专利名称：从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物中提取药用活性成分的绿色化学生产方法，更具体涉及从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法。
背景技术：
中国是世界上最主要的枇杷生产国，枇杷栽培面积和产量约占全球的2/3以上，其主产区为福建莆田、浙江塘栖和江苏洞庭山。福建莆田现有枇杷种植面积16万亩，约占全球的1/6、全国的1/4和福建省的1/2。
枇杷全身皆宝，枇杷叶、花、果、核等部位富含三萜酸(可高达1.5％)、挥发油、苦杏仁苷、皂苷、黄酮、水溶性多糖和有机酸等活性成分。目前，枇杷是以鲜果供应为主，尚未进行其它部位的深度开发和综合利用。
枇杷叶系蔷薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.]的叶子，富含熊果酸(Ursolic acid，UA)和齐墩果酸(Oleanolic acid，OA)等三萜酸，性微寒，味苦辛，止咳平喘，清肺和胃，降气化痰，收载于历版中国药典。传统中医临床常以蜜炙枇杷叶或枇杷叶与其它中药配伍成复方药入药，取得了一定的化痰止咳、消炎平喘等临床疗效。
熊果酸和齐墩果酸为两个同分异构体，为五环三萜类化合物，分子式为C30H48O3，性质极为相似，在植物中常常共存，给分离测定带来一定难度。红外光谱根据区域A(1355～1392cm-1)和区域B(1245～1330cm-1)的碳氢吸收来区别骨架类型，齐墩果酸在A区有两个峰，B区有三个峰，熊果酸在A区和B区各有三个峰，以此可区分两者。
由于熊果酸和齐墩果酸的结构复杂，人工合成困难，国内外均自中草药或植物中提取。熊果酸和齐墩果酸均为白色结晶性粉末，熔点310℃，无臭，无味，易溶于二氧六环吡啶，可溶于甲醇、乙醇等极性有机溶剂，微溶于氯仿、乙醚等脂溶性溶剂，不溶于石油醚和水。
熊果酸以游离形式或糖苷形式广泛分布于约27个科62种植物，如山楂、熊果、乌梅、陆英、白花蛇舌草、枇杷叶、车前草、女贞子等植物中；齐墩果酸以游离形式或糖苷形式广泛存在于约60个科190种植物，如辽东惚木、青叶胆、女贞子、枇杷叶、雪胆等植物中。现代药学研究表明，熊果酸和齐墩果酸均具有消炎、增强免疫、抑制血小板凝集、降糖、抗癌等临床药理作用，是治疗急性黄胆型肝炎和慢性病毒性肝炎的理想药物，且毒性低副作用少。
在枇杷产区，枇杷叶、花、核这些具有较高附加值的部分基本上被浪费掉，没有得到应有的应用。通常在不影响枇杷果生产的前提下，全国可年采收枇杷叶干品5万吨。因此，对枇杷叶进行深度开发利用，有利于促进枇杷产业的可持续健康发展，对综合利用枇杷资源，提高枇杷的经济价值，开发新产品，具有十分重要的社会效益和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法。该制备方法采用亲水性有机溶剂提取、除杂、活性炭脱色、沉淀分离，大孔吸附树脂富集、纯化，亲水性有机溶剂萃取、结晶和重结晶处理等一系列分离纯化集成技术，从枇杷叶中制备高纯度熊果酸晶体，不仅制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产，而且制备的熊果酸纯度高、生产成本低。
本发明的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法步骤为(1)枇杷叶总三萜酸的溶剂提取以枇杷叶为原料，采用5～20倍枇杷叶干重(W/W)的含水量不超过30％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液，于50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；(2)枇杷叶总三萜酸的除杂处理50～80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用不低于3倍量(W/W)的含水量不超过20％(W/W)的亲水性有机溶剂，水溶液充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热进行活性炭脱色；(3)枇杷叶总三萜酸的沉淀分离脱色后的滤液趁热加入三萜酸溶解度调节剂，控制体系中亲水性有机溶剂终浓度为20～40％和pH值1.5～5.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品；(4)熊果酸的树脂富集枇杷叶总三萜酸粗品用不低于3倍量(W/W)的20～40％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到0.5～5g/L；滤液经大孔吸附树脂吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量(W/W)的水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用不少于3倍树脂量(W/W)的20～40％的亲水性有机溶剂水溶液洗去中等极性杂质，最后用不低于3倍量(W/W)的含水量不超过20％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液洗脱熊果酸；(5)熊果酸的沉淀分离熊果酸洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入熊果酸溶解度调节剂，控制洗脱液体系中亲水性有机溶剂终浓度为20～40％和pH值1.5～5.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的结晶纯化50～80℃条件下，熊果酸粗品用不低于3倍量(W/W)的亲水性有机溶剂充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、室温条件下水洗，得熊果酸结晶。
本发明的显著优点是
一本发明采用甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂作为亲水性有机溶剂从枇杷叶中提取熊果酸，优点1甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂的溶解性能好，对枇杷叶细胞的穿透能力强，更容易渗透到枇杷叶内部组织结构中，大大提高了枇杷叶中熊果酸的溶出速率和提取效率；优点2热的甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂对枇杷叶中熊果酸的溶解度很大，而对蛋白质、多糖、精油、无机盐等杂质的溶解度较小，更利于后续进一步的分离纯化获得高纯度熊果酸。
二本发明优先选用甲醇或丙酮作为亲水性溶剂的优点为虽然甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇等亲水性有机溶剂的分离效果相当，但相对于其它亲水性有机溶剂而言，甲醇或丙酮的沸点更低、溶剂回收时能耗更小、回收率更高，能显著降低产品的制备成本。
三本发明充分利用大孔吸附树脂对熊果酸的吸附力与对蛋白质、多糖、无机盐等杂质的吸附力的不同，以及在亲水性有机溶剂水溶液中，以熊果酸为主要成分的枇杷叶总三萜酸与蛋白质、无机盐等杂质的溶解度差异，真正达到熊果酸与杂质的高效分离。
四与已有的文献相比，本发明充分利用熊果酸可溶于甲醇和乙醇等极性有机溶剂、微溶于氯仿和乙醚等脂溶性溶剂、不溶于石油醚和水的特点，不采用硅胶柱层析技术，而直接采用亲水性有机溶剂萃取、结晶和重结晶处理等方式去除杂质，获得高纯度熊果酸，具有较大的推广性。
五本发明组合采用采用亲水性有机溶剂提取、除杂、活性炭脱色、沉淀分离，大孔吸附树脂富集、纯化，亲水性有机溶剂萃取、结晶和重结晶处理等一系列分离纯化集成技术，从枇杷叶中制备高纯度熊果酸晶体，具有理论新颖、技术合理、操作安全、工艺简便、经济可行、环境友好等优点。
具体实施例方式
按照本发明内容所述的方法步骤实施从枇杷叶中分离纯化熊果酸。
其中，步骤(6)中的熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用亲水性有机溶剂重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。
所用的亲水性有机溶剂可以是甲醇、乙醇、丙酮、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂，优先选用甲醇或丙酮。
所用的大孔吸附树脂的骨架的化学组成可以是聚苯乙烯和聚丙烯酸中的一种或两种。
所用的三萜酸溶解度调节剂为无机酸水溶液、有机酸水溶液或酸性盐水溶液中的一种或几种，优先选用盐酸水溶液或硫酸水溶液；熊果酸溶解度调节剂为无机酸水溶液、有机酸水溶液或酸性盐水溶液中的一种或几种，优先选用盐酸水溶液或硫酸水溶液。
上述枇杷叶总三萜酸是熊果酸类化合物或齐墩果酸类化合物中的一种或几种化合物。
经测定，枇杷叶总三萜酸粗品中熊果酸的纯度≥25％；熊果酸粗品的纯度≥80％；熊果酸结晶的纯度≥95％；最终分离纯化获得的高纯度熊果酸晶体的纯度≥99％。
本发明理化参数测定方法如下枇杷叶总三萜酸、熊果酸和齐墩果酸的含量采用高效液相色谱仪测定。测定条件Agilent1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-Pak C18色谱柱(Φ3.9×150mm，5μm)，流动相为甲醇-0.2％磷酸水溶液(92∶8)(V/V)，流速1.0mL/min，柱温34℃，进样量20μL，检测波长分别为220nm。熊果酸和齐墩果酸标准品购于中国药品生物制品检定所。
经测定，实验所用福建省莆田市出产的枇杷叶(含水量4.2％)中枇杷叶熊果酸含量为7.8～11.3g/kg。
本发明制备方法的实施例陈述如下实施例1以福建莆田产枇杷叶为原料，将鲜枇杷叶水洗、干燥(风干、烘干或晒干均可)、粉碎、过20～30目筛得枇杷叶粉末，将2.6kg枇杷叶粉末放入提取罐中，用12倍枇杷叶粉末干重(W/W)的85％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液，于72℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；72℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用3倍量(W/W)的pH值为10.9的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加1.3％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入35％盐酸水溶液，控制体系中甲醇-丙酮(1∶1)水溶液终浓度达40％(W/W)和pH值为1.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。经测定，枇杷叶总三萜酸粗品中熊果酸的纯度25.8％。
枇杷叶总三萜酸粗品用3倍量(W/W)的pH值为12.0的20％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到0.5g/L；滤液采用HZ816大孔吸附树脂，以0.96倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用8倍树脂量的30％乙醇水溶液(V/V)分成2次，在76r/min的搅拌转速条件下洗去中等极性杂质，最后用3倍树脂量的无水甲醇，以0.56倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱熊果酸，洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入30％硫酸水溶液，控制洗脱液体系中甲醇终浓度达20％(W/W)和pH值为1.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。经测定，熊果酸粗品的纯度80.2％。
50℃条件下，米黄色熊果酸粗品用6倍量(W/W)的甲醇-丙酮(1∶1)溶剂充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、12℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶。经测定，熊果酸结晶的纯度95.6％。熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用甲醇重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.2％，枇杷叶中熊果酸回收率50.2％。
实施例2将20～30目经过石油醚脱脂的枇杷叶粉末2.8kg放入提取罐中，用20倍枇杷叶粉末干重(W/W)的pH值为3.2的70％甲醇水溶液，于50℃条件下提取2次，每次3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；50℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用15倍量(W/W)pH值为8.0的92％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加0.5％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入50％硫酸水溶液，控制体系中甲醇终浓度达20％(W/W)和pH值为4.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。经测定，枇杷叶总三萜酸粗品中熊果酸的纯度27.9％。
枇杷叶总三萜酸粗品用8倍量(W/W)的pH值为8.0的40％甲醇水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到5g/L；滤液在68r/min的搅拌转速条件下，直接采用HZ801大孔吸附树脂对浸膏进行富集吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用6倍树脂量的35％的甲醇水溶液(V/V)以1.0倍树脂量/小时的流速(V/V)洗去中等极性杂质，最后用6倍树脂量的80％甲醇水溶液(V/V)分成2次，在100r/min的搅拌转速条件下，洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入40％盐酸水溶液，控制洗脱液体系中甲醇终浓度达40％(W/W)和pH值为4.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。经测定，熊果酸粗品的纯度82.5％。
80℃条件下，米黄色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、31℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；经测定，熊果酸结晶的纯度95.8％。熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用甲醇重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.1％，枇杷叶中熊果酸回收率52.3％。
实施例3将20～30目经过二氧化碳超临界萃取脱油处理的枇杷叶粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷叶粉末干重(W/W)的无水甲醇，于80℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用10倍量(W/W)的pH值为8.9的80％甲醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加2.5％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入饱和柠檬酸水溶液，控制体系中甲醇终浓度达25％(W/W)和pH值为5.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。经测定，枇杷叶总三萜酸粗品中熊果酸的纯度29.6％。
枇杷叶总三萜酸粗品用10倍量(W/W)的pH值为9.3的20％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到0.5g/L；滤液采用HZ802大孔吸附树脂，以0.59倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用3倍树脂量的40％的甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以0.5倍树脂量/小时的流速(V/V)洗去中等极性杂质，最后用9倍树脂量的90％甲醇-丙酮(1∶1)水溶液(V/V)以1.05倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入饱和柠檬酸水溶液，控制洗脱液体系中甲醇-丙酮(1∶1)终浓度达20％(W/W)和pH值为5.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。经测定，熊果酸粗品的纯度84.2％。
72℃条件下，米黄色熊果酸粗品用8倍量(W/W)的甲醇充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、25℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；经测定，熊果酸结晶的纯度96.3％。熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用甲醇重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.0％，枇杷叶中熊果酸回收率52.6％。
实施例4将20～30目经过6#溶剂脱脂处理过的枇杷叶粉末2.9kg放入提取罐中，用5倍枇杷叶粉末干重(W/W)的pH值为6.1的95％乙醇水溶液，于80℃条件下提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用7倍量(W/W)的pH值为10.5的95％乙醇水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加2.5％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入20％酸性磷酸盐缓冲溶液，控制体系中乙醇终浓度达20％(W/W)和pH值为3.8，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用15倍量(W/W)的pH值为10.0的20％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到4.3g/L；滤液采用D101大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未以被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用7倍树脂量的40％的乙醇水溶液(V/V)以1.03倍树脂量/小时的流速(V/V)洗去中等极性杂质，最后用9倍树脂量的80％乙醇水溶液(V/V)分成3次，在89r/min的搅拌转速条件下，洗脱熊果酸，洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入20％酸性磷酸盐缓冲溶液，控制洗脱液体系中乙醇终浓度达20％(W/W)和pH值为3.8，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
65℃条件下，米黄色熊果酸粗品用4倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、20℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用乙醇重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.3％，枇杷叶中熊果酸回收率50.1％。
实施例5将20～30目枇杷叶粉末2.7kg放入提取罐中，用18倍枇杷叶粉末干重(W/W)的78％乙醇-异丙醇(2∶1)水溶液，于76℃条件下提取2次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；76℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用9倍量(W/W)的pH值为11.8的80％乙醇-异丙醇(2∶1)水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加0.9％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入28％盐酸水溶液，控制体系中乙醇-异丙醇(2∶1)终浓度达32％(W/W)和pH值为3.3，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用6倍量(W/W)的pH值为10.8的28％乙醇-异丙醇(2∶1)水溶液溶(W/W)解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到1.8g/L；滤液采用DK110大孔吸附树脂，以1.5倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用12倍树脂量的20％的乙醇水溶液(V/V)分成4次，在68r/min的搅拌转速条件下洗去中等极性杂质，最后用15倍树脂量的84％乙醇-异丙醇(1∶1)水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的搅拌转速条件下，洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入28％盐酸水溶液，控制洗脱液体系中乙醇-异丙醇(1∶1)终浓度达28％(W/W)和pH值为3.3，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
78℃条件下，米黄色熊果酸粗品用9倍量(W/W)的乙醇-丙酮(1∶2)充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、28℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用乙醇-丙酮(1∶1)重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.4％，枇杷叶中熊果酸回收率52.0％。
实施例6将20～30目枇杷叶粉末2.7kg放入提取罐中，用20倍枇杷叶粉末干重(W/W)的pH值为11.2的70％乙醇水溶液，于50℃条件下提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；50℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用3倍量(W/W)的无水乙醇充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加0.5％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入32％盐酸水溶液，控制体系中乙醇终浓度达40％(W/W)和pH值为2.6，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用3倍量(W/W)的pH值为11.5的40％乙醇水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到5.0g/L；滤液在50r/min的搅拌转速条件下，直接采用大孔吸附树脂HZ801∶HZ802(2∶1)对浸膏进行富集吸附熊果酸至饱和，吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用5倍树脂量的28％的乙醇水溶液(V/V)以0.65倍树脂量/小时的流速(V/V)洗去中等极性杂质，最后用3倍树脂量的无水乙醇以1.0倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入32％盐酸水溶液，控制洗脱液体系中乙醇终浓度达40％(W/W)和pH值为2.6，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
50℃条件下，米黄色熊果酸粗品用15倍量(W/W)的乙醇充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、14℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用乙醇重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.3％，枇杷叶中熊果酸回收率51.8％。
实施例7以福建莆田产枇杷叶为原料，将鲜枇杷叶水洗、粉碎、过10～16目筛得枇杷叶浆料，将2.6kg(以干重计)枇杷叶浆料放入提取罐中，用20倍枇杷叶干重(W/W)的pH值为6.5的70％丙酮水溶液，于50℃条件下提取3次，每次1小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；50℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用15倍量(W/W)的pH值为9.3的85％丙酮水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加2.5％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入40％硫酸水溶液，控制体系中丙酮终浓度达25％(W/W)和pH值为4.2，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用12倍量(W/W)的pH值为9.0的35％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到3.2g/L；滤液采用Amberlite XAD-4大孔吸附树脂，以0.98倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用12倍树脂量的20％的丙酮水溶液(V/V)分成3次，在82r/min的搅拌转速条件下洗去中等极性杂质，最后用6倍树脂量的85％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在85r/min的搅拌转速条件下，洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入40％硫酸水溶液，控制洗脱液体系中丙酮终浓度达35％(W/W)和pH值为4.2，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
70℃条件下，米黄色熊果酸粗品用5倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、20℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用丙酮重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，熊果酸白色晶体纯度99.5％，枇杷叶中熊果酸回收率53.6％。
实施例8将20～30目枇杷叶粉末2.8kg放入提取罐中，用5倍枇杷叶粉干重(W/W)的无水丙酮，于80℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用6倍量(W/W)的无水丙酮充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加1.1％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入50％硫酸水溶液，控制体系中亲丙酮终浓度达38％(W/W)和pH值为2.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用7倍量(W/W)的pH值为9.8的40％丙酮水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到4.9g/L；滤液在100r/min的搅拌转速条件下，直接采用HZ806大孔吸附树脂对浸膏进行富集吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用6倍树脂量的40％的丙酮水溶液(V/V)分成2次，在75r/min的搅拌转速条件下洗去中等极性杂质，最后用12倍树脂量的80％丙酮水溶液(V/V)分成3次，在90r/min的搅拌转速条件下，洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入50％硫酸水溶液，控制洗脱液体系中丙酮终浓度达40％(W/W)和pH值为2.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
80℃条件下，米黄色熊果酸粗品用3倍量(W/W)的丙酮充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、26℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用丙酮重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.4％，枇杷叶中熊果酸回收率52.9％。
实施例9将20～30目已脱脂处理的枇杷叶粉末2.6kg放入提取罐中，用15倍枇杷叶粉末干重(W/W)的84％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液，于80℃条件下回流提取2小时，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用8倍量(W/W)的pH值为10.5的82％甲醇-乙醇(5∶3)水溶液(W/W)充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热添加1.8％(W/V)活性炭进行脱色；脱色后的滤液趁热加入50％硫酸水溶液，控制体系中甲醇-乙醇(5∶3)终浓度达40％(W/W)和pH值为3.1，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品。
枇杷叶总三萜酸粗品用9倍量(W/W)的pH值为10.5的32％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(W/W)溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到2.1g/L；滤液采用HZ803大孔吸附树脂，以1.0倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量的蒸馏水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用4倍树脂量的26％的甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍树脂量/小时的流速(V/V)洗去中等极性杂质，最后用5倍树脂量的95％甲醇-乙醇(2∶5)水溶液(V/V)以0.75倍树脂量/小时的流速(V/V)，动态洗脱熊果酸；洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入50％硫酸水溶液，控制洗脱液体系中甲醇-乙醇(2∶5)终浓度达32％(W/W)和pH值为3.1，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得米黄色熊果酸粗品。
50℃条件下，米黄色熊果酸粗品用12倍量(W/W)的甲醇-乙醇(5∶3)充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、15℃条件下水洗，得白色熊果酸结晶；熊果酸结晶还可以进一步在室温条件下，用甲醇-乙醇(1∶1)重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。经测定，高纯度熊果酸晶体纯度99.8％，枇杷叶中熊果酸回收率53.8％。
以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。
本发明的一种从枇杷叶中分离纯化高纯度熊果酸的方法，工艺简单、分离纯化效果好、产品收率高、生产成本低，对我国枇杷植物资源的合理利用和传统中药产业链的延伸，解决“三农”问题，均具有重要的社会价值和现实意义。
权利要求
1.一种从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述方法的步骤为(1)枇杷叶总三萜酸的溶剂提取以枇杷叶为原料，采用5～20倍枇杷叶干重(W/W)的含水量不超过30％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液，于50～80℃条件下提取1～3次，每次1～3小时，合并提取液，过滤，滤液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；(2)枇杷叶总三萜酸的除杂处理50～80℃条件下，枇杷叶总三萜酸提取物用不低于3倍量(W/W)的含水量不超过20％(W/W)的亲水性有机溶剂，水溶液充分萃取枇杷叶总三萜酸，静置陈化、过滤去除不溶物，滤液趁热进行活性炭脱色；(3)枇杷叶总三萜酸的沉淀分离脱色后的滤液趁热加入三萜酸溶解度调节剂，控制体系中亲水性有机溶剂终浓度为20～40％和pH值1.5～5.5，缓慢冷却至开始析出枇杷叶总三萜酸沉淀、4～10℃冷藏、放置陈化、过滤，得枇杷叶总三萜酸粗品；(4)熊果酸的树脂富集枇杷叶总三萜酸粗品用不低于3倍量(W/W)的20～40％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液溶解充分，过滤去除不溶物，调整滤液体系中熊果酸终浓度达到0.5～5g/L；滤液经大孔吸附树脂吸附熊果酸至饱和，先用不少于3倍树脂量(W/W)的水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的水溶性杂质，再用不少于3倍树脂量(W/W)的20～40％的亲水性有机溶剂水溶液洗去中等极性杂质，最后用不低于3倍量(W/W)的含水量不超过20％(W/W)的亲水性有机溶剂水溶液洗脱熊果酸；(5)熊果酸的沉淀分离熊果酸洗脱液在-0.05～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收部分溶剂后，加入熊果酸溶解度调节剂，控制洗脱液体系中亲水性有机溶剂终浓度为20～40％和pH值1.5～5.5，缓慢冷却至开始析出熊果酸结晶、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤，得熊果酸粗品；(6)熊果酸的结晶纯化50～80℃条件下，熊果酸粗品用不低于3倍量(W/W)的亲水性有机溶剂充分萃取熊果酸，过滤，滤液缓慢冷却至开始析出熊果酸、4～10℃冷藏、静置养晶、过滤、室温条件下水洗，得熊果酸结晶。
2.根据权利要求1所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述步骤(6)中的熊果酸结晶进一步在室温条件下，用亲水性有机溶剂重结晶，分别用氯仿、水和石油醚洗晶除杂，得高纯度熊果酸晶体。
3.根据权利要求1或2所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述亲水性溶剂是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂。
4.根据权利要求3所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述亲水性溶剂优先选用甲醇或丙酮。
5.根据权利要求1所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述三萜酸溶解度调节剂为无机酸水溶液、有机酸水溶液或酸性盐水溶液中的一种或几种。
6.根据权利要求1或5所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述三萜酸溶解度调节剂优先选用盐酸水溶液或硫酸水溶液。
7.根据权利要求1所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述熊果酸溶解度调节剂为无机酸水溶液、有机酸水溶液或酸性盐水溶液中的一种或几种。
8.根据权利要求1或7所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述熊果酸溶解度调节剂优先选用盐酸水溶液或硫酸水溶液。
9.根据权利要求1所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于大孔吸附树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯或聚丙烯酸中的一种或两种。
10.根据权利要求2所述的从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法，其特征在于所述高纯度熊果酸晶体的纯度≥99％。
全文摘要
本发明提供从枇杷叶中分离纯化熊果酸的方法。该制备方法的特征在于以枇杷叶为原料，采用亲水性有机溶剂水溶液提取、减压回收溶剂、真空浓缩成枇杷叶总三萜酸提取物；三萜酸提取物经过溶剂除杂、活性炭脱色、沉淀分离，制得熊果酸纯度≥25％的枇杷叶总三萜酸粗品；三萜酸粗品经树脂富集纯化、沉淀分离，制得熊果酸纯度≥80％的米黄色熊果酸粗品；熊果酸粗品经亲水性有机溶剂萃取、结晶纯化和重结晶处理，最后制得高纯度熊果酸晶体。经测定，白色熊果酸晶体的纯度≥99％。本发明制备工艺简单、分离纯化效率高、容易工业化生产、制备的熊果酸纯度高、生产成本低，具有现代中成药的“三高”、“三小”和“三便”等优点，具有较大推广性。
文档编号A61K36/185GK101037467SQ200710008809
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者陈剑锋, 陈浩 申请人:福州大学