低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途的制作方法

专利名称：低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制药用途，特别涉及低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肾脏疾病药物方面的用途。
背景技术：
褐藻多糖硫酸酯是一类硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin在1913年用稀酸从掌状海带中提取出来。Kylin将提取物水解后分离出L-岩藻糖，他将这种多糖命名为fucoidin，现根据多糖的命名原则一般定名为fucoidan，中文名称为墨角藻多糖、岩藻多糖、岩藻聚糖、岩藻聚糖硫酸酯、褐藻糖胶或褐藻多糖硫酸酯。现在人们对褐藻多糖硫酸酯的组成有较为清晰的了解，它是一类化学组成和结构非常复杂的多糖，以岩藻糖和硫酸基为主，随着藻的种类不同还含有半乳糖、木糖、糖醛酸等其他成分。海带Fucoidan由岩藻糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等单糖组成。以岩藻糖和半乳糖为主，岩藻糖与半乳糖大概在3∶1。
褐藻多糖硫酸酯化学结构非常复杂，不同褐藻中分离到的褐藻多糖硫酸酯其结构有很大差异。到目前为止，对来源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的褐藻多糖硫酸酯的结构研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸酯主要以α(1→3)糖苷键连接，硫酸化主要发生在C4位。对泡叶藻褐藻多糖硫酸酯的多项研究都表明其中存在大量的α(1→3)和α(1→4)糖苷键。此外还有几种褐藻褐藻多糖硫酸酯的结构被报道。昆布(Ecklonia kurome)褐藻多糖硫酸酯主要为α(1→3)连接，硫酸化在C4位。来源于枝管藻(Cladosiphon okamuranus)和绳藻(Chorda filum)的褐藻多糖硫酸酯主链均为α(1→3)的岩藻糖，硫酸化在C4位，而且，二者均有少量的2-O-乙酰化。
墨角藻、泡叶藻褐藻多糖硫酸酯结构 昆布褐藻多糖硫酸酯结构
绳藻褐藻多糖硫酸酯结构关于海带褐藻多糖硫酸酯的结构，多数的研究资料表明海带褐藻多糖硫酸酯主要是以α-(1→3)连接的L-岩藻糖组成，硫酸化发生在C4或C2位，而且部分研究显示存在部分(1→2)连接的L-岩藻糖作为侧链。与上图中绳藻褐藻多糖硫酸酯结构有相似之处。但绳藻中有部分乙酰基。而且不同取代基团所占的比例也不一样。当然分子中还存在半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖，半乳糖可能参与了主链的组成，而木糖、鼠李糖等是以侧链的形式存在。
已有多篇文献公开了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及其制药用途。日本专利昭46-2248采用十六烷氯化吡啶或十六烷三甲基溴化铵与褐藻多糖硫酸酯反应成季胺盐复合物，再利用该复合物对盐的溶解度差异，用乙醇、甲醇和离子交换树脂处理，纯化除去褐藻胶、中性多糖和其它杂质，而得到比较纯化的褐藻多糖硫酸酸酯。CN1129109A则公开了由干海带浸泡、数次过滤、二次乙醇提取、一次乙醇洗涤、配合调节PH范围等的碱凝析法。CN1344565A则公开了另一种制备方法，包括原料预处理、控温搅拌浸提、离心、浓缩、乙醇沉淀、无水乙醇脱水等步骤。CN1517356A则将岩藻聚糖硫酸酯配制成水溶液，加入过氧化氢、次氯酸或亚硝酸及其盐，将所得混合溶液加热，用截留分子量3000-5000的膜超滤，得到岩藻聚糖硫酸酯低聚糖。CN1560086A则公开了一种高硫酸根含量岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，用热水或酸水浸提褐藻，制得含褐藻聚糖硫酸酯的提取液，将该提取液浓缩至多糖的重量百分数为2-10％，调PH5-8，加入壳聚糖溶液搅拌，离心或过收集沉淀，将沉淀用于5-10倍盐溶液提取2-4次，离心或过滤收集清液，将该清液透析或超滤脱盐。CN1616494A以天然海藻硫酸多糖为原料，将海藻硫酸糖溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，控制反应温度，恒温降解时间为0.5-3hr，再透析或超滤，减压浓缩，制得4-100KDa的低分子量海藻硫酸多糖产物。另外，CN1670028A、CN1392160A、CN1197674A也分别公开了采用絮凝等方法制备海藻多糖。在本发明中，以上发明公开的内容均被全文引入本文作为参考。
此外，以上发明还公开了褐藻多糖硫酸酯以及低分子量褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗肿瘤、抗菌和抗病毒、降血糖、抗辐射、抑制腹水瘤等活性。CN1228961A公开了褐藻多糖硫酸酯在治疗肾衰方面的用途，CN1206591A则公开了褐藻多糖硫酸酯在治疗肾小球疾病方面的用途。但尚未有文献表明低分子量褐藻多糖硫酸酯在肾脏疾病方面的用途。

发明内容
申请人经研究发现，低分子量褐藻多糖硫酸酯与褐藻多糖硫酸酯相比，在治疗肾脏疾病方面，具有意想不到的良好治疗效果。本发明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯，是指将褐藻多糖硫酸酯通过某种合适的方式(降解方式包括但不限于酸降解法、碱降解法、酶降解法、物理降解法、自由基氧化降解法等)降解而制得的硫酸化多糖或寡糖类物质，其分子量较未降解褐藻多糖硫酸酯分子量低，具体的分子量范围可以是1000～200000，优选是5000～100000，更优选是8000～80000。褐藻多糖硫酸酯可以来源于人工养殖的海带，也可以是野生褐藻马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻。优选来源于海带。
本发明的目的是提供低分子量褐藻多糖硫酸酯在治疗肾脏疾病方面的用途。其中的肾脏疾病包括但不限于肾功能衰竭、肾炎和肾病综合征等。其中所述的肾炎包括但不限于在临床上常见的急性(肾小球)肾炎、慢性(肾小球)肾炎、肾盂肾炎、隐匿性肾炎、过敏性紫癜肾炎(紫癜性肾炎)、红斑狼疮肾炎(狼疮性肾炎)等。
另一方面，本发明提供了含低分子量褐藻多糖硫酸酯的药物组合物。所述组合物中包含治疗有效量的低分子量褐藻多糖硫酸酯和至少一种药学上可接受的辅料。该组合物的给药方式可以是但不限于经静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、直肠内、局部注射等方式给药，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、凝胶剂、贴片、膏剂等，其中优选片剂、胶囊剂、注射液和冻干粉针剂。本领域技术人员根据现有技术以及制剂领域的公知常识可以方便地制备出所需剂型。
本发明的组合物中，低分子量褐藻多糖硫酸酯的含量≥50％，优选为≥70％，更优选为≥90％，最佳是≥95％。单位制剂中褐藻多糖硫酸酯的含量可以是1mg～1000mg，优选10mg～800mg，更优选20mg～500mg，最优选20mg～300mg，最佳是30mg～100mg。
本发明的褐藻多糖硫酸酯可以按以下方式提取和纯化、分级1.提取褐藻多糖硫酸酯可以用水、稀酸或氯化钙溶液提取，然后向提取液中加入氢氧化铅、氢氧化铝、乙醇或季胺盐类阳离子表面活性剂，都可使褐藻多糖硫酸酯沉淀出来，为了减少色素、蛋白质等的溶出，提取之前可以先以高浓度醇类或甲醛溶液处理藻体。
近年来也陆续有人采用微波提取、超声波提取以及高分子絮凝沉淀提取等方法。
2纯化制备的粗褐藻多糖硫酸酯通常会含有部分水溶性褐藻胶、蛋白质、褐藻淀粉、色素等，需要进一步纯化，纯化方法有以下几种乙醇重沉淀西出英一(西出英一等，日本水産学会誌，1982，48(12)1771)对热水提取的粗褐藻多糖硫酸酯水溶液在0.05M MgCl2存在时，以20％乙醇沉淀除去作为杂质的水溶性褐藻胶。王作芸、赵学武(王作芸.赵学武.铜藻的褐藻糖胶、褐藻淀粉和褐藻胶的分离及提纯.水产学报.1985；9(1)71)在研究铜藻中褐藻多糖硫酸酯时，将制得的粗褐藻多糖硫酸酯溶于水后，先后以4M CaCl2和30％乙醇沉淀去除褐藻胶，然后用80％乙醇沉出纯化的褐藻多糖硫酸酯。
季胺盐类沉淀法利用阳离子表面活性剂如十六烷基氯化吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)能与高分子电解质产生沉淀的性质使褐藻多糖硫酸酯沉淀下来。
在提取和纯化过程中，为除去溶液中的离子和小分子物质一般都采用透析的方法。也有人采用超滤分离方法以排除分子量较小的物质。有时为除去混杂在提取液中的褐藻淀粉和蛋白质，可采取酶消化法。Feury等(Fleury N andLahaye M.Studies on by-products from the industrlal extration of alglnate2.Chemieal structure analysis of fucans from the leach-water.J ApplPhycol，1993，5605-610)在研究法国褐藻胶工业的副产品时就采用葡聚糖酶和alcalase来清除其中的褐藻淀粉和蛋白质。分离褐藻淀粉和褐藻多糖硫酸酯还可以采用离子交换树脂法，因为前者是电中性的，而后者为多聚阴离子形式。
3分级由于褐藻多糖硫酸酯化学组分相当复杂，对制备出的粗褐藻多糖硫酸酯的色谱和电泳检查一般都呈现不均一性，因此人们逐步使用分级方法将混杂的多糖分成不同级分以进行深入研究。常用的分级方法有两种一种是乙醇分级沉淀，即利用不同的乙醇浓度沉淀出不同的级分，另一种是层析法，利用凝胶过滤柱层析和离子交换层析进行分级。离子交换层析法能将多糖分成荷电性不同的级分，凝胶过滤层析法则将多糖按照分子量大小进行分级。还可以采用超滤技术对褐藻多糖硫酸酯进行分级。
将褐藻多糖硫酸酯降解从而制备低分子量褐藻多糖硫酸酯的方法则可采用以下几种1.酸降解 在酸性条件下，酸性溶液能引起多糖中糖苷键的断裂，使多糖降解为低分子片段。控制酸的浓度、温度及时间可获得不同分子量大小的降解产物。多糖降解产品分子量分布较难控制，硫酸根含量变化较大。
2.碱解法 在碱性条件下，往往引起酸性多糖的改性及硫酸根的脱落，影响产品的活性，因此不适用于海藻硫酸多糖。
3.酶解法 酶解法是利用专一性糖苷酶通过开裂多糖中的某一糖苷键来达到降解的目的。酶降解反应因其高度的专一性、高效性以及降解条件及过程易于控制，无副反应等，在多糖降解中已逐渐受到重视。但由于酶的专一性强，因此不具有广泛的适用性，而且酶生产周期长，容易失去活性，成本高。这些缺点都使得该法目前无法推广应用。
4.物理降解法包括超声波和微波等方法。这两种方法由于能耗高，仪器设备条件要求高，样品处理量小，目前无法应用于工业生产。超声波辐射的结果表明，无论辐射时间长短，解聚分子量有个低限；而且，解聚物具有相当窄的分子量分布，5.自由基氧化降解例如以过氧化氢降解法，所得产物的硫酸化程度较高，成本较低，具有较大的应用价值。
另外，本文中所引用专利公开的提取方法以及由这些方法制备的产品也可以被本领域技术人员任意地采用。
在本发明的一个具体实施方式
中，低分子褐藻多糖硫酸酯是采用以下制备方法制备将海带粉碎后以甲醛溶液浸泡过夜，添加蒸馏水沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，加乙醇至浓度为75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得到纯化的褐藻多糖硫酸酯。取适量海带褐藻多糖硫酸酯，溶于蒸馏水中；向该溶液中加入适量抗坏血酸和过氧化氢，混合均匀，在室温下搅拌反应，对反应液进行透析和超滤，将超滤液进行减压浓缩，将浓缩液冷冻干燥。
以下通过具体实施方式
对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式
仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知常识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
具体实施例方式
实施例1 褐藻多糖硫酸酯的制备将海藻粉碎后以3.7％甲醛溶液浸泡过夜，然后添加蒸馏水沸水提取，提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，加乙醇至浓度为75％沉淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。将粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下20％乙醇沉淀除去水溶性褐藻胶，滤液透析、浓缩后75％乙醇沉淀，干燥后即得到纯化的褐藻多糖硫酸酯。按照上述方法制备四种海藻褐藻多糖硫酸酯，其化学组分分析如下表所示

低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备1.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到35mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围为8000-10000Da的低分子量褐藻多糖硫酸酯A；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物重均分子量为9.8KD。化学组分分析结果岩藻量28.4％，硫酸根含量28.7％。
2.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到2mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围为50KD-80KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯B；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物的重均分子量为72.2KD。化学组分分析结果岩藻糖含量28.1％，硫酸根含量29.2％。
3.称取150g海带褐藻多糖硫酸酯，溶于10L蒸馏水中配成浓度为1.5％的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的浓度分别达到10mmol/L，混合均匀，在室温下搅拌反应2小时，反应完毕后，对反应液进行透析和超滤，除去残存的抗坏血酸和过氧化氢，将超滤液进行减压浓缩，再将浓缩液冷冻干燥；制得分子量范围15KD-30KD的低分子量褐藻多糖硫酸酯C；经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法检测该产物的重均分子量为27KD。化学组分分析结果岩藻量28.5％，硫酸根含量28.2％。
实施例2 低分子量褐藻多糖硫酸酯注射剂的制备取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入注射用水500ml，甘露醇50g，调PH值至7.0，分装，冷冻干燥。
实施例3 低分子量褐藻多糖硫酸酯片剂的制备取低分子量褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，混合，加入适量水，制软材，制粒，干燥。粒子加入交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁，混合，压片，每片含低分子量褐藻多糖硫酸酯10-200mg。
实施例4 低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品B)对大鼠慢性肾衰的试验研究1.低分子量褐藻多糖硫酸酯对肾部分切除引起的大鼠慢性肾衰的影响选取180～250克雄性大鼠105只(术前测定无蛋白尿)，随机分成正常对照组和造模组(95只)，造模组大鼠以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉后，常规消毒皮肤，背部左侧切口，暴露左肾，剥离肾筋膜，迅速切除上、下极肾实质，立即以明胶海绵压迫止血，必要时滴加数滴凝血酶溶液，然后复位肾脏，结束手术。一周后再进行手术，切除右肾。术后常规饲养，于术后14周(大鼠已死亡16只)和正常对照组大鼠眼眶静脉眦取血，用42型贝克曼生化分析仪测定大鼠血清肌酐、尿素氮、总蛋白、白蛋白水平，根据测定结果，将造模大鼠进行随机分组，每组14～15只(剔除血清肌酐176μmol/L以下者)，即模型对照组、低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg两个剂量组及实施例1中用于制备低分子量褐藻多糖硫酸酯的海带褐藻多糖硫酸酯(以下简称为“样品1”)200mg/kg组、醋酸地塞米松0.07mg/kg阳性对照药组。另取未手术的大鼠为正常对照组，共六组，开始实验治疗，每日一次灌胃给药，连续30天，正常和模型对照组均每日一次灌服同体积蒸馏水，于给药治疗后10、20、30天各组大鼠乙醚麻醉，眼眶取血，分离血清，进行上述生化指标的测定，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见表1。于最后一次取血后将动物处死，取肾固定于10％甲醛溶液中，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察一般肾组织形态，测定肾小球(具有血管极或/和尿极)二条互相垂直的纵径和横径，每份标本选测10个最大的肾小球，求出各个肾小球面积及肾小球的平均面积。对每一病理切片的肾小管和间质病变程度进行病理分级(-、+、++、+++)记分。结果采用t检验及WMW非参数法进行统计学处理，结果见表2。
表1 低分子量褐藻多糖硫酸酯对肾部分切除引起的慢性肾衰大鼠血清肌酐、尿素氮、总蛋白和白蛋白的影响

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(与正常对照组比较)*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(与模型对照组比较)(N)鼠数表2 低分子量褐藻多糖硫酸酯对肾部分切除所致慢性肾衰大鼠肾病理组织学检查的影响

注-0分+1分 ++2分 +++3分；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001与模型对照组比较＝肾小管及肾间质病变按如下标准分级

表1结果表明各组大鼠经肾部分切除手术后14周形成慢性肾功能衰竭，与正常对照组比较，血清肌酐、尿素氮均呈显著性增高(p＜0.001)，血清白蛋白明显下降(p＜0.001)。在给药治疗30天期间，模型对照血清肌酐、尿素氮水平仍呈稳定增高(p＜0.001)，白蛋白明显下降状态(p＜0.01～0.001)，低分子量褐藻多糖硫酸酯治疗后，血清肌酐逐渐下降，治疗达20～30天时，肌酐和尿素氮明显下降(与模型对照组比较P＜0.05、0.01或0.001)或有下降趋势，并随剂量增加，作用增强对血清蛋白和总蛋白无明显影响。
表2病理结果表明肾部分切除所致的慢性肾衰大鼠，肾被膜结缔组织增厚，大部分肾小球代偿性肥大，肾小球面积与正常对照组比较明显增大(p＜0.001)，个别肾小球呈硬化或玻璃透明变性，肾小管浊肿、脂变、甚至萎缩、坏死，间质纤维组织增生，炎细胞浸润明显。与模型对照组比较，低分子量褐藻多糖硫酸酯可明显降低肾小球面积和肾小管病变得分，并与剂量有关，对肾间质病变亦有改善的趋势。阳性对照药醋酸地塞米松0.07mg/Kg与低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200mg/Kg剂量组作用强度相当。
2低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品B)对冷冻引起的大鼠慢性肾衰的影响选取200～250克雄性大鼠88只(术前测定无蛋白尿)，随机分成正常对照组(10只)和造模组(78只)，造模组大鼠以戊巴必妥钠30mg/Kg腹腔麻醉后，常规消毒皮肤，背部左侧切口，暴露左肾，剥离肾筋膜，将预先浸入液氮瓶内的冷刀(0.6×1.4×25cm)，依次在肾脏的上、下极和外侧前后共四个部分，每处冷冻45秒，然后复位肾脏，结束手术2周后，再行手术切除右肾，术后常规饲养。大鼠于术后6周(至此死亡17只)和正常对照组大鼠眼眶静脉眦取血，分离血清，用42型贝克曼生化分析仪测定大鼠血清肌酐、尿素氮、总蛋白和白蛋白，根据测定结果将造模组大鼠进行随机分组(剔除血清肌酐176μmol/L以下者)，每组9～10只，即模型对照组，低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg两个剂量组及样品1(200mg/kg)组、醋酸地塞米松0.07mg/kg阳性对照药组。取未手术的大鼠为正常对照组，共6组，开始实验治疗，每日一次，灌胃给药，连续40天，模型对照组、正常对照组均每日一次灌服同体积蒸馏水，于给药治疗后10、20、30、40天各组大鼠乙醚麻醉，眼眶取血，分离血清，进行上述生化指标的测定，结果见表3-1和3-2。实验结束，将大鼠断头处死。取肾，固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋，HE染色，光镜观察。肾病理观测指标及实验结果统计学处理均同于肾部分切除大鼠。结果见表4。
表3-1和3-2结果表明，各组大鼠经冷冻手术后6周形成慢性肾功能衰竭，与正常对照组比较，血清肌酐、尿素氮均呈显著性增高(p＜0.001)，血清白蛋白明显下降(p＜0.05～0.001)。在给药治疗40天期间，模型对照组血清肌酐、尿素氮水平仍呈稳定增高(p＜0.001)，白蛋白明显下降状态(p＜0.05～0.01)。低分子量褐藻多糖硫酸酯治疗后，血清肌酐逐渐下降，治疗达30～40天时，肌酐、尿素氮明显下降(与模型对照组比较P＜0.01或0.05)或有下降趋势，并随剂量增加，作用增强；对血清白蛋白和总蛋白无明显影响。
表4肾脏病理结果表明冷冻所致的慢性肾衰大鼠病理结果基本同于肾部分切除所致的慢性肾衰大鼠，表现为肾被膜结缔组织增厚，大部分肾小球代偿性肥大，肾小球面积与正常对照组比较明显增大(p＜0.001)，个别肾小球呈硬化或玻璃样透明变性，肾小管浊肿、脂变，甚至萎缩、坏死；间质纤维组织增生，炎细胞浸润明显。经低分子量褐藻多糖硫酸酯治疗后，高剂量组可使肾小球面积明显下降(p＜0.05)；肾小管病变得分明显降低(p＜0.05)，低剂量组亦呈如上变化趋势；对肾间质病变亦有改善的趋势。阳性对照药醋酸地塞米松0.07mg/kg与低分子量褐藻多糖硫酸酯B200mg/kg剂量组作用强度相当。
表3-1 低分子量褐藻多糖硫酸酯对冷冻引起的慢性肾衰大鼠血清肌酐、尿素氮的影响

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(与正常对照组比较)；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(与模型对照组比较)；(N)鼠数表3-2 低分子量褐藻多糖硫酸酯对冷冻引起的慢性肾衰大鼠总蛋白和白蛋白的影响

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(与正常对照组比较)；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(与模型对照组比较)；(N)鼠数表4 低分子量褐藻多糖硫酸酯对冷冻所致慢性肾衰大鼠肾病理组织学检查的影响

注-0分 +1分 ++2分 +++3分；*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(与模型对照组比较)
3低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品B)对腺嘌呤引起的大鼠慢性肾衰的影响选取体重160～200克Wistar大鼠60只，随即分成正常对照组和造模组，造模组大鼠灌胃给予腺嘌呤365mg/kg/日，共16天，制备慢性肾衰模型，正常对照组及造模组大鼠自由摄食及饮水，于第17天乙醚麻醉，由眼眶静脉眦取血，分离血清，用42型贝克曼生化分析仪测定大鼠血清肌酐、尿素氮、总蛋白和白蛋白。根据测定结果，将造型大鼠随机分为模型对照组、低分子量褐藻多糖硫酸酯B 200、100mg/kg两个剂量组及样品1(200mg/kg)组、醋酸地塞米松0.07mg/kg阳性对照药组，每组10只，并开始灌胃给药，模型对照组给予等容量0.5％CMC，除正常对照组外，其余各组继续灌胃给予腺嘌呤，剂量为200mg/kg/日，于给药第40天，各组大鼠乙醚麻醉，眼眶静脉眦取血，分离血清，进行上述生化指标的测定。实验结果采用t检验进行统计分析，结果列入表5。实验结束，将大鼠断头处死。立即取新鲜肾脏，观察外观形态变化，固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察。
表5结果表明模型对照组大鼠灌胃给予腺嘌呤16天后(治疗前)血清肌酐、尿素氮与正常对照组比较，均呈显著性增高(p＜0.001)，白蛋白下降趋势。随腺嘌呤灌胃日数的增加，血清肌酐、尿素氮水平呈进行性升高，白蛋白明显下降(p＜0.01)(治疗后)。各给药组大鼠治疗前(即腺嘌呤灌胃16天后)其血清肌酐、尿素氮值与正常对照组比较亦明显增加(p＜0.001)，白蛋白明显下降(p＜0.05)或有下降趋势，但与模型对照组比较，经统计学处理，无显著性差异。低分子量褐藻多糖硫酸酯(200和100mg/kg)及阳性药对照组给药治疗后血清肌酐和尿素氮明显下降(与模型对照组比较p＜0.01或0.05)，低分子量褐藻多糖硫酸酯(200mg/kg)和阳性对照药还使血清白蛋白明显上升，对血清总蛋白无明显影响。
组织形态学观察结果1)正常对照组肉眼观察肾暗红色，表面光滑，肾体积未见增大，切面皮，髓质界限清晰，未见结石及肾孟扩张。
光镜观察被膜光滑，皮、髓质清晰可见，肾小体未见减少或纤维化，远、近曲小管及集合管上皮细胞完好，管腔未见结石、管型及扩张，肾间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生、肾孟移行，上皮完整，肾孟未见扩张、积水及积石形成。
2)模型对照组肉眼观察肾脏苍白、肿大，表面光滑呈颗粒状，切面亦苍白，见许多大、小不等微孔，皮、髓质界限不清，散在多量细小结石，少数肾脏的肾盂扩张(2/8)。
光镜检查被膜凹凸不平，部分区域增厚，皮、髓质界限不清，肾小球、小管及间质可见大量散在不规则形状结晶聚集，部分肾小管被堵塞，部分肾小管明显扩张，肾小球数量明显减少，且部分萎缩，未见异常的肾单位，仅岛状存在，部分肾小管见管型，部分肾小管上皮细胞变化，甚至坏死脱落在腔中，肾间质可见异物性肉芽肿及纤维化，部分肾脏的肾孟扩张。
3)褐藻多糖硫酸酯200mg/kg组(1/8)，低分子量褐藻多糖硫酸酯100mg/kg组(0/8)肾孟扩张，肾脏病变大致如模型对照组，仅略显轻些。
4)低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg组肾脏病变与模型对照组比较明显减轻，多数肾脏(5/9)皮、髓质界限尚未辨认，肾小球数量仅轻度减少，残余的正常肾单位区域较明显，未见肾孟扩张。
5)阳性药对照组醋酸地塞米松0.07mg/kg。
肾脏病变大致如低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg组，与模型对照组相比亦明显减轻。
以上腺嘌呤引起的大鼠慢性肾衰病理结果表明低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg和阳性药对照组醋酸地塞米松均显示有改善肾损害的病理学变化。
表5 低分子量褐藻多糖硫酸酯对腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠血清肌酐、尿素氮、总蛋白和白蛋白的影响

△p＜0.05 △△p＜0.01 △△△p＜0.001(与正常对照组比较)；*p＜0.05**p＜0.01(与模型对照组比较)
实验结论1.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg给大鼠治疗给药，每天灌胃一次，连续30天，和模型对照组比较，200、100mg/kg剂量组明显降低肾部分切除所致慢性肾衰大鼠血清肌酐、尿素氮水平和肾小球面积，改善肾小管病理改变程度。并随剂量增加，作用增强。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯有治疗肾部分切除所致大鼠慢性肾衰的作用。
2.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg给大鼠治疗给药，每天灌胃一次，连续40天，和模型对照组比较，200、100mg/kg剂量组明显降低冷冻所致慢性肾衰大鼠血清肌酐，尿素氮水平，200mg/kg剂量组明显降低肾小球面积，改善肾小管病理改变程度，并随剂量增加，作用增强。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯有治疗冷冻所致大鼠慢性肾衰的作用。
3.低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg给大鼠预防和治疗给药，每天灌胃一次，连续40天，和模型对照组比较，200、100mg/kg剂量组明显降低腺嘌呤所致慢性肾衰大鼠血清肌酐、尿素氮水平，200mg/kg剂量组明显增加白蛋白水平，缓解肾脏病理变化，并随计量增加，作用增强。表明低分子量褐藻多糖硫酸酯对腺嘌呤所致大鼠慢性肾衰有防治作用。
以上实验所用阳性对照药醋酸地塞米松0.07mg/kg亦有类似作用，与200mg/kg低分子量褐藻多糖硫酸酯作用强度相当。
实施例5 低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品A)对大鼠Heymann肾小球肾炎的疗效观察选取Wistar种大鼠，击昏后打开腹腔，自肾动脉插入针头，用生理盐水反复冲洗至肾色转白厚，摘下肾脏，取肾皮质5克研成匀浆，与弗氏完全佐剂混匀成10ml，加生理盐水20ml，给同种大白鼠做腹腔内注射，两周1次，每次2ml，约3-6次，直至出现蛋白尿，说明模型形成，将此大鼠分为模型对照组，阳性药对照组即醋酸地塞米松0.1mg/kg，低分子量褐藻多糖硫酸酯A 200、100mg/kg两个剂量组及样品1(200mg/kg)组，另设正常对照组(未造模)。灌胃给药，每天1次，模型对照组和正常对照组给予等容量蒸馏水，共四周，评定指标①尿蛋白定量造型前测1次，并去除蛋白高者，确认肾炎形成后每周测1-3次(放入代谢笼中取尿，测定24小时尿蛋白定量)②血肌酐及血尿素氮造型前，确认肾炎形成后及实验结束前各测一次。采用Beckman Model42自动生化分析仪测定。③病理学检查。实验结束时，取肾脏进行肾切片(HE染色)，光镜检查，每例各选5个最大切面的肾小球，计量肾小球直径和细胞数。
实验结果低分子量褐藻多糖硫酸酯灌胃给药4周对大鼠Heymann肾炎尿蛋白的影响列入表6，对血清肌酐、尿素氮的影响列入表7，病理学检查结果列入表8。
表6 低分子量褐藻多糖硫酸酯对大鼠Heymann肾炎尿蛋白的影响

n动物数；△p＜0.05，△△p＜0.01，△△△p＜0.001(与造型前比较)；**p＜0.05，**p＜0.01(与模型对照组比较)。
由表6可见，各组造型后大鼠尿蛋白定量，均明显高于造型前(P＜0.001)表明模型成功，并且尿蛋白升高持续4周以上，低分子量褐藻多糖硫酸酯200mg/kg和100mg/kg于治疗后4周，使大鼠尿蛋白排除量明显降低(与模型对照组比较P值分别＜0.05和＜0.01)，阳性对照药醋酸地塞米松亦使大鼠尿蛋白有一定治疗作用，随剂量增加作用增强。
表7 低分子量褐藻多糖硫酸酯对大鼠Heymann肾炎血清肌酐、尿素氮的影响

n动物数；△p＜0.05，△△p＜0.01，△△△p＜0.001(与造型前比较)；**p＜0.01(与模型对照组比较)。
表7结果表明，造型后大鼠血清肌酐和尿素氮比造型前明显升高(p＜0.01或p＜0.001)，低分子量褐藻多糖硫酸酯(200和100mg/kg)及阳性药对照组治疗后血清肌酐明显下降(与模型对照组比较p＜0.01)，对血清尿素氮无明显影响。实验结果表明低分子量褐藻多糖硫酸酯对大鼠Heymann肾炎血肌酐有一定治疗作用，随剂量增加，作用增强。
表8 低分子量褐藻多糖硫酸酯对大鼠Heymann肾炎肾脏病理学的影响

△△△p＜0.001(与造型前比较)；**p＜0.01(与模型对照组比较)表8结果表明造型后大鼠病理学检查肾小球直径及肾小球细胞数均明显高于空白对照组。低分子量褐藻多糖硫酸酯给药组对肾小球直径有降低趋势，对肾小球细胞无明显影响。阳性对照药醋酸地塞米松可明显降低肾小球直径。
实验结论低分子量褐藻多糖硫酸酯200、100mg/kg，灌胃给药4周，可降低大鼠Heymann肾炎模型尿蛋白排出量及血清肌酐值，并随剂量增加，作用增强，对血清尿素氮无明显影响，病理学检查，对肾小球直径有降低趋势，对肾小球细胞数无明显影响。
实施例6 低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品C)对正常及水负荷大鼠的利尿作用1、对水负荷动物的作用体重150g～200g的雄性健康Wistar大鼠，置于代谢笼中预适应1日，接取6小时尿液，观察自由饮水条件下的尿量是否稳定。再按2.5ml/100g灌胃生理盐水，2小时内收集的尿量达到灌入量40％的动物入选试验。
按6小时排尿量将动物随机分为6组，即低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品C)低、高剂量组，样品1(200mg/kg)组，氢氯噻嗪组，模型组，正常组。给药组剂量分别为低分子量褐藻多糖硫酸酯C 100、200mg/kg，氢氯噻嗪4mg/kg，模型组给予等容积生理盐水，正常组不做处理。
试验前动物禁食18小时。试验时给药组动物药物混于负荷水中(即按2.5ml/100g灌胃给予38℃生理盐水)给予。模型组用等容积的生理盐水代替药液。给药后动物迅速放入给予充分饮水的代谢笼中，每代谢笼中放置大鼠1只，放入前轻压动物下腹，排尽余尿。药后每小时接尿一次，连续观察6小时，观察各组一定时间内尿量的差异。
结果用均数±标准差表示，用组间t检验进行显著性测验。见表9表9 低分子量褐藻多糖硫酸酯对水负荷大鼠单位时间内尿量(单位ml)的影响(x±s)

.vs正常组 .p＜0.05 ..p＜0.01*vs模型组*p＜0.05**p＜0.01由表9可见，模型组给予水负荷后动物尿量明显增加，0～3小时期间与正常组比较有统计学差异(p＜0.01或0.05)。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各组在给药后6小时内尿量与模型组比较均有增加，其中100mg/kg组在给药后3～4小时期间尿量有统计学差异(p＜0.05)；200mg/kg组在给药后1～6小时期间尿量有统计学差异(p＜0.01或0.05)。褐藻多糖硫酸酯200mg/kg组也有作用趋势。各剂量组作用有剂量依赖性。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各组在给药后2～4小时利尿作用最强。
氢氯噻嗪组在给药后6小时内尿量与模型组比较均有统计学差异(p＜0.01或0.05)。
2.对正常动物的作用体重150～200g的雄性健康Wistar大鼠，置于代谢笼中预适应1日，接取6小时尿液，观察自由饮水条件下的尿量，选尿量稳定的动物入选试验。
按6小时排尿量将动物随机分为5组，即受试药物高、低剂量组，样品1组，氢氯噻嗪组，正常组。给药组剂量分别为低分子量褐藻多糖硫酸酯100、200mg/kg，褐藻多糖硫酸酯(样品1)200mg/kg，氢氯噻嗪4mg/kg。给药容积为1ml/100g，正常组给予等容积溶媒。
试验前动物禁食18小时。给药后动物迅速放入给予充足饮水的代谢笼中，每代谢笼中放置大鼠1只，放入前轻压动物下腹，排尽余尿。药后每小时接尿一次，连续观察6小时，观察各组一定时间内尿量的差异。结果用均数±标准差表示，用组间t检验进行显著性测验，见表10。
表10 低分子量褐藻名糖硫酸酯对正常大鼠单位时间内尿量(单位ml)的影响(x±s)

*vs正常组*p＜0.05**p＜0.01由表10可见低分子量褐藻多糖硫酸酯各组在给药后尿量与正常组比较均有增加，其中200mg/kg组在给药后0～5小时期间尿量与正常组比较有统计学差异(p＜0.01或0.05)；100mg/kg组在给药后部分时间内尿量也有统计学差异(p＜0.01或0.05)。各剂量组作用具有剂量依赖性。
低分子量褐藻多糖硫酸酯各组在给药后2～4小时利尿作用最强。
氢氯噻嗪组在给药后6小时内尿量与正常组比较均有统计学差异(p＜0.01或0.05)。
试验结论低分子量褐藻多糖硫酸酯100～200mg/kg单次灌胃给药对正常及水负荷大鼠均有利尿作用，在给药后2～4小时利尿作用最强，各剂量组作用差异明显，具有一定剂量依赖关系。
实施例7 低分子量褐藻多糖硫酸酯(样品B)对小鼠迟发型超敏反应及体液免疫的影响体重24～26g的健康昆明小鼠，雌雄兼用。用1.25％的2，4-二硝基氯苯丙酮液背部皮下0.02ml/只注射小鼠致敏。致敏后一天，动物随机分为5组，即低分子量褐藻多糖硫酸酯B两个剂量组及样品1组，醋酸地塞米松组，模型组。分别灌胃给予低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg，褐藻多糖硫酸酯300mg/kg，醋酸地塞米松0.1mg/kg，模型组给予等容积生理盐水，连续灌胃9天，第10天以0.25％2，4-二硝基氯苯丙酮液皮下注射小鼠右足垫中间，剂量为0.02ml/只，对侧足注射等容积丙酮液作对照，38小时后从踝关节剪下二足，电子天平称重，按照下式计算肿胀度及抑制率，并进行统计学处理。
肿胀度＝右足重量(mg)-左足重量(mg)

处死动物前取内眦静脉血离心，速率散射比浊法测定血清C3、C4、IgG、IgM含量。
另取10只昆明种小鼠作为正常组，同样饲养10天后，内眦静脉取血离心，同上测血清C3、C4、IgG、IgM含量。结果见表11、12。
表11 低分子量褐藻多糖硫酸酯对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应的影响

由表11可见，低分子量褐藻多糖硫酸酯ig给药9天对2，4-二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应有抑制作用，150、300mg/kg组肿胀度与模型组比较p＜0.01。醋酸地塞米松组也有类似作用。
表12 低分子量褐藻多糖硫酸酯对血清C3、免疫球蛋白、总补体含量的影响

·vs正常组·p＜0.05 ··p＜0.01*vs模型组*p＜0.05**p＜0.01由表12可见，小鼠皮下注射2，4二硝基氯苯后体液免疫指标均升高。给予药物ig 9天后，低分子量褐藻多糖硫酸酯150mg/kg组对小鼠体液免疫部分指标有抑制作用；低分子量褐藻多糖硫酸酯300mg/kg组及醋酸地塞米松组对小鼠体液免疫各项指标均有显著抑制作用，与模型组比较p＜0.05或p＜0.01。
试验结论(1)低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg给药ig 9天对2，4二硝基氯苯所致小鼠迟发型超敏反应有明显抑制作用，且有剂量依赖性；(2)低分子量褐藻多糖硫酸酯150、300mg/kg给药ig9天可明显抑制超敏反应小鼠体液免疫。
权利要求
1低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯是将褐藻多糖硫酸酯通过降解而制得的硫酸化多糖或寡糖类物质。
2根据权利要求1的用途，其中所述的肾脏疾病选自肾功能衰竭、肾炎和肾病综合征中的一种或几种。
3根据权利要求2的用途，其中所述的肾炎为临床上常见的急性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎、肾盂肾炎、隐匿性肾炎、过敏性紫癜肾炎、红斑狼疮肾炎中的一种或几种。
4根据权利要求1～3中任一项权利要求的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为1000～200000。
5根据权利要求4的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为5000～100000。
6根据权利要求5的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为8000～80000。
7根据权利要求6的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为50000～80000。
8根据权利要求6的用途，其中所述的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量为15000～30000。
9根据权利要求1的用途，其中的褐藻多糖硫酸酯来源于海带、野生褐藻马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡叶藻或墨角藻一种或几种。
10根据权利要求1的用途，其中的低分子量褐藻多糖硫酸酯的剂型为注射剂、口服制剂、局部给药制剂或鼻腔给药制剂。
全文摘要
本发明公开了低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备肾脏疾病的药物中的用途。其中的肾脏疾病包括但不限于肾功能衰竭、肾炎和肾病综合征等。本发明中的低分子量褐藻多糖硫酸酯可以是从海带、墨角藻、泡叶藻、昆布或绳藻中提取得到的褐藻多糖硫酸酯降解而得，分子量为1000～200000。
文档编号A61P13/00GK101028282SQ20071006431
公开日2007年9月5日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者郝守祝, 李静 申请人:北京世纪博康医药科技有限公司