专利名称：静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法
技术领域：
本发明是从经乙肝疫苗免疫的献血员的血浆中分离的一种含有高活性抗乙 肝病毒抗体的药物。具体为静脉注射乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。
背景技术：
"静脉注射用人乙型肝炎免疫球蛋白"这一药物由于含有高活性的抗乙肝 病毒抗体，临床上是一种专门针对乙肝的治疗药品，在国内还没有生产，目前国内市场上 仅有一种供肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，该类产品有两方面缺点 一方面活性低一 只有IOO、 200、 400IU/只，另一方面其纯度低一人抗体免疫球蛋白的纯度只有90%，杂质 含量高而不能用于静脉注射用，由于以上缺点这种肌肉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白主要 用于乙肝的预防上，因此国内市场上就需要一种纯度更高的可以进行静脉注射的高活性的 人乙型肝炎免疫球蛋白制剂，目前多家生产和研发单位都在进行工艺开发，开发的重点和 难点主要集中在
1、 如何提高产品的纯度和活性，产品纯度的提高意味着杂质更少，临床副反应也就 更少。
2、 选择合适的保护剂，使产品具有更长的稳定期。
3、 选择合适的病毒灭活方法，充分保证产品的生物安全性目前，根据国家药典要求，免疫球蛋白类药品中人抗体免疫球蛋白纯度达到95%就满 足静脉注射要求。在国际上血液制品的生产研发主要集中在欧洲、美国、日本等发达国家，"静脉注 射用人乙型肝炎免疫球蛋白"作为一种血液制品，上市的产品多采用全层析的方法进行生 产，如美国百特和纽约血液中心，即用层析的方法直接从血浆中分离，此方法的缺点是生 产成本高。发明内容:本发明的目的在于提供一种成本低廉、人抗体免疫球蛋白纯度可达98%以上 的静脉注射乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。 本发明的目的是这样实现的 第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价> 8IU/ml的原料血浆经75%酒精和注射用水消 毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1. 0°C ~ 3. 0 'C之间；第二步、pH调节用pH4. 0醋酸緩冲液加入到血浆中，调节pH值到5. 80 - 6.00反应， 30分钟；第三步、20%—25°/。乙醇反应继上一步，加95%乙醇，使乙醇浓度达20 % _25°/ ( V/V ); 加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3. 01C ~-5. 0TC，反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入1.0% (W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进 行压滤，压滤时控制前压<1. 5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3—5倍量
预冷到0. (TC ~ 2. OIC的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0. (TC ~ 2. 0X:，搅 拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4. 0醋酸緩冲液，调节反应液pH值在5. 05 -5. 25范围，反应30分钟；第七步、16%—18%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，佳反应液的乙醇浓度 达lW—in，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4. 51C ~-5. 5'C,继续搅拌l 小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤;f几压滤，压滤时控制前压《1.5Kg/cm2,上清回收到 反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液緩慢加入lmol/L碳酸氢钠緩冲液，调节 反应液pH值在7. 20~7. 60范围，反应30分钟，；第十步、25%—28°/。乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓 度达到25°/。_28%,在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7. (TC ~-10. 0X:,静止1小 时以上，即可压滤；第十一步、压滤继上一步，由压滤才几压滤，进4亍压滤前调节制品温度为-10. 0X: ~-12. 0 。C，压滤时控制前压《1. 5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用6—8倍量注射用水溶解，温 度是O. 0°C ~2. 0'C;第十三步、调节pH:继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6. 5~6. 8之间，继续搅 拌反应15min;第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0. 015M磷酸緩冲液平衡至出液pH6. 5-6, 8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0. 015M磷酸緩冲液冲洗凝胶上的 残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，緩慢加入3。/nHCl调节蛋白液pH至3.5-4. 0，继续搅拌 30minj第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器， 开始预浓缩，待蛋白浓度达50 g/L左右，结束预浓缩称重，加入2。C 10。C注射用水，稀 释蛋白浓度至20~50g/L,透析6—8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度 达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3训C1调整浓缩后蛋白液的pH是3. 8-4. 4，加入麦芽糖后，补加 注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L,取样复测pH、 pH是3. 8 ~ 4. 4， 称重；第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记 录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于21'C-25TC库放置21天， 逐曰记录库温，灭活后的制品应及时移至2 °C ~ 8 。C库保存；
第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜 过滤器过滤于罐中；第二十一步、继上一步，可分装不同规格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。本发明的优点是本发明提供一种可以静脉注射的人乙型肝炎免疫球蛋白，其所含的 人抗体免疫球蛋白纯度可达98%以上，杂质更少，副反应更低。此工艺条件温和，对产品 没有损伤，而且病毒灭活效果好，优于其他单位采用的巴氏灭活法或单一的低PH孵育法。 本发明采用的是一种低温乙醇分离法与层析法和超滤法相结合的方法，使生产成本大大降 低。
具体实施例方式第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价> 8IU/ml的原料血浆经75%酒精和注射用水消 毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1. (TC ~ 3. 0 'C之间；第二步、pH调节用pH4. 0醋酸緩冲液加入到血浆中，调节pH值到5. 80~ 6. 00反应， 30分钟;第三步、20%—25 /。乙醇反应继上一步，加95%乙醇，使乙醇浓度达20 %—25% ( V/V ); 加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3. (TC ~-5. (TC，反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入1.(W (W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进 行压滤，压滤时控制前压<1. 5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3—5倍量 预冷到0. (TC ~ 2. (TC的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0. 0°C ~ 2. (TC ,搅 拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4. 0醋酸緩冲液，调节反应液pH值在5. 05~ 5. 25范围，反应30分钟；第七步、16%—18°/。乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，佳反应液的乙醇浓度 达16%—18%,在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4. 5°C ~-5. 5'C，继续搅拌1 小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压<1. 5Kg/cm2,上清回收到 反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液緩慢加入lmol/L碳酸氢钠緩冲液，调节 反应液pH值在7. 20- 7.60范围，反应30分钟，；第十步、25%—28%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓 度达到25°/。_28°/。，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7. Oi: ~-10. (TC，静止1小 时以上，即可压滤；
第十一步、压滤继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10. 0°C ~-12. 0 t:，压滤时控制前压《1. 5Kg/cm2,从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用6—8倍量注射用水溶解，温度是o. ot; -2. or;第十三步、调节pH:继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6. 5~6. 8之间，继续搅 拌反应15min;第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0. 015M磷酸緩沖液平衡至出液pH6. 5~ 6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0. 015M磷酸緩冲液冲洗凝胶上的 残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，緩慢加入3y。HCl调节蛋白液pH至3.5-4.0，继续搅拌 30min;第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器， 开始预浓缩，待蛋白浓度达50 g/L左右，结束预浓缩称重，加入2。C-1(TC注射用水，稀 释蛋白浓度至20~50g/L,透析6 — 8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度 达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3'/。HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3. 8~4. 4，加入麦芽糖后，补加 注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L,取样复测pH、 pH是3. 8 ~ 4. 4，称重；第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记 录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于21。C-25。C库放置21天， 逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2 'C ~ 8 。C库保存；第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜 过滤器过滤于罐中；第二十一步、继上一步，可分装不同规格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。 下面举例进一步详述本发明的技术方案。例1、第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价8IU/ml的原料血浆经75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1. 0 。C;第二步、pH调节用pH4. 0醋酸緩冲液加入到血浆中，调节pH值到5. 80,反应30 分钟；第三步、2(W乙醇反应继上一步，加95%乙醇，使乙醇浓度达20% (V/V)加酒精 过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0X:，反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入1. 0% (W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进
行压滤，压滤时控制前压1. 5Kg/cm2,上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3倍量预冷到0. (TC的注射用水，搅拌3小时，制冷反应液温度至O.(TC，搅拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4. 0醋酸緩冲液，调节反应液pH值5. 05，反应30分钟；第七步、16%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓度达 16%,在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4. 5。C,继续搅拌l小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤4几压滤，压滤时控制前压1. 5Kg/cm2,上清回收到 反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液緩慢加入lmol/L碳酸氩钠緩冲液，调 节反应液pH值达7. 20，反应30分钟；第十步、25°/。一28%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓 度是25%,在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7. 0C，静止l小时，即可压滤；第十一步、压滤继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0'C， 压滤时控制前压1. 5Kg/cm2,从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用6倍量注射用水溶解，温度 是O. OTC;第十三步、调节pH:继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH6. 5,继续搅拌反应15min;第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0. 015M磷酸緩冲液平衡至出液pH6. 5 后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0. 015M磷酸緩冲液沖洗凝胶上的残 余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，緩慢加入3仰C1调节蛋白液pH3. 5，继续搅拌30ndn;第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器， 开始预浓缩待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2。C注射用水稀释蛋白浓度 至20g/L,透析6倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L,抽入洁 净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3仰C1调整浓缩后蛋白液的pH是3. 8,加入麦芽糖后，补加注射 用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、 pH是3. 8，称重；第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞， 记录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于21'C库放置21天，逐日记 录库温，灭活后的制品应及时移至2iC库保存；第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米 膜过滤器过滤于罐中；第二十一步、继上一步，可分装不同规格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶； 第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。例2、第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价10IU/ml的原料血浆经75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度3. 0第二步、pH调节用pH4. O醋酸緩冲液放入到血浆中，调节pH值到6. 00，反应30 分钟；第三步、25°/。乙醇反应继上一步，加入95%乙醇，使乙醇浓度达到25% (V/V),加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-5. 0'C,反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入l. 0% (W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压1. 0Kg/cm2,上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入5倍量预冷到2.(TC的注射用水，搅拌4小时，制冷反应液温度至2.0X:，搅拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4. 0醋酸緩冲液，调节反应液pH值5. 25,反应30分4中；第七步、18%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓度达 1W，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5. 51C,继续搅拌l小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压1. 3Kg/cm2，上清回收到 反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液緩慢加入lmol/L碳酸氢钠緩冲液，反 应30分钟，反应液pH值在7. 6;第十步、28%乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓度达到 28%，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-10. 0X:，静止l. 5小时，即可压滤；第十一步、压滤继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-12. (TC， 压滤时控制前压1. 3Kg/cm2，从压滤才几上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用8倍量注射用水溶解，温度 是2, 0°C;第十三步、调节pH:继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH6. 8,继续搅拌反应15min;第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0. 015M磷酸緩冲液平衡至出液pH6. 8 后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0. 015M磷酸緩冲液冲洗凝胶上的残 余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，緩慢加入3W1C1调节蛋白液pH4. 0，继续搅拌30min;第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器， 开始预浓缩待蛋白浓度达50 g/L左右，结束预浓缩称重，加入10。C注射用水，稀释蛋白 浓度至50g/L,透析8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达90g/L，抽 入洁净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3仰C1调整浓缩后蛋白液的pH是4. 4，加入麦芽糖后，补加注射
用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L,取样复测pH、 pH是4.4,称重； 第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞， 记录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于25X:库放置21天，逐曰记 录库温，灭活后的制品应及时移至8。C库保存；第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米 膜过滤器过滤于罐中；第二H~—步、继上一步，可分装不同规格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。例3、第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价8IU/ml的原料血浆经75%酒精和注射 用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度2. 0 。C;第二步、pH调节用pH4. 0醋酸緩冲&故入到血浆中，调节pH值到5.90，反应30 分钟；第三步、23%乙醇反应继上一步，加95%乙醇，使乙醇浓度达到23% (V/V),加酒 精过程中逐渐降温，加完后，降温到-4. (TC，反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入l. 0% (W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进 行压滤，压滤时控制前压1. 1Kg/cm2，上清回收到反应罐，经压滤机回收沉淀；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入4倍量预 冷到1. Ot:的注射用水，搅拌3.5小时，制冷反应液温度至1. ox:，搅拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4. 0醋酸緩冲液，调节反应液pH值5. 15，反 应30分4中；第七步、l /。乙醇反应继上一步，向反应液加入95%乙醇，使反应液的乙醇浓度达 17°/ ,在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5. 0'C,继续搅拌l小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤;f几压滤，压滤时控制前压1. 1Kg/cm2,上清回收到 反应罐，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液緩慢加入lmol/L碳酸氢钠緩冲液，调 节反应液pH值在7. 30，反应30分钟；第十步、26%乙醇反应继上一步，向反应液加入95°/。乙醇，使反应液的乙醇浓度是 26%，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-8.0X:,静止1.5小时，即可压滤；第十一步、压滤继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-11. (TC， 压滤时控制前压1. 1Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用7倍量注射用水溶解，温度是o. rc;第十三步、调节pH:继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6. 6,继续搅拌反应15min;
第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0. 015M磷酸緩冲液平衡至出液pH6. 6 后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0. 015M磷酸緩冲液冲洗凝胶上的残 余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，緩慢加入3WIC1调节蛋白液pH至3. 6，继续搅拌30min;第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器， 开始预浓缩待蛋白浓度达SOg/L左右，结束预浓缩称重，加入4E注射用水稀释蛋白浓度 至30g/L,透析7倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达90g/L，抽入洁 净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3%HC1调整浓缩后蛋白液的pH是4. 0，加入麦芽糖后，补加注射 用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、 pH是4. 0，称重；第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞， 记录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于22"C库放置21天，逐日记 录库温，灭活后的制品应及时移至3'C库保存；第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米 膜过滤器过滤于罐中；第二十一步、继上一步，可分装不同规格500 IU/瓶、2000 IU/瓶、2500 IU/瓶、 5000 IU/瓶、10000 IU/瓶；第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
权利要求
1、一种静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法，其特征在于第一步、融化血浆将抗-HBs抗体效价≥8IU/ml的原料血浆经75％酒精和注射用水消毒外袋后，割袋混合后置于带夹层的不锈钢反应罐中水浴融化，控制血浆温度在1.0℃～3.0℃之间；第二步、pH调节用pH4.0醋酸缓冲液加入到血浆中，调节pH值到5.80～6.00反应，30分钟；第三步、20％-25％乙醇反应继上一步，加95％乙醇，使乙醇浓度达20％-25％(V/V)；加酒精过程中逐渐降温，加完后，降温到-3.0℃～-5.0℃，反应30分钟；第四步、压滤继上一步，向制品中加入1.0％(W/W)硅藻土助滤剂，搅拌30分钟进行压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐，从压滤机回收沉淀进行下步；第五步、沉淀的溶解继上一步，称量上步沉淀，置不锈钢反应罐中，加入3-5倍量预冷到0.0℃～2.0℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0.0℃～2.0℃，搅拌至溶解；第六步、调节pH值继上一步，加入pH4.0醋酸缓冲液，调节反应液pH值在5.05～5.25范围，反应30分钟；第七步、16％-18％乙醇反应继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达16％-18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃～-5.5℃，继续搅拌1小时即可压滤；第八步、压滤继上一步，由压滤机压滤，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，上清回收到反应罐进行下步，压滤机的沉淀弃做他用；第九步、调节pH值继上一步，将上步的滤液缓慢加入1mol/L碳酸氢钠缓冲液，调节反应液pH值在7.20～7.60范围，反应30分钟，；第十步、25％-28％乙醇反应继上一步，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达到25％-28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液最终温度达-7.0℃～-10.0℃，静止1小时以上，即可压滤；第十一步、压滤继上一步，由压滤机压滤，进行压滤前调节制品温度为-10.0℃～-12.0℃，压滤时控制前压≤1.5Kg/cm2，从压滤机上回收沉淀，称量沉淀备用；第十二步、沉淀溶解继上一步，将上一步备用的沉淀用6-8倍量注射用水溶解，温度是0.0℃～2.0℃；第十三步、调节pH继上一步，加入盐酸，调节溶解液pH在6.5～6.8之间，继续搅拌反应15min；第十四步、层析继上一步，将溶胀好的凝胶用0.015M磷酸缓冲液平衡至出液pH6.5～6.8后，上样蛋白液收集流穿之蛋白峰，上样结束后，用0.015M磷酸缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重；第十五步、酸处理继上一步，缓慢加入3％HCl调节蛋白液pH至3.5～4.0，继续搅拌30min；第十六步、.超滤继上一步，将调整好的蛋白液抽至清洁的超滤桶中，启动超滤器，开始预浓缩，待蛋白浓度达50g/L左右，结束预浓缩称重，加入2℃～10℃注射用水，稀释蛋白浓度至20～50g/L，透析6-8倍水，透析结束后停止加水，将制品浓缩至蛋白浓度达80g/L以上，抽入洁净不锈钢桶内称量；第十七步、配制用3％HCl调整浓缩后蛋白液的pH是3.8～4.4，加入麦芽糖后，补加注射用水，使制品最终含免疫球蛋白50g/L、麦芽糖100g/L，取样复测pH、pH是3.8～4.4，称重；第十八步、继上一步，将制品从压力桶经除菌滤器除菌分装于玻璃瓶中，盖好胶塞，记录除菌后制品量；第十九步、继上一步，低pH病毒灭活将除菌后制品置于21℃～25℃库放置21天，逐日记录库温，灭活后的制品应及时移至2℃～8℃库保存；第二十步、继上一步，纳米膜过滤除病毒经低pH病毒灭活后的制品，再经由纳米膜过滤器过滤于罐中；第二十一步、继上一步，可分装不同规格500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶、10000IU/瓶；第二十二步、继上一步，成品检定合格后包装。
全文摘要
本发明是从经乙肝疫苗免疫的献血员的血浆中分离的一种含有高活性抗乙肝病毒抗体的药物。具体为静脉注射人乙型肝炎免疫球蛋白制备方法。其特点是经过融化血浆、pH调节、20％-25％乙醇反应、压滤、沉淀的溶解、调节pH值、乙醇反应、压滤、调节pH值、25％-28％乙醇反应、压滤、沉淀溶解、调节pH、层析、超滤、分装、低pH病毒灭活、纳米膜过滤除病毒、分装、成品检定合格后包装。二十二个步骤实现人抗体免疫球蛋白纯度可达98％以上，杂质更少，副反应更低。此工艺条件温和，对产品没有损伤，而且病毒灭活效果好，优于其他单位采用的巴氏灭活法或单一的低pH孵育法。本发明采用的是一种低温乙醇分离法与层析法和超滤法相结合的方法，使生产成本大大降低。
文档编号A61K9/00GK101161232SQ20071014463
公开日2008年4月16日 申请日期2007年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者付绍兰, 孙晓东, 李常禄, 杨金平, 波 赵, 赵德龙, 晶 郭, 陈凤珠 申请人:哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司