17-氧基麦克菌素衍生物及其在癌症和/或b-细胞恶性肿瘤的治疗中的用途的制作方法

专利名称：：17-氧基麦克菌素衍生物及其在癌症和/或b-细胞恶性肿瘤的治疗中的用途的制作方法17-氧基麦克菌素衍生物及其在癌症和/或B-细胞恶性肿瘤的治疗中的用途发明的背景90kDa热休克蛋白(Hsp90)是蛋白质折叠和装配中涉及的丰富的分子伴侣，它们中的许多也参与信号转导途径(综述参见Neckers，2002;Sreedhar等人，2004a;Wegele等人，2004和本文中的参考文献)。至今已经鉴别了近50种这些所谓的客户蛋白(clientproteins),包括类固醇受体、非受体酪氨酸激酶例如src家族、细胞周期蛋白依赖性激酶例如cdk4和cdk6、嚢性跨膜调节子、一氧化氮合酶和其它(Donz6和Picard，1999;McLaughlin等人，2002;Chiosis等人，2004;Wegele等人，2004;http:〃www.picard.ch/downloads/Hsp90interactors.pdf)。jt匕夕卜，Hsp90在细胞对抗突变影响的应^LA应和保护作用中发挥了关键作用(Bagatell和Whitesell，2004;Chiosis等人，2004)。Hsp90的功能是复杂的，涉及动态多酶复合体的形成(Bohen，1998;Liu等人，1999;Young等人，2001;Takahashi等人，2003;Sreedhar等人，2004;Wegele等人，2004)。Hsp90是导致客户蛋白降解、细胞周期失调和细胞凋亡的抑制剂的靶(Fang等人，1998;Liu等人，1999;Blagosklonny，2002;Neckers,2003;Takahashi等人，2003;Beliakoff和Whitesell,2004;Wegele等人，2004)。近来，已经确定Hsp90是肺瘤侵入的重要的胞外介体(Eustace等人，2004)。已将Hsp90视为癌症治疗的新型主要治疗靶，这反映在对Hsp90功能的密集而详细的研究(Blagosklonny等人，1996;Neckers，2002;Workman和Kaye，2002;Beliakoff和Whitesell,2004;Harris等人，2004;Jez等人，2003;Lee等人,2004)以及高通量筛选测定的研发中(Carreras等人，2003;Rowlands等人，2004)。Hsp90抑制剂包括化合物类型例如安莎霉素类、大环内酯类、嘌呤、吡唑类、香豆素抗生素及其他(综述参见Bagatell和Whitesell,2004;Chiosis等人，2004和本文中的参考文献)。苯型安沙霉素是一大类化学结构，其特征是连接在芳香环结构任一侧的不同长度的脂肪环。天然存在的安沙霉素包括麦克菌素(macbecin)和18,21-二氢麦克菌素(也分别称为麦克菌素I和麦克菌素II)(1&2;Tanida等人，1980)、格尔德霉素(3;DeBoer等人，1970;DeBoer和Dietz，1976;WO03/106653和本文中的参考文献)，和除莠霉素家族(4;5，6，Omura等人，1979，Iwai等人，1980和Shibata等人，1986a,WO03/106653和本文中的参考文献)。H3CO、、、、''..'H3CO'oI」6OHOoH,、,OCH3\一H3CO、、、''、■'H3CO'OH、、OCH3、、、"麦克菌素>H3CO■'NH2VONH218,21'二氢麦克菌素(是克S素H),2O..丄L、、、'oH、、、'OH3CO'一"'、、、OHH3CQH3CO，、、、"飞O、、、、■H!H3CO,、、0R2\.、.,o格尔德霉素.3NH2除莠霉素A,4RfOCH3,R2-CH3除莠霉素B,5R^H.R2-H除^霉;C,6Rt-OCHg,R2=H最初鉴别安沙霉素是出于它们的抗细菌和抗病毒活性，然而，目前，它们作为抗癌剂的潜在应用已经吸引了更大的兴趣(Beliakoff和Whitesell，2004)。目前，临床实验正在评估许多Hsp90抑制剂(Csermely和Soti，2003;Workman,2003)。特别的，格尔德霉素具有钠摩尔级效价，并且对依赖异常蛋白激酶的肿瘤细胞具有明显的特异性(Chiosis等人，20(B;Workman,2003)。已经显示Hsp90抑制剂的治疗提高了放射对肿瘤细胞死亡的诱导作用，并且还已经证实，通过结合Hsp90抑制剂和细胞毒剂，增加了细胞杀伤能力(例如，乳癌、慢性髓性白血病和非小细胞肺癌)(Neckers，2002;Beliakoff和Whitesell，2004)。抗血管生成活性的潜力也是令人感兴趣的Hsp90客户蛋白HIF-la在实体肿瘤的发展中发挥了关键作用(Hur等人，2002;Workman和Kaye，2002;Kaur等人，2004)。Hsp90抑制剂还具有免疫抑制剂的作用，涉及一些类型的胂瘤细胞在Hsp卯抑制作用后的补体诱导裂解(Sreedhar等人，2004)。Hsp90抑制剂的治疗还可以导致与免疫细胞介导的裂解相关的诱导的过氧化物产生(Sreedhar等人，2004)。还讨论了Hsp卯抑制剂作为潜在的抗疾疾药物的用途(Kumar等人，2003)。此外，还显示格尔德霉素干扰复杂糖基化的哺乳动物朊病毒蛋白Prpc的形成(Winklhofer等人,2003)。如上所述，安沙霉素还作为潜在的抗癌和抗B细胞恶性肿瘤化合物受到关注，然而目前可获得的安沙霉素表现出不佳的药理学和制药性质，例如它们表现出不佳的水溶解性、不佳的代谢稳定性、不佳的生物利用率或不佳的配制能力(Goetz等人，2003;Workman2003;Chiosis2004)。由于强烈的肝脏毒性(综述Workman,2003),除莠霉素A和格尔德霉素都净皮认为是临床实验的不良候选物，并且格尔德霉素还由于肝脏毒性被撤出了I期临床实验(Supko等人，1995;WO03/106653)。格尔德霉素是从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的培养滤过物中分离的，表现出体外抗原生动物的强活性和抗细菌和真菌的弱活性。在1994年揭示了格尔德霉素与Hsp90的联系(Whitesell等人，19M)。克隆并测序了格尔德霉素的生物合成基因簇(Allen和Ritchie,1994;Rascher等人，2003;WO03/106653)。用NCBI登录号AY179507可获得DNA序列。近来也描述了来自吸水链霉菌二重霉素亚种(S.hygroscopicussubsp.duamyceticus)JCM4427的、遗传改造的格尔德霉素生产菌林的分离，以及4，5-二氢-7-0-脱氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素和4，5-二氢-7-0-脱氨曱酰基-7-羟基-17-0-去甲基格尔德霉素的分离(Hong等人，2004)。通过向除莠霉素生产菌林吸7jC链霉菌AM-3672饲喂格尔德霉素，分离到化合物15-羟基格尔德霉素、三环格尔德霉素类似物KOSN-1633和曱基-格尔德霉素(methyl-geldanamycinate)(Hu等人，2004)。自吸水链霉菌K279-78分离了两种化合物17-曱酰基-17-去甲氧基-18-0-21-0-二氢格尔德霉素和17-羟甲基-17-去甲氧基格尔德霉素。吸水链霉菌K279-78是含有黏粒pKOS279-78的吸水链霉菌NRRL3602,所述黏粒具有44kbp插入片段，其含有来自除莠霉素生产菌林吸水链霉菌AM-3672的多个基因(Hn等人，2004)。在格尔德霉素生物合成簇的聚酮化合物合成酶模块中的四个中，已经对酰基转移酶结构域进行了取代(Patel等人，2004)。在模块l、4和5中进行的AT取代导致了全加工的类似物14-去甲基-格尔德霉素、8-去曱基-格尔德霉素和6-去甲氧基-格尔德霉素，以及未全加工的4，5-二氢-6-去甲氧基-格尔德霉素。模块7酰基转移酶(AT)结构域的取代导致了产生三种2-去甲基化合物，KOSN1619、KOSN1558和KOSN1559，其中之一(KOSN1559)，即格尔德審素的2-去甲基-4，5-二氢-"-去曱氧基-21-脱氧衍生物，与Hsp卯的结合具有比格尔德霉素高4倍的结合亲和力，比17-AAG高8倍的结合亲和力。然而，在使用SKBr3的ICso测量中它并没有表现出改善。另一个类似物，被称为KOS-1806的新型非笨型格尔德霉素具有单酚结构(Rascher等人.，2005)。对KOS-1806没有给出活性数据。1979年，自吸水链霉菌菌林号AM-3672的发酵肉汤中分离了安沙霉素类抗生素除莠霉素A，并根据它的潜在的除草剂活性命名。通过4吏用感染了劳斯氏肉瘤病毒(RSV)温度敏感突变林的大鼠肾系细胞建立了抗肿瘤活性，所述细胞用于筛选逆转这些细胞的转化形态的药物(综述参见Uehara，2003)。推断除莠霉素A主要通过与Hsp90分子伴侣蛋白结合发挥作用，还讨论了与保守的半胱氨酸残基的直接结合，和随后的激酶的失活(Uehara，2003)。已经分离了化学衍生物，与除莠霉素A相比，在在苯醌核C19处具有改变的取代基的化合物，和在安沙链(ansachain)中的卤代化合物表现出较低的毒性和更高的抗肺瘤活性(Omura等人，1984;Shibata等人，1986b)。WO03/106653和近期的文献中鉴别了除莠霉素生物合成基因簇的序列(Rascher等人，2005)。根据它们的抗真菌和抗原生动物活性来鉴别，自诺卡氏菌属物种(Nocardiasp)No.C-14919(珍贵束丝》文线菌珍贵亚种04"/mw^me/wfl/w"/仍tmism^7/;rW仍Mm)ATCC31280)的培养上清液中分离了安沙霉素化合物麦克菌素(1)和18，21-二氢麦克菌素(2)(C-14919E-1和C-14919E-1)(Tanida等人，1980;Muroi等人，1980;Muroi等人，1981;US4，315，989和US4,187,292)。18，21-二氢麦克菌素的特征是含有二氢醌形式的核。麦克菌素和18,21-二氢麦克菌素都表现出具有相似的抗细菌和抗肿瘤活性，这是针对例如鼠白血病P388细胞系的癌细胞系(Ono等人，1982)。麦克菌素不抑制逆转录酶和末端脱氧核苷酸转移酶的活性(Ono等人，1982)。文献已经报道了麦克菌素的Hsp90抑制功能(Bohen，1998;Liu等人，1999)。在专利US4，421，687和US4,512,975中描述了在添加到孩i生物培养肉汤后，麦克菌素和18，21-二氢麦克菌素转换为在一个或多个特定位置具有羟基基团而非甲氧基团的化合物。在大量土壤微生物的筛选过程中，自属于链霉菌属的生产菌林中鉴别了化合物TAN國420A至E(7-11，EP0110710)。TAN-420A,7R^H,R2=HTAN-420C,9R一，R2=CH3TAN-420E,11RpGHg,R2=CH:NH2TAN-420B,8R，-H,R2-HTAN-420D'10RfH'R2=CH3在2000年，描述了自链霉菌属物种(^/r/^附yc^^.)S6699的细胞培养物中分离了格尔德霉素相关的、非苯醌安沙霉素代谢物reblastin,及其在治疗类风湿性关节炎中的治疗价值(Stead等人，2000)。另一个不同于化学不相关的苯醌安沙霉素的Hsp卯抑制剂是才艮赤壳素(单孢菌素)，其最初是由于抗真菌活性而自真菌波诺顿单孢菌(7l化mw/wWM附/wwonfew)中发现(综述参见Uehara，2003)，还发现其结构与自放射丛赤壳菌(Nectriaradicicola)分离的14-元环大环内酯相同。除了它的抗真菌、抗细菌、抗原生动物和细胞毒性的活性外，随后还鉴别了它作为Hsp90分子伴侣蛋白的抑制剂(综述参见Uehara，2003;Schulte等人，1999)。还描述了根赤壳素的抗血管生成活性(Hur等人，2002)及其半合成的衍生物(Kurebayashi等人，2001)。目前，注意力集中在格尔德霉素的17-M衍生物作为新一代的安沙審素抗癌化合物上(Bagatell和Whitese11，2004)，例如，17-(烯丙基胺基)-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG,12)(Hostein等人，2001;Neckers，2002;Nimmanapalli等人，2003;Vasilevskaya等人，2003;Smith-Jones等人，2004)和17-去曱氧基-17-N，N-二甲絲乙絲-格尔德霉素(17-DMAG，13)(Egorin等人，2002;Jez等人，2003)。最近，格尔德霉素在17-位衍生出17-格尔德霉素酰胺、#^甲酸酯、脲和17-芳基格尔德霉素(LeBrazidec等人，2003)。已经报道了超过60种17-烷基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素类似物的文库，并测试它们与Hsp90的亲和力和水溶性(Tian等人，2004)。另一种降低格尔德霉素毒性的方法是通过缀合肿瘤耙向的单克隆抗体，将活性的格尔德霉素化合物选择性的靶向和递送到恶性细胞中(Mandler等人，2000)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>虽然许多这些衍生物表现出降低的肝脏毒性，但是它们仍然仅具有有限的水溶性。例如，17-AAG需要使用增溶载体(例如，Cremophore,DMSO-卵卵磷脂)，所述载体本身可能在一些患者中导致副作用(Hu等人，2004)。大多数安沙霉素类的Hsp90抑制剂享有共同的结构部分苯醌是迈克尔(Michael)受体，可以容易的与亲核物质例如蛋白质、谷胱甘肽等形成共价键。苯醌部分还与二氢醌进行氧化还原平衡，其间形成产生其它非特异毒性的氧自由基(Dikalov等人，2002)。例如，使用格尔德霉素治疗可以导致诱导性过氧化物产生(Sreedhar等人，2004a)。因此，仍然需要鉴别新型安沙霉素衍生物，其可用于癌症和/或B细胞恶性肿瘤的治疗，优选的此类安沙霉素的给药具有改善的水溶性，改善的药理学模式和/或降低的副作用模式。本发明公开了通过对母体生产菌林进行遗传改造而产生的新型安沙霉素类似物。特别的，本发明公开了新型17-氧基麦克菌素类似物，其与目前可获得的安沙霉素相比，一般具有改善的药理学性质；特别的，预期它们在一个或多个以下性质中表现出改善抗不同癌症亚型的活性、毒性、水溶性、代谢稳定性、生物可利用率和配制能力。优选的，17-氧基麦克菌素类似物表现出改善的水溶性和/或生物可利用率。发明概述本发明提供了新型17-氧基麦克菌素类似物(其在C17位具有羟基或甲氧基基团)，制备这些化合物的方法，和在医学或作为中间体在生产其它化合物中使用这些化合物的方法。因此，本发明的第一个方面提供了麦克菌素的类似物，其在C17位具有羟基或甲氧基，麦克菌素的类似物可以具有苯醌(即，它们是麦克菌素I的类似物)或具有二氢醌部分(即，它们是18,21-二氢麦克菌素或麦克菌素n的类似物)。在更特定的方面，本发明提供了根据下列式(IA)或(IB)的17-氧基麦克菌素类似物，或其可药用的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中代表H、OH或OCH3;R2代表H或CH3R3代表H或CONH2R4和Rs或者都代表H或者一起代表键(即，C4至C5是双键)；和R6代表H或OH;和R7代表H或CH3.上述才艮据式(IA)或(IB)的麦克菌素类似物在本文中还被称为"本发明的化合物"，此类术语在本文中可互换的使用。式(IA)和(IB)的化合物在上述中被统称为式(I)的化合物。上述结构表现出典型的互变异构体，本发明包括式(I)的化合物的所有互变异构体，例如，酮类化合物，其中可举例烯醇类化合物，反之亦然。发明包括上文显示的结构(I)定义的化合物的所有立体异构体。在另一方面，本发明提供了麦克菌素的类似物例如式(I)的化合物，或其可药用的盐，用作为药物。定义本文所用的冠词"一个(a)"和"一种(an)"指冠词的一个或指超过一个(即至少一个)语法对象。例如，"类似物"意指一个类似物或超过一个类似物。如本文所用的，术语"类似物"指另一种化合物结构上相似的化学化合物，但其在组成上轻微的不同(如由一个原子置换另一个，或者存在或缺少特定的官能团)。如本文所用的，术语"同源物"指基因的或由本文中公开基因编码的蛋白质的同源物，所述基因来自不同的麦克菌素生产菌株中的可选的麦克菌素生物合成蔟，或者来自备选的安沙霉素生物合成基因簇的同源物，例如，来自格尔德霉素、除莠霉素或利布拉霉素(reblastatin)。此类同源物编码的蛋白质执行(可以自身执行)与所述基因或蛋白质在麦克菌素或相关的安沙霉素聚酮化合物的合成中相同的功能。优选的，此类同源物具有与本文中公开的特定基因的序列至少40%序列同一性、优选的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性(特别参见表3，SEQIDNO:ll，其是麦克菌素生物合成基因簇中的所有基因的序列，可以从中推断特定基因的序列，以及参见附图6A和6B，SEQIDNO:20和21，其显示了gdmL的核酸以及所编码的^tJ^酸序列)。百分比同一性可以4吏用任何本领域技术人员已知的程序来计算，例如在NCBI网站可获得的BLASTn或BLASTp。如本文所用的，术语"癌症"指细胞在皮肤或身体器官中恶性或良性的新生长，例如但不限于在乳房、前列腺、肺、肾、胰腺、脑、胃或肠中。癌倾向于渗透到邻近组织并扩散(转移)到远处器官上，如转移到骨、肝、肺或脑中。本文所用的术语癌包括转移性肺瘤细胞类型(例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横紋肌肉瘤、和肥大细胞瘤)和组织癌类型(例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、成胶质细胞瘤(gliobastoma)、原发性肝癌和卵巢癌。本文所用的术语"B-细胞恶性肿瘤，，包括一组疾病，其包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤，和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。它们是血液和造血器官的瘤性疾病。它们造成骨髓和免疫系统功能障碍，其使宿主对于感染和出血高度易感。如本文所用的，术语"生物利用率，，指施用后药物或其他物质被吸收或变得在生物活性位点上可利用的程度或速率。该性质依赖于许多因素，包括化合物的溶解性、肠中的吸收率、蛋白质结合和代谢的程度等。本领域技术人员将熟知各种生物利用率测试，例如在Egorin等人(2000)中描述的。在本申请中使用的术语"水溶性，，指在水介质例如pH7.3的磷酸緩冲的盐溶液(PBS)中的溶解度。在后述实施例中给出了示例性的水溶性测定。如本文所用的，术语"后-PKS基因"指聚酮化合物的后-聚酮化合物合1|#饰作用需要的基因，例如但不限于单加氧酶、O-甲基转移酶和氨甲酰基转移酶。该术语还特别涵盖了向C17位添加氧所需要的基因，例如gdmL及其同源物。特别的，术语"麦克菌素后-PKS基因"指那些修饰在麦克菌素PKS基因蔟中的基因的基因，即，mbcM、mbcN、mbcP、mbcMTl、mbcMT2和mbcP450。本发明的化合物，例如式(I)的化合物，的可药用的盐包括由可药用的无机或有机酸或碱形成的常规的盐以及季铵酸加成盐。合适酸式盐的更特定的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸(palmok)、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、安息香酸、7jC杨酸、富马酸、甲苯磺酸、曱磺酸、^2-磺酸、苯磺酸、羟基萘曱酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、单宁酸等的盐。其他酸，如草酸，它们本身不是可药用的，可用于制备盐，所迷盐用作为中间体获得本发明的化合物和它们的可药用的盐。合适的碱式盐的更特定实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N，-二千基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。本发明以后谈及本发明的化合物时包括式(I)的化合物及其可药用的盐。如本文中使用的，术语"18，21-二氢麦克菌素"和"麦克菌素II"(麦克菌素的二氢醌形式)是可互换的使用的。附图的简要描述图1:麦克菌素的生物合成的示意，显示笫一个推定的无酶中间体、前麦克菌素和后-PKS加工为麦克菌素。附图中的PKS加工步骤的列表不是意在代表事件的顺序。下列缩写用于簇中的特定基因AL0-AHBA加栽结构域；ACP-酰基载体蛋白质；KS-p-酮基合酶；AT-酰基转移酶；DH-脱水酶；ER-烯酰还原酶；KR-P-酮基还原酶。图2:产生麦克菌素的前麦克菌素的后-PKS加工位点的描述。图3:产生珍责束丝放线菌(JcftVi仍j;w/ie附a/)f油Vw"附)菌林的图示，其中，已经符合读框地缺失了mbcP、mbcP450、mbcMTl和mbcMT2基因。图4:扩增的PCR产物l+2a的序列(SEQIDNO:14)。图5:扩增的PCR产物3b+4的序列(SEQIDNO:17)。图6:A-含有gdmL的PCR产物的核酸序列B-GdmL的^J^^列发明描述如上所述，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物，制备这些化合物的方法，和在医学中使用这些化合物的方法，和这些化合物作为中间体或才莫板用于进一步半合成衍生作用或通过生物转化方法的衍生作用的用途。合适地17-氧基麦克菌素类似物具有根据式IA的结构。合适地17-氧基麦克菌素类似物具有根据式IB的结构。合适地R3代表CONH2合适地R6代表OH。可选的R^、表H。合适地R7代表H。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有根据式(IA)的结构，其中I^代表H,R2代表H,R3代表CONH2、114和Rs^f戈表H、代表OH以及R7代表H。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有才艮据式(IB)的结构，其中R，代表H，R2代表H，R3代表CONH2、114和115各代表11、以及R7代表H。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有才艮据式(IA)的结构，其中R,代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H、Rg代表OH以及R7代表CH3。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有才艮据式(IB)的结构，其中Ri代表H，R2代表H，R3代表CONH2、R4和Rs各代表H以及R7代表CH3。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有根据式(IA)的结构，其中Ri代表H，R2代表H,R3代表CONH2、R4和Rs各代表H、Rg代表H以及R7代表H。在特定的实施方案中，17-氧基麦克菌素类似物具有才艮据式(IA)的结构，其中Rj代表H，R2代表H，R3代表CONH2、Rj和Rs各代表H、代表H以及R7代表CH3。附图1和2中显示了对于麦克菌素，非氢侧链相对于柄型环(ansaring)的优选的立体化学(也就是说优选的立体化学遵循麦克菌素的立体化学)。当本发明的化合物的Re代表OH时，可以从发酵肉汤中以其苯醌形式或以其二氢醌形式分离出来。本领域普遍已知苯醌类可以化学转化为二氢醌类(还原作用)，反之亦然(氧化作用)，因此，这些形式可以使用本领域技术人员普遍已知的方法方便的互变。例如但不限于，如果分离了苯醌形式，则可以转化为相应的二氩醌类。作为示例(但不出于限制)，其可以在具有氢化物源的有机介质中实现，例如但不限于LiAlH4或SnCl2-HCl。可选的，可以通过将本发明的化合物的苯醌形式溶解在有机介质中，然后用还原剂的水溶液洗涤来介导该转化，所述还原剂例如但不限于，连二亚石危酸钠(NazS204或sodiumthionite)。优选的，该转化是通过将本发明的化合物溶解在乙酸乙酯中，并强力的混合该溶液与连二亚石克酸钠的水溶液来实现的(Muroi等人，1980)。然后，可以用水洗涤所获得的有机溶液，干燥，在减压下去除溶剂，产生几乎定量的本发明化合物的18,21-二氬形式。为了将二氢醌氧化为醌，可使用一些方法，包括但不限于以下方法将本发明化合物的二氢醌形式溶解在有机溶剂中，例如乙酸乙酯，然后强力的混合该溶液与氯化铁(III)(FeCb)的水溶液。然后，用水洗涂有机溶液，干燥，在减压下去除溶剂，产生几乎定量的麦克菌素化合物的苯醌形式。本发明还"^供药物组合物，其包含17-氧基麦克菌素类似物，或其可药用的盐，以及可药用的载体。本发明还提供使用17-氧基麦克菌素类似物作为底物，用于通过生物转化或通过合成化学进行其它修饰的用途。在一个方面，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物在生产药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物在生产用于治疗癌症和/或B细胞恶性肺瘤的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了17-氣基麦克菌素类似物在生产用于治疗疾疾、真菌感染、中枢神经系统疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗的药物中的用途。在另一个方面，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物在医学中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物在治疗癌症和/或B细胞恶性肿瘤中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了17-氧基麦克菌素类似物在生产用于治疗疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或作为癌症的预防性预治疗的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症和/或B-细胞恶性肿瘤的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的17-氧基麦克菌素类似物。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病和/或癌症的预防性预治疗的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的17-氧基麦克菌素类似物。如上所述，可以预期本发明的化合物可用于癌症和/或B-细胞恶性胂瘤的治疗。本发明的化合物在其它适应证的治疗中也是有效的，例如但不限于疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病例如类风湿性关节炎和/或作为癌症的预防性预治疗。中枢神经系统疾病和神经变性疾病包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、朊病毒病、脊髓和延髓性肌萎缩(SBMA)和肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)。依赖血管发生的疾病包括但不限于，年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变和多种其它眼病、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。自身免疫病包括但不限于，类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病、全身性红斑性狼疳和银屑病。"患者"涵盖人类和其它动物(特别是哺乳动物)对象，优选的人对象。相应的本发明的17-氧基麦克菌素类似物的方法和用途是在人医学和兽医学中的用途，优选的人类医学。上述本发明的化合物或其制剂可通过任何常规方法施用，例如但不限于，肠胃外(包括静脉内给药)、口服、局部(包括口聘、舌下或经皮)、通过医疗设备(如支架)、通过吸入或经注射(皮下或肌内)的施用。治疗可由单次剂量或一段时间的多次剂量构成。尽管本发明的化合物可以单独施用，但优选的将它与一种或多种可接受的载体一起，以药物制剂提供。因此，提供了药物组合物，其包含本发明的化合物，和一种或多种可药用的稀释剂或载体。稀释剂或载体必须是"可接受的"，含义是与本发明的化合物相容并且对其接受者无害。合适的载体例子在以下将更详细地描述。本发明的化合物可单独或与其他治疗剂共施用。共施用两种(或更多)物质可以允许显著降低每种使用的剂量，由此减少可见的副作用。它还可允许疾病例如癌症，对已经产生耐受性的在先治疗效果复敏。其还提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和其它治疗剂，以及一种或多种可药用的稀释剂或载体。在另一方面，本发明提供了本发明的化合物在与第二种物质的联合疗法中的用途，所迷第二种物质例如用于治疗癌症或B细胞恶性肿瘤的第二种物质如细胞毒剂或细胞生长抑制剂。在一个实施方案中，本发明的化合物与另一种治疗剂共施用，所述另一种治疗剂例如用于治疗癌症或B-细胞恶性肿瘤的治疗剂如细胞毒剂或细胞生长抑制剂。示例性的其它物质包括细胞毒剂，例如烷化剂和有丝分裂抑制剂(包括拓朴异构酶II抑制剂和微管蛋白抑制剂)。其它示例性的其它物质包括DNA结合剂、抗代谢物和细胞生长抑制剂，例如蛋白激酶抑制剂和酪氨酸激酶受体阻断剂。合适的物质包括但不限于，氨甲蝶呤、亚叶酸(Leukovorin)、泼尼;^(prenisone)、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)(亚德里亚霉素)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2单克隆抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)，商标名Hercq>tinTM)、卡培他滨(capecitabine)、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(例如吉非替尼(gefitinib),商标名1ressa⑧、埃罗替尼(erlotinib)，商标名TarcevaTM、西妥昔单抗(cetuximab),商标名ErbituxTM)、VEGF抑制剂(例如贝伐珠单抗(bevaciziimab)，商标名AvastinTM)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米(bortezomib)，商标名VelcadeTM)。其它合适的物质包括但不限于常规化疗药物如顺铂(cisplatin)、阿糖胞苷、环己基氯乙基亚硝基脲、吉西他滨、异环磷酰胺(ifosfamid)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、丝裂霉素、米托蒽醌(mitoxantone)、奥沙利柏(oxaliplatin)、包括紫杉醇(taxol)在内的紫杉烷类和长春地辛(vindesine);激素疗法；单克隆抗体疗法例如西妥昔单抗(抗-EGFR);蛋白激酶抑制剂如达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib);组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如伏立诺他(vorinostat);血管发生抑制剂如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、来那度胺(lenalidomide)和mTOR抑制剂如坦西莫司(temsirolimus)。其它适当的物质是伊马替尼(imatinib)，商标名为Glivec。另外，本发明的化合物可以与其它疗法(包括但不限于放射疗法或手术)组合施用。制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域的任何众知方法制备。此类方法包括使活性成分(本发明的化合物)与构成一种或多种辅助成分的载体相结合的步骤。通常，制剂通过使活性成分与液体载体或精细M的固体载体或这两者均一和紧密地结合，并且l^根据需要使产物成型而制备。本发明的化合物通常经口地或通过任何肠胃外途径以包含活性成分的药物制剂形式，任选地以无毒的有机或无机酸或碱、加成盐的形式，以可药用的剂型进行施用。根据待治疗的疾病和患者，以及施用途径，该组合物可以以变动的剂量施用。例如，本发明的化合物可以经口地、口含地或舌下地以可含有调p木剂或着色剂的片剂、胶嚢剂、胚珠制剂(ovules)、酏剂、溶液剂或混悬剂形式施用，用于立即、延迟或受控释放应用。此类片剂可以含有赋形剂(如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钩、磷酸氬钧和甘氨酸)，崩解剂(如淀粉(优选玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉)、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂硅酸盐)，和颗粒化粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石。相似类型的固体组合物也可以作为填充剂应用于明胶胶嚢中。在这个方面的优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)或高分子量聚乙二醇。对于含水混悬剂和/或酏剂，本发明的化合物可以与多种甜味剂或调味剂、着色物质或染色剂、与乳化剂和/或助悬剂以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油以及其组合进行合并。片剂可以通过压缩或模制，任选地连同一种或多种辅助成分而产生。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩处于自由流动形式(如粉末或颗粒)下的活性成分而制备，其中所述活性成分任选地与粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或M剂混合。模印片可以通过在合适的机器中模压以惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物而制备。片剂可以任选地包衣或刻痕并且可以如此进行配制，使用例如旨在提供所需释放模式的变动比例的羟丙基曱基纤维素而^f吏得片剂的活性成分緩慢释放或受控释放。适于经口施用的本发明制剂可以作为不连续的单元如胶嚢剂、扁嚢剂或片剂(每个单元含有预定量的活性成分)；作为散剂或颗粒剂；作为在含水液体或非含水液体中的溶液剂或混悬剂或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂而存在。活性成分还可以作为大丸剂、煎骨剂或糊剂而存在。适于局部施用于口中的制剂包括在调味基材(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含活性成分的锭剂；在惰性基材如明皿甘油或者蔗糖及阿拉伯胶中包含活性成分的软锭剂；和在合适液体载体内包含活性成分的漱口剂。应当理解除了以上具体提到的成分之外，本发明的制剂可以包括与所讨论的制剂类型有关的本领域内常用的其它制剂，例如，适于经口施用的那些制剂可以包M味剂。适应于局部施用的药物组合物可以配制为软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、浸渍敷料、喷雾剂、气雾剂或油剂、透皮装置、撒粉剂等。这些组合物可以经常规方法制备，含有活性物质。因此，它们还可以包含相容性常规载体和添加剂，如防腐剂、辅助药物渗透的溶剂、乳膏剂或软膏剂中的软化剂以及用于洗剂的乙醇或油醇。此类栽体可以占组合物的约1%至多到约98%。更通常地，它们将形成组合物的至多到约80%。仅作为说明，乳膏剂或软膏剂通过如此方式制备，即混合足量的亲水性材料与水(含有重量约5-10%的化合物)以产生具有所需稠度的乳膏剂或软膏剂。适应于透皮施用的药物组合物可以作为分立的贴剂而存在，其中所迷的贴剂意图保持与受者表皮的紧密接触延长的时间段。例如，活性物质可以通过离子电渗疗法自贴剂中送递出来。对于应用于外部组织，例如口和皮肤，组合物优选地作为局部用软骨剂或乳膏剂施加。当配制在软膏剂中时，活性物质可以随石蜡或水混溶性软膏剂基质一起应用。另外，活性物质可以随水包油乳膏剂基质或油包水基质配制在乳骨剂中。对于肠胃外施用，流体单位剂型使用活性成分和无菌运载体进行制备，其中所述的运载体例如是但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，优选是水。根据所用的运载体和浓度，活性成分可以悬浮或溶解于运载体中。在制备溶液剂中，活性成分可以溶解在注射用水中并且在装填至合适的小瓶或安瓿前过滤消毒并密封。有利地，物质如局麻药、防腐剂和緩冲剂可以溶解于运载体中。为增强稳定性，组合物可以在装填至小瓶后冷冻并且将水在真空下除去。干燥的冻干粉末随后密封于小瓶内并且可以提供附带的注射用水小瓶以便在用前复水液体。肠胃外混悬剂以如溶液剂那样的基4^目同方式制备，除了活性成分悬浮而不非溶解在运载体中并且消毒不能通过过滤进行。活性成分可以在悬浮于无菌运栽体中之前通过暴露于环氧乙烷得到消毒。有利地，可以在组合物中包括表面活性剂或润湿剂以促进活性成分均匀分布。本发明的化合物也可以使用本领域已知的医学装置施用。例如，在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以用无针头的皮下注射装置，如在U.S.5,399,163;U.S.5,383,851;U.S.5,312,335;U.S.5,064,413;U.S.4,941,880;U.S.4,790,824或U.S.4,596,556中公开的装置而施用。用于本发明中的众所周知的植入物和计量单元(module)的实例包括US4,487,603，其^Hf了用于以受控速率分配药物的可^v性-微量输注泵；US4,486,194,其公开了用于施用药物穿过皮肤的治疗装置；US4，447，233,其/>开了用于以精确输注速率送递药物的药物输注泵；US4,447,224，其公开了用于连续性药物送递的流量可变的可植入输注装置；US4,439,196，其公开了具有多腔室容器的渗透性药物送递系统；以及US4,475,196，其公开了渗透性药物送递系统。众多的其它装置如植入物、送递系统和计量单元是本领域技术人员已知的。本发明化合物的待施用剂量将根据特定化合物、所涉及疾病、受试者和疾病性质及严重性以及受试者的身体状况，和选择的施用途径而变化。适合的剂量可以毫不费力地由本领域技术人员确定。组合物可以含有0.1%重量、优选5-60%、更优选10-30%重量的本发明化合物，这取决于施用的方法。本领域技术人员会iU只到本发明化合物的最佳量和单个剂量的间隔期将由正在治疗的病症的性质和程度、施用的形式、途径和部位和正在治疗的具体受试者的年龄和条件决定，并且内科医生将最终确定待使用的合适剂量。这个剂量可以根据需要经常地重复使用。如果出现副作用，该剂量的量和/或频率可以按照正常临床惯例加以改变或降4氐。在另一个方面，本发明提供了生产17-氧基麦克菌素类似物的方法。可以认为麦克菌素以两个阶段进行生物合成。在第一个阶段，核心-PKS基因通过2-碳单位的重复装配来装配大环内酯核，所述大环内酯核然后环化形成第一个无酶中间体"前-麦克菌素"，参见附图1。在第二个阶段，一系列"后-PKS，，剪裁酶(tailoringenzyme)(例如，P450加氧酶、曱基转移酶、FAD-依赖性加氧酶和氨甲酰基转移酶)作用将多个其它基团添加到前麦克菌素模板上，获得最终的母体化合物结构，参见附图2。可以用类似的方式生物合成本发明的17-氡基麦克菌素类似物。可以通过合适的生产菌林的遗传改造来开发该生物合成生产，来获得新型化合物的生产。特别的，本发明提供了生产17-氧基麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌株，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素或其类似物；b)插入一个或多个能够氧化麦克菌素C17位的后-PKS基因；c)在用于新型化合物的生产的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和d)任选的分离所生产的化合物。在步骤(a)中，"麦克菌素或其类似物"意指麦克菌素或被&的定义涵盖的麦克菌素的那些类似物。在步骤(b)中，插入的后-PKS基因优选的是^/zw1,或其同源物。该方法还可以包括下列步骤e)缺失或灭活一个或多个麦克菌素后-PKS基因或其同源物，所述步骤通常在步骤c)前发生并且可以在步骤b)前发生。在步骤e)中，缺失或灭活一个或多个后-PKS基因合适地将有选择的完成。可选的方法还包括步骤f)再引入一个或多个缺失的麦克菌素后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生；和/或g)引入来自其它PKS簇的后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生。在另一个实施方案中，步骤e)包括灭活一个或多个后-PKS基因，或其同源物，这是通过在基因中整合DNA从而不生产功能性蛋白质。在可选的实施方案中，步骤e)包括产生一个或多个后-PKS基因或其同源物的靶向缺失。在另一个实施方案中，一个或多个后-PKS基因或其同源物通过定点诱变失活。在另一个实施方案中，对步骤a)的宿主菌抹进行突变，选择这样的修饰的菌林，其中一个或多个后-PKS酶或其同源物是无功能的。本发明还涵盖了调控一个或多个后-PKS基因或其同源物的调节子的突变，本领域技术人员将理解调节子的缺失或灭活可以具有与基因缺失或灭活相同的结果。在另一个实施方案中，步骤e)的菌林用已经缺失或灭活的一个或多个基因，或其同源物补充(complement)。在另一个实施方案中，步骤e)的菌林用来自不同的PKS簇的一个或多个后-PKS基因补充(complement)，所述基因例如但不限于这样的基因，其表达能够将曱基转移到C17的羟基的蛋白质。在本发明的特定的实施方案中，选择性插入后PKS基因的方法包括(i)使用基因组DNA做模板，通过PCR扩增分离负责C17-羟基化的基因，其中基因组DNA是自身生产相关的合适的羟化分子的菌林的基因组DNA，例如通过4吏用特定引物或简并引物从格尔德霉素生产者中分离W附丄基因，所述特定引物基于公开的^m丄序列，所述简并引物基于公开的^/附丄序列，如果模板是^//wZ基因或其序列是不可获得的的同(ii)将该基因克隆到用于转染宿主细胞的合适的载体中，其将在细胞中维持，并将允许^/附丄基因或其同源物的表达，来生产功能性的C17-羟化酶。例如但不限于，克隆吸7jC链霉菌NRRL3602g^Ml基因，将其放置在载体中的fl"/启动子之下，所述栽体还含有fl"//-01^4激活子，从而有利于^/w丄的表达。实施例2中使用的载体还含有用于接合转移的w,'r，phiBTl附着位点和阿泊拉霉素抗性标记。(iii)通过例如接合，用该载体转化宿主细胞。本领域技术人员将易于接受宿主细胞内的DNA片段可以通过多种标准方法来维持。在优选的实施方案中，可以按实施例2的描述，将启动子和^/w丄或其同源物引入链霉菌噬菌体phiBTl的染色体噬菌体附着位点中(Gregory等人，2003)本领域技术人员将理解，表达耙基因不限于在此噬菌体附着位点引入载体，或者确实使用附着位点。因此，例如通过使用pSET152的衍生物(Bierman等人，1992)，可以将表达载体引入其它噬菌体附着位点，例如链霉菌噬菌体phiC31的附着位点。可以使用其它可获得的整合功能元件(integrationfunction)来类似地实施此类整合，包括但不限于基于pSAM2整合敏例如，在pPM927中(Smovkina等人，1990))、R4整合酶(iru在pAT98(Matsimra等人，1996))、VWB整合酶(例如，在pKT02中(VanMellaert等人，1998))，和L5整合酶(例如，Lee等人，1991)的栽体。本领域技术人员将i人识到有许多》文线菌(Actinomycete)噬菌体，其可预期含有整合功能元件，所述整合功能元件可以与合适的启动子一起转移到递送栽体上，产生可用于将基因引入珍贵束丝放线菌(A/^ft'ww附)的其它系统。确实，已经M线菌中鉴别了许多噬菌体，并且可以从其中获得整合功能元件并以相似的方式使用。随着越来越多的噬菌体#^征，可以期待将有其它可以类似的使用的、可获得的整合酶。在一些情况下，这可能需要通过向整合酶添加特定的W诏位点来改变宿主菌林，从而获得高效率的整合。在合适的启动子下引入或其同源物还可以不受限制地受到以下的影响染色体中向中性位置的同源重组，染色体中向非中性位置的同源重组(例如中断选定的基因)。还可以使用自我复制的载体，例如但不限于，含有来自pSG5(例如，pKC1139Bierman等人，1992)、pIJ101(例如，pIJ487，Kieser等人，2000)和SCP2*(例如，pIJ698,Kieser等人，2000)的链霉菌复制起点。本领域技术人员还将容易的接受有许多启动子可用于GdmL或其同源物的生产，例如，可以使用来自次生^R谢物生物合成簇的启动子如启动子，如实施例2中与其关联激活子actlI-ORF4通常一起使用的actl或aetIII启动子(Rowe等人，1998)，应答压力的启动子例如抗原始霉素的启动子(Blane等人，1995)和红霉素抗性基因ermE启动子，PermE(Bibb等人，1985)和突变形式P在本发明的特定的实施方案中，选择性缺失或灭活后PKS基因的方法包括(i)基于目标基因的同源物(例如，来自格尔德霉素PKS生物合成簇和/或来自除莠霉素生物合成簇)设计简并寡聚物，从合适的麦克菌素生产菌林中分离目标基因(或其同源物)的内部片段，例如通过在PCR反应中使用这些引物，(ii)将含有该片段的质粒通过同源重组整合到相同或不同的麦克菌素生产菌林中，导致靶向基因(或其同源物)的中断，(iii)在适合麦克菌素类似物生产的条件下培养如此生产的菌林。在特定的实施方案中，步骤(i)中的麦克菌素生产菌林是奇迹束丝放线菌(y4"/wftsj;wwe附a附/>附)(A/iM'm附)。在另一个特定的实施方案中，步骤(ii)中的麦克菌素生产菌林是珍贵束丝放线菌(A/^ft'仍"附)。本领域技术人员将理解，可以使用上述方法的备选方法来获得等价的菌林，例如可以使用筒并的寡聚物从多种麦克菌素生产菌林之一中扩增目标基因，所述菌林例如但不限于珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌可以设计不同的简并寡聚物，其将成功的扩增麦克菌素生产者的耙基因或其同源物的合适区域。可以使用珍贵束丝放线菌的把基因序列产生对珍贵束丝放线菌的靶基因特异的寡聚物，然后可以从任何麦克菌素生产菌林(例如珍贵束丝放线菌或奇迹束丝放线菌)中扩增内部片段。可以与同源基因序列一起使用珍贵束丝放线菌菌林的靶基因的序列来产生简并寡聚物，然后可以从任何麦克菌素生产菌林(例如珍贵束丝放线菌或奇il^丝放线菌)中扩增内部片段。附图2显示了麦克菌素生物合成蔟中的后-PKS基因的活性。因此，本领域技术人员将能够鉴别需要缺失或灭活的额外后-PKS基因，从而实现生产目标化合物的菌林。在这些系统中可以观察到，当产生这样的菌林时可以生产一种以上的麦克菌素类似物，所述菌株中已经插入了额外的后-PKS基因，并且任选地其中一个或多个后-PKS基因或其同源物没有功能(作为描述过的方法之一包括灭活或缺失的结果)，并且任选地还已经重新插入了其它后-PKS基因。本领域技术人员将理解该做法有多种可能的理由。例如，存在后-PKS步骤的优选顺序，去除单个活性导致在对于所涉及的酶而言非天然的底物上执4亍所有后续步骤。由于对于呈递至后-PKS酶上的新底物效率的降低，其可以导致中间体在培养肉汤中积累，或者，可能由于步骤顺序已经改变，不再是剩余酶的底物的产物被分流。可选的，可以对生物合成途径中的一些基因的表ii^"影响c本领域才支术人员将理解，通过利用生长务降的变化，可以操*混合物中观察到的化合物的比例。当观察到化合物的混合物时，可以容易的使用标准技术来分离，一些技术描述在下列实施例中。可以通it^文中描述的一些方法筛选17-M麦克菌素类似物，并且在当单个化合物表现出有利的性质的情况下，可以改造菌林使该化合物是优选的。在不常见却也并非不可能的情况下，可以产生中间体，然后将其生物转化来生产需要的化合物。本发明"^供了新的麦克菌素类似物，其产生是通过一个或多个能够氧化麦克菌素17位的后-PKS基因的选择性插入，任选的结合一个或多个来自麦克菌素PKS基因簇的后-PKS基因的缺失或灭活。特别地，本发明涉及新的17-lu^麦克菌素类似物，这是通过^/附丄或其同源物的插入，任选的结合一个或多个来自麦克菌素PKS基因簇的后-PKS基因或其同源物的选择性缺失或灭活来产生。在特定的实施方案中，宿主菌林中额外缺失或灭活了一个或多个后-PKS基因，其选自附6c尸、w6cM、/w6dV、/w6ci^50、附6dWT7和/w6cAfr2。在另一个实施方案中，额外缺失或灭活了两个或多个后-PKS基因，其选自w6c尸、wi6c3/、附6c7V、附6c/^/50、附6cMT7和/n6dWT2。在另一个实施方案中，额外缺失或灭活了三个或多个后-PKS基因，其选自/wAc户、附6cM、附&7V、附&尸45。、附AdW77和附6cAfT7。在另一个实施方案中，额外缺失或灭活了四个或多个后-PKS基因，其选自wi6cP、附6cM、附6dV、附Z^iV5"、附6cM77和附6dWT2。在另一个实施方案中，额外缺失或灭活了五个或多个后-PKS基因，其选自附6c户、附6cAf、附6c7V、附6c尸450、在特定的实施方案中，缺失了/w6c尸、附6c/^50、/w6cM77和w6dWT2，引入(例如，在噬菌体附着位点)并在启动子下表达g^/附/:，来产生4，5-二氢-1l-O-去甲基-15-去曱7-羟基麦克菌素。在特定的实施方案中，缺失了附6cM，引入(例如，在噬菌体附着位点)并在启动子下表达^//丄，来产生4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-羟基-21-去氡基麦克菌素。在特定的实施方案中，缺失了w&M，引入(例如，在噬菌体附着位点)并在启动子下表达^/附丄，来产生4,5-二氢-11-0-去甲基-15-0-去曱基-17-羟基-21-去氧基麦克菌素。在特定的实施方案中，缺失了柳6dVf、附k尸、附6c/V5。、柳6dWT7和附6dWT2，引入(例如，在噬菌体附着位点)并在启动子下表达^/附1，来产生4，5-二氢-ll-0-去曱基-15-去曱氧基-17-甲氧基-21-去l^麦克菌素。在特定的实施方案中，缺失了附6cAf、附6c尸、附6c/V5^附6cM77和柳6dWT2，引入(例如，在噬菌体附着位点)并在启动子下表达^/m丄，来产生4，5-二氢-ll-0-去甲基-15-0-去甲基-17-甲氧基-21-去氧基麦克菌素。本领域冲支术人员将理解，导致基因无功能并不需要完*失基因，因此，本文中使用的术语"缺失或灭活"涵盖了任何导致基因无功能的方法，包括但不限于缺失完整的基因、缺失基因的一部分、靼基因中的插入灭活、导致基因不表达或表达失活形式的定点诱变、导致基因不表达或表达失活形式的宿主菌林诱变(例如，通M射或暴露给诱变化学物、原生质体融合或转座子诱变)。可选的，可以用抑制剂化学的损伤活性基因的功能，例如甲基双吡啶丙酮(metapyrone)(备选名称2-甲基-l，2-双(3-吡咬基-l-丙酮)，EP0627009)和嘧咬醇是加氧酶的抑制剂，可以在生产培养基中添加这些化合物来产生类似物。此外，西奈芬净是甲基转移酶抑制剂，可类似的使用但是用于在体内抑制曱基转移酶活性(McCammon和Parks1981)。在可选的实施方案中，在插入了一个或多个能够氧化17位的后-PKS基因的菌林中，可以缺失或灭活所有的后-PKS基因，然后可以通过补充作用(complementation)(例如，在附着位点处，在自我复制的质粒上，或在染色体的同源区域上插入)重新引入一个或多个基因。因此，在特定的实施方案中，本发明涉及产生17-氧基麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌株，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素；b遞择性的插入一个或多个能够氧化麦克菌素C17位的后-PKS基因，c)选择性的缺失或灭活所有的后-PKS基因，d)在用于生产新型化合物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和e)任选的分离所生产的化合物。优选的，在步骤b)中，后-PKS基因是grf附L，或其同源物。在可选的实施方案中，重新引入了在步骤c)中缺失或灭活的一个或多个麦克菌素后-PKS基因。在另一个实施方案中，重新引入了一个或多个后-PKS基因，其选自挑6c尸、附6cAf、/w6cTV、柳6ciV50、附6ciWT7和附6dWT2。在另一个实施方案中，重新引入了两个或多个后-PKS基因，其选自m6ci>、附6cAf、/wkiV、附6cf50、附6cAf77和附6c3f72。在另一个实施方案中，重新引入了三个或多个后-PKS基因，其选自附6c尸、附6cM、附6dV、m6c户450、附6dWT7和附6dWT2。在另一个实施方案中，重新引入了四个或多个后-PKS基因，其选自附6c户、附6cM、/w6dV、附6ci^50、附6dWT7和附6ciWT2。在另一个实施方案中，重新引入了五个或多个后-PKS基因，其选自wk户、附6cAf、附6ciV、附6ciW50、附6cAfJ7和附6cAfT7。在另一个实施方案中，重新引入了/w6c尸、iw6cM、/w6dV、附6ciV50、附6cAfT7和附6ciWT7。此外，在已经插入一个或多个能够氧化C17位的后-PKS基因(其中至少一个所述后-PKS基因是^/wi或其同源物)的菌林中，可以缺失或灭活麦克菌素后-PKS基因的子集，并且重新引入所^-PKS基因的更小的子集，从而得到生产17-^麦克菌素类似物的菌林，i^t本领域技术人员是显而易见的。本领域技术人员将理解，有多种方法产生含有麦克菌素生物合成基因簇的菌林，其还额外表达一个或多个能够氧化C17位的后-PKS基因，其中至少一个所述后-PKS基因是或其同源物。本领域技术人员普遍已知，聚酮化合物基因簇可以在异源宿主中表达(Pfeifer和Khosla，2001)。因此，本发明包括将麦克菌素生物合成基因簇转移到异源宿主中，所述基因簇具有^^|￡或其同源物，具有或没有抗性和调节基因，此外是完整的或者含有额外缺失。可选的，可以将麦克菌素生物合成基因簇转移到天然含有^/wl或其同源物的菌林中。如上所述用于转移此类大DNA片段的方法和载体是本领域普遍已知的(Rawlings，2001;Staunton和Weissman，2001)，或在本文中在^>开的方法中提供。在本上下文中，优选的宿主细胞林是原核生物，更优选的是放线菌或大肠杆菌(五5r/^r/c/rZaM/Z)，仍然更优选的包括但不限于奇迹束丝放线菌(A鹏vwm)、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸水链霉菌、吸水链霉菌物种(S.hygroscopicus.sp)、吸7jc链霉菌子嚢霉素变种/^gmscw'c"sv<mfl5W考c"Zc附)、筑波链霉菌(/SV"to附jces1加A:"6ae/isis)、天蓝色链霉菌(5V/^/7to附j;cesc<e//co/w)、变铅青链霉菌(5^"e尸to附ji;ces//v/V/fl/ts)、糖多孢红霉菌^y"cc/rtfn3/w/wo/vze/j幼/wflf)、脆弱链霉菌(5y，to附yc"/"ff^'"e)、阿维链霉菌(Sfre/to挑;;cesflve/7m'ft7/s)、肉桂地链霉菌(&r印to附j;c""'""a附o"ert5^)、龟裂链霉菌(5^pto考cesnVwosw)、白色链霉菌(5^尸e/^0附yces"/6m51)、灰褐链霉菌(jS^e/7to附yc^sgn'5^o/"sc"s)、黄色长孢链霉菌(&r印to附ycM/0/ig/spwo/7av"s)、委内瑞拉链霉菌(5^印to附y"sveez"e/"e)、白色链霉菌(5"/r印to附j;cM"/A附)、微单孢菌属物种(M/crowwio5poms/7.)、灰红微单孢菌(M/cm附o"osponig^yewMWrfa)、地中海拟无枝酸菌(/4附ycoZ"to/M7s附^Z/te,m"g/)或游动放线菌属物种(J"/朋/;/做^印.)N902-109。其它实例包括吸水链霉菌去势亚种0SV，似考cay/y^msr—cms1s"As/;.ge/</fl/iws)和紫黑链霉菌(iSV"epto附^cesWo/ace"s"/ge尸)。在一个实施方案中，转移具有^/附丄或其同源物的完整的生物合成蔟。在可选的实施方案中，转移没有任何相关的麦克菌素后-PKS基因，但具有^/wl或其同源物的完整PKS。任选地，其可以分步进行。任选地，可以合适的引入一些后-PKS基因。任选地，可以合适的引入来自其它簇(例如格尔德霉素或除务霉素途径)的额外的基因。在其它实施方案中，转移具有^/附丄或其同源物的完整的麦克菌素生物合成簇，然后^艮据本文描述进行^Mt。在本发明的可选的方面，还可以通过合适菌林的生物转化来处理本发明的17-氡基麦克菌素类似物。合适的菌林或者是可获得的野生型菌林，例如但不限于奇迹束丝放线菌、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸水链霉菌、吸7K链霉菌物种(S.hygroscopicussp.)。可选的，合适的菌林可以被改造，从而允许用特定的后-PKS酶生物转化，所述的后-PKS酶例如但不限于，那些由/w6cAf、w6ciV、附6c/V5〃、附6cM77、附AcM77(如本文中定义的)、gd附7V、^f附Af、grf附尸、(Rascher等人2003)格尔德霉素O-甲基转移酶、/^附W、A/wi丄、/^附户、(Rascher等人2005)除莠霉素O-曱基转移酶和其它除莠霉素单力口氧酶、os附7、fls附J0、os附JJ、os附J2、aw柳79和flw附27(Cassady等人，2004，Spiteller等人，2003)所编码的。当基因尚需鉴别或序列尚未位于公众领域时，通过标准方法获得此类序列对本领域技术人员是常规的。例如，编码格尔德霉素O-曱基转移酶的基因序列不属于公众领域，但是本领域技术人员可以产生探针(使用相似的O-甲基转移酶来生产异源探针，或通过自可获得的同源基因设计简并引物并从生产的生物体中扩增DNA片段来生产同源探针)，所述探针随后可用于对格尔德霉素生产菌林进行Southern印迹，从而获得该基因来产生生物转化系统。相似的，除莠霉素簇的公开序列看起来没有最终结构需要的一个P450单加氧酶。本领域技术人员可以产生探针(使用相似的P450生产异源探针，或通过使用可获得的同源基因的序列设计简并引物并从生产的生物体中扩增DNA片段来分离同源探针)，所述探针随后用于对除莠霉素生产菌林进行Southern印迹，从而获得该基因来产生生物转化系统。在可选的实施方案中，C17-0-甲基转移酶与或其同源物共表达，来生产C17甲氡基麦克菌素类似物。可以使用上述的简并引物从格尔德霉素生产菌林中分离O-甲基转移酶。在特定的实施方案中，菌林可以有一个或多个其天然的聚酮化合物簇被完整的或部分的缺失，或者失活，从而阻止所述天然的聚酮化合物簇生产的聚酮化合物产生。所述被改造的菌林可以选自，例如但不限于，奇迹束丝放线菌、珍贵束丝放线菌珍贵亚种、吸7JC链霉菌、吸7K链霉菌物种(S.hygroscopicus.sp)、吸7jC链霉菌子嚢霉素变种、筑波链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌、糖多孢红霉菌、脆弱链霉菌、阿维链霉菌、肉桂地链霉菌、龟裂链霉菌、白色链霉菌、灰褐链霉菌、黄色长孢链霉菌、委内瑞拉链霉菌、微单孢菌属物种、灰红微单孢菌、地中海拟无枝酸菌或游动放线菌属物种N902-109。其它可能的菌林包括吸7JC链霉菌去势亚种和紫黑链霉菌。在另一个方面，本发明提供了天然生产麦克菌素或其类似物的宿主菌林，其中已经插入了grf附JL基因或其同源物，从而其因此生产17-氧基麦克菌素或其类似物(例如，如式(I)化合物定义的17-氧基麦克菌素类似物)，并且提供了它们在生产17-氧基麦克菌素或其类似物中的用途。因此，在一个实施方案中，本发明提供了遗传改造的菌林，其以其未改变状态天然的生产麦克菌素，所述菌林具有插入的一个或多个能够氧化C17位的后-PKS基因(其中至少一个所述后-PKS基因是^/w丄或其同源物)，以及任选地，缺失了一个或多个来自麦克菌素PKS基因簇的后-PKS基因。本发明涵盖了本文中描述的发明过程的所有产物。虽然上述本发明的制备17-氧基麦克菌素类似物的方法基本上或完全是生物合成的，但是并不排除通过包括标准合成的化学方法的方法来生产或相互转换本发明的17-氡基麦克菌素类似物。为了允许麦克菌素PKS基因簇的遗传操作，首先测序来自珍贵束丝i文线菌珍贵亚种的基因簇，然而，本领域技术人员将理解有备选的生产麦克菌素的菌林，例如但不限于奇迹束丝放线菌。可以如在本文对于珍贵束丝放线菌珍贵亚种所述的，对来自这些菌株的麦克菌素生物合成基因簇测序，信息用于产生等价的菌林。本发明的其他方面包括-基于麦克菌素产生菌林的改造的菌林，其中已经引入了编码能够在17-位氧化麦克菌素的活性的基因，例如^/柳￡。任选的，可以缺失或灭活其它后-PKS基因例如附6c尸、附6ci^/50、附6cM77和附6ciV/77，并且任选的可以重新引入这些基因的一些或全部，和/或任选的可以引入一个或多个来自异源簇的后-PKS基因。可以以伶河顺序执行这些步骤。合适的麦克菌素产生菌林是W"束丝放线菌或奇迹束丝放线菌。画生产17-氧基麦克菌素类似物的方法，其包括培养上述菌林。可以在本领域技术人员已知的合适的培养基中培养菌林，并提供合适的饲养物例如合适的起始酸。-这样的方法，其还包括分离17-氧基麦克菌素或其类似物的步骤。可以通过常规方法例如色i普(例如HPLC)实施分离。-此类改造的菌林在制备17-氧基麦克菌素类似物中的用途。发明的化合物的优点在于预期它们具有一个或多个下列性质与母体化合物相比，良好的抗一种或多种不同癌症亚型的活性；良好的毒理学特性例如良好的肝毒性特性、良好的肾毒性、良好的心脏安全性；良好的水溶性；良好的代員定性；良好的制剂能力；良好的生物利用率；良好的药物动力学或药效学性质例如与Hsp90的紧密结合、快速的与Hsp90的结合率和/或良好的脑药物动力学；良好的细胞摄取；和低的与红细胞的结合。实施例一般方法培养物的发酵用于生长细菌菌林珍贵束丝放线菌珍贵亚种ATCC31280(US4，315,989)和奇迹束丝放线菌DSM43827(KCCA-0225,Watanabe等，1982)的条件在专利US4,315,989和US4,187,292中描述。本文中所用方法改编自这些专利中并且如下用于在震摇培养箱内的管或烧瓶的肉汤里培养，在实施例中指出对已公开方案的改变。菌林在ISP2琼脂(培养基3，Shirling，E.B.和Gottlieb,D.，1966)上在28°C培育2-3天并且用来接种种子培养基(培养基l，见改编自US4，315，989和US4,187,292的下文)。接种的种子培养基随后于5或2.5cm的抛距(throw)以200-300转/分钟震摇，在28。C孵育48小时。为产生麦克菌素、18，21-二氢麦克菌素和麦克菌素类似物如17-氧基麦克菌素，将发酵培养基(培养基2，见下文和US4,315,989及US4，187，292)用2.5%-10%的种子培养物接种并于5或2.5cm的抛3巨以200-300转/分钟之间的震摇，开始是在28°C孵育24小时，随后26°C孵育4-6天。随后收获培养物用于提取。培养基培养基1-种子培养基在1L蒸馏水中<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>来自乳固体的胨(西格玛公司(Sigma))<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>在121。C高压灭菌20分钟进行消毒。根据需要，在高压灭菌后添加安泊拉霉素以产生终浓度50mg/L。培养基2-发酵培养基在1L蒸馏水中<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在121。C高压灭菌20分钟进行消毒。提取培养肉汤用于LCMS分析加入培养肉汤(lmL)和乙酸乙酯(lmL)并混合15-30分钟，然后离心10分钟。收集0.5mL的有机层，蒸发干燥，然后重溶于0.25mL的甲醇，或0.23mL的甲醇+0.02mL的1。/。FeCl3溶液中。LCMS分析流程可以^(吏用AgilentHP1100HPLC系统结合BrukerDaltonicsEsquire3000+电喷射质i脊仪在阳离子和/或阴离子模式操作下来实施LCMS。可以在PhenomenexHyperclone柱上(C18BDS，3u，150x4.6mm)实施色^普，在lmL/分钟的流速下洗脱，使用下列梯度洗脱过程T=0，10%B;T=2，10%B;T=20，100%B;T=22，100%B;T=22.05,10%B;T=25，10%B。流动相A-水+0.1。/。曱酸；流动相B-乙腈+0.1。/。甲酸。在l卯和400nm之间记录UV语，在210、254和276nm获得提取的色语。在100和1500amu之间记录质谱。NMR结构^兌明方法可以在BrukerAdvance500分光计上，以298K，在500MHz和125MHz操作，分别对^和13C记录NMR语。可以使用标准的Bruker脉沖序列获得iH」HCOSY、APT、HMBC和HMQC谱。NMR谱可以用其所运行的溶剂中的剩余质子或标准碳共振作为参照。化合物纯度的评价可以使用上述LCMS方法分析纯化的化合物。可以通过MS在多波长下(210、254和276nm)评价纯度。所有的化合物可以在所有波长下>95%纯。最终可以通过，H和13CNMR谱的检查来确定纯度。水溶性的评价可以按如下检测水溶性在室温下在100%DMSO中制备17-氧基麦克菌素类似物的10mM储液。将一式三份0.01mL等分试样，在安培(amper)瓶中用0.1MPBS，pH7.3溶液或100%DMSO补充到0.5mL。在黑暗中振荡所获得的0.2mM溶液，室温下在IKAvibraxVXR振荡器上振荡6小时，然后将获得的溶液或悬浮液转移到2mLEp管中，在13200rpm离心30分钟。然后用如上所述LCMS分析上清液的等分试样。在258nm通过峰值区域测量来定量化合物。所有分析均一式三份的实施，通过比较PBS溶液和DMSO中的0.2mM(假设DMSO中的溶解度为100°/。)计算17-氧基麦克菌素化合物的溶解度。抗癌活性的体外生物测定可以在实验肿瘤学研究所肿瘤检测公司的肿瘤检测测试实验室(OncotestTestingFacility,InstituteforExperimentalOncology,OncotestGmbH，Freiburg)进行化合物的抗癌活性的体外评价，这是在一组人肿瘤细胞系中在单层增殖测定中进行。表l中总结了挑选的细胞系的特征。表l-测试细胞系#细胞系特征51CNXF498NLCNS2CXFHT29结肠3LXF1121L肺、大细胞ca4MCF-7乳腺、NCI标准5MEXF394NL黑素瘤1G6DU145前列腺-PTEN阳性Oncotest细胞系是按Roth等人，(1999)描述的>^肿瘤异种移植物中建立的。Fiebig等人，(1999)描述了供体异种移植物的起源。其它的细胞系是自NCI(DU145，MCF-7)获得的或自DSMZ公司(DSMZ)，Braunschweig,德国购买的。除非另作说明，所有的细胞系均在加湿的大气中(95%空气,5%C02)，37。C下，在含有RPMI1640培养基、10。/。胎牛血清和0.1mg/mL庆大霉素(PAA，Cmbe,德国)的"即用混合(ready-mix)，，培养基中生长。可以使用改良的碘化丙锭测定来评价测试化合物对人肿瘤细胞系的生长的影响(Dengler等人，(1995))。简而言之，通过胰酶消化从指数期培养物中收获细胞，计数并置于96孔平底微量滴定板上，所放置的细胞密度取决于细胞系(5-10,000活细胞/孔)。恢复24小时以允许细胞重新指数生长后，向孔内添加O.OlOmL的培养基(每个平板6个对照孔)或含有麦克菌素的培养基。每个浓度一式三份放置。化合物以两个浓度(1照/mL和10|Lig/mL)应用。在连续暴露4天后，用0.2mL的含水碘化丙锭(PI)溶液(7mg/L)替换具有或没有测试化合物的细胞培养基。为了测量活细胞的比例，通过冷冻平板对细胞进行透化处理。在平板融化后，使用Cytofluor4000微量平板读数仪测量荧光(激发530nm，发射620nm)，产生与活细胞总数的直接关系。用处理/对照x100(%T/C)来表示生长抑制。实施例1-对麦克菌素PKS基因簇的测序基因组DNA使用Kieser等(2000)中所述的标准方案从珍贵束丝放线菌(ATCC31280)和奇迹束丝放线菌(DSM43827，ATCC29888)分离。DNA测序通过位于剑桥CB21QW的TennisCourt路的剑桥大学生物化学系的测序设备，使用标准方法实施。4吏用引物BIOSG1045'画GGTCTAGAGGTCAGTGCCCCCGCGTACCGTCGT-3，(SEQIDNO:1)和BIOSG1055'-GGCATATGCTTGTGCTCGGGCTCAAC-3'(SEQIDNO:2)，利用标准技术扩增来自吸7JC链霉菌NRRL3602(序列登录号AY179507)的格尔德霉素生物合成基因簇中的氨甲酰基转移酶编码基因^/附见Southern印迹实验使用DIG试剂和用于非放射性核酸标记和检测的试剂盒根据制造商的说明书(罗切公司(Roche))实施。DIG标记的gd附7VDNA片段用作异源探针。使用^mTV产生的探针和从珍贵束丝放线菌2112分离的基因组DNA，在Southern印迹分析中鉴定到大约8kbEcoRI片段。该片段采用标准方法被克隆至Litmus28并且通过菌落杂交法鉴定转化体。克隆p3被分离并对大约7.7kb插入片段测序。从克隆p3中分离的DNA用EcoRI和EcoRI/SacI消化并且分别分离在约7.7kb和在约1.2kb处的条带。标记反应根据制造商的方案实施。使用载体SuperCos1和GigapackIIIXL包装试剂盒(斯莱特因^^司(Stratagene))根据制造商的说明书产生以上所提及两个菌林的黏粒文库。这两个文库使用标准方案加以筛选并且使用来自克隆p3的7.7kbEcoRI片段的DIG标记片段作为探针。縣粒52从珍贵束丝放线菌的黏粒文库中鉴定并提交至剑桥大学生物化学系测序设备进行测序。类似地，勦粒43和黏粒46从奇迹束丝放线菌的黏粒文库鉴定。这三种黏粒如Southern印迹分析所示均含有7.7kbEcoRI片段。黏粒43的PKS区的约0.7kbp片段4吏用引物BIOSG1245'國CCCGCCCGCGCGAGCGGCGCGTGGCCGCCCGAGGGC-3，(SEQIDNO:3)和BIOSG1255'-GCGTCCTCGCGCAGCCACGCCACCAGCAGCTCCAGC-3'(SEQIDNO:4)采用标准方案扩增、克隆并且用作探针对珍贵束丝放线菌黏粒文库筛选重叠克隆。黏粒52的序列信息也用来产生用于篩选珍贵束丝放线菌黏粒文库的衍生自DNA片段的探针，其中所述的DNA片段由引物BIOSG1305'-CCAACCCCGCCGCGTCCCCGGCCGCGCCGAACACG隱3'(SEQIDNO:5)和BIOSG1315-GTCGTCGGCTACGGGCCGGTGGGGCAGCTGCTGT-3'(SEQIDNO:6)以及BIOSG1325'-GTCGGTGGACTGCCCTGCGCCTGATCGCCCTGCGC画3'(SEOIDNO:7)和BIOSG1335隱GGCCGGTGGTGCTGCCCGAGGACGGGGAGCTGCGG-3,(SEQIDNO:8)扩增。分离黏粒311和352并且将黏粒352送交测序。黏粒352含有与黏粒52的大约2.7kb重叠区。为筛选其它黏粒，使用引物BIOSG1365'-CACCGCTCGCGGGGGTGGCGCGGCGCACGACGTGGCTGC-3'(SEQIDNO:9)和BIOSG1375'-CCTCCTCGGACAGCGCGATCAGCGCCGCGCACAGCGAG-3'(SEQIDNO:10)和黏粒311作为模板，采用标准方案扩增大约0.6kbPCR片段。筛选珍贵束丝放线菌的黏粒文库并分离黏粒410。黏粒410与|*粒352重叠大约17kb并将黏粒410送交测序。将三个重叠黏粒(恭粒52、黏粒352和黏粒410)的序列装配起来。测序的区域覆盖约100kbp并且鉴定可能构成麦克菌素生物合成基因簇(SEQIDNO:ll)的23个可读框。每个可读框在SEQIDNO:ll中的位置在表3显示。表2-縣粒的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>糾立52珍贵束丝放线菌ATCC31280黏粒311珍贵束丝放线菌ATCC31280黏粒352珍贵束丝放线菌ATCC31280黏粒410珍贵束丝放线菌ATCC31280表3-每个可读框在SEQIDNO:ll中的位置SEQIDNO:11中的核苷酸位置基因名称所编码蛋白质的功能14925-17卯9*mbcRII转录调节物18025-l卯74cmbcO氨基氢化奎尼酸(Amiiiohydroquiiiate)合酶19263-20066C*mbc未知，AHBA生物合成20330-40657mbcAIPKS40654-50859mbcAIIPKS50867-62491AmbcAIIIPKS62500-63276*mbcF酰胺合酶63281-64852*mbcMC21单加氧酶64899-65696c*PH磷酸酶65693-66853c*OX氧化还原酶66891-68057c*AhsAHBA合酶68301-68732*AdhADHQ脱水酶68690-69661c*AHkAHBA激酶70185-72194c*mbcN氨曱酰基转移酶<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>注1:c表示该基因由互补DNA链编码；注2:有时候可以鉴定出多于一个的潜在候选起始密码子。本领域技术人员会认出这种情况并且能够鉴定备选的可能起始密码子。我们已经用符号'*'标出具有多于一个可能起始密码子的那些基因。尽管我们标出了我们所认为的起始密码子，然而，本领域技术人员理解可以有使用备选起始密码子产生活性蛋白质的可能实施例2——4，5-二氢-ll-0-去曱基-15-去甲氧基-17-羟基-麦克菌素的生产产生珍贵束丝放线菌菌株，其中，已经符合读框地缺失了w&尸、柳6c/M50、附6d^T77和柳6cMr2基因，在该菌林中，还额外表达^/附丄来生产4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲M-17-羟基-麦克菌素。2.1克隆与附6cM77下游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板以及PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del1(SEQIDNO:12)和ls4del2a(SEQIDNO:13),在标准的PCR反应中从珍贵束丝it线菌(ATCC31280)中扩增1595bp的DNA区域。在寡聚物ls4del2a中设计了5，延伸，来引入爿vrll位点，帮助扩增片段的克隆(附图3)。扩增的PCR产物(l+2a，附图4SEQIDNO:14)编码附6dWT2的3'端的196bp,以及下游同源的另外1393bp。将该1595bp片段克隆到已经用5>"1线性化的pUC19中，获得质粒pLSSl+2a。ls4del1(SEQIDNO:12)5，-GGTCACTGGCCGAAGCGCACGGTGTCATGG-3"ls4del2a(SEQIDNO:13)5，一CTAGGCGACTACCCCGCACTACTACACCGAGCAGG-3"2.2克隆与附6dlf上游侧翼区域同源的DNA使用黏粒52(来自实施例1)作为模板和PfuDNA聚合酶，使用寡聚物ls4del3b(SEQIDNO:15)和ls4del4(SEQIDNO:16)，在标准的PCR反应中从珍贵束丝放线菌(ATCC31280)中扩增1541bp的DNA区域。在寡聚物ls4del3b中设计了5，延伸，来引入爿wll位点，帮助扩增片段的克隆(附图3)。扩增的PCR产物(3b+4，附图5SEQIDNO:17)编码附Ac尸的5，端的95bp,以及上游同源的另外1440bp。将该1541bp片段克隆到已经用线性化的pUC19中，获得质粒pLSS3b+4。ls4del3b(SEQIDNO:15)5，一CCTAGGAACGGGTAGGCGGGCAGGTCGGTG-3'ls4del4(SEQIDNO:16)5,-GTGTGCGGGCCAGCTCGCCCAGCACGCCCAC-3'将产物l+2a和3b+4克隆到pUC19中，以利用pUC19多聚接头中的和5a附HI位点用于下一克隆步骤。将来自pLSSl+2a的1621bp/4wII////"dIII片段，和来自pLSS3b+4的1543bp^vrlI/5fl附HI片段克隆到pKC1132的3556bpi7/"dlII/Ba附HI片段中，产生pLSS315。因此，pLSS315含有历wdlII/jB"附HI片段，其编码与在爿vrll位点融合的所需的四个ORF缺失区域的侧翼区域同源的DNA(附图3)。2.3珍贵束丝放线菌珍贵亚种的转化使用pLSS315用电穿孔转化具有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567,产生用于接合的大肠杆菌供体菌林。通过营养接合(Matsushima等人，1994)使用该菌林转化珍贵束丝放线菌珍贵亚种。将接合后体涂布在MAM培养基(1%小麦淀粉、0.25%玉米浆固体、0.3%酵母提取物、0.3%碳酸4丐、0.03%硫酸铁、2%琼脂)上，在28。C孵育。在24小时后用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘啶酮酸涂布平板。由于pLSS315在珍贵束丝放线菌珍贵亚种中不能复制，预计阿泊拉霉素抗性菌落是包含质粒的转化体，其中所述质粒藉由质粒来源的同源性区域通过同源重组被整合到染色体中，2.4筛选次级交换(secondarycross)选择6个麦克菌素生产接合后体用于进一步分析。从6个接合后体中分离基因组DNA，消化并用Southern印迹分析。印迹显示，6个分离体中的5个已经在同源性的RHS区域中发生整合，6个分离体中的1个已经在LHS区域中发生了同源整合。选择由LHS区域中的同源性整合产生的一林菌林(BIOT-3829;珍贵束丝放线菌pLSS315#9)和由RHS区域中的同源性整合产生的两林菌林(BIOT-3826;珍贵束丝放线菌pLSS315#3和BIOT-3830;珍贵束丝放线菌pLSS315#12)进行传代培养，来筛选次级交换。将菌林涂斑(patch)至MAM培养基上(补充以50mg/L阿泊拉霉素)并在28°C生长4天。每个菌斑(patch)的1cm2区域被用来接种在50ml福尔肯管(falcon)中的7mL的ISP2(0.4%酵母提取物、1%麦芽提取物、0.4%右旋葡萄糖，未补充抗生素)。培养物生长2-3天，然后传代培养(5%接种物)至50mL福尔肯管中的7mLISP2中。在4-5轮传代培养后，将培养物超声处理，连续稀释，涂布到MAM培养基上，并在M。C孵育4天。然后将单个菌落一式两份涂斑到含有阿泊拉霉素的MAM培养基上和不含抗生素的MAM培养基上，并且将平板在28°C孵育4天。将生长在无抗生素平板上、但没有生长在阿泊拉霉素平板上的菌斑，重新涂斑到+/-阿泊拉霉素平板上，验证它们已经丟失了抗生素标志物。需要的突变菌林具有麦克菌素蔟的3892bp缺失，包含基因w6c尸、附6c/V50、附6dWT7和附6dWT2。从含有正确缺失的珍贵束丝放线菌pLSS315M2产生的一个菌落被命名为BIOT-3852。按一般方法中描述的提取和分析来自该菌林的发酵肉汤。LCMS分析表明没有生产麦克菌素，但是观察到保留时间为15.0分钟，和m/z-515.5[M-H-，539.5[M+Na]+的单个、更高极性的、主要组分"。通过LCMS和NMR无法区分该组分(在分离后)与另外生产的化合物4，5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲緣麦克菌素，2.5质粒Lit28gdmL的分离使用标准技术，从吸7JC链霉菌NRRL3602的格尔德霉素生物合成基因簇(序列登录号AY179507)中，使用寡聚物BioSGllO(SEQIDNO:18)和BioSGlll(SEQIDNO:19)，扩增1512bp的DNA区域。(SEQIDNO:20;附图6A，还显示了gdmL的^J^酸序列，附图6B，SEQIDNO:21)。在引物末端引入的和iVrfel限制性酶切位点用下划线标示。将扩增的PCR产物，使用标准技术克隆到已经预先用JcoRV线性化的载体Litmus28中。分离质粒Lit28gdmL，并用DNA序列分析证实。BioSGllO(SEQID脆19):5，-GGCATATGTTGACGGAGAGCACGACCGAGGTCGTTG-3"BioSGlll(SEQIDNO:18):5，画GGTCTAGAGGTCAGGGCACCCTCGCGAGGTCGCCGG画3'2.6质粒pGP9gafwl的分离用7Vrfel/AT/ml消化质粒Lit28gdmL,分离约1.5kb插入DNA片段，并克隆到A^el/AT^iI处理的栽体pGP9中。使用标准技术分离质粒pGP9gdmL。通过限制性消化分析验证构建体。2.7用pGP9gdmL补充BIOT-3852使用质粒pGP9gdmL对BIOT-3852的接合实验按如下进行。使用具有质粒pUZ8002的大肠杆菌ET12567通过电穿孔转化pGP9gdmL，产生用于接合的大肠杆菌供体菌林。该菌林与BIOT-3852组合用于接合实验(Matsushima等人，1994)。将接合后体涂布到培养基4(MAM培养基)上，并且在28。C孵育。在24小时后将平板用50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸涂布。将转化体涂斑至含有50mg/L阿泊拉霉素和25mg/L萘咬酮酸的MAM平板(培养基4)上。使用来自每个菌斑的6mm环形塞(circularplug)接种含有补充了50mg/L阿泊拉霉素的10mL种子培养基(由培养基1调整的一2%葡萄糖、3%可溶性淀粉、0.5。/。玉米浆固体、1%豆粉、0.5%胨、0.3。/。氯化钠、0.5%碳酸4丐)的各个50mL福尔肯管中。这些种子培养物在28°C、以2英寸抛距的200rpm孵育2天。然后，这些种子培养物用于接种(0.5mL至10mL中)生产培养基(培养基2-5%甘油、1%玉米浆固体、2。/o酵母提取物、2%磷酸二氢钾、0.5%氯化镁、0.1%碳酸钧)，并在28。C生长24小时，然后在26。C生长另外6天。按一般方法中描述的实施发酵肉汤的提取和后续的LCMS检测。在一个此类提取物中，除了产生14以外，还观察到保留时间为13.4分钟洗脱的少量新化合物(15)的产生。其表现的特征性离子具有m/z=531.4[M-H]—和555.4[M+Na+,这与15为化合物4,5-二氢-11-0-去甲基-15-去甲氧基-17-羟基麦克菌素一致。在本申请中参考的所有文献，包括专利和专利申请，都以其最完整的程度整合到本文中作为参考。在说明书和以下的权利要求中，除非上下文另外要求，词语"包含"，及其变体例如"含有，，和"包括"都将理解为包括所述整体或整体的步骤或群组，但不排除任何其他的整体或整体的步骤或群组或者步骤。参考文献Allen,I.W.和Ritchie,D.A.(1994)CloningandanalysisofDNAsequencesfrom5^re/;to附3;cesAj;gmsc甲'c"sencodinggeldanamycinbiosynthesis.Mol.Gen.Genet.243:593-599.Bagatell，R.和Whitesell，L.(2004)AlteredHsp90functionincancer:Auniquetherapeuticopportunity.MolecularCancerTherapeutics3:1021-1030.Beliakoff，J.和Whitesell,L.(2004)Hsp90:anemergingtargetforbreastcancertherapy.Anti-CancerDrugs15:651-662.Bibb,M.J"G.R.Janssen，等人(1985)."CloningandanalysisofthepromoterregionoftheerythromycinresistancegeneofSfre尸to考ceye/j幼rae"s."Gene38(1-3》215-26.Bierman，M.，Logan,R.，O'Brien,K.，Seno,ET.，NagarajaRao，R.和Schemer,BE.(1992)"PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfrom^"5r/rm'c/r/flrco/i'to5^尸ep似考cess//."Gene116:43-49.Blagosklonny,M.V.(2002)Hsp-90-associatedoncoproteins:multipletargetsofgeldanamycinanditsanalog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氧基麦克菌素类似物、组合物、用途或方法，其中其它治疗选自常规化疗药物如顺铂、阿糖胞苷、环己基氯乙基亚硝基脲、吉西他滨、异环磷酰胺、甲酰四氢叶酸、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂；包括紫杉醇在内的紫杉烷类和长春地辛；激素疗法；单克隆抗体疗法例如西妥昔单抗(抗-EGFR);蛋白激酶抑制剂如达沙替尼和拉帕替尼；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂如伏立诺他；血管发生抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、来那度胺；mTOR抑制剂如坦西莫司；以及伊马替尼。24.生产根据权利要求1至15的任一项的17-氧基麦克菌素类似物的方法，所述方法包括a)提供第一个宿主菌林，其在合适的条件下培养时生产麦克菌素或其类似物；b)插入一个或多个通常与麦克菌素PKS基因簇不相关的后-PKS基因，其中至少一个所述后-PKS基因是grfwl，或其同源物；c)在用于生产新型化合物的合适的条件下培养所述修饰的宿主菌林；和d)任选的分离所生产的化合物。25.根据权利要求24的方法，其额外包括步骤e)缺失或灭活一个或多个麦克菌素后-PKS基因或其同源物，所迷步骤通常在步骤c)前发生。26.根据权利要求25的方法，其额外包括步骤f)再引入一个或多个缺失的后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生。27.根据权利要求24至26的任一项方法，其额外包括步骤g)引入来自其它PKS簇的后-PKS基因，所述步骤通常在步骤c)前发生。28.遗传改造的宿主菌林，其在其未改变的状态下天然的生产麦克菌素，所述菌林具有插入的一个或多个与麦克菌素PKS基因簇不天然相关的后-PKS基因，其中至少一个所述后-PKS基因是^//￡或其同源物。29.权利要求28的宿主菌林，其中已经额外缺失了来自麦克菌素PKS基因簇的一个或多个后-PKS基因。30.权利要求29的宿主菌株，其中已经重新引入了一个或多个缺失的后-PKS基因。31.权利要求28至30的任一项的宿主菌林，其中已经重新引入了来自异源PKS簇的一个或多个后-PKS基因。32.权利要求29的宿主菌林，其中已经缺失了附Ac户、w6c/V50、附&厘77和附6dlf77，并且已经引入了。33.根据权利要求28至32的任一项的宿主菌林，其是珍贵束丝放线菌(J./v幼Vmwi)或奇迹束丝i丈线菌(爿.附,V""附)。34.生产17-氧基麦克菌素或其类似物的方法，其包括培科艮据权利要求28至33的任一项的菌林。35.根据权利要求34的方法，其还包括分离17-M麦克菌素或其类似物的步骤。36.根据权利要求28至33的任一项的宿主菌株生产17-IL&麦克菌素或其类似物的用途。全文摘要本发明涉及在例如治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、疟疾、真菌感染、中枢神经系统疾病和神经变性疾病、依赖血管发生的疾病、自身免疫疾病中和/或作为癌症的预防性预治疗中有效的根据式(IA)或(IB)的17-氧基麦克菌素类似物或其可药用盐，其中R₁代表H、OH或OCH₃；R₂代表H或CH₃，R₃代表H或CONH₂，R₄和R₅每个都代表H或它们一起代表键(即C4至C5是双键)；以及R₆代表H或OH；以及R₇代表H或CH₃。本发明还提供了生产这些化合物的方法和它们在药物中的用途，特别是在癌症或B细胞恶性肿瘤的治疗和/或预防中的用途。文档编号A61K31/395GK101437802SQ200780016588公开日2009年5月20日申请日期2007年5月9日优先权日2006年5月9日发明者C·马丁,M·张,N·科茨,S·盖瑟申请人:百奥帝卡技术有限公司