专利名称：猪流感dna疫苗plga微球的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，属于药物缓释 剂型方面的研究。
技术背景.-
猪流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种猪的急性、传染性呼吸道 疾病，传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为猪流感病毒亚型较多、抗 原易发生变异和可在种间传播，给流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑 战。所以猪流感在人流感和禽流感之间发挥着关键性作用，具有重大的公共卫
DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表 达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA 疫苗大动物实验、人体临床实验结果表明DNA疫苗存在着给药剂量较大，生 物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了DNA疫苗 的研究进展。因此如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是 当前DNA疫苗研究的国际热点。如何在保证DNA疫苗的稳定性、微球粒径适 宜的前提下，提高载药量和包封率是DNA疫苗PLGA微球制备中需要解决 的难题。目前，国外DNA疫苗微球给药系统的研究发展十分迅速，取得了不少 阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗在给药系统方面的研究工作 开展较少，DNA疫苗可控缓释微球给药系统的研究则更少。DNA疫苗可控缓 释微球给药系统的研究结果已经显示出了巨大的应用潜力，微球给药系统具有 靶向作用，对DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果并可 口服和鼻腔给药，诱导粘膜免疫等特点。因此，DNA疫苗可控缓释微球给药系 统是一个很好的给药系统，经过进一步的深入研究，必将产业化，促进DNA疾 苗在畜牧业和临床的实际应用，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患， 将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨 大的。普通DNA疫苗的作用特点是持续时间短，在体内易被降解，不能够实现
3缓释的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，及该 制备工艺的影响因素。
上述的目的通过以下的技术方案实现
猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，其组成包括取初乳制成复乳， 将复乳转移至烧杯中，磁力搅拌5小时，室温条件下挥干有机溶剂，离心10分 钟，收集微球，用灭菌水洗涤，真空冷冻干燥即得猪流感DNA疫苗PLGA微 球。
所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，所述的取初乳制成复乳 为吸取含DNA的猪流感DNA疫苗水溶液作为内水相，经二氯甲烷溶解的PLGA 为油相，将所述的内水相加至所述的油相中，超声乳化后加入到聚乙烯醇中， 搅拌后得复乳。
所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，所述的复乳制作为吸取 含DNA重量份数为2的猪流感DNA疫苗水溶液作为内水相，取重量份数为200 的PLGA，加入体积份数为5的二氯甲烷溶解完全，作为油相，将所述的内水 相加至所述的油相中，冰浴条件下超声乳化10秒，得初乳，在7000rpm转速 下，将所得初乳加至体积份数为20的2%聚乙烯醇中，乳化器搅拌35秒后停止， 得复乳。
所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，将所得复乳转移至烧杯 中，在200rpm转速下磁力搅拌5小时，室温条件下挥干有机溶剂，在4000rpm 转速下离心10分钟，收集微球，用灭菌水洗漆3次，真空冷冻干燥即得猪流感 DNA疫苗PLGA微球，所述的重量份数与体积份数对应单位为mg:ml。
本发明的有益效果
1.使用本方法制备的DNA疫苗微球在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有 较高的包封率，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间。因 此，可实现药物的缓释、靶向给药，具有重要的理论价值和实际应用前景，用 于动物体或人体一些流行性疾病的预防、治疗和诊断，市场规模巨大，必将创造巨大的经济效益。
2.该制备方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少, 较好保持了 DNA疫苗的活性等优点，试验筛选的处方和工艺也可放大到生产应 用，因而对产业化的应用具有指导意义。
本发明的
具体实施例方式
实施例l:
猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，其组成包括初乳、复乳的制 作，所述的初乳制作为吸取含DNA重量份数为2的猪流感DNA疫苗水溶液作 为内水相，取重量份数为200的PLGA,加入体积份数为5的二氯甲烷溶解完 全，作为油相，将所述的内水相加至所述的油相中，冰浴条件下超声乳化10秒， 得初乳，在7000rpm转速下，将所得初乳加至体积份数为20的2%聚乙烯醇中， 乳化器搅拌35秒后停止，得复乳，将所得复乳转移至烧杯中，在200rpm转速 下磁力搅拌5小时，室温条件下挥干有机溶剂，在4000rpm转速下离心10分 钟，收集微球，用灭菌水洗涤3次，真空冷冻干燥即得猪流感DNA疫苗PLGA 微球，所述的重量份数与体积份数对应单位为mg:inl。
采用复乳(wl/o/w2)-溶剂挥发法制备猪流感DNA疫苗PLGA (聚乳酸/ 羟基乙酸共聚物)微球，吸取DNA疫苗水溶液(含DNA2mg)，作为内水相(wl); 称取PLGA200mg，加入5mL 二氯甲烷溶解完全，作为油相(o);将内水相加 至油相中，冰浴条件下超声乳化10s，得初乳(wl/o);在7000rpm转速下，将 初乳加至20mL2y。聚乙烯醇(PVA)中，乳化器搅拌35s后立即停止，得复乳 (wl/o/w2);复乳转移至烧杯中，200rpm磁力搅拌5h，室温条件下挥干有机 溶剂，4000rpm离心10min，收集微球，用灭菌水冼涤3次，真空冷冻干燥即 得微球。由此方法制备的猪流感DNA疫苗PLGA微球在电镜下观察结果为大 小均匀，外形圆整，表面光滑，测得的微球粒径在6-l(Him之间，微球的包封率 达到60%，载药量达到5.5%。
微球制备工艺的影响因素
考察的影响囟素包括①超声乳化的时间；②乳化器搅拌速度；③PVA的 浓度；④油相中PLGA的浓度(m/v);⑤DNA疫苗与PLGA的比例(mg/mg)。从DNA疫苗的稳定性考察影响因素①
称取PLGA25mg溶于0.75mL 二氯甲垸中，待完全溶解后，加入40ulDNA疫 苗水溶液，冰浴条件下超声乳化时间分别为5s、 8s、 10s、 12s、 14s得初乳，加入 lmLTE， 2000rpm涡旋振荡15min， 4000rpm离心lOmin，取上清10pL，琼脂
糖电泳分析，结果表明，冰浴条件下超声乳化时间为10s，初乳乳化效果较好且 DNA疫苗的降解不明显。
从DNA疫苗的稳定性考察影响因素②
称取PLGA25mg溶于0.75mL 二氯甲烷中，待完全溶解后，加入40ulDNA疫 苗水溶液，冰浴条件下超声乳化时间10s得初乳，分别在5000rpm， 6000rpm, 7000rpm, 8000rpm转速下，将初乳加至20mL2。/o聚乙烯醇(PVA)中，得复 乳，200r/min磁力搅拌5h， 4000r/min离心10min，收集微球，用灭菌水洗涤 3次制备出在四种搅拌速度下的微球，向收集的微球中加入2mL 二氯甲烷使微 球完全溶解，溶解后加入5mLPBS，涡旋振荡30min， 4000rpm离心10min，取 上清10pL，琼脂糖电泳分析，结果表明，搅拌速度在7000rpm乳化效果较好 且DNA疫苗的降解不明显。
包封率和载药量的测定
将制备好的猪流感DNA疫苗PLGA微球中加入2mL 二氯甲垸使微球完全 溶解，溶解后加入5mLPBS，涡旋振荡30min， 4000rpm离心10min，取上清 用紫外分光光度仪测定萃取出的DNA的浓度，即可计算出DNA的含量。再根
据公式计算出包封率和载药量。
包封率(％) =PLGA微球中DNA疫苗的测得含量/制备时PLGA微球中疫
苗的理论载药量xlOO"/。 载药量(％) =PLGA微球中DNA疫苗的测得含量/微球的重量xlOO%
考察影响因素③④⑤对粒径大小、包封率和载药量的影响 PVA的浓度分别为1。/。、 2%、 3%;油相中PLGA的浓度(m/v)分别为2.5%、 4%、 5。/。；DNA疫苗与PLGA的比例(mg/mg)分别为0.5%、 1%、 .5%，通过
单因素试验设计，由前面所述的方法制备出各种微球，分别测定粒径大小、包 封率和载药量。从而优化出的最佳条件为PVA的浓度为2。/。；油相中PLGA的 浓度(m/v)为4%; DNA疫苗与PLGA的比例(mg/mg)为0.5%。
权利要求
1. 一种猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，其组成包括取初乳制成复乳，其特征是将复乳转移至烧杯中，磁力搅拌5小时，室温条件下挥干有机溶剂，离心10分钟，收集微球，用灭菌水洗涤，真空冷冻干燥即得猪流感DNA疫苗PLGA微球。
2. 根据权利要求1所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，其特 征是所述的取初乳制成复乳为吸取含DNA的猪流感DNA疫苗水溶液作为内 水相，经二氯甲垸溶解的PLGA为油相，将所述的内水相加至所述的油相中， 超声乳化后加入到聚乙烯醇中，搅拌后得复乳。
3. 根据权利要求1所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，其特 征是所述的复乳制作为吸取含DNA重量份数为2的猪流感DNA疫苗水溶液 作为内水相，取重量份数为200的PLGA，加入体积份数为5的二氯甲垸溶解 完全，作为油相，将所述的内水相加至所述的油相中，冰浴条件下超声乳化IO 秒，得初乳，在7000rpm转速下，将所得初乳加至体积份数为20的2%聚乙烯 醇中，乳化器搅拌35秒后停止，得复乳。
4. 根据权利要求1或2或3所述的猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工 艺，其特征是将所得复乳转移至烧杯中，在200rpm转速下磁力搅拌5小时， 室温条件下挥干有机溶剂，在4000rpm转速下离心10分钟，收集微球，用灭 菌水洗涤3次，真空冷冻干燥即得猪流感DNA疫苗PLGA微球，所述的重量 份数与体积份数对应单位为mg:ml。
全文摘要
猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，普通DNA疫苗的作用持续时间短，在体内易被降解，不能实现缓释的目的。猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备工艺，取初乳制成复乳，将复乳转移至烧杯中，磁力搅拌5小时，室温条件下挥干有机溶剂，离心10分钟，收集微球，用灭菌水洗涤，真空冷冻干燥即得猪流感DNA疫苗PLGA微球。本工艺用于猪流感DNA疫苗PLGA微球的制备。
文档编号A61P31/16GK101422618SQ20071014454
公开日2009年5月6日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者周东坡, 孙庆申, 凯 赵, 金媛媛, 魏海霞 申请人:黑龙江大学