专利名称：：用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗。
背景技术：
：至今结核病仍然是全球感染性疾病的第一"杀手"，主要原因是卡介苗不能有效地预防成人肺结核，结核菌耐药问题越来越严重，艾滋病、移民和贫困等社会问题使得结核病在一些发达国家开始回升。世界卫生组织(WHO)报告全球现有结核病人2000万，每年新增结核病人800—1000万，每年200—300万人死于结核病。我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调査结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌，现有肺结核病人451万，每年死亡人数约13万，位于全国各种传染病之首。耐药结核病人多，结核分枝杆菌总耐药率为27.8%，其中初始耐药率为18.6%，获得性耐药率为46.5%，耐多药率为10.7%。结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性传染病，合理、规律的化疗一般在12个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗34个月，甚至更长时间。由于耐多药结核病的流行、化疗药物的毒副作用，以及人类免疫缺陷病毒的感染、免疫抑制剂的使用和老年性结核病等原因引起的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战，尤其是耐多药结核病(MDR—TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)面临无药可治的困难局面，使我国的结核病疫情的控制并不十分理想，结核病人数、发病人数、死亡人数均位于全国各种传染病之首。因此，研制新的抗结核制剂势在必行。由于研制新的抗结核药物，不仅投入大，周期长，比新的治疗性疫苗的研制更困难，而且新药也可能很快产生耐药性。而疫苗治疗在几个月中只注射几针，远比每天服药方便，且副作用较少，费用低。因此，近年来通过免疫调节治疗结核病成为研究的热点之一，治疗性疫苗的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。治疗性疫苗的应用对象与预防性疫苗不同，前者用于结核菌感染者或结核病患者，而后者用于正常人群。有效的预防性疫苗并不一定能用作治疗性疫苗，如研究证明卡介苗用于治疗效果不理想。抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，疫苗治疗可以通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的潜力，来达到治疗疾病的目的。目前用于结核病辅助治疗的免疫调节剂主要有二类一类是非特异性的细胞因子如ifn-y、il-2等，半衰期短，需反复注射，费用高。另一类是特异性的免疫调节剂(1)母牛分枝杆菌菌苗(商品名微卡菌苗)由安徽龙科马生物制药有限公司生产，是母牛分枝杆菌经高温灭活纯化后制成的无细胞免疫调节剂，其活性成分以细胞壁为主，还有以蛋白质为主的细胞因子诱导物质，及具有较强免疫活性的dna聚合体。ii、iii期临床研究结果表明微卡菌苗能增强肺结核患者的细胞免疫功能，与化疗联用能加快痰菌阴转、病灶吸收及空洞縮小关闭的速度，縮短短程化疗疗程。其不良反应少且较轻微，使用安全，复发率低。目前该菌苗已在临床应用，作为肺结核的免疫治疗和短程化疗的辅助治疗。(2)草分枝杆菌制剂(商品名乌体林斯utilin's):由成都金星健康药业有限公司研制，是灭活的草分枝杆菌制成的免疫调节剂，可显著提高肺结核患者的细胞免疫功能，促进肺结核病灶的吸收好转。(3)卡介苗多糖核酸注射液(商品名斯奇康)由长沙九芝堂生产，是采用热酚法去掉了卡介苗菌体可诱导迟发型超敏反应的菌体蛋白质，再用乙醇沉淀提取免疫活性较强的菌体脂多糖成分，然后制成灭菌生理盐水溶液，可增强肺结核患者的细胞免疫和体液免疫功能，显著增强机体内t淋巴细胞和自然杀伤细胞功能，提高il-2、il-2受体的表达和ifn-y的诱生水平，促进细菌阴转和结核病灶的吸收好转，提高了联合化疗的疗效。这三种疫苗都是死疫苗，只能诱导体液免疫和Thl型细胞免疫应答，不能诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(ctl)应答。目前国内外尚未见应用核酸疫苗治疗耐药结核病的研究报道。如何应用核酸疫苗治疗耐药结核病就成为该
技术领域：
急需要解决的技术难题。
发明内容本发明的目的是提供一种用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗。本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗，其特征在于所述的耐药结核病的结核杆菌基因疫苗为将结核分枝杆菌Ag85A编码基因序列克隆到真核表达载体pVAXl上；或Ag85A和ESAT6编码基因序列一起克隆到真核表达载体pVAXl上，形成ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗。本发明的上述制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗的应用步骤如下一、Ag85A核酸疫苗的制备(一)基因序列所述的用于治疗耐药结核病的结核杆菌Ag85A核酸疫苗的基因序列如下1TTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGT61GACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC121GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG181TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC241ACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTC301CTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGC361GCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCC421CAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGT481CCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGAOVTGTGG541GGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTG601ATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGT661GGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTC721CAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGT781ACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGA(XTGCAACGG841GCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCTAG所述的用于治疗耐药结核病的结核杆菌ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗中的Ag85A的基因序列同上，ESAT6的基因序列如下1ATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGT61AATGTCACCTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCA121GCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCC皿ACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGT241CAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG(二)通过基因工程技术克隆Ag85A基因1、引物设计与合成上游弓I物15,-GACTGCTAGCCACCATGGTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGG-3'下游引物25，-GACTGGATCCTTACTAGGCGCCCTGGGGCGCGG-3，引物l位于Ag85A基因序列第2—22位碱基，其5'端含有一个NheI(GCTAGC)酶切位点;引物2位于Ag85A基因序列第869—885位碱基，其5'端含有一个BamHI(GGATCC)酶切位点。2、PCR扩增Ag85A基因用引物l、2，在高保真pfuDNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增Ag85A基因。PCR反应程序94°Clmin,68°Clmin，72°C1min，循环30次；最后72。C延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定923bp的扩增DNA片段；3、Ag85A基因扩增片段的酶切和回收取结核杆菌Ag85A基因扩增片段和真核表达载体pVAXl质粒(购自Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)各1微克，分别加入10单位的限制性内切酶NheI和BamHI，混合于50微升的反应缓冲液中，于37r消化l小时，经常规琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译"分子克隆实验指南"，第三版，387—399页，404~407页，2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的Ag85A基因片段和pVAXl质粒片段。4、Ag85A基因片段与pVAXl质粒片段连接将纯化后Ag85A基因片段与克隆载体pVAXl质粒片段连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下2x连接缓冲液5plpVAXl质粒片段1^1Ag85A基因片段T4DNA连接酶lpl无菌水补至10pi5.大肠杆菌DHl或DH5a感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5a(或DH1)单菌落接种于5mlLB培养液中，置37'C振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100mlLB培养液中，置37°C振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度0060()为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4。C、4000rpm、离心10min，弃上清液；20ml冰预冷的O.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，冰浴30min;于4。C、6000rpm、离心10min，弃上清液；用4mlO.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，置4。C冰箱放置过夜；次晨加入lml无菌甘油，吹打混合均匀，每100pl分装于一个1.5ml的离心管中，置-7(TC保存备用；6.连接产物的转化将Ag85A基因片段与pVAXl质粒片段的连接产物各5pl分别加入含有100pl大肠杆菌DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400nl，37。C恒温摇床培养1h;加入X-Gal60^1，IPTG4pl，混匀，取出200—400pl涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37"C恒温培养箱培育14h;7.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落8个，分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，37'C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒；'(1)质粒小量提取试剂的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.CL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在IOlbf/in2(6.895xl04Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4。C备用；溶液Ih0.2mmol/LNaOH，1%SDS临用前配制溶液III:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml去离子水28.5mlje存于4t:，备用；(2)小量提取质粒分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12，000rpm离心1min，弃上清液；细菌沉淀重悬于200pi溶液I中，冰浴10min;加400pl新配制的溶液II，冰浴5min;加300nl溶液m，冰浴10min;于4°C12，000rpm离心10min;上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-2(TC放置2h沉淀DNA;于4°C12,000rpm离心10min，弃上清液；用lml70%乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20plTE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20ng/ml，于37"C水浴30min，消化RNA;取2^1进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置一2(TC储存备用；8.鉴定重组质粒(1)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，以引物l、2进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为pVAXl-Ag85A;(2)酶切鉴定取重组质粒5pl，分别用限制性内切酶NdeI、BamHI双酶切2h;于1%琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后产生两个片段，一个与载体片断大小一致，一个与该基因扩增片断一致；(3)序列测定直接挑选一个克隆送测序，测序结果与报道的基因组序列一致。从而获得了Ag85A核酸疫苗。(三)通过基因工程技术克隆ESAT6—Ag85A嵌合基因1、引物设计与合成上游弓I物35，-GACTGGTACCTAATGGCAGAGCAGCAGTGG-3，下游引物45，-GACTGGTACCTTGCGAACATCCCAGTGAC-3，引物3位于ESAT6基因序列第1—18位碱基，其5'端含有一个KpnI(GGTACC)酶切位点；引物4位于ESAT6基因序列第268—285位碱基，其5'端也含有一个KpnI酶切位点。2、PCR扩增ESAT6基因用引物3、4，在高保真pfuDNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增ESAT6基因。PCR反应程序94°Clmin，55°Clmin，72°C1min，循环30次；最后72"C延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定308bp的扩增DNA片段；3、Ag85A和ESAT6基因扩增片段的酶切和回收取重组质粒pVAXl-Ag85A和结核杆菌ESAT6基因扩增片段，分别加入限制性内切酶KpnI，混合于50微升的反应缓冲液中，于37'C消化1小时，经常规琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译"分子克隆实验指南"，第三版，387—399页，404407页，2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段。4、pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段连接将纯化后pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段连接，使ESAT6基因序列插入到Ag85A基因序列的249位KpnI酶切位点上，10ul反应体系如下2x连接缓冲液5^1ESAT6基因片段1^1pVAXl-Ag85A基因片段1^1T4DNA连接酶lpl无菌水补至10^5.大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5a单菌落接种于5mlLB培养液中，置37"C振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100mlLB培养液中，置37'C振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度006()()为0.60.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4。C、4000rpm、离心10min，弃上清液；20ml冰预冷的0.1mol/LCaC12重悬菌沉淀，冰浴30min;于4°C、6000rpm、离心10min，弃上清液；用4ml0.1mol/LCaC12重悬菌沉淀，置4'C冰箱放置过夜；次晨加入lml无菌甘油，吹打混合均匀，每100^1分装于一个1.5ml的离心管中，置-7(TC保存备用；6.连接产物的转化将pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段的连接产物各5pl分别加入含有lOOpl大肠杆菌DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400nl，37"C恒温摇床培养1h;加入X-Gal60iul，IPTG4pl，混匀，取出200—40(^1涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37'C恒温培养箱培育14h;7.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，37'C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒；(1)质粒小量提取试剂的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.CL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4°C备用；溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS临用前配制溶液III:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml去离子水28.5ml贮存于4t:，备用；(2)小量提取质粒分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清液；细菌沉淀重悬于200^溶液I中，冰浴10min;加400pl新配制的溶液II，冰浴5min;加300pl溶液m，冰浴10min;于4°C12,000rpm离心10min;上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20。C放置2h沉淀DNA;于4。C12，000rpm离心10min，弃上清液；用lml70。/。乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20plTE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20pg/ml，于37。C水浴30min，消化RNA;取2|11进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置—20'C储存备用；8.鉴定重组质粒(1)酶切鉴定取重组质粒分别用限制性内切酶NdeI、BamHI双酶切2h;于1Q/^琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准为对照，酶切后产生两个片段，一个为载体片断，一个为重组ESAT6-Ag85A基因片段；(2)序列测定直接挑选四个克隆送测序，选择出连接方向正确的重组质粒作为ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗。三、核酸疫苗的配制与贮存将得到的纯化的重组质粒溶解于生理盐水中，浓度为1mg/ml;或制备为冻干制剂贮存，用前溶解于生理盐水中。四、核酸疫苗的应用每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射结核杆菌核酸疫苗Ag85A基因疫苗或ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗50ug/50pl，合计每只小鼠每次肌肉注射100ixg/100y1，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2mm。本发明的有益效果本发明通过基因工程技术将结核分枝杆菌Ag85A编码基因序列或Ag85A和ESAT6编码基因序列一起克隆到真核表达载体pVAXl上，构建Ag85A基因疫苗或ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗作为耐药结核病治疗性疫苗。本发明首次应用Ag85A基因疫苗或ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗有效地治疗耐多药结核病，使结核病模型肺病理改变减轻，主要脏器细菌数明显减少，Ag85A基因疫苗组的疗效明显强于生理盐水组、pVAXl载体治疗组、利福平(RFP)治疗组、ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗组和微卡菌苗组，为耐药结核病开辟了一条新的治疗途径，对有效控制耐药结核病的传播和流行具有重要的意义。本发明DNA疫苗在细胞内生成内生性抗原，不仅能诱导体液免疫和Thl型细胞免疫应答，还能诱导特异性CTL应答，可特异地调节耐药结核病人的免疫功能，激活其免疫系统中蕴藏的潜力，提高对结核菌的特异免疫应答，消除免疫耐受，从而治疗细胞内感染的结核病。基因疫苗与目前常用的免疫调节剂相比，具有以下优点(1)基因疫苗生产简便、快速，避免了传统疫苗制备的繁琐过程。(2)基因疫苗能在体内长期稳定地表达，诱导免疫的持续时间显著长于常规免疫接种。(3)基因疫苗在宿主细胞内表达蛋白抗原的过程与自然感染相似，按正常途径加工、处理、修饰，并以天然构象呈递给宿主免疫系统，可同时诱导体液免疫和Thl型免疫，并能够诱导CTL免疫应答，但死疫苗如微卡菌苗只能诱导体液免疫和Thl型细胞应答，通常不能诱导CTL应答。(4)基因疫苗对热不敏感，可以冻干保存，在盐溶液中可恢复原有的活性，保存、运输方便，无需冷藏条件即可运输至世界各地，因而可广泛应用。(5)在几个月内注射几针基因疫苗，比每天给药的细胞因子方便而价廉;(6)副作用较少，使用较安全可靠。下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。图1是生理盐水组小鼠肺大体病理改变的照片。图2是pVAXl载体治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图3是利福平治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图4是微卡菌苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图5是RFP+Ag85A核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图6是Ag85A核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图7是RFP+Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图8是Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。图9是各治疗组小鼠肺组织病理改变的照片。具体实施方式实施例1用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗，其一为结核分枝杆菌Ag85A编码基因序列克隆到真核表达载体pVAXl上。(一)基因序列所述的用于治疗耐药结核病的结核杆菌Ag85A核酸疫苗的基因序列如下1TTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGT61GACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC121GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG182TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC242ACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTC301CTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGC361GCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCC421CAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGT481CCCACCCTCATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGG541GGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTG602ATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGT661GGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTC721CAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGT781ACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGG841GCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCTAG(二)通过基因工程技术克隆Ag85A基因1、引物设计与合成上游引物15，隱GACTGCTAGCCACCATGGTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGG-3，下游引物25，隱GACTGGATCCTTACTAGGCGCCCTGGGGCGCGG-3，引物l位于Ag85A基因序列第2—22位碱基，其5'端含有一个NheI(GCTAGC)酶切位点;引物2位于Ag85A基因序列第869—885位碱基，其5'端含有一个BamHI(GGATCC)酶切位点。2、PCR扩增Ag85A基因用引物l、2，在高保真pfbDNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增Ag85A基因。PCR反应程序94。Clmin，68°Clmin，72°C1min，循环30次；最后72。C延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定923bp的扩增DNA片段；3、Ag85A基因扩增片段的酶切和回收取结核杆菌Ag85A基因扩增片段和真核表达载体pVAXl质粒(购自Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)各1微克，分别加入10单位的限制性内切酶NheI和BamHI，混合于50微升的反应缓冲液中，于37t:消化l小时，经常规琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译"分子克隆实验指南"，第三版，387—399页，404^07页，2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的Ag85A基因片段和pVAXl质粒片13段。4、Ag85A基因片段与pVAXl质粒片段连接将纯化后Ag85A基因片段与克隆载体pVAXl质粒片段连接，目的基因片段与载体片断按摩尔比3:1混合，10ul反应体系如下2x连接缓冲液5^1pVAXl质粒片段Ag85A基因片段0.6plT4DNA连接酶lpl无菌水补至lOpl5.大肠杆菌DH1或DH5a感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5a(或DH1)单菌落接种于5mlLB培养液中，置37'C振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100mlLB培养液中，置37°C振荡培养箱中于200ipm继续培养2-3h，待菌浓度OD6oo为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4。C、4000rpm、离心10min，弃上清液；20ml冰预冷的O.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，冰浴30min;于4。C、6000rpm、离心10min，弃上清液；用4mlO.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，置4"C冰箱放置过夜；次晨加入lml无菌甘油，吹打混合均匀，每100pl分装于一个1.5ml的离心管中，置-7(TC保存备用；6.连接产物的转化将Ag85A基因片段与pVAXl质粒片段的连接产物各5^1分别加入含有lOOpl大肠杆菌DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h;放入42"C水浴箱热休克卯s，迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400pl，37。C恒温摇床培养1h;加入X-Gal60nl，IPTG4nl，混匀，取出200—400^1涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37。C恒温培养箱培育14h;7.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落8个，分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，37X:振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒；(1)质粒小量提取试剂的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-CL(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895xl04Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4°C备用；溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS临用前配制溶液III:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml去离子水28.5ml贮存于4'C，备用；(2)小量提取质粒分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清液；细菌沉淀重悬于200^il溶液I中，冰浴10min;加400pl新配制的溶液II，冰浴5min;加300|Lil溶液III，冰浴10min;于4°C12，000rpm离心10min;上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-2(TC放置2h沉淀DNA;于4。C12,000rpm离心10min，弃上清液；用lml70%乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20plTE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20ng/ml，于37"C水浴30min，消化RNA;取2pl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置一20'C储存备用；8.鉴定重组质粒(2)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，以引物l、2进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为pVAXl-Ag85A;(2)酶切鉴定取重组质粒5pl，分别用限制性内切酶NdeI、BamHI双酶切2h;于1%琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准及扩增产物为对照，酶切后产生两个片段，一个与载体片断大小一致，一个与该基因扩增片断一致；(3)序列测定直接挑选一个克隆送测序，测序结果与报道的基因组序列一致。从而获得了Ag85A核酸疫苗。9.核酸疫苗的配制与贮存将得到的纯化的重组质粒溶解于生理盐水中，浓度为lmg/ml;或制备为冻干制剂贮存，用前溶解于生理盐水中。实施例2用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗，其为结核分枝杆菌Ag85A和ESAT6编码基因序列克隆到真核表达载体pVAXl上，形成ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗。(一)基因序列所述的用于治疗耐药结核病的结核杆菌Ag85A核酸疫苗的基因序列如下1TTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGGAGTACCTGCAGGTGCCGTC^CCGTCGATGGGCCGT61GACATCAAGGTCCAATTCCAAAGTGGTGGTGCCAACTCGCCCGCCCTGTACCTGCTCGAC121GGCCTGCGCGCGCAGGACGACTTCAGCGGCTGGGACATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGG183TACGACCAGTCGGGCCTGTCGGTGGTCATGCCGGTGGGTGGCCAGTCAAGCTTCTACTCC243ACTGGTACCAGCCCGCCTGCGGCAAGGCCGGTTGCCAGACTTACAAGTGGGAGACCTTC301CTGACCAGCGAGCTGCCGGGGTGGCTGCAGGCCAACAGGCACGTCAAGCCCACCGGAAGC361GCCGTCGTCGGTCTTTCGATGGCTGCTTCTTCGGCGCTGACGCTGGCGATCTATCACCCC421CAGCAGTTCGTCTACGCGGGAGCGATGTCGGGCCTGTTGGACCCCTCCCAGGCGATGGGT481CCCACCCTGATCGGCCTGGCGATGGGTGACGCTGGCGGCTACAAGGCCTCCGACATGTGG541GGCCCGAAGGAGGACCCGGCGTGGCAGCGCAACGACCCGCTGTTGAACGTCGGGAAGCTG603ATCGCCAACAACACCCGCGTCTGGGTGTACTGCGGCAACGGCAAGCCGTCGGATCTGGGT661GGCAACAACCTGCCGGCCAAGTTCCTCGAGGGCTTCGTGCGGACCAGCAACATCAAGTTC721CAAGACGCCTACAACGCCGGTGGCGGCCACAACGGCGTGTTCGACTTCCCGGACAGCGGT781ACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCGCAGCTCAACGCTATGAAGCCCGACCTGCAACGG841GCACTGGGTGCCACGCCCAACACCGGGCCCGCGCCCCAGGGCGCCTAG所述的用于治疗耐药结核病的结核杆菌ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗中的Ag85A的基因序列同上，ESAT6的基因序列如下1ATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGT61AATGTCACCTCCATTCATTCCCTCCTTGAC121GCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCG181ACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAG241CAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCATACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTACTGGGATGTTCGCATAG(二)通过基因工程技术克隆ESAT6—Ag85A嵌合基因1、引物设计与合成上游引物35，-GACTGGTACCTAATGGCAGAGCAGCAGTGG-3，下游引物45，-GACTGGTACCTTGCGAACATCCCAGTGAC-3'引物3位于ESAT6基因序列第1一18位碱基，其5'端含有一个KpnI(GGTACC)酶切位点；引物4位于ESAT6基因序列第268—285位碱基，其5，端也含有一个KpnI酶切位点。2、PCR扩增ESAT6基因用引物3、4,在高保真pfuDNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增ESAT6基因。PCR反应程序94°Clmin，55°Clmin，72°Clmin，循环30次；最后72。C延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定308bp的扩增DNA片段；3、Ag85A和ESAT6基因扩增片段的酶切和回收取重组质粒pVAX1-Ag85A和结核杆菌ESAT6基因扩增片段，分别加入限制性内切酶KpnI，混合于50微升的反应缓冲液中，于37"C消化1小时，经常规琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按:r.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译"分子克隆实验指南"，第三版，387—399页，404—407页，2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段。4、pVAX1-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段连接将纯化后pVAX1-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段连接，使ESAT6基因序列插入到Ag85A基因序列的249位KpnI酶切位点上，10ul反应体系如下2X连接缓冲液ESAT6基因片段17pVAXl-Ag85A基因片段T4DNA连接酶无菌水补至10W5.大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备挑取大肠杆菌DH5a单菌落接种于5mlLB培养液中，置37。C振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100mlLB培养液中，置37"C振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD,为0.60.8时，放入用冰预冷的大离心管中，4°C、4000rpm、离心10min，弃上清液；20ml冰预冷的0.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，冰浴30min;于4。C、6000rpm、离心10min，弃上清液；用4ml0.lmol/LCaC12重悬菌沉淀，置4'C冰箱放置过夜；次晨加入lml无菌甘油，吹打混合均匀，每100W分装于一个1.5ml的离心管中，置-70'C保存备用；6.连接产物的转化将pVAXl-Ag85A基因片段和ESAT6基因片段的连接产物各分别加入含有lO(mi大肠杆菌DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h;放入42'C水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400W，37。C恒温摇床培养1h;加入X-Gal60W，IPTG4W，混匀，取出200—400W涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37X:恒温培养箱培育14h;7.质粒的提取根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有卡那霉素的LB培养基中，37'C振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒；(1)质粒小量提取试剂的配制溶液I:50mmol/L葡萄糖25画1/LTrisCL(pH8.0)10mraol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895X1(TPa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4t:备用；溶液II:0.2mmol/LNaOH，1%SDS临用前配制溶液III:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ral去离子水28.5ml贮存于4'C，备用；(2)小量提取质粒分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12，000rpm离心1min，弃上清液；细菌沉淀重悬于200W溶液I中，冰浴10min;加400W新配制的溶液II，冰浴5min;加300W溶液III，冰浴10min;于4°C12，OOOrpm离心10min;上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-2(TC放置2h沉淀DNA;于4。C12，OOOrpm离心10min，弃上清液；用lral70%乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20[xg/ml，于37'C水浴30min,消化RNA;取2^1进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置一20'C储存备用；8.鉴定重组质粒(1)酶切鉴定取重组质粒分别用限制性内切酶NdeI、BamHI双酶切2h;于1%琼脂糖凝胶中电泳。以DNA分子量标准为对照，酶切后产生两个片段，一个为载体片断，一个为重组ESAT6-Ag85A基因片段；(2)序列测定直接挑选四个克隆送测序，选择出连接方向正确的重组质粒作为ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗。9.核酸疫苗的配制与贮存将得到的纯化的重组质粒溶解于生理盐水中，浓度为lmg/ml;或制备为冻干制剂贮存，用前溶解于生理盐水中。应用实施例11、感染菌株的选择与菌量按《结核病诊断细菌学检验规程》进行分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。耐INH标准10pg/ml和lpg/ml分别为高、低度耐药；耐RFP标准250|ig/ml和50吗/ml分别为高、低度耐药。1例结核病人痰标本经传统的分枝杆菌培养阳性，进行传统的菌种鉴定为结核分枝杆菌，将其编号为结核分枝杆菌临床分离株HB361。应用传统的药敏试验方法鉴定结核分枝杆菌临床分离株HB361为高耐利福平、.低耐异烟肼的耐多药株(见表l)。表1药物敏感试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>改良罗氏鸡卵培养基上生长良好的结核分枝杆菌临床分离株HB361用玻璃研磨器研磨成菌悬液，用生理盐水配制3mg/ml的菌悬液后，再进行10倍系列稀释，将10—'、10—2、10—3、10—4菌液各取0.1ml接种于2支改良罗氏鸡卵平皿培养基，于37t培养4周。攻击用的HB361菌悬液每毫升含有5.5xl(fCFU，每只小鼠尾静脉注射O.4ml，每只小鼠实际攻击菌量为2.2xl()5CFU(见表2)。表2结核分枝杆菌临床分离株HB361菌悬液菌落计数结果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2、动物选择:从军事医学科学院购进有合格证的体重为17-19g的6-8周龄雌性Balb/c小鼠105只，同批试验体重差异不超过2g，放动物实验室喂养l天。3、感染途径每只小鼠尾静脉注射0.4ml菌悬液感染小鼠。4、实验分组将小鼠称重后，随机均匀地分为8组，每组10只。感染后第3天开始治疗。(1)生理盐水组每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射生理盐水50)il，每次肌肉注射生理盐水100u1，每15天注射1次，共5次。(2)pVAXl载体治疗组每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射pVAXl载体质粒DNA50ug/50pl，每只小鼠每次肌肉注射pVAXl载体质粒DNAlOOug/100u1，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2mm。(3)利福平(RFP)治疗组规格100粒/瓶，0.15g/粒，批号0611071，厂家沈阳红旗制药有限公司。按每天每公斤体重20mg(0.02mg/g)给药，小鼠按20克计算，每只小鼠0.4mg。取利福平胶囊l粒，倒出药粉，加水187.5ml溶解，利福平浓度为0.8mg/ml。感染后第3天起每只小鼠每天喂利福平一次，每次0.5ml。(4)微卡菌茵治疗组成人22.5ug/ml/60kg，即0.000375ug/g，小鼠每只按20g计算注射0.0075ug的微卡。方法取22.5ug/支微卡l支，加10ml灭菌注射用水，混匀，浓度为2.25ug/ml，再取lml稀释好的微卡，加9ml无菌注射用水，浓度为0.225ug/ml，再取lml0.225ug/ml的微卡，加2ml无菌注射用水，浓度为0.075ug/ml，每次肌肉注射微卡0.0075ug(5)RFP+Ag85A核酸疫苗治疗组利福平的治疗同(3)。感染后第3天起每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射Ag85A核酸疫苗50iig/50pl，每只小鼠每次肌肉注射Ag85A核酸疫苗100ixg/100u1，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2隱。(6)Ag85A核酸疫苗治疗组感染后第3天起每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射Ag85A核酸疫苗50"g/50nl，每只小鼠每次肌肉注射Ag85A核酸疫苗100ug/100ul，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2mm。(7)RFP+Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组利福平的治疗同(3)。感染后第3天起每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗50ug/5(^l，每只小鼠每次肌肉注射Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗100Ug/100ul，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2mm。(8)Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组感染后第3天起每只小鼠双侧胫前肌缓慢注射Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗50ug/50nl，每只小鼠每次肌肉注射Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗lOOng/100u1，每15天注射1次，共5次。疫苗肌肉注射的深度为2mm。5、观察指标(1)小鼠体重变化治疗前称体重1次，治疗后每周称体重1次；(2)记录小鼠死亡数、计算死亡率；(3)肺、肝、脾大体病理观察；(4)肺、肝、脾重量指数小鼠肺、肝、脾重量分别除以小鼠体重；(5)肺和脾的活菌计数小鼠称重后，用拉颈断髓法处死小鼠，观察肺、肝和脾大体病理，取左肺、右肺、肝、上脾和下脾称重。取左肺和上脾分别各加3ml和2ml生理盐水，用组织研磨器研磨成组织悬液，肺取lml悬液加lml6。/。NaOH消化30min摇匀，用生理盐水系列稀释成10—'、10—2、10-3、l(T菌悬液,将10—2、10-3、l(T菌悬液O.lml接种于改良罗氏培养基上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37。C培养4周；脾不用消化，用生理盐水系列稀释成10—1、10—2、10—'、10—4菌悬液，将菌悬液10—2、10—'、10—4菌悬液0.lml接种于含两性霉素B的改良罗氏培养基上，每个稀释度接种2个培养基，涂抹均匀，于37T:培养4周。6、结果基因疫苗用于治疗小鼠耐多药结核病模型的效果观察1.小鼠体重变化小鼠在结核分枝杆菌攻击后，各组小鼠体重缓慢增长，无显著差异。2.各组小鼠死亡情况利福平治疗组在杀鼠前死亡1只，其余各组均未见小鼠死亡。3.停止治疗后3周杀鼠肉眼观察肺、肝、脾大体病理改变(表3，图l):如图1所示，是生理盐水组小鼠肺大体病理改变的照片。由图l(应用松下Panasonic720万像素的数码像机拍摄，光学变焦3.6，距离15厘米；图2-图8同。)可以看出，生理盐水组中，3只小鼠肺呈轻中度肿大，其余均为肺萎縮；2只小鼠全肺未见结节性病变，3只小鼠肺部可见10-20个结节性病灶，5只小鼠肺部可见40多个结节性病灶；2只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，8只可见轻、中、重度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达43%。肝未见明显异常。脾轻、中度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。l只小鼠出现大量腹水。如图2所示，是pVAXl载体治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图2可知l只小鼠肺呈轻中度肿大，其余均为肺萎縮；小鼠肺部均可见10-40多个结节性病灶8只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，2只可见轻、中度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达37.5%。肝未见明显异常。脾轻、中度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。如图3所示，是利福平治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图3可以看出，利福平治疗组中，2只小鼠肺呈轻中度肿大，其余均为肺萎缩；小鼠肺部均可见10-40多个结节性病灶；2只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，7只可见轻、中度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达21%。肝未见明显异常。脾轻、中、重度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。如图4所示，是微卡菌苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图4可以看出，微卡菌苗治疗组中，2只小鼠肺呈轻度肿大，其余均为肺萎縮；7只小鼠肺部可见10多个结节性病灶，3只小鼠肺部可见40多个结节性病灶；4只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，5只可见轻度的干酪样坏死，1只可见重度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达31%。肝未见明显异常。脾轻、中度肿大。肺门淋巴结轻(30%)、中度(70%)肿大。如图5所示，是RFP+Ag85A核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图5可以看出，利福平加Ag85A核酸疫苗治疗组中，2只小鼠肺呈轻中度肿大，其余均为肺萎縮；2只小鼠肺部可见10多个结节性病灶，8只小鼠肺部可见40多个结节性病灶；7只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，3只可见轻、中度的千酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达23%。肝未见明显异常。脾轻、中度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。如图6所示，是Ag85A核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图6可知，Ag85A核酸疫苗治疗组中，2只小鼠肺呈轻度肿大，其余均为肺萎縮；2只小鼠肺部可见10多个结节性病灶，8只小鼠肺部可见40多个结节性病灶；8只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，2只可见轻、中度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达20%。肝未见明显异常。脾轻、中度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。如图7所示，是RFP+Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图7可知，利福平加Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组中，小鼠肺均萎縮；小鼠肺部均可见10-40多个结节性病灶；7只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，3只可见轻度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达15%。肝未见明显异常。脾轻、中、重度肿大。肺门淋巴结轻、中度肿大。如图8所示，是Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组小鼠肺大体病理改变的照片。由图8可知，Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组中，3只小鼠肺呈轻中度肿大，其余均为肺萎縮；4只小鼠肺部可见10多个结节性病灶，6只小鼠肺部可见40多个结节性病灶；7只小鼠肺部未见干酪样坏死灶，3只可见轻度的干酪样坏死，平均每只小鼠肺部干酪样坏死面积达16.7%。肝未见明显异常。脾轻、中、重度肿大。肺门淋巴结中度肿大。3.脏器重量指数各组脏器重量指数与对照组的差别不显著，没有意义(见表3)。4.肺组织病理学检查肺组织用10%的多聚甲醛固定后包埋在石蜡中切片。组织切片用苏木精和曙红试剂染色，在光学显微镜(4倍放大)下观察分析结果，见图9。5.由图9可以看出，生理盐水组、pVAXl载体治疗组肺组织病变广泛，未见或少见增殖性结节；利福平治疗组、利福平加Ag85A核酸疫苗治疗组、Ag85A核酸疫苗治疗组、利福平加Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组、Ag85A/ESAT-6嵌合基因核酸疫苗治疗组、微卡治疗组肺组织病变较轻，病变范围局限，可见较多的结核结节，主要呈增殖性改变。6.肺和脾的活菌计数Ag85A基因疫苗组、RFP+Ag85A基因疫苗组、ESAT6-Ag85A嵌合基因疫苗组、RFP+ESAT6-Ag85A嵌合基因疫苗组和微卡菌苗组肺脾菌落计数均比生理盐水组、pVAXl载体治疗组、利福平(RFP)治疗组减少2-5倍；其中Ag85A基因疫苗组和RFP+Ag85A基因疫苗组的疗效明显强于ESAT6-Ag85A嵌合基因疫苗组、RFP+ESAT6-Ag85A嵌合基因疫苗组和微卡菌苗组(见表3)。实验结论基因疫苗对小鼠耐药结核病具有治疗作用，Ag85A基因疫苗的治疗作用最显著。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>序列表〈110〉中国人民解放军第三O九医院上海海规生物科技有限公司〈120〉用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗〈130〉〈160〉6〈170>Patentlnversion3.1<210〉1〈211>887〈212〉■〈213>结核分枝杆菌Ag85A〈400〉1Uttcccggccgggcttgccggtggagtacctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggccgt60gacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcgcccgccctgtacctgctcgac120ggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctggg3C3tC3acaccccggcgttcgsgtgg180tacgaccagtcgggcctgtcggtggtcatgccggtgggtggccagtcaagcttctactcc240actggtaccagcccgcctgcggcaaggccggttgccagacttacaagtgggagaccttcc300tgaccagcgagctgccggggtggCtgC3ggccaacaggcacgtcaagcccaccggaagcg360ccgtcgtcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatctatcaccccc420agcagttcgtctacgcgggagcgstgtcgggcctgttggacccctcccaggcgatgggtc480ccaccctgatcggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctccgacatgtggg540gcccg犯ggaggacccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtcgggaagctga600tcgccaaca3cacccgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcggatctgggtg660gcaacaacctgccggccaagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaacatcaagttcc720aagacgcctacaacgccggtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccggacagcggta780cgcacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgacctgcaacggg840cactgggtgcC3CgCCC￡l3Caccgggcccgcgccccagggcgcctag887〈210〉2〈211>288〈212〉腿<213>结核杆菌ESAT6<400〉23tggC,gCagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccagggt60aatgtcacctccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgca120gcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgcc180acggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggt240C郷C33tggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag288〈210〉3〈211〉39〈212〉腿〈213〉人工合成〈400〉3gactgctagccaccatggtttcccggccgggcttgccgg39〈210〉4〈211〉33〈212>腿〈213>人工合成〈400〉4gactggatccUact鄉cgccctggggcgcgg33〈210〉5〈211〉30〈212>匿〈213〉人工合成〈400〉5gactggtacctaatggcagagcagcagtgg30〈210>6〈211〉29〈212〉■〈213>人工合成<400〉6gactggtaccttgcgaacatcccagtgac29权利要求1、用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗，其特征在于所述的耐药结核病的结核杆菌基因疫苗为将结核分枝杆菌Ag85A编码基因序列克隆到真核表达载体pVAX1上；或Ag85A和ESAT6编码基因序列一起克隆到真核表达载体pVAX1上，形成ESAT6—Ag85A嵌合基因疫苗。全文摘要本发明涉及用于制备治疗耐药结核病的结核杆菌基因疫苗，其特征在于所述的耐药结核病的结核杆菌基因疫苗为将结核分枝杆菌Ag85A编码基因序列克隆到真核表达载体pVAX1上；或Ag85A和ESAT6编码基因序列一起克隆到真核表达载体pVAX1上，形成ESAT6-Ag85A嵌合基因疫苗。单独免疫或联合化疗可明显减轻耐药结核病小鼠肺部病理改变，明显减少小鼠肺、脾细菌数。文档编号A61K39/04GK101376025SQ20071012103公开日2009年3月4日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者琦余,刘庆良,史迎昌,吴雪琼,张俊仙,琰朱,宁李,李忠明,艳梁,兰王,阳幼荣申请人:中国人民解放军总医院第二附属医院;上海海规生物科技有限公司