硅胶柱层析技术纯化栀子苷相比，本发明充分利用栀子黄色素难溶于乙酸乙酯，而栀子苷和绿原酸在热的乙酸乙酯中可溶、放冷后会析出的特点，不采用柱层析技术，而直接采用热乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，萃取液低温结晶，结晶经乙酸乙酯-丙酮溶剂常温洗涤去除绿原酸，得纯度≥98.5％的栀子苷白色晶体。
五本发明组合采用亲水性溶剂提取、大孔吸附树脂吸附除杂和乙酸乙酯萃取结晶等分离纯化集成技术，能工业化生产高纯度栀子苷，具有理论新颖、技术合理、操作安全、工艺简便、经济可行、环境友好等优点。
具体实施例方式
按照本发明内容所述的方法步骤实施从栀子中分离纯化栀子苷晶体。
其中，所述步骤(3)中的栀子苷结晶还可以进一步在室温条件下，用乙酸乙酯和丙酮溶剂洗涤除杂，得高纯度栀子苷晶体。
所用的亲水性溶剂是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂；优先选用甲醇或丙酮，或者亲水性溶剂选用不同pH值缓冲溶液。
所用的大孔吸附树脂的骨架的化学组成可以是聚苯乙烯或聚丙烯酸中的一种或两种。
栀子黄色素是藏红花酸、藏红花素1、藏红花素2或藏红花素3中的一种或几种化合物。
最终分离纯化获得的栀子苷白色晶体纯度≥98％。
本发明各制备物的理化参数测定方法如下栀子苷、绿原酸和栀子黄色素的含量采用紫外-可见三波长同时检测的高效液相色谱仪测定。测定条件Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-PakC18色谱柱(Φ3.9×150mm，5μm)，甲醇-0.2％磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在60min内甲醇比例从15％线性梯度升至100％，然后保持2min。流速1.0mL/min，柱温34℃，进样量20μL。栀子苷、绿原酸和栀子黄色素的检测波长分别为238nm、320nm和440nm。
标准品栀子苷、异栀子苷、栀子酸、京尼平龙胆二糖苷购于Yoneyama公司(日本)，藏红花酸购于Sigma公司，绿原酸、藏红花素购于中国药品生物制品检定所。
经测定，实验所用的福建莆田产栀子(含水量4.9％)中栀子苷、绿原酸和栀子黄色素的含量分别为83.2g/kg、8.9g/kg和3.8g/kg，分离纯化获得的各栀子苷晶体纯度≥98％。
栀子苷熔点测定取自制栀子苷白色晶体，干燥、研细、装入毛细管，采用YRT-3熔点测定仪测定其熔点，以栀子苷标准品为对照。经测定，自制栀子苷白色晶体的熔点范围148.2～150.8℃，栀子苷标准品的熔点为148～150℃。
本发明制备方法的实施例陈述如下实施例1
以福建莆田产栀子为原料，将鲜栀子水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过16～40目筛，得栀子粉末，将2.7kg栀子粉末放入提取罐中，用5倍栀子粉末干重(W/W)的75％甲醇水溶液，于80℃条件下回流提取1小时，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
加蒸馏水调整浸膏浓度达3波美度，采用HZ816大孔吸附树脂，以0.96倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
50℃条件下，用4倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。12℃条件下，用6倍量(W/W)的pH 7的乙酸乙酯-丙酮溶剂(19∶1)洗涤结晶1次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.4％，栀子中栀子苷回收率56.3％。
实施例2将16～40目已经脱脂的栀子粉末2.6kg放入提取罐中，用20倍栀子粉末干重(W/W)的25％甲醇水溶液，于50℃条件下提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏，浸膏浓度达7.5波美度。
在68r/min的搅拌转速条件下，直接采用HZ801大孔吸附树脂对浸膏进行富集吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
70℃条件下，用3倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。22℃条件下，用5倍量(W/W)的pH 10的乙酸乙酯-丙酮溶剂(4∶1)洗涤结晶1次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.0％，栀子中栀子苷回收率54.2％。
实施例3将鲜栀子水洗、粉碎、过10～30目筛，将2.9kg栀子(以干重计，W/W)投入提取罐中，用10倍栀子粉末干重(W/W)的40％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液，于68℃条件下回流提取3小时，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
加蒸馏水调整浸膏浓度达3波美度，采用HZ806大孔吸附树脂，以0.59倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
62℃条件下，用5倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。33℃条件下，用3倍量(W/W)的pH 6.5的乙酸乙酯-丙酮溶剂(12∶1)洗涤结晶3次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.3％，栀子中栀子苷回收率57.0％。
实施例4以福建莆田产栀子为原料，将鲜栀子水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过16～40目筛，得栀子粉末，将2.4kg栀子粉末放入提取罐中，用20倍栀子粉末干重(W/W)的38％乙醇水溶液，于50℃条件下提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏，浸膏浓度达8波美度。
加蒸馏水调整浸膏浓度达3波美度，采用D101大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
65℃条件下，用4倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。24℃条件下，用5倍量(W/W)自然pH值的乙酸乙酯-丙酮溶剂(1∶1)洗涤结晶2次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.1％，栀子中栀子苷回收率55.2％。
实施例5将16～40目栀子粉末2.6kg放入提取罐中，用8倍栀子粉末干重(W/W)的45％甲醇-异丙醇(1∶1)水溶液，于73℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
加蒸馏水调整浸膏浓度达4.2波美度，采用DK110大孔吸附树脂，以1.50倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
58℃条件下，用6倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。16℃条件下，用3倍量(W/W)的pH 5的乙酸乙酯-丙酮溶剂(10∶1)洗涤结晶2次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.6％，栀子中栀子苷回收率55.8％。
实施例6将2.9kg栀子粉末放入提取罐中，用5倍栀子粉末干重(W/W)的75％乙醇水溶液，于80℃条件下提取1小时，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
在90r/min的搅拌转速条件下，直接采用大孔吸附树脂HZ801∶HZ802(2∶1)对浸膏进行富集吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
50℃条件下，用10倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。14℃条件下，用3倍量(W/W)的pH11的乙酸乙酯-丙酮溶剂(15∶1)洗涤结晶3次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.0％，栀子中栀子苷回收率56.7％。
实施例7以福建莆田产栀子为原料，将鲜栀子水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过16～40目筛，得栀子粉末，将2.6kg栀子粉末放入提取罐中，用15倍栀子粉末干重(W/W)的25％丙酮水溶液，于50℃条件下提取3次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
加蒸馏水调整浸膏浓度达4.5波美度，采用Amberlite XAD-4大孔吸附树脂，以0.98倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
65℃条件下，用5倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。16℃条件下，用3倍量(W/W)的(W/W)自然pH值的乙酸乙酯-丙酮溶剂(9∶1)洗涤结晶3次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.5％，栀子中栀子苷回收率54.8％。
实施例8将16～40目栀子粉末2.5kg放入提取罐中，用5倍栀子粉末干重(W/W)的75％丙酮水溶液，于80℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏，浸膏浓度达8波美度。
在100r/min的搅拌转速条件下，直接采用HZ802大孔吸附树脂对浸膏进行富集吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
70℃条件下，用3倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。26℃条件下，用3倍量(W/W)的pH 8.9的乙酸乙酯-丙酮溶剂(8.5∶1.5)洗涤结晶3次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.4％，栀子中栀子苷回收率56.3％。
实施例9将16～40目栀子粉末2.3kg放入提取罐中，用20倍栀子粉末干重(W/W)的pH 8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液，于80℃条件下提取3次，每次2小时，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、65～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏。
加蒸馏水调整浸膏浓度达3.6波美度，采用HZ803大孔吸附树脂，以1.0倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品。
50℃条件下，用10倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷粗品中的栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得米黄色栀子苷结晶。20℃条件下，用3倍量(W/W)的pH 8.5的乙酸乙酯-丙酮溶剂(7∶3)洗涤结晶2次，得高纯度栀子苷白色晶体。经测定，栀子苷白色晶体纯度98.8％，栀子中栀子苷回收率56.5％。
以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。
本发明构思新颖，工艺简单，提取效率高，生产成本低，符合国家倡导的中药现代化及国际化的产业政策，具有较大的推广意义。
权利要求
1.一种栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述方法的步骤为(1)栀子苷的溶剂提取以栀子为原料，采用5～20倍栀子干重(W/W)的25～75％亲水性溶剂水溶液，于50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.06～-0.095MPa、50～80℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗提物浸膏；(2)栀子苷的树脂分离栀子苷粗提物浸膏经大孔吸附树脂吸附栀子黄色素至饱和，漏出液在-0.05～-0.09MPa、50～65℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品；(3)栀子苷的结晶纯化50～70℃条件下，栀子苷粗品用不低于3倍量(W/W)的乙酸乙酯充分萃取栀子苷，分离乙酸乙酯萃取液，缓慢冷却至开始析出栀子苷、4～10℃冷藏、放置养晶、过滤，得栀子苷结晶。
2.根据权利要求1所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中的栀子苷结晶进一步在室温条件下，用乙酸乙酯和丙酮溶剂洗涤除杂，得高纯度栀子苷晶体。
3.根据权利要求1所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述亲水性溶剂是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。
4.根据权利要求3所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述亲水性溶剂优先选用甲醇或丙酮。
5.根据权利要求1所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述亲水性溶剂是不同pH值的缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述栀子黄色素是藏红花酸、藏红花素1、藏红花素2或藏红花素3中的一种或几种化合物。
7.根据权利要求1所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于大孔吸附树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯或聚丙烯酸中的一种或两种。
8.根据权利要求2所述的栀子苷的分离纯化方法，其特征在于所述栀子苷晶体的纯度≥98％。
全文摘要
本发明提供栀子苷的分离纯化方法。该方法为采用亲水性溶剂水溶液，从栀子中提取栀子苷制成浸膏；浸膏经大孔吸附树脂吸附去除栀子黄色素，漏出液经减压回收溶剂、真空浓缩成栀子苷粗品；粗品用热的乙酸乙酯充分萃取栀子苷，萃取液低温处理，得栀子苷结晶；结晶经乙酸乙酯和丙酮溶剂室温洗涤除杂，得纯度≥98％的栀子苷晶体。本发明从中国大宗的药食两用中药材中分离纯化高纯度栀子苷晶体，不仅原料价廉易得、制备工艺简单高效、容易放大生产，而且构思新颖、生产成本低，所制栀子苷晶体具有现代中成药“三高”、“三小”和“三便”等优点，具有较大推广性。
文档编号A61K36/185GK101037460SQ200710008798
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者陈剑锋, 陈浩, 郭养浩 申请人:福州大学