重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白及其药物组合物的制作方法

专利名称：：重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白及其药物组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)、其cDNA基因、含有该cDNA基因的重组载体、用该载体转化的微生物、以及含有该重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的药物组合物。
背景技术：
：心脑血管疾病是目前威胁人类健康的主要疾病之一，其中因脑卒中引起的死亡率极高，其发病后的主要表现为①形成脑血肿；②形成脑血栓；③脑缺血；④出现脑水肿。目前认为以上几种病理改变与白细胞浸润、凝血酶激活和微循环障碍有关。现已知白细胞抑制因子和水蛭素分别能抑制白细胞浸润和凝血酶激活。(MoyleMetal:US5789175;MaddenKetal，InflammRes1997,46(6):216-223;MasaddaT.etal,BrainRes,2000,867(2):173-179.)白细胞抑制因子(NIF)由257个氨基酸组成，含有7个糖基化位点，基因工程重组去糖基化NIF被证明同样具有其生物活性。白细胞抑制因子能有效抑制中性粒细胞的活性，包括与内皮细胞的粘附、过氧化氢和超氧化离子的释放、中性粒细胞趋化、聚集和吞噬功能等。(MoyleMetal:JBiolchem1994，269(13):10008-10015)鉴于NIF具有以上的功效，应用重组NIF在动物模型中证明具有临床应用价值，可防止和治疗缺血性的神经损伤(大鼠MCAO模型)，具有改善脑损伤的血液供应，减轻脑组织损伤面积。(ZhangLetal:stroke.2003,34(7):17M-1795)通过对水蛭素的结构与功能的研究，发现C端的12肽(即5364位)具有水蛭素抗凝血酶活性的全部功能。(NaskiMC.etal:JBiocchem.1990,265(23):13484-13489;MaraganoreJmetal:Biochemistry1990，29(30):7095-7101)在此基础上人工合成了12肽，命名为水蛭原(Hirugen)，水蛭原被证明能与凝血酶的阴离子结合区域结合，不能与催化位点区域和纤维蛋白结合，而凝血酶可与纤维蛋白结合，所以该水蛭原不能特异地与凝血酶结合，即缺乏对凝血酶的靶向性。但水蛭原在体内外同样具有抑制凝血酶将纤维蛋白原转化成纤维蛋白的功能，延长APTT、PT和TT时间，起到抗凝作用。根据以上病理以及NIF和水蛭原的生物活性，中国专利申请(申请号031011551)公开了一种将白细胞抑制因子与水蛭原经基因工程重组技术而形成的双功能嵌合蛋白(NIF-HimdinHybrid,简称NHH)，该嵌合蛋白的结构如下白细胞抑制因子-(Gly)5-水蛭原。该NHH由274个氨基酸组成，具有抑制中性粒细胞的粘附和活化，和抑制凝血酶活性的功能，适用于急性脑血管性疾病的治疗。然而，由于上述NHH中的水蛭原不能与催化位点区域结合，所以该NHH同水蛭原一样缺乏对凝血酶的靶向性，大大抑制了其在治疗心脑血管疾病方面的效果。
发明内容为克服现有技术的缺陷，本发明的目的旨在提供一种新的能耙向抑制凝血酶活性的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，从而改善治疗心脑血管疾病，如脑卒中的治疗效果。为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)，其具有如下结构Met-白细胞抑制因子-交联区l-FPRP-交联区2-水蛭原，其中，交联区1为515个甘氨酸，优选为510个甘氨酸；交联区2为(GSGG)n，n为l-3。本发明的第二个方面提供了该重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的cDNA序列。本发明的第三个方面提供了含有上述cDNA的表达载体。本发明的第四个方面提供了含有上述表达载体的微生物。本发明的第五个方面提供了一种包含本发明重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的药物组合物。本发明的TNHH的结构为Met-白细胞抑制因子-交联区l-FPRP-交联区2-水蛭原。优选地，TNHH中的交联区1为515的甘氨酸，更优选为5个甘氨酸；交联区2(GSGG)n，n为l3，n更优选为l。FPRP中的苯丙氨酸(F)优选为L型；Met为甲硫氨酸。优选的嵌合蛋白为Met-NIF(257)-(Gly)5-FPRPGSGG-Hirugen，其中FPRP中的苯丙氨酸(F)为L型。本发明的TNHH中的FPRP结构能特异结合纤维蛋白，从而使TNHH在抑制凝血酶活性和治疗心脑血管疾病方面具有靶向性。为了获得所述的TNHH，本发明采取了如下步骤①以GenBank中的NIF的cDNA以及根据水蛭原的12肽推测的密码子序列为依据，结合大肠杆菌或酵母或CHO表达的偏爱密码子原则，设计了NHH相对应的用于人工合成的cDNA序列；②根据上述设计的cDNA碱基序列，设计若干对互补重叠引物，用递归PCR方法扩增所设计的碱基序列，插入pUC57测序质粒，由全自动DNA测序仪(ABI)测序确定人工合成的cDNA片断的碱基序列与所设计一致；③以含有②中所设计的碱基序列的pUC57为模板，设计引物扩增TNHH基因，扩增后的基因首尾分别含有酶切位点，且在尾部的酶切位点前含有终止子，优选含有TAATGA的终止子，以方便插入表达载体中，以及表达载体在宿主细胞中的表达。其中优选首尾分别插入^^/和5""〃/，以便插入原核表达载体中;^^;④由于扩增后的TNHH首尾分别含有酶切位点，用含有相同酶切位点的测序质粒来检验扩增的TNHH基因与设计的完全一致后，酶切TNHH基因正确序列的测序质粒以及表达载体，从而使表达载体与TNHH基因连接，得到含有TNHH基因的表达载体；⑤将所得的含有TNHH基因的表达载体转化宿主细胞，转化的宿主细胞经测序分析，目的基因正确地嵌入载体中，并且目的基因序列与所设计的相同。使TNHH蛋白在宿主细胞中得以表达。最后从菌体中提取纯化得到TNHH蛋白。本发明所提供的表达TNHH的cDNA优选为SEQIDNO.2。本发明所提供的含有所述cDNA的表达载体优选为pET-3c。本发明所提供的含有所述表达载体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞和CHO细胞等，优选为大肠杆菌。本发明的药物组合物可为任何常规剂型，如注射剂型，其包括注射液和冻干粉等形式。制备注射剂型时，可将本发明TNHH加入一定量的无机盐或氨基酸缓冲，如磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸，其中盐主要指钠盐，其离子强度为5—100mmol/L之间。药物组合物的酸碱值维持在5.0-9.0之间。该组合物中还可加入蛋白保护剂如白蛋白、明胶、多糖、淀粉、甘油等。其中多糖优选为甘露醇、蔗糖、海藻糖中的一种或多种，其比例(g/ml)为2.0—6.0%。本发明提供的含有所述重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的药物组合物能够治疗心脑血管疾病，尤其是脑卒中。图l:PCR扩增的各DNA片段，其中M.100bpDNALadderMarker;1.Hirulog基因(70bp);2.NIF基因(810bp);3.TN朋基因(870bp)图2:扩增后的TNHH的测序结果，其中，图2a为扩增后的TNHH的测序结果(正向测序)；图2b扩增后的TNHH的测序结果(反向测序)图3:pLEX-TNHH、pLEX和pET3c质粒的酶切鉴定，其中Ml.XDNA///zwdIII+￡coRIAgeW;1.pLEX-TNHH/7W/eI十SamHI;2.pLEX/厕eI十B謂HI;3.pET3c/肠I十B函HI;M2.訓bpDNALadderMarker图4:表达重组质粒pET3-TNHH的构建图5:重组质粒pET3-TNHH的鉴定，其中M.XDNA/历"dIII+￡coRI消化；1.pET3c/iVdeI+J5amHI;2-3.pET3-TNHH/AWeI十BawHI;4.TNHH基因PCR片段图6:pET3-TNHH中TNHH基因的测序结果，其中图6a为pET3-TNHH中TNHH基因的测序结果(正向测序)，图6b为pET3-TNHH中TNHH基因的测序结果(反向测序)图7:TNHH的免疫印迹鉴定，其中M.蛋白质中分子量Marker;1.纯化的TNHH;2.Hirudin;l，.TNHH的免疫印迹；2，.Hirudin的免疫印迹图8:TNHH的N端及C端氨基酸测序结果，其中，图8a为TNHH的N端及C端氨基酸测序结果(N端测序)，图8bTNHH的N端及C端氨基酸测序结果(C端测序)图9:正常对照组大脑皮层神经细胞层次清晰，胞核深染，胞体皱缩或消失图10:模型组大脑皮层神经细胞层次紊乱，胞核深染，胞体皱縮或消失图11:NIF组大脑皮层神经细胞层次欠规则，部分胞核深染，部分胞体皱縮或消失图12:NHH组大脑皮层神经细胞层次欠规则，部分胞核深染，部分胞体皱縮或消失图13:TNHH组大脑皮层神经细胞层次较规则，可见部分胞核深染，可见部分胞体皱縮或消失(HE10X10)图14:TNHH组大脑皮层神经细胞结构层次较规则，可见部分核深染，可见部分胞体皱縮或消失(HE40X10)具体实施方式以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围不仅限于实施例。实施例1NHH基因的获得委托上海生物工程有限公司全基因人工合成，其设计方案为根据NHH设计的全基因序列(SeqIDNo.l)合成14个寡核苷酸片段，长度为80130bp之间。其中l、3、5、7、9、11、13片段为正向片段，2、4、6、8、10、12、14为反向片段。在相邻二个片段之间设计20个左右碱基序列的互补区。合成以上片段并纯化后，按等量混合作为递归PCR的底物，进行PCR反应后获得822bp的NHH基因cDNA。NHH基因序列前端加Kex2位点，该位点开始六碱基为屈oI位点；NHH后跟两个终止密码子；终止密码子后跟I6"I位点。合成的NHH全基因序列如下(SEQIDNO.1):XhoIKex2AACGGTACTGAAATGCCAGGTTTCAACGACTCCATCAGAGCTTTGGGTCACATCTCCATCACTGAAGAATCCGAATCCGACGACGACGACGACTTCGGTTTCTTGCCAGACTTCGCTCCAAGAGCTTCCAAGATGAGATACTTGGAATACGACTGTGAAGCTGAAAAGTCCGCTTACATGTCCGCTAGAAACTGTTCCGACTCCTCCTCCCCACCAGAAGGTTACGACGAAAACAAGTACATCTTCGAAAACTCCAACAACATCTCCGAAGCTGCTTTGAAGGCTATGATCTCCTGGGCTAAGGAAGCTTTCAACTTGAACAAGACTAAGGAAGGTGAAGGTGTTTTGTACAGATCCAACCACGACATCTCCAACTTCGCTAACTTGGCTTGGGACGCTAGAGAAAAGTTCGGTTGTGCTGTTGTTAACTGTCCATTGGGTGAAATCGACGACGAAACTAACCACGACGGTGAAACTTACGCTACTACTATCCACGTTGTTTGTCACTACCCAAAGATCAACAAGACTGAAGGTCAACCAATCTACAAGGTTGGTACTCCATGTGACGACTGTTCCGAATACACTAAGAAGGCTGACAACACTACTTCCGCTGACCCAGTTTGTATCGACTCCAAGGAGTTCTACAGATTCAGAGAATTGGGCGGTGGCGGTGGCAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCAGAAGAATACTTG[TAATGA|rC7^04终止子X6a/合成基因嵌入pUC57质粒且命名为pUC57-NHH。该NHH基因用于与pPIC9K构建重组质粒、线性化后重组入宿主菌毕节酵母(户/c/nh内并进行诱导表达，制备重组NHH作为本品动物模型对照筛选蛋白。实施例2TNHH基因的获得在本实施例中，所设计的TNHH具有Met-NIF-GGGGG-FPRPGSGG-水蛭原结构，其对应的cDNA序列如下(SEQIDNO.2):AACGAACACAACTTGAGATGTCCACAAAACGGTACTGAAATGCACAACGGTTACAGATCCAAGTTGGCTTTGGGTCACATCTCCATCACTGAAGAATCCGAATCCGACGACGACGACGACTTCGGTTTCTTGCCAGACTTCGCTCCAAGAGCTTCCAAGATGAGATACTTGGAATACGACTGTGAAGCTGAAAAGTCCGCTTACATGTCCGCTAGAAACTGTTCCGACTCCTCCTCCCCACCAGAAGGTTACGACGAAAACAAGTACATCTTCGAAAACTCCAACAACATCTCCGAAGCTGCTTTGAAGGCTATGATCTCCTGGGCTAAGGAAGCTTTCAACTTGAACAAGACTAAGGAAGGTGAAGGTGTTTTGTACAGATCCAACCACGACATCTCCAACTTCGCTAACTTGGCTTGGGACGCTAGAGAAAAGTTCGAAACTAACCACGACGGTGAAACTTACGCTACTACTATCCACGTTGTTTGTCACTACCCAAAGATCAACAAGACTGAAGGTCAACCAATCTACAAGGTTGGTACTCCATGTGACGACTGTTCCGAATACACTAAGAAGGCTGACAACACTACTTCCGCTGACCCAGTTTGTATCCCAGACGACGGTGTTTGTTTCATCGGTTCCAAGGCTGACTACGACTCCAAGGAGTTCTACAGATTCAGAGAATTGGGCGGTGGCGGTGGCTTCCCAAGACCAGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTCGAAGAAATCCCAGAATNHH基因通过如下步骤获得合成4条引物P1、P2、P3禾t!P4，以重组质粒pUC57-NHH为模板，用引物P1、P2扩增NIF基因(尾部带有编码FPRP的碱基序列)，用引物P3、P4扩增Himlog基因(首部带有编码FPRP的碱基序列)；再用NIF基因及Himlog基因为模板，用引物P3、P4扩增TNHH基因。扩增的TNHH基因首尾分别加入NdeI和BamHI位点，方便插入原核表达载体pET-3c。引物序列如下Pl(正向)5'-CGC4r爿rGAACGAACACAACTTGAGATGTCCA-3，P2(反向)5'-ACC^TGGTCTTGGGA^GCCACCGCCACCGCCCAATTCTCTGAA-3'P3(正向)5，-GGC[lTCCCAAGACCA|GGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC-3'P4(反向)5，_TG7TCTTACAAGTATTCTTCTGGGATTTC-3，C4L4rC:Mfcl位点；TTC:5amHl位点；方框内碱基编码氨基酸序列FPRP;下划线碱基编码氨基酸序列GGGGG或GSGG。重叠延伸PCR方法扩增TNHH目的基因的反应体系如下各PCR的反应体系均用PCR反应试剂盒(TaKaRa，大连)按商家的说明书设置(表l)。以重组质粒pUC57-NHH为模板，以P1、P2作引物，扩增810bp的NIF基因(图1泳道2)。以重组质粒pUC57-NHH为模板，以P3、P4作引物，扩增70bp的水蛭原基因(图1泳道1)。以凝胶回收的NIF基因和水蛭原基因作模板，以P1、P4作引物，最终扩增870bp的TNHH基因(图1泳道3)。表1PCR反应体系模板1nl上游引物(25pmol/L)2|xl下游引物(25pmol/L)2pldNTPs(每种碱基分别为2.58plmmol/L)10xPCR缓冲液10plMgCl2(25mmol/L)10pi7b《DNA聚合酶1piddH20_66^总体积100^将反应体系振荡混匀，离心处理后，加入40nl石蜡油。反应参数如下94°C预变性3分钟，94。C55°C72°C72°C1分钟1分钟1.5分钟10分钟,35循环反应完毕后取3反应产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果(图1)PCR结果显示，各步PCR成功扩增出目的DNA片段，TNHH基因初步获得，序列是否正确通过如下鉴定将TNHH基因及载体pLEX(Invitrogen)用MfeI和BawHI双酶切后，回收目的片段，用T4DNA连接酶连接起来形成重组质粒pLEX-TNHH，经DNA测序(TaKaRa，大连)后表明，扩增的TNHH基因与设计的完全一致，参见图2。实施例3重组质粒构建1.主要材料宿主菌￡.co"BL21(DE3)pLysS、￡.co/ZDH5a、质粒pET3c(Novagen)，DNA抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)，ADNA////^/IH+五coRIMarker(华美)，工具酶7W/eI、5amHI、历"dIII、DNALadderMarker、DNARecoveryKit和DNALigationKitVer.2.1(TaKaRa，大连)，抗生素Ampicillin、Streptomycin、Tetracycline,Kanamycin(AMRESCO)。2.方法pLEX-TNHH经两个限制性内切酶I、5a/wHI双酶切后回收目的片段，TNHH基因与7W/el、5訓HI双酶切的pET3c质粒大片段用DNALigationKit连接。采用CaCl2法制备感受态转化DH5a，均匀涂抹于含100mg/L氨卡青霉素的LB平板，在37"C培养箱中孵育12h生长出乳白色半透明单菌落，用无菌牙签挑取单菌落在含100mg/LAmpicillin的LB液体培养基中培养后提取质粒，用I、加仿HI双酶切筛选出已嵌合860bp片段的表达质粒pET3-TNHH。①质粒提取按DNA抽提纯化试剂盒操作手册方法进行。②酶切分别进行pLEX-TNHH质粒和pET3c质粒的酶切反应。反应体系为0.5吗的质粒DNA、5amHI1.0单位、iV^feI1.0单位、10倍酶反应缓冲液2.0^tl，加去离子水(DDW)至总体积20nl。37。C恒温箱中酶切2h,各取1pl进行1%琼脂糖凝胶电泳。pLEX-TNHH酶切后显示一860bp条带和一2900bp条带，pET3c显示出一条4600bp带(图3)。③pET-3c与TNHH基因连接将上述酶切样品全部进行胶回收电泳，按DNARecoveryKit操作手册方法回收酶切pLEX-TNHH后的目的片段和线性化pET-3c，将回收的线性化pET-3c和目的片段按DNALigationKit操作手册，16'C连接30min，得到pET3-TNHH(图4)。④感受态制备及转化按常规氯化钙方法进行五.co//DH5a和￡.co//BL21(DE3)pLysS感受态制备和pET3-TNHH的转化(《分子克隆试验指南》第二版，P55)。实施例41.连接和转化将pET3-TNHH阳性连接液及阴性连接液分别转化五.co/z'DH5a，各自涂在含100mg/LAmpicillin的两个LB平板上37。C恒温培养12h,阴性平板生长出5个单菌落，而阳性平板生长出IOO个左右的单菌落，证明连接和转化成功，其形态特征为大肠杆菌典型表现。2.重组表达质粒pET3-TNHH的酶切鉴定用无菌牙签挑取阳性平板上两个单菌落在含100mg/LAmpicillin的LB液体培养基37"C培养12h后，提取重组表达质粒pET3-TNHH经I和BawHI双酶切，结果显示出4600bp和860bp(该片段用TNHHPCR产物做对照)大小的两片段，与设计的完全一致(图5)。3.重组表达质粒pET3-TNHH的测序鉴定从pET3-TNHH/￡.co//DH5a中提取质粒pET3-TNHH，经酶切鉴定正确后，取一部分送宝生物工程(大连)有限公司测序，见图6。测序结果表明，所得表达质粒中包含的TNHH序列与预先设计的一致。实施例5TNHH的提取与纯化<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>TNHH原液实施例6TNHH原液的免疫印迹鉴定以及测序鉴定。将纯化的TNHH以相同上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳后，再用电转移仪转移到硝酸纤维素膜上与鼠抗水蛭素(Himdin)抗体(一抗)结合，再与羊抗鼠IgG-HRP(二抗)结合后，通过底物显色反应得到免疫印迹鉴定(图7)。从图7看出，TNHH内显示了与抗Hirudin抗体特异结合的成分，这表明设计的HV2抗原表位充分暴露并能以抗体特异结合。从图8看出，所得的TNHH的氨基酸N端测序结果为MNEHNLRCPQNGTEM，C端测序结果为EYL，与设计的序列DDDDDFGFLPDFAPRASKMRYLEYDCEAEKSAYMSARNCSDSSSPPEGYDENKYIFENSNNISEAALKAMISWAKEAFNLNKTKEGEGVLYRSNHDISNFANLAWDAREKFGCAVVNCPLGEIDDETNHDGETYATTIHVVCHYN端序列与C端序列完全吻合，结合DNA测序结果表明TNHH的氨基酸序列与设计的完全一致。其中，(Gly)5前面氨基酸序列为NIF,NGDFEEIPEEYL为水蛭原的氨基酸序列。从上可看出，所得TNHH具有如下结构Met-NIF-GGGGG-FPRPGSGG-水蛭原。实施例7含交联区1(Gly)15和交联区2(GSGG)3的TNHH的制备用PCR技术将TNHH的基因的交联区1和交联区2替换成NIF—(Gly),5—FPRF—(GSGG)3—Hirogen形式。合成两对引物序列P5(正向)同实施例2中P1P6(反向)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>_-3，P7(正向)5,—GGC阮CCAAGACCA卜GGTAGC—GGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC—3，P8(反向)同实施例2中P4其中方框内碱基编码的氨基酸序列为FPRP，P6下划线碱基编码的氨基酸序列为(Gly)15，P7下划线碱基编码的氨基酸序列为(GSGG)3。以TNHHcDNA基因为模板，按照实施例2，3，4，5的方法，PCR获得目的基因，构建重组质粒，连接和转化以及鉴定，提取和分离纯化。获得的重组TNHH命名为TNHH—G15/n3。通过体外分析比较研究，证明TNHH-G15/n3和TNHH的抑制凝血酶活性及抗白细胞粘附活性一致。合成二对引物序列P5(正向)同实施例2中PIP6(反向)5，一ACCTGGTCTTGGGAAGCCACCGCCACCGCCACC「3，P7(正向)5，一GGCTTCCCAAGACCA—GGTAGC—GGTGGCGGTAGCGGTGGCGGTAGCGGTGGCAACGGTGACTTC—3,P8(反向)同实施例2中P4其中方框内碱基编码的氨基酸序列为FPRP，P6下划线碱基编码的氨基酸序列为(Gly)15，P7下划线碱基编码的氨基酸序列为(GSGG)3。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例8TNHH的药物组合物制剂8.1注射液用实施例5制备所得的TNHH重组蛋白溶液按照下列配方制备药物组合物注射液配方A:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>配方B<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>8.2冻干粉用实施例5制备所得的重组蛋白TNHH液按下列配方制备成冻干粉配方C<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>配方E<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例8中的制备工艺均按照常规注射液和冻千粉的制备工艺制备。实施例9NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血损伤治疗作用的比较1.材料药物试药NIF、NHH和TNHH由重庆富进生物医药公司提供。试剂氯化三苯基四氮唑(TTC)，购自中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20020610;APTT试剂盒，购自上海太阳生物技术公司，批号国药器械(进)字2002第3401632号。动物Wistar大鼠24只，雄性，180-230g,由重庆医科大学动物试验中心提供。2.方法将Wistar大鼠随机分为四组，模型组，NHH组，NIF组和TNHH组，每组6只。各Wistar大鼠，用10%水合氯醛(350mg/kg，ip)麻醉。将其仰卧固定，沿颈正中切口切开皮肤，纯性分离出右侧颈总动脉并穿线2根游离备用。再分离出颈外动脉，结扎之。在颈外动脉下方分离出颈内动脉及翼突腭动脉，将翼突腭动脉结扎之。将分离的颈总动脉近心端和远心端用动脉夹夹闭，于颈外动脉上剪一小口，将一尼龙线棒(<D=0.220.30mm)插入小口，缓缓推入至前脑动脉(约20mm)再回拉约2mm即至大脑中动脉口，长约17mm，用7号缝线结扎固定尼龙棒，取下动脉夹，缝合肌肉和皮肤，术毕放加大笼单独饲养。待动物清醒后，行为学评分小于11分为模型成功的标志。在每组动物模型成功后(按动物麻醉清醒后行为学评分小于ll分为准)，各组动物分别从尾静脉给相应的药物，2mg/kg，bid，给药容积为1ml/100g，模型组给予相应容量的生理盐水。分别于术后4h，8h，24h，48h，72h进行神经行为学评分(满分为11分)。于术后72评分后，经颈动脉插管取血1.8ml，迅速加入盛有0.2ml的0.109mol/L枸椽酸钠抗凝液的硅化下班管中，轻轻颠倒混匀，300rpm离心15min，收集上层液体，按试剂说明书步骤测定APTT。然后再将大鼠断头，去除头盖骨后取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑于，余下部分称其重量后，将大脑沿冠状面切成5片，将脑片置4%TTC的磷酸缓冲液中37"C温孵30min,其间翻动34次，正常脑组织染成红色，而梗死脑组织呈白色，剪下白色的梗死区称重，以"重量求面积法"计算梗死脑组织重量占全脑重量的百分比作为梗死面积。每组再任选2只动物，处死后取大脑作病理检査。3.结果3.1NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血行为学评分比较如表2所示，NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血的行为学评分有明显改善作用，各用药组与模型组比较有差异和显著差异(尸<0.05禾卩户<0.01)。表2NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血行为学评分比较<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.2NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑梗死体积的比较如表3所示，NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑梗死体积有明显的减少作用，各用药组与模型组比较有差异和显著差异(户<0.05禾卩户<0.01)。表3NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑梗死体积的比较组别动物数脑梗死的体积(％)模型组439.4±5.7NIF纟且424.9±9.6*NHH组425.2±5.2**TNHH组423.2±5.4**3.3NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血后血清APTT的比较如表4所示，NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血后血清APTT值有延长作用，各用药组与模型组比较有差异和显著差异(P<0.05禾卩尸<0.01)。表4NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血后血清_APTT比较_组另U_动物数血清中APTT(秒)模型组618.5±4.8NIF组620.2±3.3NHH组628.5±2.7"TNHH组624.8±3.6*3.4NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑组织梗死的病理切片观察结果与正常对照组的脑组织相比，模型组与各用药组大脑皮层神经细胞结构层次有不同程度的紊乱，胞核深染固縮，胞体皱縮。海马CA1区的锥体细胞结构层次有不同程度的紊乱，细胞排列疏松，胞浆淡染，胞核深染固縮，细胞数不同程度的下降。与模型组相比，NIF、NHH和TNHH的病理变化均轻于模型组，其中以TNHH组病理变化最轻(见图9-14)。由以上病理切片可以看到，对大脑中动脉阻塞性脑组织梗死，与模型组相比，NIF、NHH和TNHH有不同程度的保护作用，以TNHH组脑组织缺血坏死变化最轻。4.结论NIF、NHH和TNHH对大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血损伤有明显的治疗作用，其中TNHH的治疗保护作用最显著。实施例10NIF、NHH和TNHH对大鼠实验性脑血肿治疗作用的比较1.材料药物试药NIF、NHH和NTHH由重庆富进生物医药公司提供。动物SD大鼠32只，雄性，180~230g，由第三军医大学大坪医院动物试验中心提供。2.方法2.1大鼠脑出血模型的建立将SD大鼠随机分为四组，模型组，NHH组，NIF组和TNHH组，每组8只实验鼠经水合氯醛麻醉后，断尾取血0.1ml，将大鼠固定于立体定位仪上。头皮正中切口，剪开骨膜，暴露前囟，于前囟后lmm,中线左旁开3mm处钻一直径为lmm的小孔，用固定于立体定位仪上的微量进样器沿钻孔进针，进针深度为5.8mm(即尾状核位置)，缓慢注射自体血液0.1ml。动物苏醒后按评分标准立即进行神经功能缺失体征评分。行为学评分小于11分动物入选本实验。以后分别于造模后进行行为评分，至实验结束。2.2观察指标神经功能缺损体征评分的观察及选造模后4h、12h、24h、48h、72h5个时间点；脑含水量的变化及组织病理学观察在造模后72h处死动物后进行。2.3给药方法每组动物模型建成后(按动物麻醉清醒后行为学评分小于11分为准)，各组动物分别从尾静脉给相应的药物，2mg/kg，bid，给药容积为1ml/100g，模型组给予相应容量的生理盐水。2.4脑含水量的测定动物处死后迅速取脑，取血肿边缘处脑灰质150200g(去除皮质)。采用干湿法测脑组织含水量，按公式脑含水量=(湿重-干重)/湿重x100%，计算脑含水量。2.5普通光镜观察在选定的时间点迅速断头取脑，沿冠状面切下厚2mm的脑片，置入10%甲醛中固定，常规HE染色，封片，观察病变区及附近脑组织病理变化。2.6行为指标评分于术后4h、12h、24h、48h、72h进行行为评分。方法简述于下提鼠尾观察前肢屈曲情况，如前肢对称伸向地面，计为O分，如手术的对侧前肢出现腕屈，肘屈，肩内旋，既有腕肘屈曲又有肩内旋者，分别计分1，2，3，4分。将动物置于平地面上，分别推双肩向对侧移动，检査阻力，如双侧阻力对等且有力，计为O分，如向手术的对侧推动时阻力下降则根据下降程度不同分为轻、中、重三度，分别计为l，2，3分。将动物双前肢置一金属网上，观察双前肢的肌张力。双前肢肌张力对等且用力者计为O分，同样根据手术对侧肢张力下降程度不同计为1，2，3分。动物有不停向一侧转圈者，计为1分。根据标准评分，满分为11分，分数越高，动物行为障碍越严重。3结果3.1NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿行为学评分比较如表5所示，NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿行为学评分有明显改善作用，各用药组与模型组比较有差异和显著差异(户<0.05和户<0.01)。表5NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿行为学评分比较动行为学评分__组别物4h12h24h48h72h必,_^_模型组82.50±0.842.83±0.753.83±1.725.33±1.636.17±1.47NIF组81.86±0.902.14±0.90*2.43±0.53**3.14±0.90**4.14±1.68**NHH组82.14±0.691.86±0.90**2.43±1.00**2.57士0.13**3.57±1.72**TNHH组82.00±1.072.00±0.76**2.25±0.46**2.12±0.64**2.88±1.46**与模型组比较*尸<0.05，**/><0.01，以下相同。3.2NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿脑含水量的比较结果如表6所示，NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿脑含水量有明显的减少作用，各用药组与模型组比较有差异和显著差异(/><0.05禾口尸<0.01)。表6NIF、NHH和TNHH对大鼠试验性脑血肿行为学评分比较组别_动物数脑含水量(％)模型组883.35土2.07NIF组879.36±0.47"NHH组878.66±0.55**TNHH组878.28±1.97**3.3NIF、NHH和TNHH对大鼠实验性脑血肿的病理切片观察结果观察指标脑水肿，神经细胞变性、坏死，神经纤维脱髓鞘，胶质细胞增生，炎症细胞浸润和间质出血。对侧脑对照组观察大脑皮髓结构清晰，神经细胞、胶质细胞、血管分布、血管结构均无异常，无脑水肿，炎症细胞浸润及出血。模型组大脑皮髓质结构不清，神经细胞有变性及坏死，有明显脑水肿和炎症细胞浸润，间质有出血，胶质细胞有增生。上述病变表现程度为多数动物为++—+++度病变，2例为+度病变。NIF组上述病变多数为±—+度病变，3例为+—++度病变。NHH组上述病变多数为0—+度病变，3例为+—++度病变。TNHH组上述病变有明显好转，多数为0—±度病变，仅2例±度病变。4结论NIF、NHH和TNHH对大鼠实验性脑血肿有明显的治疗作用，其中TNHH的治疗保护作用最显著。大鼠大脑中动脉阻塞性脑缺血损伤实验病理照片实施例IITNHH与纤维蛋白和凝血酶在体外结合情况。1试验材料1.1药物TNHH原液(3.0mg/ml)。人纤维蛋白(lg/支，F5386)，sigma公司。人凝血酶(127Unit/支)，批号20021105，中国药品生物制品检定所。1.2溶液磷酸盐缓冲液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)。色谱流动相缓冲液20mmol/LNaH2PO4-Na2HPO4，0.15mol/LNH4S04，pH6.8。1.3仪器恒温水浴锅。凝胶色谱注(ShodexPROTEINKW-82.5)。Waters600HPLC系统带浙江大学N2000色谱工作站。1mlEP管架1个，1mlEP管若干，lml移液枪及枪头。2试验方法及结果2.1供试品取TNHH，用磷酸缓冲液稀释为1.0mg/ml，待用；精密称取适量取纤维蛋白，用磷酸缓冲液溶解并稀释为0.1mg/ml，待用；取凝血酶，按标示量用磷酸缓冲液溶解并稀释为100单位/ml，待用。2.2供试品反应按下所列方法分组取各供试品置37C反应1小时，然后按色谱条件进行分析。(1)分别取各供试品溶液20pl进样分析，记录各自保闺时间。(2)取纤維蛋白和凝血酶供试品溶液各0.5ml，混匀后置37'C反应1小时，取样20pl进样分析。(3)取TNHH和纤维蛋白供试品溶液各0.5ml，混匀后置37。C反应l小时，取样20]id进样分析。(4)取TNHH和凝血酶供试品溶液各0.5ml，混匀后置37'C反应1小时，取样20pl进样分析。(5)取TNHH和纤维蛋白与凝血酶混合反应样品各0.5ml，混匀后置37'C反应1小时，取样20pl进样分析。2.3色谱条件流速0.5ml/min;检测波长214nm;柱温室温；记录色谱图25min。2.4色谱结果表7TNHH与纤维蛋和凝血酶结合SEC-HPLC分析色谱结果,、，保留时间(min)峰1峰2TNHH(T)23.657/纤维蛋白(F)16.680/凝血酶")18.778/凝血酶+纤维蛋白(f+F)12.58218.578TNHH+纤维蛋白(T+F)14.598/TNHH+凝血酶+纤维蛋白(T+F+f)10.26512.772结果分析TNHH,纤维蛋白及凝血酶在SEP-HPLC中保留时间各不相同，分别为23.657，16.680和18.778min，能有效分离。凝血酶与纤维蛋白能部分结合后侈时间为12.582min，TNHH与纤维蛋白有效结合后保留时间为期不远14.598min，TNHH与凝血酶和纤维蛋白三者结合后的.保留时间为10.265min。3结论TNHH，人纤维蛋白和人凝血酶三种不同蛋白在SEC-HPLC色谱保留时间分别不同。根据试验条件(生理缓冲)相互混合后出现了明显的高分子量蛋白峰，其中纤维蛋白和凝血酶可相互结合，本品TNHH与纤维蛋白和凝血酶可相互结合。此结果表明TNHH在体外可以和纤维蛋白及凝血酶相结合，证明本品结构中含有与凝血酶或纤维蛋白结合的水蛭原保留了其空间构象。实施例12TNHH与凝血酶体外可逆反应试验1.试验材料1.1药物TNHH(3.0mg/ml);凝血酶(127Unit/支，中国生物制品检定所，批号20021105);IMUBINDHirudinELISA(AmericanDiagnosticainc.ProductNo.853》1.2仪器电热恒温水浴锅(XMTB/H-3000上海仪表集团有限公司)；UniversalMicroplateReader(Elx國800，BIO-TEKINSTRUMENTSINC.);离心机(TGL-16B上海安亭科学仪器厂)。2.试验方法取人凝血酶1支，加入1.27ml水，混匀得100Unit/ml的溶液；另取TNHH原液用水稀释成1.0mg/ml后，取0.5ml加入0.1ml凝血酶溶液(50个单位的凝血酶)，于37t:反应2hr，离心收集上清液，用稀释液(IMUBINDHirudinELISAKit说明书中所述的稀释液)稀释10倍后，按4倍梯度稀释6次后按照IMUBINDHirudinELISAKit使用说明书上方法进行检测，结果于450nm波长处测定其吸收值。3试验结果与结论样品均不显色，水蛭素阳性标记品(试剂盒自带)呈线性关系。说明TNHH与凝血酶体外作用是不可逆的。HirudinELISAKit是特异与水蛭素C肽结合并测定其浓度的ELISA试剂盒(见说明书附件)，本试剂盒可最低检测出0.1ng/ml的水蛭素C肽。根据Angiomax(二价水蛭素)的资料其含D-FPRP-4xGly-Himgen的结构中PG之间肽键可被凝血酶水解，释放出含Himgen(水蛭原)的C端肽段。通过以上实验证明，本品TNHH中的"FPRP-GSGG-水蛭原"结构不能被凝血酶酶解，两者结合具有不可逆性。实施例13体外抗血小板凝集试验1试验材料1.1药物TNHH(6.0mg/ml)人凝血酶(127Unit/支)，批号20021105，中国药品生物制品检定所。甘露醇注射液(20%甘露醇)，北京双鹤药业。重组水蛭素(1.0mg/支)，批号20050301，-20°<:保存，富进生物医药有限公司。1.2动物健康雄性日本大耳白家兔，体重2.32土0.21kg，由第三军医大学试验动物中心提供。1.3仪器血小板凝集仪，BS634型，北京生化仪器厂。2.试验方法给药前穿刺耳中动脉测定血小板聚集率，根据血小板聚集率水平及体重将兔子随机分为5组(每组4只)；①阴性对照组(5.12mg甘露醇/kg)，②TNHH高剂量组(4.0mg/kg)，③TNHH中剂量组(2.0mg/kg)，TNHH小剂量组(1.0mg/kg),⑤阳性对照组(0.1mg重组水蛭素/kg)。各组家兔均按所述剂量经耳缘静脉注射给药一次，给药后15min(秒表准确计时)，穿刺耳中动脉取血，测定血小板聚集率。血小板聚集率测定方法用硅化注射器穿刺耳中动脉取血，3.8%枸橼酸钠溶液抗凝(血抗凝剂=9:1)，200xg离心8分钟，取上清即为富血小板血浆(PRP)，剩余部分2200xg离心10分钟，取上清即为贫血小板血浆(PPP)。PRP中血小板计数为4.0xl()S/mm3左右。按照Born氏比浊法，将盛有200plPRP及1小磁棒的比浊管置于血小板聚集仪中，37。C保温lmin，经PPP标定后，在搅拌情况下加入诱导剂人凝血酶(0.76IU/ml)诱导聚集。根据仪器自动打印出来的聚集曲线及最大聚集率分析药物对血小板聚集的影响。最大聚集率计算公式如下聚集后PRP透光度一聚集前PRP透光度inne/PPP透光度一聚集前PRP透过度3.试验结果表8TNHH对家兔血小板聚集率的影响聚集率(％，F±SD)组别剂量(mg/kg)兔数(只)药前药后15min差值甘露醇/4高剂量4.04中剂量2.04小剂量1.04水蛭素0.1458.13±9.6160.51±9.182.38±7.0459.23±6.309.22±4.5150.92±4.33*59.62±7.2219.33±10.2530.30±9.92*57.19±4.4236.27士12.1320.82±7.98*58.44±4.424.34±6.8854.09±8.69**与对照组(甘露醇)比较尸<0.01由测定结果可见，当凝血酶诱导家兔血小板聚集时，给药前各组间血小板聚集率无明显差异，给药后15min，各给药组和阳性对照组水蛭素的血小板聚集率均显著低于阴性对照组(PO.01)，且量效关系明显。4.结论上述结果表明经兔耳缘静脉注射给药一次，药后15mhi，TNHH三个剂量均显著降低凝血酶诱导的家兔血小板聚集率(尸O.Ol)。提示TNHH具有抑制血小板聚集的作用，但明显低于阳性药物水蛭素的抑制血小板聚集作用。实施例14抑制人外周血白细胞释放11202试验l.试验材料1.1人外周血白细胞的制备取健康人静脉血lOml，肝素钠抗凝全血，加入10mlHASBuffer(含RPMI1640+10mMHEPES+1.2mMCaCl2+1.0mMMgCl2+1%HAS，pH7.4)混匀。取白细胞分离液(上海生工)到无菌离心管中，然后缓慢加入等体积的全血混合液，2000rpm离心15分钟。取交界处白细胞液，加入适量1640培养液，于无菌离心管离心10分钟，洗涤2次。弃去上清，加入适量HASBuffer,重悬沉淀制成白细胞悬液，计数细胞密度，调整细胞密度为4xl0"ml，37。C分离后一个小时内使用。1.2药物和试剂TNHH(1.0mg/ml，抗白细胞粘附效价720单位/ml)，辣根过氧化氢酶(100单位/mg)，上海生工。FMLP(5mg/支，F3506)，Sigma公司。11202来源于重庆东试化工公司。释放分析缓冲液含25mM葡萄糖，10%胎牛血清，200mg/ml酚红，32mg/ml辣根过氧化氢酶的Hank's液。1.3仪器UniversalMicroplateReader(Elx-800，BIO-TEKINSTRUMENTSINC.);离心机(TGL-16B上海安亭科学仪器厂)。2.试验方法取24孔细胞培养板，用含50%胎牛血清的Hank's液包被细胞培养板，37"C培养60min，再用0.15MNaCl洗板两次。用释放分析缓冲液稀释细胞至6.0xl06/ml，加细胞，37。C培养5min。加入FMLP至终浓度250nM。加入不同浓度TNHH供试品，37。C培养60min。吸取细胞悬浮液8000xg离心3min取上清，复孔加入96孔酶标板后每也加入1NNaOH(25终止反应，置610nm波长读数。同时取标准11202的溶液做对照，计算TNHH抑制白细胞释放H202的IC5()值。3.试验结果(见表9):表9抑制人外周血白细胞释放11202试验TNHH浓度(吗/ml)_平均OD值_抑制率(％)1000.12181.99500.13579.91250.25961.4512.50.31750.826.250.40240.173.1250.51922.761.5620.6286.550.7810.681-1.3对照0.672&02抑制率-(对照OD值-样品OD值)/对照OD值xiooy。4.结论表9表明TNHH抑制人外周血白细胞释放H2O2的IC50为8.5ng/ml。提示TNHH具有抑制人外周血白细胞释放H202的作用，与对照组相比，抑制率为70%左右。表明本品除可抑制白细胞粘附作用外，尚可抑制外周血白细胞的活化功能。实施例15体外抗全血凝固试验1.试验材料1.1药物TNHH;肝素钠，上海生工；磷酸盐缓冲液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)。1.2动物一只健康大耳白色家兔，体重2.49kg。1.3仪器兔子固定箱l个，10ml注射器2支，试管架1个，试管6支，lml移液枪及枪头。2.试验方法及结果2.1样品稀释将TNHH用磷酸盐缓冲液(10mmol/LPB，0.15mol/LNaCl，pH7.4)分别稀释为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml。肝素钠用相同缓冲液配制成1mg/ml。2.2试验方法取新鲜家兔耳缘静脉血，迅速加lml于0-5号试管中，将己稀释好的不同浓度的TNHH样品分别加0.2ml于l-4号试管中，0号试管中加入0.2ml磷酸盐缓冲液为阴性对照管，5号试管中加入0.2ml肝素钠(1mg/ml)为阳性对照管。迅速混匀后于室温放置15分钟，观察其结果。3.结果(表10)表10TNHH体外抗血液凝固试验<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>4.结论磷酸盐缓冲液作为阴性对照(血液凝固)，肝素钠作为阳性对照(血液未凝固)，不同浓度的TNHH(血液凝固)。上述结果表明TNHH在体外无抗全血凝固作用。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。权利要求1.重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其具有如下结构Met-白细胞抑制因子-交联区1-FPRP-交联区2-水蛭原。2.根据权利要求1所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中交联区1为5~15的甘氨酸；交联区2为(GSGG)n，n为1~3。3.根据权利要求1所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中FPRP中的F为L型。4.根据权利要求3所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白，其中交联区1为5个甘氨酸，交联区2为GSGG。5.权利要求1至4任一所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的cDNA序列。6.根据权利要求5所述的cDNA序列，其特征在于该序列为SEQID.2。7.包含权利要求5或6中所述cDNA的表达载体。8.根据权利要求7所述的表达载体，其中所述表达载体为pET-3c。9.包含权利要求7或8所述的表达载体的微生物。10.根据权利要求9所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌。11.一种药物组合物，其包括一种权利要求1至5任一所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白。12.根据权利要求ll所述的组合物，其中所述组合物为注射剂型。13.权利要求1至5任一所述的重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白在制备治疗心脑血管疾病的药物中的应用。14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述心脑血管疾病为脑卒中。全文摘要本发明涉及一种重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白(TNHH)、其cDNA基因、含有该cDNA基因的重组载体、用该载体转化的微生物、以及含有该重组白细胞抑制因子和水蛭原嵌合蛋白的药物组合物。文档编号A61P9/00GK101245110SQ20071008413公开日2008年8月20日申请日期2007年2月16日优先权日2007年2月16日发明者开范,赵志全申请人:鲁南制药集团股份有限公司;重庆富进生物医药有限公司