专利名称：：脂氧素在治疗肿瘤中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗肿瘤的药物，特别涉及生物分子在治疗肿瘤中的应用，即抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的播散转移。技术背景肿瘤是危害人体健康最严重的疾病之一，由于其发病原因复杂,不能有效预防。目前治疗肿瘤的主要方法有化疗、放疗和手术治疗三种。然而许多癌症患者在接受手术、化疗或放疗后，癌细胞反而加速扩散甚至"越治越扩散"[参见HomsMY,KuipersEJ，SiersemaPD.Palliativetherapy.JSurgOncol.2005,92(3):246-56.]。加之目前多数抗肿瘤药物不具有明显的选择性，对l下常细胞也存在明显的毒副作用。因而，研发低毒性、高选择性特别是抗肿瘤扩散的药物正是当今医学界亟待解决的课题。脂氧素(Lipoxins，LXs)是哈佛大学Serhan教授于1984年发现的二十烷家族中--类花生四烯酸的代谢产物，在脂加氧酶作用下经跨细胞途径(transcellularpathway)合成[参见2ClarksonMR,McGintyA,GodsonC,etal,Leukotrienesandlipoxins:lipoxygenase-derivedmodulatorsofleukocyterecruitmentandvasculartoneinglomerulonephritis.NephrolDialTransplant,1998，13:3043-3051.]。随着对LXs研究的深入，人们发现炎症的发生与消散过程中LXs与白三烯(leukotrienes,LTs)相互拮抗，前者有很强的抗炎症效应，被称之为炎症反应的"刹车信号(brakingsignals)"或"停止信号(stopsignals)"[参见O'mearaYM，BradyHR.Lipoxins,leukocyterecruitmentandtheresolutionphaseofacuteglomerulonephritis.KidneyIntSupp).]997，58:S56-61,]。
发明内容本发明的任务是提供一种治疗肿瘤的药物，使其具有能有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的播散转移等作用。本发明提供的这种治疗肿瘤的药物是脂氧素(Lipoxins,LXs)。实验资料一、实验材料1.实验动物BALB/c—nu/nu裸小鼠32只，鼠龄46周，体重152Qg，雌性，购自华中科技大学同济医学院动物研究所，饲养条件按无特定病原体(SPF)要求。2.试剂与仪器1640培养基(Hyclony公司)，胎牛血清(Gibco公司)，脂氧素(Cayman公司)，D'H]-TdR为中科院上海原子能研究所产品，琼脂糖，Trizol,胰蛋白酶、DMSO及(Sigma公司)，线粒体膜电位检测试剂盒和DNALadder抽提试剂盒(碧云天生物技术研究所)。C02培养箱(ThermoForma公司)，PCR仪(MjRsearch公司)，流式细胞仪(Becton公司)，紫外分光光度计、激光共聚焦显微镜(01ympus公司)。3.细胞来源人白血病细胞株K562和HL60、人结肠腺癌细胞株L-174-T(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)。培养于含10X胎牛血清的RPMI-1640培养液中并置于37'C、5%(:02细胞培养箱内，定期换液，细胞70-80%融合时进行传代。按实验设计将培养细胞分组。二、实验方法1RT-PCR检测lipoxinA4rec印tor表达各组细胞处理24小时后，采用Trizol提取各样品总RNA，紫外分光光度计测定纯度定量后取4ug进行逆转录，然后取l"1逆转录产物进行PCR反应。lipoxinA4rec印tor上游引物为5'-CACCAGGTGCTGCTGGCAAG-3'，下游引物为5'-AATATCCCTGACCCCATCCTCA-3'。脂氧素受体(ALXR)的退火温度为64°C,循环次数为30次。产物于2%琼脂糖凝胶电泳后照相并行图像分析。2细胞增殖检测2.13H-TdR法细胞接种于24孔板，处理24小时后，加入'H-TdR74kBq/well'继续培养6h后，收集细胞，液闪仪测放射性活度。2.2流式细胞术分析细胞增殖周期各组细胞处理48h后，离心收集细胞，以75^乙醇一20。C固定过夜；离心弃上清，PBS洗2次后，加入染色液(PI50ug/ml，RNaseA50ug/ml，Na2EDTA0.lmmol/L，Triton-X1000.1%),4。C染色lh后，上流式细胞仪(Becton)检测。2.3肿瘤细胞接种裸鼠8只裸鼠不作任何处理，按无特定病原体(SPF)要求饲养。取对数生长期人结肠腺癌细胞株LS-174-T细胞，常规方法消化后计数，台盼蓝测定细胞活力在95%以上。悬浮于无血清RPMI-1640培养液中，制成lX107ml的细胞悬液。余下每组8只，每只裸鼠接种O.2ml细胞悬液，内含2X106肿瘤细胞接种于左胁腹部皮下。裸鼠通过尾静脉给药，连续7天，每次注射0.lml脂氧素溶液(按表l所述分组，每组8只小剂量20nM，中剂量100nM，大剂量500nM)，另取8只裸鼠尾静脉注射等体积的生理盐水作为对照组。5周后处死裸鼠，摘取接种肿瘤细胞的裸鼠的接种瘤，置于10%甲醛中固定，石蜡包埋、组织连续切片(每隔lmm)HE染色。显微镜下观察并拍照，观察、记录肿瘤大小和生长情况。3细胞凋亡检测3.1流式细胞术分析细胞凋亡比例各组细胞处理48小时后，离心收集细胞，以75%乙醇一20"固定过夜；离心弃上清，PBS洗2次后，加入染色液(PI50yg/ml，RNaseA50ng/ml，N&EDTA0.1画1/L，Triton-X1000.1%)，4。C染色l小时后，上流式细胞仪(Becton)检测。3.2DNALadder法检测凋亡1000-2000g离心1-2分钟，弃上清，收集细胞。每1毫升样品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混匀。对于上述处理好的样品，每5毫克组织或者106个细胞中加入500微升添加了蛋白酶K的样品裂解液，Vortex混匀，充分裂解组织或细胞。50'C水浴消化过夜。加入500微升Tris平衡苯酚抽提样品。加入Tris平衡苯酚后剧烈颠倒或晃动10-30秒，以使酚相和水相充分相互作用。然后4。C,约12000g离心5分钟。吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积Tris平衡酚再抽提一次。吸出酚相及中间相(可以吸除少量靠近中间相的水相液体)，剩余的水相用等体积氯仿再抽提一次。吸出约300微升上清液，加入60微升10M醋酸钹和600微升无水乙醇，颠倒数次混匀，此时可见DNA沉淀产生。-2(TC冻存1小时，以充分沉淀小片断DNA。12，00()g离心10分钟，弃上清。加入7CB乙醇洗涤DNA沉淀一次。取部分抽提得到的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分析。3.3激光共聚焦测测细胞线粒体膜电位取10-60力'细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中。加入0.5mlJC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37'C孵育20分钟。在孵育期间，按照每lmlJOl染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X),并放置于冰浴。37'C孵育结束后，600g4'C离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次加入lnilJC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g4'C离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入lmlJC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g4。C离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再用适量JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，用激光共聚焦显微镜观察。3.4流式细胞术分析细胞线粒体膜电位取10-60万细胞，重悬于0.5ml细胞培养液中。加入0.5mlJC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37。C孵育20分钟。在孵育期间，按照每lmlJC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。37'C孵育结束后，600g4"离心3-4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次加入lmlJC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g4。C离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再加入lmlJC-1染色缓冲液(1X)重悬细胞，600g4。C离心3-4分钟，沉淀细胞，弃上清。再用适量JC-1染色缓冲液(1X)重悬后，用流式细胞仪观察。4细胞迁移的检测4.1Transwell小室法检法检测肿瘤细胞迁移transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞，无血清培养液洗2次，计数，配成细胞悬液，每孔加入100Ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；37。C培养箱中，孵育20-24h;取出transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定，4°C;PBS洗2遍，加入结晶紫(0.1%)染色，室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数IO照相，记录。4.2裸鼠内脏肿瘤转移的检测按2.3方法处理后取出各组裸鼠肺置于10%甲醛中固定，石蜡包埋、组织连续切片(每隔lmm)HE染色。显微镜下观察并拍照，观察、记录转移瘤大小和生长情况。5报告质粒荧光素酶检测24孔板细胞张至80%密度时，转染NF-KB报告质粒或空载体，并同时转染e-半乳糖酐酶报告质粒作为内参照，转染后6h，更换培养液并加入LXAi孵育24小时。弃培养液，加入裂解缓冲液，将裂解产物转入离心管中，涡旋振荡15s，4'C下12000g离心2min，取上清，一部分上清加入荧光素酶检测试剂检测荧光素酶活性，另取部分与e-半乳糖酐酶检测试剂混合，37。C孵育3小时后420nm测e-半乳糖酐酶活性。6ELISA检测培养上清中TGF-e含量各组细胞处理预设的时间后，收集培养上清，按试剂盒说明书方法依次加入样本或标准品、生物素化抗体、酶结合物工作液、显色液、显色终止液，最后酶标仪450nm测U直。三、统计学处理所得数据均以x士S表示，SPSS13.0统计分析软件进行方差分析及均数间多重比较。P<0.05为差异有显著意义。四、结果1.K562，HL60和LS-174-T细胞表达脂氧素受体RT-PCR结果显示，K562和HL60细胞均能表达脂氧素受体，见图1K562,HL60和LS-174-T细胞表达脂氧素受体。2.脂氧素抑制肿瘤细胞增殖(1)见图2脂氧素抑制K562和HL60细胞增殖(";X0.01vscontrolgroup),细胞处理24小时后:'H-TdR法分析发现脂氧素A4抑制K562和HL60细胞增殖，对HL60细胞的作用更为明显。(2)脂氧素对白血病细胞周期的影响见图3脂氧素对K562和HL60细胞增殖周期的影响(AP〈0.05vs空白组)，脂氧素作用于肿瘤细胞48小时后，细胞周期的G。/G,期细胞比例增高，而S期和G,/M期细胞比例则降低。本结果提示脂氧素具有明显的G。/d期阻滞作用。(3)脂氧素对裸鼠接种人结肠腺癌细胞株LS-174-T后接种瘤生长的影响接种后动物未见明显异常反应，局部均未出现明显的红肿等情况。第1、2周未发现肉眼可见的结节。第3周开始，生理盐水对照组裸鼠接种肿瘤细胞部位可观察到类圆形结节状物，局部无红肿。以后肿块逐渐增大，呈不规则形或分叶状。脂氧素治疗组结节状物比生理盐水对照组小。5周后处死裸鼠，分别摘取接种瘤和肺，置于10%甲醛中固定，石蜡包埋、组织连续切片(每隔1mm)，HE染色。显微镜下观察并拍照，对照组接种瘤表面可见清晰的血管网形成。部分裸鼠出现恶液质现象，表现为明显消瘦，体重减轻，活动减少，呈弓背状。见表1。__表l接种瘤生长情况__组别出现肿瘤的例数接种部位肿瘤大小(mm3)肿瘤重量(g)空白对照组^55生理盐水对照组83254±3655.88±0.93**小剂量脂氧素组82865±3164.25±0.67*袖中剂量脂氧素组61974±3212.74±0.55**1大剂量脂氧素組._^_336±143_0.79±0.35*抑*P<0.05，**P<0.01vs空白对照组；存PO.05,弁弁PO.01vs生理盐水对照组3.脂氧素促进肿瘤细胞凋亡(1)流式检测结果见图1脂氧素对K562和HL60细胞凋亡的影响。(2)DNAladder结果见图5脂氧素对K562和HL60细胞凋亡的影响，(1，DNALadderMarker;2,空白HL60细胞;3,K562细胞;4,Lipoxin+HL60;5,Lipoxin+K562)。(3)激光共聚焦检测细胞线粒体膜电位结果见图6脂氧素对K562和HL60细胞膜电位的影响。(4)流式检测细胞线粒体膜电位结果见图7脂氧素对K562和HL60细胞膜电位的影响，由图7可见，K562和HL60细胞接受Lipoxin刺激后，经流式分析，UR部分比例明显下降，提示线粒体膜电位下降的细胞含量增加。结果表明，Lipoxin促进K562和HL60细胞的凋亡是部分通过线粒体途径的。4.脂氧素抑制肿瘤细胞迁移(1)如图8脂氧素LXA4抑制K562和HL60细胞迁移("/X0.01vscontrolgroup),transwell小室分析发现脂氧素A4抑制K562和HL60细胞迁移。(2)脂氧素对裸鼠接种人结肠腺癌细胞株LS-174-T后肿瘤肺转移的影响肉眼可见裸鼠肺脏较同期空白对照组肺脏明显增大，个别裸鼠肺脏表面见结节状物，呈半透明灰白色不规则形。镜下可见巨大转移灶并可见血管周围转移淋巴结，肺组织有明显的癌细胞浸润。脂氧素小剂量治疗组肺组织表面可见灰白色斑点，呈花斑状外观，镜下观察转移灶数量较多，体积较大，细胞呈高度异型性，呈多边形，核大、浓染，核浆比例失调，核分裂象多见，癌细胞呈团状排列，偶见腺管样结构，间质较少。脂氧素中剂量治疗组肺组织表面可见散在灰白色斑点，直径约0.8-1.3誦，镜下可见少量微小转移灶，细胞呈巢状排列，胞核明显浓染脂氧素大剂量治疗组肺组织外观无明显异常改变，镜下未发现微小转移灶。见表2。表2棵鼠肺组织重量及转移灶统计情况<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05,**P<0.01vs空白对照组；#P<0.05,##P<0.01vs生理盐水对照组5.脂氧素抑制肿瘤细胞NF-icB转录活性转染带有NF-KB结合位点的荧光素酶报告质粒发现，脂氧素A4抑制K562和HL60细胞NF-kB转录活性，而对空载体的基础荧光素酶活性无明显影响(见图9LXA4抑制K562和HL60细胞NF-kB转录活性，Ap〈0.05vscontrolgroup)。6.脂氧素抑制肿瘤细胞分泌TGF-e见图10LXA4抑制K562和HL60细胞分泌TGF-P，脂氧素A4抑制K562和HL60细胞分泌TGF-0(AA/X0.01vscontrolgroup)。本研究结果表明，脂氧素可有效抑制肿瘤转移，并可有效抑制肿瘤血管床的形成，从而抑制转移灶的产生和癌细胞扩散。脂氧素可以有效抑制K562和HL60白血病细胞TGF-e的分泌，即从源头上阻断TGF-t5信号通路，从而抑制肿瘤的扩散。脂氧素通过抑制NF-icB活性从而促进肿瘤细胞凋亡抑制增殖及转移。图1K562,UL60和LS-174-T细胞表达脂氧素受体；图2脂氧素抑制K562和HL60细胞增殖，细胞处理24h后3H-TdR法分析发现脂氧素A4抑制K562和HL60细胞增殖，对HL60细胞的作用更为明显。图3脂氧素对K562和HL60细胞增殖周期的影响，脂氧素作用于肿瘤细胞48h后，细胞周期的G。期细胞比例增高，而S期和G2/M期细胞比例则降低。本结果提示脂氧素具有明显的G。/Gl期阻滞作用。图4脂氧素对K562和HL60细胞凋亡的影响；图5脂氧素对K562和HL60细胞凋亡的影响，图中1为DNALadderMarker;2为空白HL60细胞；3为K562细胞；4为Lipoxin+HL60;5为Lipoxin+K562。图6脂氧素对K562和HL60细胞膜电位的影响；图7脂氧素对K562和HL60细胞膜电位的影响，K562和HL60细胞接受Lipoxin刺激后，经流式分析，UR部分比例明显下降，提示线粒体膜电位下降的细胞含量增加。结果表明，Lipoxin促进K562和HL60细胞的凋亡是部分通过线粒体途径的。由图7可见，K562和HL60细胞接受Lipoxin刺激后，经流式分析，UR部分比例明显下降，提示线粒体膜电位下降的细胞含量增加。结果表明，Lipoxin促进K562和HL60细胞的凋亡是部分通过线粒体途径的。图8脂氧素LXA4抑制K562和HL60细胞迁移；图9LXA4抑制K562和HL60細胞NF-kB转录活性；图10LXA4抑制K562和HL60细胞分泌TGF-e，脂氧素A4抑制K562和HL60细胞分泌TGF-P。具体实施方式实施例脂氧素用于治疗肿瘤的用法(1)商品购买脂氧素溶于乙醇稀释。(2)用于实验小鼠尾静脉给药，连续7天，每次注射O.1ml脂氧素溶液，每次O.5-1.0mg。(3)用于人静脉给药，连续14天，一天1次,每次1-2.5mg。权利要求1.脂氧素在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。2.—种治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于，它含有有效量的脂氧素和制药学上可接受的载体。3.根据权利要求2所述的治疗肿瘤的药物制剂，其特征在于，所说的制药学上可接受的载体为乙醇。全文摘要本发明提供了一种治疗肿瘤的药物，这种治疗肿瘤的药物是脂氧素Lipoxins，LXs，将脂氧素用于肿瘤的治疗，具有能有效抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的播散转移等作用。文档编号A61K31/185GK101327205SQ20071005251公开日2008年12月24日申请日期2007年6月21日优先权日2007年6月21日发明者叶笃筠,萍吴,周小燕,力张,李咏生,陈建国申请人:华中科技大学