专利名称：一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的用途，属于医学材料领域。
背景技术：
20世纪90年代以来，随着“人类基因组计划”的实施，基因技术、纳米技术的发展，人们对于癌症的发生机理有了更加深入的认识与研究，众多科学工作者开始尝试从癌细胞的产生根源——基因变异上寻找治疗癌症的方法。人们开始关注并致力于研究一种新的癌症治疗技术——基因治疗。
基因治疗，是指通过有效的基因传递系统，将质粒DNA插入到目标细胞中，进行转录，最终将所携带的基因信息传递给所连接的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。而具备高效，安全的基因载体是基因治疗的关键。
由于病毒载体有较大的安全隐患，非病毒载体在被利用，如阳离子脂质体，阳离子多聚物，SiO2等。但它们都有各自的局限性阳离子脂质体具有一定的细胞毒性；阳离子多聚物生物相容性差，可降解性不高；SiO2需进行阳离子聚合物或氨基硅烷化等功能化修饰，程序化较复杂。因此，寻找新型安全高效的基因载体是基因治疗的当务之急。
壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料是目前一种刚研制出不久的新型纳米复合材料，已被证实具有较好的药物包封率和缓释效果，但对其用途的研究还处于开发阶段，目前尚未有将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的任何报导。
发明内容
本发明的目的是开拓壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的新用途，将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用，为基因治疗技术提供一种新型的、安全有效的基因载体材料——壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料。
实现本发明目的的技术方案是将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料用作基因载体。
且所用壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料中的壳聚糖季铵盐与累托石重量百分比分别为1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
并且，以壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体，两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物，用于基因治疗。
并且通过调节壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料与质粒DNA的比例确定最佳转染剂量。
本发明将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用，是因为该纳米复合材料的细胞相容性良好，它是有机、无机纳米复合物的典型杂化材料，通过二者的耦合作用而产生许多优异的性能。而且由于纳米粒子较小的尺寸、大的比表面产生的量子效应，赋予纳米复合材料许多特殊的功能。它有效地结合保护DNA，良好的内吞性，强质子海绵特性提高了细胞的转染率。它分散性良好，满足了基因载体的有效性。
本发明通过细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备和载体-质粒DNA复合体体外转染实验，证明作为壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体时具有细胞相容性好、安全低毒、DNA包载量大的优点，是一种安全有效的基因载体。
图1细胞相容性结果图。
图2载体包裹质粒DNA实验结果图。图中壳聚糖季铵盐与累托石重量百分比分别为1∶2，1∶1，2∶1和4∶1，分别标记为HR1，HR2，HR3及HR4。
图3琼脂糖凝胶电泳实验结果照片。
图4壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体照片。
图5载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染72h后荧光显微镜照片。
图6A载体-质粒DNA复合体体外转染实验中细胞流失仪对照孔图。
图6B载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染96h后细胞流失仪检测结果图。
图7A载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染120h后激光共聚焦暗视野照片。
图7B载体-质粒DNA复合体体外转染实验中转染120h后激光共聚焦明视野照片。
具体实施例方式
壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备和体外转染实验的具体过程如下(1)壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料细胞相容性实验取一定量的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料溶于水中，加入磁子搅拌之其完全溶解。接种HCCLM7于96孔板中，10000个/孔，24h待细胞贴壁后，加入壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料溶液，使其浓度为0.1，0.5，1.0，2.5，5，25，50，100μg/孔。在温箱中培养24h后，吸出培养液，PBS洗三次；每孔加入100ul无血清培养基，并加入MTT 20μl/孔，4h后小心吸干孔内液体，每孔加入DMST 150ul酶标仪测量490nm吸光度。细胞相容性结果见如图1。
(2)载体包裹质粒DNA实验取10μgDNA分别与不同质量比壳聚糖季铵盐/累托石的复合物以1∶1；1∶2；1∶4；1∶8混合，振荡器上振荡2h，离心机上7000rpm 5分钟，紫外分光光度计测定上清中DNA浓度，由此可以得出壳聚糖季铵盐/累托石复合材料所包裹的DNA量。载体包裹质粒DNA实验结果见图2。从图2可以看出，HR3显示了最好的包裹能力，可以确定最佳转染剂量为质粒DNA与壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的质量比为2∶1。说明通过调节壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料与质粒DNA的比例能确定最佳转染剂量(3)琼脂糖凝胶电泳实验称取0.8g琼脂糖放入0.5×TBE缓冲液100ml中，加热30min至完全溶化，取出摇匀，待琼脂糖凝胶溶液冷却到50℃左右，再加入10μl浓度为5μl/ml的EB，在第一泳道加入裸质粒DNA，其他泳道加入10μl不同比例壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合物，电泳条件是电压60V时间90min。琼脂糖凝胶电泳实验结果见图3。
(4)壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体的制备取10ug的壳聚糖季铵盐/累托石复合物和5ug的质粒DNA混合，室温振荡器上振荡2h，-20℃保存。所得壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合体照片见图4。
(5)载体-质粒DNA复合体体外转染实验将LCCM7细胞以2×105接种在六孔板中，每孔中加入3ml培养液(含10％血清的RPMI1640)，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养24h；转染前去掉培养液，用0.01mol/L(pH7.4)PBS洗涤一次，每孔中先分别加入1ml无血清的RPMI1640，再加入10μl不同质量比的壳聚糖季铵盐/累托石-DNA复合物；转染24h后，去掉培养液，细胞用PBS洗涤两次后，每孔中再加入3ml培养液(含10％血清的RPMI1640)；再培养48h后，去掉培养液，用PBS洗涤三次后，以75％的乙醇固定15min；再用PBS洗涤三次，每次10min；然后将浓度为4μg/ml的PI分别加入到六孔板中，室温避光染色15min后，再次用PBS洗涤三次，每次约15min，最后取出六孔板中的盖玻片，用50％的缓冲甘油封片备用。
细胞表达的GFP通过荧光显微镜，流式细胞仪，激光共聚焦荧光显微镜进行检测。GFP采用波长为488nm的氖激光激发，其荧光发射波长为495-550nm。载体-质粒DNA复合体体外转染实验结果照片见图5、图6A、图6B、图7A和图7B。
从上述实验结果可知本发明用作基因载体的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的细胞相容性好，能100％包裹质粒DNA，载体-质粒DNA复合体稳定分散，在激光共聚焦显微镜下，约80％细胞表达绿色荧光，壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体，两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物，能用于基因治疗。
权利要求
1.一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途，其特征在于将壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料用作基因载体。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途，其特征在于壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料中的壳聚糖季铵盐与累托石重量百分比分别为1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途，其特征在于壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为质粒DNA的载体，两者形成的纳米颗粒复合物为携带基因药物，用于基因治疗。
4.根据权利要求1或2所述的壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料的用途，其特征在于通过调节壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料与质粒DNA的比例确定最佳转染剂量。
全文摘要
本发明公开了一种壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料作为基因载体应用的用途。本发明通过细胞相容性实验、载体包裹质粒DNA实验、琼脂糖凝胶电泳实验、壳聚糖季铵盐/累托石－DNA复合体的制备及体外转染实验，表明该壳聚糖季铵盐/累托石纳米复合材料是一种细胞相容性好、安全低毒、高效的基因载体。
文档编号A61K47/02GK101085360SQ200710052430
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者尚林源, 郭阳洁, 朱卓 申请人:武汉大学