专利名称：：高效表达sars冠状病毒s蛋白的重组杆状病毒及构建的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程技术和医药
技术领域：
，特别是涉及一种能够高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒AcMNPV-厶CC-SA(AcMNPV:v4Wogra;^aca/z/or"/ozMNPV)，还涉及该重组杆状病毒的构建方法。所述重组杆状病毒AcMNPV-ACC-SA命名为重组杆状病毒AcBacAre—S，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2007年5月18日，保藏号为CCTCCNO:V2007(B。
背景技术：
：严重急性呼吸综合症(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)的病原体被命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)，S蛋白是SARS-CoV的外壳组分，是SARS-CoV的主要表面抗原，也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞免疫反应的重要因子。S蛋白属于I型膜蛋白，它是已知最大的膜结构蛋白，全长有1256个氨基酸(aa)，相对分子质量为139170kD，其中113aa是信号肽，11971218aa有一段跨膜序列，是S蛋白和病毒外壳膜结合的位置。目前GenBank所收录的SARS病毒分离株的S蛋白的编码基因及氨基酸序列进行同源性分析发现分离株S蛋白氨基酸突变率和编码碱基突变分别仅为0.23%和0.16%，是用来研制保护性疫苗的理想部位，进行多重比对显示，S蛋白的编码基因序列、S蛋白的特殊功能及其相对保守性为有效疫苗的开发奠定了很好的基础，尤其在生产疫苗时，S蛋白常作为首选抗原蛋白。然而目前，在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法，具体研究中将S蛋白作为研究靶点还存在很多问题，尤其是在保证S蛋白免疫原性及高分子量S蛋白的纯化操作中还存在困难。目前针对同S蛋白相类似的高分子量的膜蛋白，大多选用技术已十分成熟的原核表达系统，但还存在许多原核表达难以克服的缺点，如原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；细菌产生的致热原致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难。
发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足进行改进，提供一种能够高效表达SARS-CoV近全长S蛋白的重组杆状病毒，其蛋白的表达量高、具有表达后修饰功能、表达的外源蛋白具有更好的抗原性活强，大大方便了大分子量及复杂的膜蛋白的表达及后续的纯化。同时基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的原理，使得构建操作更简单和有效。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案本发明提供的高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒是CCTCCNO:V200703。本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCCNO:V200703,其构建方法是基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，利用改造的带有病毒AcMNPV自身的组织蛋白酶信号肽基因的转移载体pFastBacSHTa，将SA即由SARS-CoVWH20株S蛋白基因中去除了其l13aa信号肽和跨膜序列以后序列313588bp的近全长S片段，克隆到pFastBacSHTa的多克隆位点上，使SA基因序列与6个组氨酸标签对框融合，从而获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa-S△，再利用该质粒上的同源臂将其转座到双缺失的穿梭载体Ac-bacACC上，获得重组穿梭载体Ac-bacACC-SA，然后转染昆虫细胞，即可获得重组杆状病毒AcMNPV-ACC-SA，其为CCTCCNO:V200703。本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCCNO:V200703的构建方法，其在进行下一步基于S蛋白的免疫诊断、疫苗研发或疾病治疗及研究方面中的用途。本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCCNO:V200703的构建方法，其在对S基因的表达产物进行类似于哺乳动物体内的翻译后加工和糖基化修饰作用，使S蛋白的表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白中的用途。本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCCNO:V200703的构建方法，在用于难以表达的外源蛋白中的用途，该外源蛋白包括膜结构蛋白，以及高分子量、修饰加工复杂的蛋白。本发明利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，通过构建杆状病毒穿梭质粒载体，利用昆虫细胞表达体系，提供了一种能够高效表达SARS-CoV近全长S蛋白的重组杆状病毒及其构建方法。与现有技术相比，本发明具有以下的主要优点将S大片段去除了信号肽(113aa)和跨膜及其后部分(12191256aa)后，有利于S蛋白利用杆状病毒的信号肽，使表达量有了成倍的提高。杆状病毒Bac-to-Bac表达系统属于一种快速、高效的真核表达系统，具有对真核基因的表达产物进行正常的翻译后加工和糖基化修饰等功能，pFastBacSHTa使用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子，可使S基因得到高效表达。由于所得到真核重组病毒为分泌型表达，使真核细胞内表达的蛋白更容易分泌至胞外，便于进行蛋白纯化。通过在转移载体上加入6个组氨酸的标签，更利于用Ni-NTA树脂亲和层析纯化蛋白。使用双缺失Ac-bacmid使获得的近全长S蛋白的重组病毒的表达量提高了至少10倍。同时所使用的昆虫细胞(sfNcell)尤其适合于外源蛋白的表达，使得表达量有了进一步的提高。这些改进不仅使外源蛋白表达量高，而且大大方便了高分子量和修饰复杂的外源蛋白质的表达与纯化。此外基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的原理，使得操作更简单、快速、安全、有效。图1是本发明杆状病毒表达系统转移载体质粒pFastBacSHTa示意图。图2是本发明高效表达SARS-CoVS蛋白的重组杆状病毒结构示意图。图3是本发明高效表达SARS-CoVS蛋白的重组杆状病毒构建过程示意图。具体实施例方式本发明提供的高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒是CCTCCNO:V200703。本发明提供的重组杆状病毒CCTCCNO:V200703,其构建方法是选取SARS-CoVWH20株S蛋白基因的313588bp片段的近全长片段，我们命名为SA，即去除了大部分信号肽(113aa)和跨膜序列(12191256aa)以后部分。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，构建了一种带有病毒(AcMNPV)自身的组织蛋白酶信号肽基因和6个组氨酸(6XHis)标签的转移载体pFastBacSHTa,在pFastBacSHTa的多克隆位点(MCS)上插入SA基因。同时构建缺失几丁质酶和组织蛋白酶的双缺失Ac-bacmid(AcA(X-bac),通过转座作用将转移载体上同源臂(Tn7R和Tn7L)间的基因(包括目的基因SA)位点特异性转座到双缺失Ac-bacmid上，经过抗性筛选及PCR验证将正确的重组Ac-bacmid转染到一种有利于蛋白表达的昆虫细胞(sfNcell),随后即可得到一种能够高效表达SARS-CoV近全长S蛋白的重组杆状病毒AcMNPV-ACC-SA，其为CCTCCNO:V200703。所述SARS-CoVWH20株S蛋白序列具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列(参见位于文章末尾的序列表)。该序列全长为3768bp,其中139bp编码一段信号肽，36573768bp编码C端的跨膜区及以后序列。下面结合具体实例和附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明。从图l、图2和图3可知，本发明是通过利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的原理而实现的。本发明CCTCCNO:V200703的构建方法，具体操作步骤如下①先用聚合酶链式反应(PCR)法从含组织蛋白酶信号肽(CaSP)基因的野生型AcMNPV的bacmid中扩增出CaSP基因序列，克隆到pGEM-TEasy上，获得含CaSP基因质粒pGEM-TEasy-CaSP，并进行测序验证。②在商品化的转移载体质粒pFastBacHTa上进行改造，应用4/71I禾t]WAel双酶切pGEM-TEasy-CaSP，获得带双酶切粘端的CaSP，把其克隆到用同样的两个酶消化的质粒pFastBacHTa上，即在6个组氨酸(6XHis)标签前对框插入，获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa,这样有利于外源蛋白的定位以及形成外源蛋白的分泌型表达。标签的作用是便于用Ni-NTA树脂亲和层析纯化蛋白。③以SARS病毒WH20株的mRNA为模板，通过一步RT—PCR得到S基因的11979bp和1843—3588bp两个片段，由于两段间有137bp的重叠，再通过重叠拼接聚合酶链式反应(over-l叩pingPCR)扩增出S基因的313588bp片段(SA)，将其克隆到T载体(pGEM-TEasy)上，获得含SA基因的质粒pGEM-TEasy-S△，并进行测序验证。其间，使用了AcMNPV结构基因中多角体蛋白的强启动子和组织蛋白酶信号肽(CaSP)，这样有利于SA蛋白的高效分泌型表达。应用单酶切pGEM-TEasy-SA，之后用Klenow酶补平，获得双平端的SA，把其克隆到用lol酶切消化并补平的质粒pFastBacSHTa的多克隆位点(MCS)上，即与6XHis标签对框融合，获得新转移载体质粒pFastBacSHTa-S△。⑤在AcMNPV野生型穿梭载体(bacmid)上，利用分子生物技术在已删除了几丁质酶(chintinase)和组织蛋白酶(v-cathepsin)基因编码区的位点处，插入氯霉素标记基因(chl)，获得双缺失的穿梭载体Ac-bacACC,有利于提高外源蛋白SA的表达量。标记基因还可以用绿色荧光蛋白GFP基因等替换。⑥将转移载体质粒pFastBacSHTa-SA转化到含Ac-bacACC的大肠杆菌DH10B细胞中，通过位点特异性转座作用，经过PCR检测和基因组酶切检测获得重组bacmid(Ac-bacACC-SA)。⑦将重组的Ac-bacACC，SA转染昆虫细胞(5/9、^1)，收集病毒上清经过纯化，即可得到纯的重组病毒即高效表达SARS-CoVS蛋白的重组杆状病毒AcMNPV-ACC-SA。实际应用时，将重组杆状病毒AcMNPV-ACC-SA感染昆虫细胞(sfN),收集细胞，超声破碎，并利用NhNTA树脂进行亲和层析纯化S蛋白，复性后用于下一步的研究与应用。使用昆虫细胞(^/N)扩增病毒，与普通的昆虫细胞(《/9、《/21)相比，使得表达量提高了近两倍。本发明的关键技术是杆状病毒Bac-to-Bac表达系统属于一种快速、高效的真核表达系统，具有对真核基因的表达产物进行正常的翻译后加工和糖基化修饰等功能，我们构建的pFastBacSHTa是使用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子，可使外源S蛋白得到高效表达。我们选取的SA大片段去除了大部分信号肽和跨膜序列以后部分，并利用杆状病毒组织蛋白酶的信号肽，有利于提高表达量。通过在转移载体pFastBacSHTa上的6个组氨酸标签，更利于用Ni-NTA树脂亲和层析纯化蛋白。使用双缺失Ac-bacmid，与野生型Ac-bac相比，可以使S蛋白的重组病毒的表达从无到有，有利于象S这样大小的膜结构蛋白的表达。同时所使用的昆虫细胞(sfNcell)尤其适合于外源蛋白的表达，与普通的昆虫细胞相比，使得表达量提高了近两倍。这些改进与措施不仅使外源蛋白表达量高，而且大大方便了高分子量和修饰复杂的外源真核蛋白质的表达与纯化。此外基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的原理，使得操作更简单、快速。本发明涉及一种能够高效表达SARS-CoVS蛋白的重组杆状病毒，还涉及该重组杆状病毒的构建方法。SARS-CoVS蛋白的获得，将有利于进一步发现与其结合的除ACE2之外的其它受体或共受体，为完整解释SARS-CoV进入不同组织细胞的具体机制奠定基础。同时该蛋白的获得也为基于S蛋白的免疫诊断、疫苗研发以及疾病治疗提供良好的实验基础。<110〉中国科学院武汉病毒研究所<120><140〉<141>高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒及其构建2007—6—13<160〉3768(序列的总数，即与数值最大的序列标识符相对应的正整数)<170〉<210〉<211〉<212〉<220><221〉<222><223>13768bpDNA<213〉SARS冠状病毒S基因SARScoronavirusSgene<300><301〉<302><303><304〉<305〉<306〉<307><308〉<309>王华林李娟邓菲袁丽胡志红2007—6—132007—6—13<400〉1atgtttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccggtgcaccacttttgatgatgttcaagctcctaattacactcaacatacttcatctatgaggggggtttactatcctgatgaaatttttagatcagacactctttatttaactcaggatttatttcttccattttattctaatgttacagggtttcatactattaatcatacgtttgacaaccctgtcataccttttaaggatggtatttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttggttctaccatgaacaacaagtcacagtcggtgattattattaacaattctactaatgttgttatacgagcatgtaactttgaattgtgtgacaaccctttctttgctgtttctaaacccatgggtacacagacacatactatgatattcgat犯tgcatttaattgcactttcgagtacatatctgatgccttttcgcttgatgtttcagaaaagtcaggtaattttaaacacttacgagagtttgtgtttaaaaataaagatgggtttctctatgtttataagggctatcaacctatagatgtagttcgtgatctaccttctggttttaacactttgaaacctatttttaagttgcctcttggtattaacattacaaattttagagccattcttacagccttttcacctgctcaagacacttggggcacgtcagctgcagcctattttgttggctatttaaagccaactacatttatgctcaagtatgatgaaaatggtacaatcacagatgctgttgattgttctcaaaatccacttgctgaactcaaatgctctgttaagagctttgagattgacaaaggaatttaccagacctctaatttcagggttgttccctcaggagatgttgtgagattccctaatattacaaacttgtgtccttttggagaggtttttaatgctactaaattcccttctgtctatgcatgggagagaaaaaaaatttctaattgtgttgctgattactctgtgctctacaactcaacatttttttcaacctttaagtgctatggcgtttctgccactaagttgaatgatctttgcttctccaatgtctatgcagattcttttgtagtcaagggagatgatgt犯gacaaat已gcgccaggacaaactggtgttattgctgattataattataaattgccagatgatttcatgggttgtgtccttgcttggaatactaggaacattgatgctacttcaactggtaattataattataaatataggtatcttagacatggcaagcttaggccctttgagagagacatatct犯tgtgcctttc<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>acaacaacatcaactgcattgggcaagctgcaagacgttgttaaccagaatgctcaagcattaaacacacttgttaagcaacttagctctaattttggtgcaatttcaagtgtgctaaatgatatcctttcgcgacttgataaagtcgaggcggaggtacaaattg已caggttaattacaggcagacttcaaagccttcaaacctatgtaacacaacaactaatcagggctgctgaaatcagggcttctgctaatcttgctgctactaaaatgtctgagtgtgttcttggacaatca犯aagagttgacttttgtggaaagggctaccaccttatgtccttcccacaagcagccccgcatggtgttgtcttcctacatgtcacgtatgtgccatcccaggagaggaacttcaccacagcgccagcaatttgtcatgaaggcaaagcatacttccctcgtgaaggtgtttttgtgtttaatggcacttcttggtttattacacagaggaacttcttttctccacaaataattactacagacaatacatttgtctcaggaaattgtgatgtcgttattggcatcattaacaacacagtttatgatcctctgcaacctgagcttgactcattcaaagaagagctggacaagtacttcaaaaatcatacatcaccagatgttgatcttggcgacatttcaggcattaacgcttctgtcgtcaacattcaaaaagaaattgaccgcctcaatgaggtcgctaaaaatttaaatgaatcactcattgaccttcaagaattgggaaaatatgagcaatatattaaatggccttggtatgtttggctcggcttcattgctggactaatggccatcgtcatggttacaatcttgctttgttgcatgactagttgttgcagttgcctcaagggtgcatgctcttgtggttcttgctgcaagtttgatgaggatgactctgagccagttctcaagggtgtcaaattacattacacataa3768权利要求1.一种高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒，其特征是CCTCCNOV200703。2.—种高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征是基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，利用改造的带有病毒AcMNPV自身的组织蛋白酶信号肽基因的转移载体pFastBacSHTa，将SA即由SARS-CoVWH20株S蛋白基因中去除了其113aa信号肽和跨膜序列后的近全长S片段序列313588bp，克隆到pFastBacSHTa的多克隆位点上，使SA基因序列与6个组氨酸标签对框融合，从而获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa-S△，再利用该质粒上的同源臂将其转座到双缺失的穿梭载体Ac-bacACC上，获得重组穿梭载体Ac-bacACC-SA，然后转染昆虫细胞，即可获得重组病毒AcMNPV-ACC-SA，其为CCTCCNO:V200703。3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于SARS-CoVWH20株S蛋白序列具有SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。4.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是转移载体pFastBacSHTa由以下步骤的方法获得(1)先用PCR法从含组织蛋白酶信号肽基因的野生型AcMNPV的bacmid中扩增出CaSP基因序列，克隆到pGEM-TEasy上，获得含CaSP基因质粒pGEM-TEasy-CaSP，并进行测序验证；(2)在商品化的转移载体质粒pFastBacHTa上进行改造，应用4/7II和A^el双酶切pGEM-TEasy-CaSP，获得带双酶切粘端的CaSP，把其克隆到用同样的两个酶消化的质粒pFastBacHTa上，即在6个组氨酸标签前对框插入，获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa。5.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是转移载体质粒pFastBacSHTa-S△由以下步骤的方法获得(1)以SARS病毒WH20株的mRNA为模板，通过一步RT—PCR得到S基因的11979bp和1843—3588bp两个片段，由于两段间有137bp的重叠，再通过重叠拼接聚合酶链式反应扩增出S基因的313588bp片段，命名为S△，将SA克隆到T载体即pGEM-TEasy上，获得含SA基因的质粒pGEM-TEasy-SA，并进行测序验证；(2)应用5^1单酶切pGEM-TEasy-S△，之后用Klenow酶补平，获得双平端的S△，把其克隆到用X/^I酶切消化并补平的质粒pFastBacSHTa的多克隆位点MCS上，即与6XHis标签对框融合，获得转移载体质粒pFastBacSHTa-SA。6.根据权利要求2所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是重组穿梭载体Ac-bac△CC-SA由以下步骤的方法获得(1)在AcMNPV野生型穿梭载体上，利用分子生物技术在已删除了几丁质酶和组织蛋白酶基因编码区的位点处，插入氯霉素标记基因或绿色荧光蛋白GFP标记基因，获得双缺失的穿梭载体Ac-bacACC;(2)将pFastBacSHTa-SA转化到含Ac-bacACC的大肠杆菌DH10B细胞中，通过位点特异性转座作用，经过PCR检测和基因组酶切检测获得重组穿梭载体Ac-bacACC-SA。7.根据权利要求6所述的重组杆状病毒的构建方法，其特征是将重组穿梭载体Ac-bacACC-SA转染昆虫细胞sf9、sf21，收集病毒上清经过纯化，即可得到纯的CCTCCNO:V200703。8.—种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在进行下一步基于S蛋白的免疫诊断、疫苗研发或疾病治疗及研究方面中的用途。9.一种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在对S基因的表达产物进行类似于哺乳动物体内的翻译后加工和糖基化修饰作用，使S蛋白的表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白中的用途。10.—种权利要求2所述高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其在用于难以表达的外源蛋白中的用途，该外源蛋白包括膜结构蛋白，以及高分子量、修饰加工复杂的蛋白。全文摘要本发明涉及高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒CCTCCNOV200703。该病毒的构建方法是基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，利用改造的带有病毒AcMNPV自身的组织蛋白酶信号肽基因的转移载体pFastBacSHTa，将SΔ即由SARS-CoVWH20株S蛋白基因中去除了部分信号肽和跨膜序列后的近全长S片段序列，克隆到pFastBacSHTa的多克隆位点上，再将新质粒转座获得重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ，然后转染昆虫细胞即可。本方法操作简单，蛋白表达量高、表达产物抗原性强、易于纯化和安全，同时表达产物具有在疾病诊断及疫苗生产等相关领域的重要应用价值。文档编号A61K39/12GK101100680SQ20071005248公开日2008年1月9日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者娟李,王华林,胡志红,菲邓申请人:中国科学院武汉病毒研究所