专利名称：：一种抗人乳头瘤病毒感染的药物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及e-榄香烯在治疗和/或预防人乳头瘤病毒感染的疾病中的应用。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(HPV，HumanPapillomaVirus)是人类肿瘤病毒病因中最为重要的一类病毒，为乳头瘤空泡病毒科A属成员，具有72个病毒壳微粒组成的无包膜、对称性的20面立体衣壳，含有7900个碱基对的双链环状DNA。研究表明，由于人乳头瘤病毒的唯一宿主是人，因而无法在体外和动物模型细胞中进行培养的扩增，这使对治疗HPV感染的药物研究受到极大限制，造成目前在治疗这类病症方面尚无一种疗效满意、可靠的特异性抗HPV药物。高危的HPV易引起恶性肿瘤，而且与宫颈癌、阴茎癌、食道癌、口腔癌及皮肤癌等病密切相关，特别是HPV-16、18型等高危型，目前研究结果显示，HPV16与宫颈鳞癌关系最为密切，而HPV18最易导致宫颈腺癌(石敏等，国外医学，妇产科学分册，1997，24(5):284)。近年有研究表明，HPV16、18型，尤其是HPV16型与子宫颈癌的发生有密切关系，在宫颈癌中的检出率高达90%(陈丽萍等，中国实用妇科与产科杂志，2000，Vol.l6，No.3P.166);在乳腺癌中，HPV18、16有较高的感染率(达70.6%)，其中HPV18的感染略高于HPV16，在良性乳腺病变中也较高，因此它可能与乳腺的良恶性病变均有关(周晓燕等，临床与实验病理学杂志，2002Aug:18(4):374-377);在膀胱移行细胞组织中HPV16与18型的阳性率为33.3%与6.7%，在膀胱癌组织中HPV16、18的阳性在肿瘤病理分级中差异有极显著性，主要表现为HPV感染与P53突变有关，在HPV阳性组中，以HPV16组的P53阳性率最高达92%,其实为HPV18(陈廷等，中华实验和临床病毒学杂志，2004年，4(14));现代医学研究已发现，HPV的致癌性主要与其E6及E7基因有关，E6，E7蛋白分别结合并灭活抑癌蛋白P53与pRb，高危HPVE6与P53结合通过泛素依赖途径使P53降解，失去对细胞生长的负调控功能，这是E6致宫颈癌变的重要方面。生殖殖器感染人乳头瘤病毒，在某些情况下导致瘤形成，如鳞状细胞癌与子宫颈癌，是最广泛传播的HPV相关疾病，研究发现HPV第16和18型是子宫鳞状细胞癌的主要原因，不同的HPV类型与子宫上皮癌有关。目前较流行的治疗方式是局部有破坏的治疗，如刀切、激光灼烧、液氮冷冻、电热凝、三氯乙酸或者普达非伦脂腐蚀等(谷鸿喜，中华实验和临床病毒学杂志，1999,13(1):17)，但这些方法只是针对可见或病变局部进行治疗，而HPV还可在临近接受治疗的组织中潜伏，因此治疗后HPV感染的再发生率高。也有人利用干扰素的抗病毒、抗增殖和免疫调节等作用，通过肌肉和病变局部联合用药的方法治疗HPV收效比较显著，但有关HPV所致宫颈癌的预防与诊疗至今还没有一个十分完美和实际可行的方法，对HPV感染的预防及如何迅速准确的诊断、安全有效的治疗有待进一步研究(刘寒梅，中华现代妇产科学杂志，2004，12,1(5))。在HPV所致宫颈癌的预防与治疗中，基因疫苗用于治疗也是一个有效途径，ConsonJ在防御HPV16型感染的疫苗中提到，子宫颈分泌物中存在的抗HPV16核壳蛋白的中和抗体可能具保护作用，故而可制备HPV疫苗以预防原HPV16感染(刘寒梅，中华现代妇产科学杂志，2004，12，1(5))，现在这种疫苗的研究已取得相当进展。榄香烯系由植物温莪术中分离出来的有效成分，临床己证实其对多种肿瘤具有确切疗效，且无明显毒副作用(方琴等，中国药师2004年，7(8):579-81)。迄今为止，虽然对榄香烯的抗肿瘤作用机理作了多方面的探讨，但是其主要抗肿瘤机理并不十分明确(顾洪丰等，湖南中医学院学报2002年，22(4):64-65;花文峰等，中药材2006年，29(1):93-97)。虽然有报导称肿瘤基底部注射榄香烯配合手术或放射疗法可用于宫颈癌的治疗(王晶等，黑龙江医学1999年，(3):22)，但是关于榄香烯抗宫颈癌的机理研究结果并不一致，例如，有文献报导"宫颈癌细胞HPV18E6基因的表达不受榄香烯药物作用的影响"(马东礼等，中国癌症杂志2001年，(1):9-)，也有文献报导"榄香烯阻滞Hda细胞在分裂期，若联合使用G2/M期特异性药物，将起到更好的治疗效果"(马东礼等，上海第二医科大学学报2000年，20(6):484-487)，还有文献报导"对人宫颈癌细胞Hela的体外增值有明显的抑制作用，但是就榄香烯诱导凋亡时各因素之间的关系目前尚无定论"(孙等军等，复旦学报医学科学版2001年，28(5):403陽405)。上述研究表明，肿瘤的发生或发展是一个极其复杂的生物学过程。迄今为止的己有技术处于基础研究阶段，尚无法对HPV、尤其是第16型HPV感染疾病的临床治疗或预防提供科学依据。众所周知，第16型HPV感染与第18型HPV感染疾病的症状及其治疗方案是有所不同。以宫颈癌为例，HPV16型最易引起宫颈鳞癌，感染引起的宫颈癌是由于E6和E7癌蛋白影响各种宿主细胞调节蛋白的功能，导致HPV逃避宿主免疫系统的监视，剌激细胞增殖，最终诱发肿瘤，通常采用治疗方案有HPVE6E7融合蛋白疫苗与放疗联合应用，效果较好(周小川等，中国肿瘤生物治疗杂志，2005Mar;12(1):19-22)，或采用干扰素a-2b直接抑抑制宫颈癌细胞生长，并可能通过HPVE6E7基因表达分子机制达到抑制肿瘤的目的。而HPV18型感染而HPV18最易导致宫颈腺癌，文献报导中尚无采用明确针对性的治疗。
发明内容本发明的一个目的在于提供e-榄香烯在治疗和/或预防人乳头瘤病毒感染相关疾病中的应用。本发明人发现，e-榄香烯能影响HPVE6E7基因表达的变化，诱导HPV引起的癌细胞的调亡，用于宫颈癌、喉癌或口腔癌的治疗。试验证实，在以人宫颈癌CaSKi细胞系(整合型HPV-16阳性)及人宫颈鳞上皮永生化细胞系H8(HPV-16阳性)为模型的研究中，在用最佳浓25-100iig/Pl的e-榄香烯的作用下，对CaSKi和H8细胞的生长有明显的抑制作用，且生长抑制呈药液浓度依赖性关系。CaSKi和H8细胞的形态在e-榄香烯的作用后，在显微镜下检査，观察药物作用先后的变化，可见有明显差异，用药后细胞生长稀疏，部分细胞固縮。在e-榄香烯作用下，细胞同期分布和调亡率均受影响，CaSKi细胞的Gl期细胞减少，G2及S期增加，细胞阻滞于G2、S期。H8细胞G1期细胞减少，S期细胞增加使细胞阻滞于S期，细胞的调亡率有统计学差异，且两种细胞HPVE6E7基因片段mRNA的表达明显低于对照组，其中CaSKi细胞呈剂量依赖关系。本发明的另一个目的在于提供适于上述应用的药物组合物。该药物组合物由5-95%重量的活性成分和95-5%重量的药用赋形剂组成。本发明的活性成分是指e-榄香烯(Elemene)。所述e-榄香烯以植物提取物、有效部位的形式提供，所述植物选自姜科植物温郁金(温莪术)、蓬莪术、广西莪术。含有e-榄香烯的其它植物(例如白术、一枝黄花、香茅、没药)，也可实现本发明。在上述提取物、有效部位中，0-榄香烯的含量至少为45%重量，优选为55-100%、更优选为75-95%。上述提取物、有效部位中也可含有少量Y-榄香烯、5-榄香烯及其它萜类化合物。由上述植物提取和制备榄香烯的方法为已知技术，在此不作赘述。所述e-榄香烯以化学单体或者衍生物的形式提供。可以理解的是，具有榄香烯结构的榄香烯衍生物和络合物也适于本发明，例如羟基类衍生物(ZL95114026)、含氮衍生物(ZL95114026、95114027、200610080037、200610081625)、含氮杂环衍生物(ZL02121674、200410050277、200410050278、200410050280)、嘧啶类衍生物(ZL02121672)、氨基酸或羧酸衍生物(ZL200610081623)，以及金属络合物(ZL95114029)等。在上下文中，"本发明药物"所涉及的术语"榄香烯"具有上述定义。下面的试验将证实按照本发明描述的具有上述定义之"榄香烯"，具有本发明所述的有益效果。鉴于现有技术中己存在着相当成熟且有效的制备/提纯上述定义组分的技术，在此不作重点描述。例如，可以采用现代提取和分离技术，以提高活性物质的纯度、尽量除去不需要的杂质，例如中国专利申请ZL02132986、98106848、02132984、02132985、200310121760、200410064570、200510049615、200610052575等。可针对榄香烯的溶解特性和体内吸收特点，采用标准制剂技术，加入药用辅料制成适宜口服或非肠道给药剂型，类似的技术也已相当成熟有效，例如环糊精包合物(ZL02144941)、滴丸(ZL200310115168)、气雾剂(ZL02132874、02132875)、凝胶剂(ZL200410060826)、注射剂(ZL93110091、98116563、02117219、02155072)、粉针剂(ZL01131732、031323820、021446008、200410002103)、乳剂(ZL02155072)、微或纳米制剂(ZLO1131732、200410018410)、磷脂复合物及脂质体(ZL98121007、200410082866)等。本发明组合物临床使用中，示例性的每日口服推荐剂量为丹参(以丹参素或丹参兩IIa(C19H1803)计)l-20mg(优选2-8mg、更优选2-4mg)、丹参(以丹酚酸B(C36H3()016)计)10-200mg(优选20-120mg、更优选40-80mg)、芍药苷10-100mg(优选20-40mg、更优选20-40mg)。随后进行的研究表明，与己有"丹参+芍药+其它组分"的大处方组合(例如，ZL等)相比，在减少了一种或更多活性成分的情况下，本发明药物组合依然保持了相同、甚至就某些方面而言更为有利的药理作用(例如避免了某些成分之不需要的药理作用或不良反应)，多项指标显著优于单独施用的丹参或芍药，这是本领域技术人员无法根据现有技术推测的。本发明的上述药物组合克服了已有药物存在的作用单一、服药量大等缺点，代表了天然药物治疗和预防上述疾病的新趋势。药理药效学试验研究实验1e-榄香烯对宫颈癌细胞HPV16E6E7基因抑制作用的影响实验材料1)、宫颈癌细胞系人宫颈癌CaSKi细胞系(整合型HPV16阳性)；人宫颈鳞状上皮永生化细胞系H8(HPV-16阳性)，均由中国医学科学院基础医学研究所生物物理室提供。2)、引物由上海生工生物工程技术服务有限公司，应用美国PE公司391型DNA自动合成仪合成，纯化方式PAGE。3)、培养基和血清Dulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)培养基(GIBCOBRL)，胎牛血清(天津市川页生化制品有限公司)；工具酶TaqDNA聚合酶(Promega)，逆转录酶(AMVReverseTranscriptase)(Promega).4)、本实验中采用的0-榄香烯是从天然植物中提取且一种异物体纯度》85%重量比的提取物。实验方法1)、宫颈癌细胞系的培养人宫颈癌CaSKi细胞在5。/。胎牛血清的DMEM培养基中，H8细胞在含2。/。胎牛血清的DMEM培养基中，37°C，5%C02饱和湿度环境下培养。2)、药物浓度选择根据预试验选择药物作用终浓度25"g/ml，50ug/ml，100yg/ml。3)、细胞形态观察活细胞照相将对数生长期的细胞接种于6孔板培养板，每孔10X104个细胞，在各实验组的6孔培养板中每孔放置一片盖玻片，形成附有细胞的盖片，第二天细胞贴壁后更换为含药培养基，培养三天后，在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。4)、四甲基偶氮唑蓝比色法检测不同浓度的13-榄香烯药液对CaSKi细胞和H8细胞生长抑制情况将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔3000个细胞，第二天加入e-榄香烯药液(0，25，50，100ug/ml)，每个浓度平行5孔，37°C，5%C02培养24小时后每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)20ul，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150iU,培养20分钟后酶标仪492nm测定OD值，连续6天，作生长曲线。5)、细胞周期检测同前法在六孔培养板中以含不同浓度药物的培养基培养五天，每个药物浓度平行3孑L，收集细胞，制备单细胞悬液，PBS清洗2次，预次冷70%乙醇固定，4。C保存待检。经0.01%RNA酶处理胞浆RNA、50mg/L碘化丙锭(popidiumiodide，PI)DNA染色30min后，经300目筛过滤除去成团细胞，应用COULTEREPICSXL流式细胞仪检测细胞周期中不同时相的细胞调亡率。每份标本测定5000个细胞，根据DNA含量区分细胞所处细胞周期时相。6)、mDNA表达检测收集培养第五天的细胞，TRIZOL处理后提取RNA，逆转录为cDNA，扩增HPV16E6、E7，同时扩增e-action作为内参照，HPV16E6、E7弓l物(616bp):上游5'-TGACTTTGCTTTTCGGGGATT-3，下游5-GAGAACAGATGGGGCACAC-3'。P-action(552bp)引物序列上游5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3'，下游5'-CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3'。扩增参数为94。C预变性5min;94'C变性45s，5(TC复性45s，72。C延伸lmin，扩增30个循环；72'C延伸加时5min;PCR产物4'C保存；2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，电压40V。应用ScionImage4.0(NIH)软件进行电泳条带图象灰值的半定量分析。待测基因电泳条带灰度比值-待测条带灰度值/同一份标本内参照e-action条带灰度值。每个加药样本至少检测三次。7)、应用SPSS13.0.0统计软件，进行单因素方差分析(ANOVA)、t检验等。结果与结论用药后各组与对照组相比，可见出现了细胞数量减少，吸光度值均较低于对照组，随着药物浓度增高，吸光度值呈下降趋势；从电泳条带吸光度值，计算HPV16E6E7基因片段的吸光度值，与对照组相比，实验组HPV16E6E7mRNA的表达量降低，且与药物制量呈线性关系。实验2不同e-榄香烯药液对CaSKi和H8细胞增殖的影响MTT检验发现，CaSKi和H8在e-榄香烯药液作用下第一天开始，不同药物浓度与空白对照吸光度值(OD)有显著性差异(ANOVA，P小于0.01)，并呈剂量依赖性，见表1，2及图1，2。表l不同浓度的e-榄香烯药液对CaSki细胞的生长抑制作用(OD,x士SD，n=5)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果与结论CaSKi和H8细胞在e-榄香烯药液作用下，不同药物浓度与空白对照吸光度值(OD)有显著性差异(ANOVA,P小于0.01)，并呈剂量依赖性。实验3对细胞周期分布和细胞调亡率以及对HPVE6、E7基因表达的影响在e-榄香烯作用下，细胞同期分布和调亡率均受影响，CaSKi细胞的Gl期细胞减少，G2及S期增加，细胞阻滞于G2、S期。H8细胞G1期细胞减少，S期细胞增加使细胞阻滞于S期，细胞的调亡率有统计学差异，见表3、表4。在e-榄香烯作用下两种细胞HPVE6E7基因片段mRNA的表达明显低于对照组，其中CaSKi细胞呈剂量依赖关系，见表5。表3e-榄香烯作用下CaSKi细胞周期分布和细胞凋亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4e-榄香烯作用下H8细胞周期分布和细胞凋亡率细胞周期分布(％)凋亡(％)GlG2Scontrol25ug/ml50ug/ml72.29±0.6456.7±2.66*'57.37±2.40*7.7±0,927.17±1.8712.23±5.91-19.5±0.6436.13±1.29*30.43±3.50*0.527±0.1482.333±0.447*16.0±2.152*表5RT-PCR产物电泳条带灰度值HPV16E6E7/PHPV16E6E7AactinHPV16E6E7/P.F值P值-actinControl50ng/ml-actinl00(ig/mlCaSKi0.3916±0.01870.2025±0.04270.0236±0.0012644.16P<0.01H80.3164±0.08490.3809±0.04270.0839±0.059217.42P<0.01结果与结论在P-榄香烯作用下CaSKi和H8两种细胞HPVE6E7基因片段mRNA的表达明显低于对照组，其中CaSKi细胞呈剂量依赖关系。图1.P-榄香烯作用下CaSKi细胞的生长曲线图2.e-榄香烯作用下H8细胞的生长曲线具体实施例方式实施例一本实施例子中的榄香烯为采用莪术或香茅的挥发测油为原料，提取分馏获取榄香烯，最后经纯化为含重量比》85%的e-榄香烯提取物。取榄香烯提取物10g,大豆磷脂26g，胆固醇15g,甘油4g，于8(TC恒温加热溶解，加入65ml的磷酸盐缓冲液，置捣碎机内进行高速搅拌制成初乳，再加磷酸盐缓冲液至1000ml，再用高压乳匀机乳化3次，至用粒度分析仪测定粒度合格后，滤过，分装于2ml安瓿中，100r流通蒸汽灭菌30分钟，即得榄香烯乳注射液。实施例二本实施例中使用的榄香烯为通过商业途径获得的提取物，其纯异构体纯度按重量比计大于85%。取榄香烯提取物10g，大豆磷脂26g,胆固醇15g，甘油4g，于8(TC恒温加热溶解，加入65ml的磷酸盐缓冲液，置捣碎机内进行高速搅拌制成初乳，再加磷酸盐缓冲液至1000ml，再用高压乳匀机乳化3次，至用粒度分析仪测定粒度合格后，滤过，分装于2ml安瓿中，100'C流通蒸汽灭菌30分钟，即得榄香烯乳注射液。权利要求1、一种含有β-榄香烯的药物在抗人乳头瘤病毒(HPV)的相关的疾病或症状的应用。2、根据权利要求1的应用，所述人乳头瘤病毒为人宫颈癌细胞系及人宫颈鳞状上皮永生细胞系H8。3、根据权利要求l的应用，所述HPV类型为第16型。4、根据权利要求3的应用，所述HPV的蛋白是E6、E7蛋白。5、根据权利要求l的应用，其中所述的药物含有约10-100yg/ml。6、根据权利要求l的应用，其中所述的药物浓度25-100Pg/ml。7、根据权利要求l的应用，所述疾病为宫颈癌、喉癌或口腔癌。全文摘要本发明涉及β-榄香烯的药物应用，特别是用于人乳头瘤病毒(HPV)感染的药物中的应用。文档编号A61K31/02GK101199498SQ20071012890公开日2008年6月18日申请日期2007年8月2日优先权日2007年8月2日发明者容陈申请人:海南碧凯药业有限公司