专利名称：一种有机中药复合免疫增强剂/佐剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种防治畜禽传染病疫苗的纯中药复合免疫增强剂/佐剂及其制备方法。
背景技术：
畜禽传染病是严重危害畜牧生产的疾病，它不仅可以造成畜禽大批死亡，畜禽生产性能降低，畜禽产品质量下降而直接影响农牧民的经济收入和对外贸易，而且某些人畜共患病还威胁着人类健康。现阶段，对于传染病的防治，较多地依赖于多种疫(菌)苗的免疫接种以及药物的使用，但由于长期以来大量的滥用药物及不合理的疫苗接种而导致机体免疫功能下降，特别是淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞处于低迷或抑制状态；加之近年来新的畜禽疫病不断出现及旧的疫病的病原体变异和毒力增强，导致常规疫苗免疫接种预防效果不佳，以及用药量逐渐加大，而仍未达到理想的治疗和预防效果。
为了增强疫苗的免疫保护效果以及药效，国内外虽有多种免疫增强剂和佐剂包括油类免疫佐剂、细菌或细菌源的免疫佐剂(脂多糖、牛分枝杆菌卡介苗、分枝杆菌片断)、无机盐类免疫增强剂/佐剂、化学合成物类免疫增强剂/免疫佐剂(脂质体、左旋咪唑、葡聚糖硫酸脂)。由于某些免疫增强剂/佐剂价格昂贵等多种原因，多数仍处于实验室阶段；化学药物类免疫增强剂不同程度地存在着降低机体生产性能，引发毒副作用和药物残留，危害人体健康等弊端；疫苗佐剂应用较为广泛亦主要为矿物油，然而，注射油苗后易出现较强的应激反应，且因油佐剂中矿物油在体内因不能代谢而长期存在，往往造成局部组织损伤和形成难以消散的硬结，这些在畜禽体内无法吸收的矿物油易引起胴体质量下降，且经食物链直接进入人体，严重影响人们的身体健康。另外禽传染病(如禽霍乱病、鸡新城疫)预防方面也有一些蜂胶佐剂灭活疫苗的探索和报道，但佐剂型单一，多为单纯的蜂胶，预防对象为鸡、鸭、鹅。
发明内容
申请人在防治禽病的临诊和开展科研工作的基础上，对家禽疫苗、抗体、免疫增强剂等生物制剂以及中药制剂进行了大量的研究，提出了一种高效、安全、稳定的防治畜禽传染病的纯中药复方免疫增强剂/佐剂及其制备方法，此为本发明的目的。本发明能以较低生产成本来获得较为理想的适合于防治畜禽疾病的免疫增强剂/佐剂，它既能增强现有疫苗的免疫力，又能增强畜禽抗病能力的非特异性防御机制。
实现本发明目的所采用的技术方案如下1、复合免疫增强剂/佐剂组方筛选利用蜂胶、扶芳藤、黄芪、党参、灵芝等中药，含多种黄酮类、皂苷类、氨基酸类、生物碱、酚类化合物、叶绿素衍生物、胡萝卜素等成分，按一定工艺提取有效成份，合理组合，作为免疫佐剂有良好的免疫增强作用，具有补气、抗疲劳和提高机体网状内皮系统的功能，增加白细胞吞噬功能，诱生干扰素，促进抗体的形成，提高机体的特异性和非特异性免疫力，增强机体抗病力。
通过鸡胚中和试验、动物(鸡)免疫力试验，从各种中药的提取液中，筛选出以蜂胶为主，结合黄芪、扶芳藤、党参、灵芝，以一定比例有机组合成新配方。
所获得的中药复方免疫增强剂/佐剂的原料药配方为(按重量份配比)蜂胶0.01～0.03份、黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份、人参0～3份、黄连0～3份、金银花0～3份和连翘0～3份。
2、复合免疫增强剂/佐剂的制备按上述配方称取原料药，按下列步骤制备复合免疫增强剂/佐剂a)将称取的蜂胶，用95％的乙醇浸溶，制成含蜂胶质量浓度为20％～50％的蜂胶酊；b)将称取的原料药黄芪、扶芳藤、党参、灵芝、人参、黄连、金银花和连翘，分别加水煎煮2次，每次2～3小时，合并煎液，过滤，将滤液减压浓缩，再经乙醇沉淀处理2次，将醇提物回收乙醇后，按所得物重量的4～30倍量加入注射水，置4℃48小时，过滤，取上清液，煮沸10分钟，再过滤，取上清液，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～5.0，加吐温-80至其质量浓度为1％～6％，制得提取液；c)在所得提取液中加入苯甲醇，使苯甲醇的质量浓度为1％～5％，再与上述制得的蜂胶酊混合，即制成本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂混悬液。
在上述步骤b)中，当制备有机中药复合免疫佐剂时，所述原料药的醇提液回收乙醇后，可按所得物重量的4～10倍量加入注射水；当制备有机中药复合免疫增强剂时，所述原料药的醇提液回收乙醇后，可按所得物重量的10～30倍量加入注射水。
本中药复合免疫增强剂/佐剂作为中药复合免疫增强剂使用，可直接给禽、畜口服，也可作肌肉或皮下注射，使用方法如下1.肌肉或皮下注射禽0.5毫升～1毫升/羽份(0.5公斤重量)；猪2毫升～4毫升/头(50公斤重量)。
2.口服禽0.5毫升～1毫升/羽份(0.5公斤重量)；猪4毫升～8毫升/头(50公斤重量)。
适用范围鸡、鸭、鹅、鸽等禽类和猪。
用本有机中药复合免疫增强剂/佐剂作为佐剂与PA/PMV-I(鸽禽I型副粘病毒)或NDV(鸡新城疫的病毒)等灭活抗原混配即可配制成中药复合佐剂灭活疫苗。其配制方法如下将经效价测定调至合格的PA/PMV-I或NDV等灭活抗原与本中药复合免疫佐剂混悬液按1～3∶1～5比例混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混合液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后分装，即成为纯中药复合佐剂灭活疫苗，适用于肌肉或皮下注射使用。中药复合佐剂PA/PMV-I(NDV)灭活疫苗的使用方法如下1.预防鸽、鸡等禽类，肌肉或皮下注射0.5毫升/羽份；
2.紧急防疫接种鸽、鸡，肌肉或皮下注射0.8毫升～1.0毫升/羽份。
本发明达到的技术效果1.动物试验1取1日龄健康粤禽黄肉鸡60只为试验鸡，随机分为2组(I为试验组，II为空白对照组)，每组30只。试验组于4～8日龄时，在饮水中按每天每只鸡0.5毫升添加本中药复合免疫增强剂，对照组则不添加本制剂作空白对照，并于14日龄、21日龄、35日龄时每组随机取10只鸡称重后分别无菌采血样，进行淋巴细胞转化试验及血液中超氧化物歧酶测定；然后将试验鸡颈静脉放血处死，解剖并分离法氏囊和脾脏，分别称重，计算法氏囊系数和脾脏系数。结果显示，试验组雏鸡的胸腺指数、法氏囊指数、脾脏指数均明显高于空白对照组，两两之间均差异极显著(p＜0.01)；同时测得试验组SOD活力于14日龄时与对照组差异显著(p＜0.05)，于21日龄、35日龄时试验组SOD活力与对照组相比差异极显著(p＜0.01)。结果综合说明，本中药复合免疫增强剂可明显促进免疫器官中免疫活性细胞的增殖，提高机体细胞免疫和体液免疫的机能。
2.为了验证本中药复合免疫增强剂在畜禽生产中应用价值，我们在饲料中添加中药复合免疫增强剂后，对肉鸡、乳鸽的成活率、增重量及料肉比进行了测定试验，取得了较好的效果。
2.1.取1日龄健康粤禽黄优质肉鸡500只为试验鸡，随机分为2组，每组250只。试验组于4～8日龄时，在饮水中按每天每只鸡0.5毫升添加本中药复合免疫增强剂，对照组则不添加本制剂作空白对照，常规饲养，试验期为30天。于试验结束时称重，并计算其成活率、增重量及料肉比。我们发现在平均育雏成活率、增重二个指标上，添加了复合免疫增强剂试验组(98.6％、450.65克)，均大于未添加复合免疫增强剂的对照组(92.3％，389.5克)，经数据统计分析，两两之间差异极其显著(P＜0.01)；料肉比试验组(1.56∶1)明显比对照组(1.72∶1)低。
2.2.取15～16日龄乳鸽50只，随机分为试验组和对照组各25只，离巢至育肥仓育肥饲养。同时，每组设一个重复。试验组乳鸽分别于20～24日龄，每次逐只灌服0.5毫升复合免疫增强剂，每天上午、下午各灌一次。各组乳鸽于15日龄和35日龄时，分别计数和称重。试验结果表明，在增重和料重比两个指标上，试验组(123.2克，4.86∶1)均优于对照组(95.2克，6.16∶1)。
3.鸽副粘病毒病(PA/PMV-I)中药复合佐剂灭活疫苗的实验室效力试验取3日龄非免疫鸽240只，随机分成2个试验组，第1组(120只)肌肉接种中药佐剂灭活苗0.5ml/只，第2组(120只)不进行疫苗免疫以作为对照。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后3天、6天、9天、14天、21天、35天、60天、90天、120天、150天、180天)抽血1ml分离血清，用鸽A/PMV-I GDP199902为抗原，按常规微量法分别测定其HI价，其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点，以Xlog2表示，每次测定均重复一次，取平均值。并于免疫后21天、35天、90天、120天、150天、180天，2个组各随机抽取20只，进行强毒(200个ELD50/0.1ml)攻击，隔离饲养，连续观察25天，以检测其免疫保护效果。试验结果表明，使用中药复合佐剂后4天即可检出抗体，14天至30天维持最高峰(10.8～11.5log2)，180天仍能维持较高的抗体水平(6.0～6.9log2)，且没有油苗的难于注射和局部形成硬结的问题。在实验室内，试验组于免疫后21天、60天、90天、120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD50/0.1ml攻击，其保护指数分别为100％、100％、100％、94.4％、88.9％、83.5％。此时，检测其血清抗体HI价，平均(10.5log2～11.5log2)log2以上。根据“HI抗体效价与攻毒保护率平行关系的试验报告”我们制定为免疫21天后测定HI效价平均应≥6log2。
4.鸡新城疫(NDV)中药复合佐剂灭活疫苗的实验室效力试验取10日龄非免疫鸡240只，随机分成2个试验组，第1组(180只)肌肉接种中药佐剂灭活苗0.5ml/只，21天后从中随机取出60只肌肉接种中药佐剂灭活苗0.8ml/只；第2组(180只)不进行疫苗免疫以作为对照。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后4天、6天、9天、14天、21天、35天、60天、90天、120天、150天、180天)抽血1ml分离血清，用NDIV系为抗原，按常规微量法分别测定其HI价，其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点，以Xlog2表示，每次测定均重复一次，取平均值。并于免疫后21天、35天、90天、120天、150天、180天，2个组各随机抽取20只，进行强毒(200个ELD50/0.1ml)攻击，隔离饲养，连续观察25天，以检测其免疫保护效果。试验结果表明，使用本中药复合佐剂后4天即可检出抗体，14天至35天维持最高峰(8.8log2～10.1log2)，6个月仍能维持较高的抗体水平(6.0log2)，且没有油苗的难于注射和局部形成硬结的问题。在实验室内，试验组于免疫后21天、60天、90天、120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD50/0.1ml攻击，其保护指数分别为100％、100％、100％、90％、85.4％、81.9％；二免疫后120天、150天、180天分别用强毒株200个ELD50/0.1ml攻击，其保护指数分别为100％、93％、85.4％。
可见，本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂作为中药复合免疫增强剂对畜禽具有以下作用和特点1.使其既能增强疫苗的免疫力，又能增强畜禽抗病能力的非特异性防御机制；2.防病保健作用双向调理，可预防疾病发生，减轻疾病发生的严重程度，提高成活率8.9％～13.8％；3.促生长作用可使禽畜长得更快、更大；4.抗应激作用可显著降低禽畜应激反应；5.降低疾病防治成本可降低疾病防治成本50％。
6.适用面广可广泛适用于家禽家畜以及鸽、山鸡等珍特禽；7.经济效益显著由于上述多方面的作用，可显著地降低综合饲养成本，提高经济效益。
用本有机中药复合免疫增强剂/佐剂作为佐剂配制的纯中药复合佐剂灭活疫苗经现场试验，效果如下
1.PA/PMV-I中药复合佐剂灭活疫苗的现场应用效果为了观察PA/PMV-I中药复合佐剂灭活疫苗的现场应用效果，我们先后分别生产了1万羽份，在广东省内不同地区6个场1万只鸽应用，后备种鸽于30～45日龄和配对上笼1～2周各接种1次，在半年内不发生疫情；在饲养条件较好的种鸽场(2个场)，接种2年龄以上产鸽4000对，1年内不发生鸽新城疫疫情，预防有效率可达100％；在受威胁区，接种4批3～15日龄的乳鸽，共1000只，安全有效，在整个肉鸽生产期内不发生疫情，还提高其成活率和生产效益；对已发生本病者，紧急接种后，4～7天可基本控制疫情，除了个别病情严重，出现歪头、扭颈等严重神经症状的病鸽难以治愈外，其余的均能逐渐康复，对本病的紧急防疫接种有效率可达92.3％以上。经跟踪6个鸽场免疫效果观察及抽样检测抗体水平的结果表明，经免本疫苗半年后，其平均HI价可达5.6log2以上。
2.NDV中药复合佐剂灭活疫苗的现场应用效果为了观察NDV中药复合佐剂灭活疫苗的现场应用效果，我们先后分别生产了5000羽份，在广东省内不同地区3个场3000只肉鸡应用，对鸡新城疫的预防有效率可达100％，紧急防疫有效率可达90.1％以上。
具体实施例方式
实施例一中药复方免疫增强剂/佐剂的原料药配方为(按重量份配比)黄芪1份、扶芳藤1份、党参1份、灵芝1份，纯蜂胶0.01份。
中药复方免疫增强剂/佐剂的制备1、将纯蜂胶用95％乙醇浸溶，制成含蜂胶质量浓度为98％的蜂胶酊；2、将黄芪、扶芳藤、党参和灵芝，分别经水煎煮2次，每次2～3小时，合并煎液，过滤，将滤液减压浓缩，再经乙醇沉淀处理2次，将醇提液回收乙醇后，于所得物中加入注射水(当制备免疫佐剂时，按每重量份所得物加入注射水5份，当制备免疫增强剂时，按每重量份所得物加入注射水12份)，置4℃48小时，过滤，后煮沸10分钟，再过滤，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～5.0，加吐温-80至其质量浓度为2％，制得提取液；3、在所得提取液中加入苯甲醇，使苯甲醇的质量浓度为3％，再与上述制得的蜂胶酊混合，即制成本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂混悬液。
PA/PMV-I(NDV)中药复合佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的PA/PMV-I(NDV)抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为纯中药复合佐剂PA/PMV-I(NDV)灭活疫苗。
质量指标本中药复方佐剂PA/PMV-I(NDV)灭活疫苗和中药复方免疫增强剂均为棕黑色混悬液，均匀度好，粘度低，通针性良好；在4℃下存放2月以上，瓶底可能有少许沉淀，但在使用前摇匀，不影响效果；不含其它病原；无菌；使用安全，有效。
实施例二中药复方免疫增强剂/佐剂的原料药配方为(按重量份配比)黄芪3份、扶芳藤3份、人参3份、党参3份、灵芝3份、黄连3份、金银花3份、连翘3份，纯蜂胶0.03份。
中药复方免疫增强剂/佐剂的制备1、将纯蜂胶用95％乙醇浸溶，制成含蜂胶质量浓度为98％的蜂胶酊；2、将黄芪、扶芳藤、人参、党参、灵芝、黄连、金银花和连翘，分别经水煎煮2次，每次2～3小时，合并煎液，过滤，将滤液减压浓缩，再经乙醇沉淀处理2次，将醇提液回收乙醇后，于所得物中加入注射水(当制备免疫佐剂时，按每重量份所得物加入注射水8份，当制备免疫增强剂时，按每重量份所得物加入注射水20份)，置4℃48小时，过滤，后煮沸10分钟，再过滤，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～5.0，加吐温-80至其质量浓度为2％，制得提取液；3、在所得提取液中加入苯甲醇，使苯甲醇的质量浓度为4％，再与上述制得的蜂胶酊混合，即制成本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂混悬液。
PA/PMV-I(NDV)中药复合佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的PA/PMV-I(NDV)抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为纯中药复合佐剂PA/PMV-I(NDV)灭活疫苗。
实施例三中药复方免疫增强剂/佐剂的原料药配方为(按重量份配比)黄芪1份、扶芳藤1份、党参2份、灵芝2份、黄连1份、金银花1份，纯蜂胶0.02份。
中药复方免疫增强剂/佐剂的制备1、将纯蜂胶用95％乙醇浸溶，制成含蜂胶质量浓度为98％的蜂胶酊；2、将黄芪、扶芳藤、党参、灵芝、黄连、金银花和连翘，分别经水煎煮2次，每次2～3小时，合并煎液，过滤，将滤液减压浓缩，再经乙醇沉淀处理2次，将醇提液回收乙醇后，于所得物中加入注射水(当制备免疫佐剂时，按每重量份所得物加入注射水6份，当制备免疫增强剂时，按每重量份所得物加入注射水15份)，置4℃48小时，过滤，后煮沸10分钟，再过滤，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～5.0，加吐温-80至其质量浓度为2％，制得提取液；3、在所得提取液中加入苯甲醇，使苯甲醇的质量浓度为3％，再与上述制得的蜂胶酊混合，即制成本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂混悬液。
PA/PMV-I(NDV)中药复合佐剂灭活疫苗的配制经效价测定调至合格的PA/PMV-I(NDV)抗原后与中药复方佐剂混悬液1∶1～1.5混合，后将灭菌吐温-80按1％～2％加入混悬液中，搅拌混合均匀，再倾入匀浆泵乳化，无菌及安全检查后，分装，成为纯中药复合佐剂PA/PMV-I(NDV)灭活疫苗。
实施例四中药复方免疫增强剂/佐剂的原料药配方为(按重量份配比)黄芪1份、扶芳藤1份、党参2份、灵芝2份、黄连1份、金银花1份、连翘1份。
中药复方免疫增强剂或佐剂及其中药复合佐剂灭活疫苗的配制方法如实施例三。
上述四个实施例所配制的中药复合佐剂灭活疫苗的试验效果取7日龄非免疫健康粤禽黄优质肉鸡60只为试验鸡，随机分为5组，每组10只。试验(I-IV)组于10日龄时，肌肉注射按下面4种配方分别制成的纯中药复合佐剂与同-NDV灭活抗原配成疫苗，对照组则不免疫作空白对照，常规饲养，试验期为21天。在免疫前后定期(免疫前1天及免疫后3天、9天、14天、21天)抽血分离血清，按常规微量法分别测定其HI价，其HI价结果判定以完全抑制血凝的最高稀释度为终点，以Xlog2表示，每次测定均重复一次，取平均值。结果如下中药复合佐剂NDV灭活疫苗免疫前后血清ND-HI抗体测定结果
权利要求
1.一种有机中药复合免疫增强剂/佐剂，其特征在于由下列重量份的原料药制成蜂胶0.01～0.03份、黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份、人参0～3份、黄连0～3份、金银花0～3份和连翘0～3份。
2.根据权利要求1所述的有机中药复合免疫增强剂/佐剂，其特征在于由下列重量份的原料药制成蜂胶0.01份、黄芪1份、扶芳藤1份、党参1份和灵芝1份。
3.权利要求1所述的有机中药复合免疫增强剂/佐剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤a)称取蜂胶，用95％的乙醇浸溶，制成含蜂胶质量浓度为98％的蜂胶酊；b)称取原料药黄芪、扶芳藤、党参、灵芝、人参、黄连、金银花和连翘，分别加水煎煮2次，每次2～3小时，合并煎液，过滤，将滤液减压浓缩，再经乙醇沉淀处理2次，将醇提液回收乙醇后，按所得物重量的4～30倍量加入注射水，置4℃48小时，过滤，取上清液，煮沸10分钟，再过滤，取上清液，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～5.0，加吐温-80至其质量浓度为1％～6％，制得提取液；c)在所得提取液中加入苯甲醇，使苯甲醇的质量浓度为1％～5％，再与上述制得的蜂胶酊混合，即制成复合免疫增强剂/佐剂混悬液。
4.根据权利要求3所述的有机中药复合免疫增强剂/佐剂的制备方法，其特征在于当制备有机中药复合免疫佐剂时，在步骤b)中，所述原料药的醇提液回收乙醇后，按所得物重量的4～10倍量加入注射水。
5.根据权利要求3所述的有机中药复合免疫增强剂/佐剂的制备方法，其特征在于当制备有机中药复合免疫增强剂时，在步骤b)中，所述原料药的醇提液回收乙醇后，按所得物重量的10～30倍量加入注射水。
全文摘要
本发明提出一种用以防治畜禽传染病的有机中药复合免疫增强剂/佐剂及其制备方法，该防治畜禽传染病的原料药配方为(按重量份配比)蜂胶0.01～0.03份、黄芪1～3份、扶芳藤1～3份、党参1～3份、灵芝1～3份、人参0～3份、黄连0～3份、金银花0～3份和连翘0～3份。将原料药黄芪、扶芳藤、党参、灵芝、人参、黄连、金银花和连翘的提取液与蜂胶的95％的乙醇浸液混配即可制得本发明的有机中药复合免疫增强剂/佐剂。本发明能以较低生产成本来获得较为理想的适合于防治畜禽疾病的免疫增强剂/佐剂，它既能增强现有疫苗的免疫力，又能增强畜禽抗病能力的非特异性防御机制。
文档编号A61K35/56GK101019940SQ20071002706
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者邹永新 申请人:广东省家禽科学研究所