专利名称：防制鸽禽i型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及防治鸽禽I型副粘病毒病的疫苗及其制备方法。
背景技术：
鸽禽I型副粘病毒(PA/PMV-I)病，俗称鸽瘟，又称鸽新城疫，是由禽I型副粘病毒(A/PMV-I)引起鸽的一种高度接触性、败血性的急性传染病。自从20世纪80年代初，在我国部分地区发现以来，现已普遍发生于我国各养鸽地区，且一直是鸽病中发生频率最高、危害性最大的一种疾病，在不同品种、龄期的鸽子中都能感染发病，且传播迅速，发病率高，死亡率一般为20％～80％之间，耐过者常因有神经症状而被迫淘汰，造成了很大的经济损失。此外，本病病原与鸡新城疫的病原(NDV)同属禽副粘病毒，现场发病情况及流行病学的研究证明本病病原对鸡的毒力较弱，NDV也能感染敏感鸽，并使之发病和死亡。因此本病病原对鸡等家禽也是一种严重的潜在威胁。
为防制本病，目前许多鸽场均应用鸡新城疫弱毒(NDV)疫苗或PA/PMV-I同源病毒制备的灭活疫苗免疫接种。应用鸡NDV疫苗免疫鸽群，一般不能获得满意的效果，只能获得低水平保护，保护率仅有20％左右，且免疫期短；而目前以PA/PMV-1同源病毒制备的灭活疫苗免疫，虽能为免疫鸽提供较为持久的免疫保护，但亦有免疫鸽群仍发生PA/PMV-I病。因此，安全、有效的PA/PMV-I疫苗的研究和开发显得非常迫切和重要。
为提高疫苗的免疫保护效果，在疫苗的制备过程中常采用添加免疫系统的调节剂及免疫佐剂。
发明内容
多年来，本申请人在防治禽病的临诊和开展科研工作的基础上，对PA/PMV-I进行了流行病学跟踪调查和现场防治实践，在此过程中从全国多个省市的不同地区、品种、龄期的发病鸽群中成功分离并鉴定到的23株PA/PMV-1中，筛选出1株免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒。另外，在对家禽疫苗、抗体、免疫增强剂等生物制剂以及中药制剂等方面，进行了大量的研究，提出了疫苗、佐剂的研制方法和工艺；结果研制出了鸽禽I型副粘病毒病疫苗，经实验室及适度的现场试验，证明本疫苗安全，有效。
本发明的目的就是提出一种安全、有效的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法。
本发明所提出的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗，是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的疫苗种毒，该种毒被鉴定命名为鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902，用该种毒接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，加入佐剂混配而制成所述的疫苗。
所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902的相关特性测定结果如下1.1种毒的特性测定本病毒属副粘病毒科，为RNA病毒，电镜下观察病毒呈圆形、椭圆形或不规则的病毒粒子，在电镜下为有纤突的病毒粒子，直径均为120～200nm。对理化因素的抵抗力不强，经紫外线照射或在100℃条件下1min，55℃时20～60min可全部被灭活。对氯仿、乙醚、胰酶及酸敏感，能被二价镁离子保护。病毒的囊膜上具有HN纤突，具有凝集红细胞的能力，能凝集鸡、鸭、鹅、鸽、人、猪、牛、羊、豚鼠、小白鼠的红细胞。本病毒可在鸡(鸭)胚中繁殖，尿囊腔接种9～11日龄的易感鸡胚，37℃培养72h～96h，可致死鸡胚，收获胚液测定HA效价≥7log2。分别取抗NDV、AI-H5、AI-H9和EDSV血清抗体，4～8个血凝单位的本病毒液为抗原，作HI试验，结果表明，本病毒能被抗NDV血清所抑制，而不能被抗AI-H5、AI-H9、AI-H7和EDSV血清抗体所抑制。
本病毒接种SPF鸡胚成纤维细胞单层后，44～48h出现细胞病变，形成多核巨细胞；空斑试验结果表明，分离毒于接种5d后形成3种大小不同的空斑，随着时间的延长，空斑日渐增大，最后连成一片。于接种7d后测量空斑大小为大斑2.0～2.5mm，中斑1.3～1.8mm，小斑0.5～1.0mm。
1.2种毒毒力测定1.2.1攻毒用种毒，选用本种毒毒株的原代毒，经SPF鸡胚传代，毒力在第6～13代内不变，用其200个ELD50/0.2ml经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体)，结果为乳鸽出现明显症状和病变，并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-8.34/0.2ml，鸡胚平均致死时间(MDT)为104h，1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.38，六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.0。
1.2.2制苗用种毒选用本病毒，经SPF鸡胚传代，在第20～28代内毒力不变，用其200个ELD50/0.1ml分别经肌肉注射攻击1月龄非免疫乳鸽(无特异抗体)结果为乳鸽出现明显症状和病变，并有死亡。其鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-8.34/0.2ml、10-8.52/0.2ml、10-7.80/0.2ml，鸡胚平均致死时间(MDT)分别为96h，106h，98.4h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为1.58、1.56、1.43，六周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为2.21、2.30、1.95。
1.2.3种毒纯净 毒种没有细菌、霉菌、支原体、禽流感及其它外源病原污染。
1.2.4种毒保存 湿毒在-30℃不超过12个月，-15～-20℃不超过6个月；冻干毒在-30℃不超过24个月，-15～-20℃不超过18个月。
所述的鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902已于2006年9月8日寄交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NOV200605。
本发明所述的新型灭活疫苗，所用的佐剂为油乳佐剂、蜂胶佐剂或中药复方佐剂。
所述的油乳佐剂，其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为白矿油93％～96％、吐温-80 2％～3％、司本-802％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。将各组分混配，煮溶后，高压灭菌。
所述的蜂胶佐剂，为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。
所述的中药复方佐剂，其原料药的重量份配比为黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。
本发明所述的新型灭活疫苗的制备方法，包括下列步骤a)PA/PMV-I抗原的培养将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释，使每0.1ml～0.5ml含毒量约104.0～5.0EID50，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，24小时前死胚为非特异性死亡废弃，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价27～9的鸡胚液，即得PA/PMV-I抗原，分装，-15℃～-20℃保存备用；b)PA/PMV-I抗原的灭活在每1000ml鸡胚液中加入1ml～3ml甲醛含量为37％～40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。
在上述步骤c)中，如应用所述的油乳佐剂，其制备方法是将灭活抗原与所述的油乳佐剂按1∶1～2比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为油乳剂灭活疫苗。
在上述步骤c)中，如应用所述的蜂胶佐剂，其制备方法是按每1000毫升灭活抗原中加入所述的蜂胶佐剂20～50毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为蜂胶佐剂灭活疫苗。
在上述步骤c)中，如应用所述的中药复方佐剂，其制备方法是将灭活抗原与所述的中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80加入混悬液中，灭菌吐温-80的加入量为混悬液重量的1％～2％，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，即成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。
本发明从生产实际出发，应用经筛选出的抗原性良好的1株地方流行病毒，作为制苗用种毒，辅以免疫佐剂(包括白矿油佐剂、蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂)研制成一系列安全、有效的灭活疫苗。研制的蜂胶佐剂、复合中药免疫佐剂PA/PMV-I灭活疫苗，均具有不损伤鸽体，易被机体吸收，在接种部位不会形成硬结，不影响胴体品质，且易于组织规模生产及成本低的优势。既适用于紧急免疫接种和受威胁区小日龄后备种鸽的免疫接种，也适用于种鸽的免疫。使之成为对防制鸽PA/PMV-I病，具有特异、效佳、安全、使用方便的新型系列灭活疫苗。
本发明达到的技术效果如下
1、灭活疫苗的安全性试验1.1取以上三种疫苗各5批，分别以单(0.5ml/羽份)免疫剂量，肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽，观察接种免疫鸽的反应，观察期15天。结果表明，接种鸽食欲、精神状况正常，均无不良反应。
1.2取以上三种疫苗各5批，分别以4倍(2ml/羽份)免疫剂量，肌肉或颈皮下各接种10只30日龄非免疫鸽和10只1年龄非免疫产鸽，观察接种免疫鸽的反应，观察期15天。结果表明，接种鸽食欲、精神状况正常，均无不良反应。
2、灭活疫苗的免疫效力试验取30日龄非免疫鸽1320只，随机分成4个试验组，第1组(330只)肌肉接种中药佐剂灭活苗0.5ml/只，第2组(330只)肌肉接种蜂胶佐剂灭活苗0.5ml/只，第3组(330只)肌肉接种油佐剂灭活苗0.5ml/只，第4组(330只)不进行疫苗免疫以作为对照。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后3天、6天、9天、14天、21天、35天、60天、90天、120天、150天、180天)抽血1ml分离血清，用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902为抗原，按常规微量法分别测定其HI价，其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点，以Xlog2表示，每次测定均重复一次，取平均值。并于免疫后7天、14天、21天、35天、90天、120天、150天、180天，4个组各随机抽取20只，用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD50/0.1ml)进行攻击，隔离饲养，连续观察25天，以检测其免疫保护效果。试验结果表明，使用中药复合佐剂、蜂胶佐剂和油佐剂苗免疫后6天即可检出抗体，14天至30天维持最高峰(10.8～11.5log2)，6个月仍能维持较高的抗体水平(6.9log2)，且没有油苗的难于注射和局部形成硬结的问题。在实验室内，中药复合佐剂苗、蜂胶佐剂苗和油佐剂苗于免疫后21天、60天、90天、120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD50/0.1ml攻击，其保护指数分别为100％、100％、100％、94.4％、88.9％、83.5％；100％、96.7％、90.2％、83.7％、83.0％、80.2％和100％、100％、94.2％、83.7％、82.7％、81.1％。疫苗免疫21天后，用强毒攻击，均可得到100％的保护；此时，检测其血清抗体HI价，平均(10.5log2～11.5log2)log2以上。根据“HI抗体效价与攻毒保护率平行关系的试验报告”我们制定为免疫21天后测定HI效价平均应≥6log2。
3、灭活疫苗的保存期试验将批号为200305的蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗和油佐剂灭活苗分别分成10小瓶，10毫升/瓶，置4℃～8℃冰箱内保存，并分别于第90天、120天和180天抽取保存的疫苗各1瓶，按0.5毫升/只的剂量各免疫30天龄青年鸽10只，于免疫后21天，各抽检HI抗体水平及用鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902强毒(200个ELD50/0.1毫升)攻击，免疫鸽均得到保护，且疫苗的性状和免疫特性不变。个别油佐剂灭活苗保存12个月后表面有少量的白油析出，摇匀后又成为均匀的乳白色油苗，不影响效价。蜂胶佐剂灭活疫苗和中药复方佐剂灭活疫苗保存180天后，瓶底均有少许沉淀，但在使用前摇匀，不影响效价。
4、灭活疫苗的免疫期试验研制的中药复合佐剂疫苗、蜂胶佐剂疫苗和油佐剂疫苗分别作了180天的免疫攻毒试验，证实其免疫期分别至少6个月以上。在实验室内，使用蜂胶佐剂灭活苗、中药复方佐剂灭活苗、油乳剂灭活疫苗免疫后4天可产生抗体，6～9天即可达较高抗体水平，分别至14天、14天、21天时达最高峰(10.5log2、11.0log2、11.5log2)，6个月仍能维持较高的抗体水平(5.9log2、6.2log2、7.2log2)，于免疫后21天、30天、60天、90天、180天用强毒株200个ELD50/0.1毫升攻击，其保护指数分别是油佐剂苗为100％、100％、100％、94.4％、94.4％；蜂胶佐剂苗为100％、100％、100％、88.9％、88.9％；中药复方佐剂苗为100％、100％、100％、94.4％、88.9％。在试验过程中，使用本三种疫苗后，均没发生鸽新城疫病毒的感染。
具体实施例方式
实施例一按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病油乳佐剂灭活疫苗1、PA/PMV-I抗原的制备a)PA/PMV-I抗原的培养将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.5ml含毒量约104.0～5.0EID50，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价27～9的鸡胚液，分装，-15℃～-20℃保存备用；b)PA/PMV-I抗原的灭活在每1000ml鸡胚液中加入2ml甲醛含量为37％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；2、油乳佐剂的制备将960ml白矿油、20ml吐温-80、20ml司本-80和200克硬脂酸铝配合，煮溶后，高压灭菌，制得油乳佐剂。
3.PA/PMV-I油乳佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的抗原与油乳佐剂按1∶1.5比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为油乳剂灭活疫苗。
实施例二按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病蜂胶佐剂灭活疫苗1、PA/PMV-I抗原的制备a)PA/PMV-I抗原的培养将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP19990 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.2ml含毒量约104.0～5.0EID50，尿囊腔接科10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价27～9的鸡胚液，分装，-15℃～-20℃保存备用；b)PA/PMV-I抗原的灭活在每1000ml鸡胚液中加入1ml～3ml甲醛含量为40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；2、蜂胶佐剂的制备纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶质量浓度为50％。
3、PA/PMV-I蜂胶佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的抗原每1000毫升中加入蜂胶佐剂20毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为蜂胶佐剂灭活疫苗。
实施例三按下述步骤制备防制鸽禽I型副粘病毒病纯中药复合佐剂灭活疫苗1、PA/PMV-I抗原的制备a)PA/PMV-I抗原的培养将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水100倍稀释，使每0.3ml含毒量约104.0～5.0EID50，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价27～9的鸡胚液，分装，-15℃～-20℃保存备用；b)PA/PMV-I抗原的灭活在每1000ml鸡胚液中加入2ml甲醛含量为37％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原，按常规进行灭活效果检验；2、纯中药复合佐剂的制备原料药的重量份配比纯蜂胶0.01份、黄芪1份、扶芳藤1份、党参1份和灵芝1份，将黄芪、扶芳藤、党参和灵芝的提纯浸液与蜂胶的95％乙醇浸液混配而成纯中药复合佐剂混悬液。
3、PA/PMV-I纯中药复合佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为纯中药复合佐剂灭活疫苗。
上述三个实施例所制得蜂胶佐剂、中药复方佐剂PA/PMV-I灭活疫苗为棕黑色混悬液，均匀度好，粘度低，通针性良好；在4℃下存放2月以上，瓶底可能有少许沉淀，但在使用前摇匀，不影响效价；油乳剂PA/PMV-I灭活疫苗为油包水型乳白色乳剂苗。以上三种疫苗均不含其它病原；无菌；分别以4倍免疫剂量(2ml/只)和单免疫剂量(0.5ml/只)，肌肉注射免疫10只30日龄鸽，观察20天，无不良反应，安全，有效。胚液抗原HA效价达27以上。
所制得的PA/PMV-I灭活疫苗的使用方法预防肌肉或皮下注射0.5ml/羽份；紧急防疫接种肌肉或皮下注射0.8ml～1.0ml/羽份。
权利要求
1.一种防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗，其特征在于用鸽1型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV-I抗原，将PA/PMV-I抗原灭活后，加入佐剂混配而成。
2.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为油乳佐剂，其组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为白矿油93％～96％、吐温-80 2％～3％、司本-80 2％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。
3.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为蜂胶佐剂，该佐剂为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。
4.根据权利要求1所述的新型灭活疫苗，其特征在于所述的佐剂为中药复方佐剂，该佐剂的原料药重量份配比为黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。
5.权利要求1所述的新型灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括下列步骤a)PA/PMV-I抗原的培养将鸽I型副粘病毒PA/PMV-I种毒GDP199902 CCTCC V200605用无菌生理盐水作适当稀释，使每0.1ml～0.5ml含毒量约104.0～5.0EID50，尿囊腔接种10～11日龄非免疫鸡胚，每胚0.2ml，37℃孵育48～96小时，24小时前死胚为非特异性死亡废弃，收获24小时以后的死亡的胚液，测定其HA效价，取HA效价27～9的鸡胚液，分装，-15℃～-20℃保存备用b)PA/PMV-I抗原的灭活在每1000ml鸡胚液中加入1ml～3ml甲醛含量为37％～40％的福尔马林溶液，并将其转入另外的高压消毒瓶中，置摇床上37℃灭活48小时，即为灭活抗原；c)将灭活抗原配入佐剂而成灭活疫苗。
6.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，将灭活抗原与油乳佐剂按1∶1～2比例混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而成油乳剂灭活疫苗，所述的油乳佐剂的组份包括白矿油、吐温-80、司本-80和硬脂酸铝，其中，白矿油、吐温-80、司本-80的配比按体积百分比计为白矿油93％～96％、吐温-80 2％～3％、司本-80 2％～4％，硬脂酸铝占油乳佐剂总重量的1～3％。
7.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，按每1000毫升灭活抗原中加入蜂胶佐剂20～50毫升，混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而制成灭活疫苗，所述的蜂胶佐剂为纯蜂胶的95％乙醇浸液，浸液中蜂胶的质量浓度为10～50％。
8.根据权利要求5所述的新型灭活疫苗的制备方法，其特征在于在步骤c)中，将灭活抗原与中药复方佐剂混悬液按重量比1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80加入混悬液中，灭菌吐温-80的加入量为混悬液重量的1％～2％，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化而制成中药复合佐剂灭活疫苗，所述的中药复方佐剂的原料药重量份配比为黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份和蜂胶0.01～0.03份，由所述的黄芪、扶芳藤、党参和灵芝提纯浸液与蜂胶95％乙醇浸液混配而成。
全文摘要
本发明提出一种防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗及其制备方法，所述的防制鸽禽I型副粘病毒病新型灭活疫苗，是应用申请人所筛选出的免疫原性强、对流行毒株有高保护率的鸽I型副粘病毒PA/PMV－I种毒GDP199902 CCTCC V200605，接种非免疫鸡胚，再从死胚的胚液中提取PA/PMV－I抗原，将PA/PMV－I抗原灭活后，加入佐剂混配而成。本疫苗对防制鸽禽PA/PMV－I病，特异、安全、有效。
文档编号A61P31/14GK101020054SQ20071002706
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者邹永新 申请人:广东省家禽科学研究所