专利名称：：华蟾毒精的免疫调节新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及华蟾毒精的免疫调节作用，属于医药领域范围。二、
背景技术：
华蟾毒精(Cinobufagin，CBG)是蟾蜍有效成分之一，化学名为:5beta画Bufa-20，22-dienolide,14，15beta國epoxy-3beta，16beta-dihydroxy誦，16-acetate(8CI)。其结构如下具强心、升压、局部麻醉、抗肿瘤等作用，但其对机体免疫功能的影响尚未见报道。本发明研究了华蟾毒精对小鼠免疫功能调节作用，并初步阐明其免疫增强作用的机制，为寻找新的有效的中药免疫增强剂提供一定的科学依据。三、
发明内容通过MTT法检测CBG单独作用及协同刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)作用对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响，通过MTT法和中性红吞噬实验检测CBG对腹腔巨噬细胞(Peritonealmacrophage,PM①)能量代谢水平及吞噬功能的影响；通过流式细胞术检测CBG对正常小鼠脾淋巴细胞周期及脾中T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8表达的影响。四具体实施方式1材料与方法1.1实验动物健康Balb/c小鼠，雄性S，6-8周龄，体重(20土2)g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，合格证号SCXK(吉2003-0001)。1.2药品及试剂1.2.1华蟾毒精来源华蟾毒精购自于中国生物制品检定所。1.2.2试剂及配制华蟾毒精单体为脂溶性药物，配制时用匿S0(终体积〈0.1%)助溶。刀豆球蛋白A(ConATypeIV)、脂多糖(LPS)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、台盼蓝(TrypanBlue)均为Sigma产品，RPMI-1640培养基(RPMI-1640完全培养基配制100UmL—1青霉素、100g'L"链霉素、1%谷氨酰胺、10%灭活新生牛血清，pH7.2)、胰蛋白酶均为Gibco产品，CD4/L3T4-PE、CD8a/Lyt-2-FITC荧光标记抗体均为SouthernBiotech产品。1.3MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化率备成5乂106个.L"的淋巴细胞悬液，每孔IOOpL加入96孔培养板，再每孔100加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10、15mg'L"(单药组)，或加入不同浓度CBG(0.5、1.0、2.5、5.0、10、15mgI/1)和ConA(5mgL力或LPS(20mgL力的混合液(组合药物组)，同时设阳性、阴性和空白对照组，每组均设4复孔。37°C、5%C02培养箱中连续培养44h，每孔20pL加入MTT液，继续培养4h，用TECAN酶标仪(奥地利产品)于570nm处测定吸光度A，结果以刺激指数(SI)反映小鼠脾淋巴细胞增殖、转化率的高低SI=药物刺激孔:i/阴性对照孔21.4小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平及吞噬功能的测定制备、纯化小鼠PMO，计数细胞密度为5乂106个*1/，每孔100PL加入96孔培养板，再每孔100uL加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、2.5、10mgI/1(单药组)，或加入不同浓度的CBG(O.5、2.5、10mgC口ConA(5mgf1)或LPS(20mg'L")的混合液(组合药物组)，同时设阳性、阴性及空白对照组，每组均设4复孔。37。C、5%C02培养箱中培养20h，每孔20uL加入MTT，继续培养4h，于570nm处测定吸光度。另取PMd)，加药法同上，培养24h，1800Xg离心10min弃上清，每孔IOO"L加入中性红lg'L"生理盐水液，继续培养30min;PBS洗板2次，每孔IOOuL加入细胞溶解液(乙酸无水乙醇=1:1K:O，室温静置过夜并于540nm处测定吸光度。1.5流式细胞术检测小鼠脾中T淋巴细胞表面标志无菌取小鼠脾，制备成5乂106个'L"的淋巴细胞悬液，每孔1mL加入24孔培养板，再每孔lmL加入含不同浓度CBG的RPMI-1640完全培养液，使终浓度分别为0.5、2.5、10mg'L"(单药组)，或加入含不同终浓度CBG(0.5、2.5、10mgI/1)和ConA(5mgI/1)或LPS(20mg*L")的混合液(组合药物组)，并设阴性、阳性对照组，每组均设3复孔。37°C、5%C02培养箱中培养48h，收集细胞，CD4/L3T4-PE、CD8a/Lyt_2-FITC荧光标记，上FACSCalibur型流式细胞仪(美国BectonDickinson公司产品)检测T淋巴细胞表面抗原。1.6流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞周期小鼠脾细胞悬液，处理同1.5，收集细胞，PI染色，上流式细胞仪检测细胞周期。1.7统计学处理所有数据输入计算机，用SPSSforwindows10.0版本软件进行t检验，计算结果以；±s表示。2结果2.1华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响如表1显示，CBG单药组及协同ConA或LPS药物组的SI值相对于阴性及阳性对照组均有一定提高，并呈一定量效关系，在一定剂量时SI值达到高峰(代0.05或代0.01)，随着剂量的增加，其对小鼠脾淋巴细胞转化的促进作用反而降低；其中协同LPS作用组对小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的促进作用较其它两组明显。表l.华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞转化率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注1)阴性对照组，2)5mgL"ConA阳性对照组，3)20mg-I^LPS阳性对照组。单药组同阴性对照组比较，组合组与阳性对照组比较，4)代0.Q5，5)代O.Ol，每组4复孔。2.2华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞的影响如表2-3显示，在O.5、2.5、10mgL"三个剂量下，CBG单药组及协同ConA或LPS药物组对小鼠PM①代谢MTT及吞噬中性红能力均有一定的促进作用(代0.05或代O.Ol)，并在2.5mg'L"剂量时CBG的促进作用达到高峰，其中协同LPS作用组较其它两组明显。表2.华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3.华蟾毒精对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注处理同表l。2.3华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞周期及T淋巴细胞表面标志的影响如表4显示，在0.5、2.5、10mg*L—^1」量下，与阴性对照组相比，CBG单药组，小鼠脾中CD4+CD8+T淋巴细胞亚群百分率均有显著提高，CBG中、高剂量组中CD4+CD8—和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群百分率之和均有显著提高，CBG低剂量组的CD47CD8+比值有显著提高(代0.05);CBG低、高剂量组，CD4—CD8+T淋巴细胞亚群百分率均有明显降低(尸〈0.05);与阴性对照组相比，CBG协同ConA作用，能够显著提高小鼠脾中CD4+CD8+T淋巴细胞亚群百分率，增加CD4+CD8—和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群百分率之和(尸〈0.05或尸〈0.01);但CD4+CD8一、CD4—CD8+T淋巴细胞亚群百分率均有明显降低，CBG协同ConA作用的中、低剂量组CD47CD8+比值也明显降低(尸<0.05或尸〈0.01);与阴性对照组相比，CBG协同ConA或LPS作用组，能明显增加小鼠脾淋巴细胞进入S期的细胞百分率(尸〈0.05或尸〈0.01);CBG单药组的S期细胞百分率也有所提高，但无统计学意义。表4.华蟾毒精对小鼠T淋巴细胞CD4、CD8表达的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>续表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注阳性对照组用5mg'L—tonA刺激。与阴性对照组比较，1)尸〈0.05，2)尸〈0.01，实验重复操作3次。表5.华蟾毒精对小鼠脾淋巴细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注阳性对照组用5mgL"ConA或20mgL"LPS刺激。与阴性对照组比较，1)代0.05，2)代O.Ol，实验重复操作3次。3讨论脾淋巴细胞转化实验是研究药物对T、B淋巴细胞作用的常用方法，淋巴细胞转化率是反映机体免疫的基本指标，因此检测淋巴细胞的增殖、转化可以了解药物对机体免疫功能的影响，一般认为ConA主要作用于T淋巴细胞而LPS主要作用于B淋巴细胞；当外来抗原侵入机体后，抗原提呈细胞如巨噬细在调节机体的非特异性免疫反应中也起重要作用，活化的巨噬细胞合成分泌如IL-2等的细胞因子，具有重要的免疫调节和杀伤肿瘤细胞的功能，适度调控巨噬细胞的活化对于提高机体的免疫力也有重要意义。上述免疫指标检测结果显示，蟾酥氯仿萃取层中的CBG对免疫系统存在一定的影响，在一定剂量范围内能增强小鼠脾淋巴细胞及其对ConA或LPS外源刺激的反应能力，中药免疫增强作用的药效有一定的量效关系，即存在某一合适的剂量，说明CBG对机体的细胞免疫及体液免疫应答在一定剂量范围内有一定的正向调节作用；CBG单独作用及协同ConA或LPS作用亦能活跃小鼠腹腔巨噬细胞的能量代谢水平并提高其吞噬外源物质中性红的能力，其中协同LPS作用药物组的促进作用最为明显。T淋巴细胞具有多种重要的免疫功能，不同的免疫功能与其细胞膜上的分化抗原(CD)的种类相关联，其中CD4和CD8是关键的分化抗原，CD4和CD8与相应MHC抗原结合是T细胞在胸腺外发挥免疫功能的生化基础CD4、CD8双阳性T细胞亚群(CD4+CD8+，简称DP细胞)可产生多种细胞因子，参与细胞介导的免疫应答并调节Th的发育，剌激B细胞的生长并诱发B细胞产生抗体，即具有类似于Th细胞的辅助性功能，其作用方式是MHC-II限制性的，同时它也兼具细胞毒性T细胞的功能，其细胞毒性活力与CD8+细胞相当，此外DP细胞还具有免疫记忆功能，其记忆功能是从CD4+细胞遗传下来的。流式细胞术检测结果显示，同阴性对照组相比，CBG单独作用及协同ConA作用均能显著提升CD4+CD8+T淋巴细胞亚群百分率，即增加DP(T)淋巴细胞的数量(代O.05或代O.01)。虽然除CBG单药组个别剂量外，其它药物组作用后，具CD4—CD8+表型及CD4tD8—表型的T淋巴细胞亚群百分率均有明显下降，但具CD4+CD8+与CD4+CD8—T淋巴细胞亚群百分率之和均有显著提升(代0.05或代O.Ol)。CD4+CD8一T淋巴细胞亚群为具有辅助诱导功能的Th细胞，而具CD4+CD8+表型的DP(T)细胞也具有类似于Th细胞的辅助性功能，同时它也兼有Tc细胞的细胞毒作用及从CD4+细胞遗传的免疫记忆功能。因此，上述流式检测结果提示我们，CBG可能是通过活化CD4+T细胞表达CD8a受体，增加兼具辅助和细胞毒作用的DP(T)细胞的数量来发挥免疫增强作用的；且这种免疫促进作用可能具有记忆功能。参考国内外的中药免疫活性体外实验研究，许多药物是通过提升T淋巴细胞中具CD4+CD8—表型的T淋巴细胞亚群百分率及CD47CD8+的比值来发挥免疫增强作用的，即主要是通过提升Th细胞的数量发挥免疫促进作用。本实验中，除个别给药组外，CD4+CD8—亚群的百分率和CD47CD8+的比值均有一定下降，也就是说，具有辅助功能的CD4+单阳性细胞的数量减少了，这可能是由于药物的作用诱导了CD4+单阳性细胞表达CD8a受体，表现为具CD4+CD8+双阳性表型的T淋巴细胞亚群百分率增加。DP细胞可以通过CD4分子表现其MHC-II限制性，且CD4+T细胞上的CD8+抗原表达是CD4+T细胞活化的表现，因此，CD4+单阳性细胞数量的减少，并不代表具有辅助性功能的淋巴细胞数量减少了，只是CD4+单阳性细胞通过药物诱导活化并表达了CD8ci受体，其辅助性功能并没有消失，且增加了杀伤靶细胞的细胞毒作用。研究发现，药物作用后CD4tD8+和CD4+CD8—T淋巴细胞亚群百分率之和显著增加，因此我们推测CBG可能是通过诱导CD4+单阳性细胞表达CD8a受体，增加具辅助性功能的T淋巴细胞数量，发挥免疫促进作用。国内外也有一些类似的、通过增加DP细胞数量，发挥免疫增强作用的药物研究报道，如雷建平等用卡介苗免疫大鼠，可以显著降低被结核病分枝杆菌攻击的大鼠的发病及死亡率，其增强大鼠抗结核保护性细胞免疫力的表现之一就是DP(CD4+CD8+)细胞百分率的升高。此外，对于DP细胞具有免疫保护作用的研究国内外也有相关报道。在体外条件下，我们对蟾酥氯仿溶剂萃取层中的华蟾毒精的免疫活性进行了初步研究，结果显示CBG具有一定的免疫增强作用，联系已有的对CBG抗肿瘤作用的研究报道，提示我们CBG可能具有抗肿瘤与免疫调节的双重作用；其免疫调节机制可能是通过提升具CD4+CD8+双阳性表型的T淋巴细胞亚群百分率，促进小鼠脾淋巴细胞进入DNA合成期，活化并增加免疫效应淋巴细胞，进而发挥免疫增强作用的。本实验对中药蟾酥的免疫活性成分作为免疫增强剂的研究方面具有一定的指导意义。权利要求1.一种具有如下结构华蟾毒精的免疫调节作用。2.如权利要求1所述的免疫调节作用，其特征在于增强机体脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞的反应能力，具有免疫增强作用，用于在制备治疗或预防人和动物免疫系统疾病制剂中的应用。全文摘要通过MTT法检测华蟾毒精单独作用及协同刀豆球蛋白A或脂多糖作用对正常小鼠脾淋巴细胞增殖、转化的影响，通过MTT法和中性红吞噬实验检测CBG对腹腔巨噬细胞能量代谢水平及吞噬功能的影响；通过流式细胞术检测CBG对正常小鼠脾淋巴细胞周期及脾中T淋巴细胞表面抗原CD4、CD8表达的影响。证实华蟾毒精具有免疫增强作用。文档编号A61P37/02GK101327218SQ200710055779公开日2008年12月24日申请日期2007年6月20日优先权日2007年6月20日发明者宇宋,王大成,邓旭明申请人:宋宇;邓旭明;王大成