用于治疗脊髓增生病的jak抑制剂的制作方法

专利名称：用于治疗脊髓增生病的jak抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及脊髓增生病(NfPDs)和脊髓发育异常综合征的治疗。具 体地说，本发明涉及使用作为JAK2抑制剂的化合物，特别是使用稠合 吡咯并咔唑化合物来治疗MPDs和脊髓发育异常综合征。
背景技术：
脊髓增生病(MPDs)是一种特征在于一种或多种造血谱系超量产生 的无性系恶性病，该造血谱系具有导致细胞过多骨髓(BM)的相对正常 的分化。认为MPDs出现在单一的多能祖细胞或干细胞中，其支配BM 和血液。经过培养的得自MPDs患者的造血祖细胞显示生长性改变和 生长因子非依赖性。对于某些MPDs的分子基础还不清楚的，直到一 系列新近的报告识别了在JAK2的假激酶(pseudokinase)结构域中的单 个氨基酸替换V617F，在真性红细胞增多症(PV)、特发性血小板增多(ET) 和慢性特发性骨髓纤维化(CIMF)中作为盛行的分子损害。这一突变在 75%-97%的PV患者和约40%-50%的ET和CIMF患者中被发现(James 等人，2005, Trends in Molecular Medicine 11, 546-554)。重要地是，在 85种其它激酶的自抑制性(autoinhibitory)结构域或激酶结构域中没有 发现其它的突变(Levine等人，2005, Cancer Cell 7, 387-397)。另外，还 在脊髓发育异常综合征(MDS)中识别了 V617F突变。基于预测的JAK2 结构，V617F置换破坏了 JH2与蛋白质的激酶(JH1)结构域之间的自抑 制性相互作用。因此，V617F突变体具有组成活性并且当在BaF3/EPOR 细胞中表达时被赋予生长因子非依赖性和组成STAT5活化(Levine等 人，Cancer Cell 2005, 7, 387-397; Kralovics等人，2005， N. Engl J. Med. 352， 1779-1790))。运载V617F突变的红系祖细胞当缺乏外源性红细胞 生成素(EPO)时生长并形成内源性红系集落(EEC)(MPDs的一个标志)， 并且siRNA介导的JAK2失活减少EEC形成。最后，用表达V617F突变体而非野生型JAK2的鼠骨髓细胞进行移植的小鼠发展成的病理特 征密切地相似于人中的PV，包括血红蛋白/血细胞比容的高度增加，白
细胞增多，巨核细胞增生，骨髓外造血，导致脾大(spleenomegaly) 和骨髓的骨髓纤维化(James等人，2005, Nature 434, 1144-1148; Wernig 等人，2006, Blood. 2006 Feb 14,[先于印刷的电子公开])。临床上，CIMF 患者中突变体的存在与更具攻击性的疾病和显著更差的存活率有关 (Campbell等人，2006， Blood, 2098-2100)。
本领域需要抵制与突变的或活化的JAK2有关的表现型和用于治 疗与JAK2活化有关的骨髓增生性疾病和脊髓发育异常综合征。

发明内容
受体结合型酪氨酸激酶(trk)是跨膜蛋白，其包含胞外配体结合结 构域、跨膜序列和胞质酪氨酸激酶结构域。酪氨酸激酶在细胞信号转 导中发挥作用。细胞增殖、分化、移行、代谢和程序死亡死亡是酪氨 酸激酶介导的细胞应答的实例。JAK2是非受体酪氨酸激酶。
已经发现JAK2抑制剂可被用来治疗脊髓增生病和其它的其中 JAK2的组成型表达对病理状态有贡献的疾病。
因此本发明提供了使用包含稠合吡咯并咔唑衍生物的组合物来治 疗脊髓增生病和相关病症的方法。
可用本发明的方法治疗的与活化JAK2有关的脊髓增生病和相关 病症包括但不限于骨髓增生性疾病，诸如，例如真性红细胞增多症(PV)、 特发性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纤维化(MMM)(也被称 作慢性特发性骨髓纤维化(CIMF))、未分类的脊髓增生病(uMPDs)、嗜 酸性白细胞增多综合征(HES)和系统性肥大细胞增多症(SM)。
在本发明的方法中，将治疗有效量的JAK2抑制剂给用至受试者。
15对于平均体重为70千克的成人，给药方案可以是例如约20毫克约120 毫克，每天两次。在一些实施方案中，对于通常成人的剂量为约40毫 克到约100亳克，每天两次。在其它实施方案中，对于通常成人的剂 量为约60毫克到约80毫克，每天两次。
在本发明的方法中，在存在稠合吡咯并咔唑衍生物时，某些蛋白 质的活性与不存在稠合吡咯并咔唑时相比被降低。这些蛋白质包括但 是不限于JAK2、 STAT5、 STAT3、 SHP2、 GAB2、 AKT和ERK。


图1表示CEP-701对JAK2激酶活性的抑制。
图2表示等位基因特异PCR(画面A)和限制酶切分析(画面B)的结 果，所述试验的进行是为了证实在HEL 92细胞中存在V617F突变。 K562细胞(其不隐匿这一突变)用作野生型对照。画面A:对于等位 基因特异PCR，突变体特异性引物产生诊断突变的203 bp产物(箭头)； 364 bp产物用作PCR的内对照。M，分子量标记；泳道1和2，是显 示364bp突变体和野生型等位基因以及203bp突变体特异等位基因的 HEL 92细胞。泳道3，是仅显示364bp野生型等位基因的对照K562 细胞。画面B:对于限制酶切分析，包括V617F突变的PCR产物从 HEL92和K562 DNA产生并且被BsaXI限制酶酶切消化。未消化的(用 "-"表示)和被BsaXI消化的(用"+ "表示)PCR产物用M (分子量的 标记)表示。生成K562 DNA的预测的限制图谱。试验了每个细胞系 的两个独立的DNA制备物。图3表示CEP-701对HEL 92细胞中 JAK2/STAT信号发放的作用。HEL 92细胞与O.l(iM、 0.3|iM、 I.OjiM 和3.0pM的CEP-701培养24小时，如图所示。对JAK2/STAT信号发 放的作用的评价通过如图所示的使用磷酸特异性STAT3和STAT5抗 体的蛋白质印迹进行，或者通过JAK2的免疫沉淀/蛋白质印迹规程 IP/WB)进行总的JAK2抗体用于IP并且通过使用磷酸酪氨酸抗体的 WB评价磷酸化作用。Bcbd的表达通过蛋白质印迹测定。
图4表示CEP-701对HEL 92细胞生长的作用。如图所示，HEL 92细胞与浓度渐增的CEP-701培养24小时和48小时。对细胞生长的作 用通过MTS试验评价。在10% FCS(画面A和B)或没有血清(画面C 和D)中进行实验。画面A系显示了在10。/。胎牛血清(FBS)存在的条件 下培养24小时的结果。画面B表示在10%FBS存在的条件下培养48 小时的结果。画面C表示在不存在FBS的条件下培养24小时的结果。 画面D表示在不存在FBS的条件下培养48小时的结果。对于画面A-D， 将渐增量的CEP-701加入到单独的培养基中(如阴影条形图所示)； 未经处理的细胞在第一条形图中示出。
图5表示在每24小时补充化合物的条件下CEP-701对HEL 92细 胞生长的作用。HEL 92细胞在2% FCS中与浓度渐增的CEP-701 (如 图所示)培养72小时。每24小时补充CEP-701 。对细胞生长的作用通 过MTS试验进行评价。未经处理的细胞在第一条形图中示出。
图6表示CEP-701在HEL 92细胞中对细胞程序死亡诱导的作用。 HEL 92细胞与浓度渐增的CEP-701 (如图所示)培养24小时、48小 时和72小时。细胞程序死亡的诱导通过组蛋白/DNA释放试验进行分 析。画面A表示24小时试验，画面B表示48小时试验，和画面C表 示72小时试验。
图7表示CEP-701在HEL 92细胞中对STAT5活化的抑制。HEL 92细胞与浓度渐增的CEP-701培养1小时、1.5小时和2.5小时(如图 所示)。制备了全细胞提取物并通过使用特异性抗体的蛋白质印迹评 价了对STAT5磷酸化作用的影响。对谱带进行定量并将磷酸化程度相 对于样品中STATS的总量进行归一化。结果表示为剩余的STAT5磷 酸化与用媒介物处理样品相比的百分数。
5个实验的通常值在底部显示。基于5个独立实验，在HEL92细 胞中对STAT5抑制的ICso经测定为约10nM。
图8表示CEP-701在HEL 92细胞中对STAT3活化的抑制。HEL 92细胞与浓度渐增的CEP-701培养1小时、1.5小时和2.5小时(如图 所示)。制备了全细胞提取物并通过使用特异性抗体的蛋白质印迹评 价了对STAT3磷酸化作用的影响。对谱带进行定量并将磷酸化程度相 对于样品中STAT3的总量进行归一化。结果表示为剩余的STAT3磷酸化与用媒介物处理样品相比的百分数。5个实验的平均值在底部显
示。在HEL92细胞中对STAT3抑制的IC5o如图所示为约10nM。
图9表示人ocl-AGP在HEL 92细胞中对CEP-701介导的STAT5 活性抑制的作用。HEL 92细胞与1.0毫克/的otl-AGP和浓度渐增的 CEP-701 (如图所示)培养1小时，制备了全细胞提取物并通过使用特 异性抗体蛋白质印迹评价了对STAT5磷酸化作用的影响。对谱带进行 定量并将磷酸化程度相对于样品中STAT5的总量进行归一化。结果表 示为剩余的STAT5磷酸化与用媒介物处理样品相比的百分数。与1.0 毫克/毫升AGP的共同培养使对STAT5抑制的IC^改变为3pM。
图10表示每天两次皮下给予CEP-701(30毫克/千克)对HEL 92肿 瘤异种移植物的生长的作用。画面A:未经处理的肿瘤的生长用正方 形表示，而经过处理的肿瘤用三角形表示。画面B:表示切除的未经处 理的和经过处理的肿瘤。图11表示CEP-701在HEL 92肿瘤异种移植 物中对JAK2/STAT信号发放的作用。对携带HEL 92肿瘤异种移植物 的动物皮下给予一剂CEP-701(30毫克/千克)并在通过蛋白质印迹在 CEP-701给予后的0、 1、 2、 4、 8和12小时评价对STAT5和STAT3 活化的作用。还测定了 CEP-701的肿瘤内的浓度。图12表示用于通过 等位基因特异PCR测定V617F突变的存在的临床样品的基因型。通过 等位基因特异PCR试验了慢性特发性骨髓纤维化(CIMF)患者弁648和 #650的V617F突变。野生型和突变体等位基因作为364bp片段扩增， 而203bp (突变体特异PCR产物)显示了存在V617F突变。还显示了 HEL 92(其包含突变体等位基因)和野生型K562细胞的结果。
图13表示使用限制酶BstXl的临床样品的基因型。包括V617F 突变的PCR产物由BstXl进行酶切消化，如图所示。SLC是包含BstXl 位点的JAK2非相关PCR产物，其用作消化完成的对照。
图14表示CEP-701对得自患者#648的CD34+原代培养物的生长 的作用(XTT试验)。画面A: 24小时。画面B: 48小时。
图15表示CEP-701对得自患者#648的CD34+原代培养物的生长 和存活的作用。CD34+造血祖细胞从患者糾48中纯化得到并且与浓度 渐增的CEP-701进行培养，如图所示。画面A:细胞用CEP-701处理
1824小时并且通过FACS分析评价对细胞生长(活细胞)和细胞程序死亡 (锚定蛋白(Annexin V))的作用。画面B:用CEP-701处理24小时的细 胞被稀释到新鲜的培养基中并培养72小时。细胞计数使用锥虫蓝来测 定。T-O表示在实验开始时的细胞数。
图16表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培养物中对 JAK2/STAT信号发放的作用。CD34+造血祖细胞从患者弁648中纯化得 到并且与浓度渐增的CEP-701进行培养1小时，如图所示。制备了全 细胞提取物并通过使用特异性抗体的蛋白质印迹分析了 STAT5、 STAT3的表达和磷酸化。为了评价JAK2活性，将JAK2免疫沉淀，然 后使用抗磷酸酪氨酸特异性抗体(4G10)的蛋白质印迹分析。将斑点剥离 并用JAK2抗体再次进行探针探测。亲环蛋白和(5肌动蛋白用作内对照。
图17表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培养物中对 SHP2和Gab2活化以及对AKT和MAPK信号发放的作用。CD34+造血 祖细胞从患者#648中纯化得到并且与浓度渐增的CEP-701培养1小时， 如图所示。制备了全细胞提取物并通过使用特异性抗体的蛋白质印迹 分析了多种信号分子的表达和磷酸化。画面A:通过磷酸特异性抗体 (pSHP2和pGAB2)评价了 CEP-701对SHP2和GAB2活化的作用。分 析了总表达水平(SHP2和GAB2)。画面B:使用对抗AKT(pAKT)和 ERK(pERK)的磷酸特异性抗体评价了 CEP-701对MAPK和AKT信号 发放的作用。使用特异性抗体(AKT和ERK)分析了总表达水平。p肌 动蛋白用作内对照。
图18表示与CEP-701培养24小时在得自患者#648的CD34+原代 培养物中对STAT5信号发放的作用。CD34+造血祖细胞从患者弁648中 纯化得到并且与浓度渐增的CEP-701培养24小时，如图所示。制备了 全细胞提取物并通过使用特异性抗体的蛋白质印迹分析了 STAT5的表 达和磷酸化以及Bclxl的表达。p肌动蛋白和亲环蛋白的表达用作内对 照。
示例性实施方案的详细说明本发明涉及使用生物学活性的稠合 吡咯并咔唑衍生物治疗多种与JAK2活化有关的病症或综合征的方法。在某些实施方案中，病症和/或综合征包括例如脊髓增生病(MPDs)和脊
髓发育异常综合征。可用于治疗所述病症和/或综合征的稠合吡咯并咔 唑衍生物之一是B引哚并咔唑和茚并咔唑衍生物。更具体地说，本发明 涉及使用吲哚并咔唑治疗MPDs和脊髓发育异常综合征和其它的与 JAK2活化有关的相关病症。可用于这种病症的稠合吡咯并咔唑衍生物
是本领域已知的并且可通过本领域技术人员已知的许多方法制备，所
述方法包括例如Murakata等人的美国专利4,923,986; Hudkins等人的 美国专利5,705,511; Hudkins等人的美国专利5，808，060; Singh等人的 美国专利6,127,401; Hudkins等人的美国专利6,841,567; Gingrich等 人的美国专利6,630,500; Lewis等人的美国专利5,756,494; Glicksman 等人的美国专利5,468,872; Dionne等人的美国专利5,516,771; Hudkins 等人的美国专利6,306,849;和Hudkins等人的美国专利6,093,713;这 些公开被全文并入本文作为参考。在某些实施方案中，在吲哚并咔唑 制备中的起始材料例如K-252a和KT-5556是光学活性的。在制备可用 于本文所述治疗方法中的化合物中，使用起始原料K252a或KT5556 可导致部分地或完全地传递光学活性到所需的稠合吡咯并咔唑衍生 物。
如上被采用并贯穿本公开的，除非另有陈述，以下术语应当被理 解具有以下的含义。
本文中使用的"约"是指给定值的±10%的数值范围。例如，"约 20"包括20±10%，或为18到22，包括端点在内。
本文中使用的"烷基"是指任选被取代的、饱和的、直链或支链 的烃(以及在该范围内的范围和特定碳原子数的所有组合和再组合)，包 含约1到约8个碳原子，优选含约1到约4个碳原子(本文中称作"低 级烷基")。烷基包括但是不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁 基，异丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，新戊基，正己基，异己基， 3-甲基庚基，2,2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。
20本文中使用的"烯基"是指任选被取代的烷基，具有约2到约10 个碳原子、更优选具有约2到约8个碳原子和一个或多个双键(以及在 该范围内的范围和特定碳原子数的所有组合和再组合)，其中烷基的定 义如上所述。
本文中使用的"炔基"是指任选被取代的垸基，具有约2到约10
个碳原子、更优选具有约2到约8个碳原子和一个或多个三键(以及在
该范围内的范围和特定碳原子数的所有组合和再组合)，其中烷基的定 义如上所述。
本文中使用的"芳基"是指任选被取代的单环、二环或三环芳香
环体系，具有约6到约14个碳原子(以及在该范围内的范围和特定碳原 子数的所有组合和再组合)，更优选具有约6到约IO个碳原子。非限制 性例子包括例如苯基，萘基，蒽基和菲基。
本文中使用的"芳基烷基"是指任选被取代的部分，其由带有芳 基取代基的烷基组成，其中芳烷基部分具有约7到约22个碳原子(以及 在该范围内的范围和特定碳原子数的所有组合和再组合)，优选具有约 7到约10个碳原子。非限制性例子包括例如苄基，二苯甲基，三苯甲 基，苯乙基和二苯乙基。本文中使用的"杂芳基"是指任选被取代的 芳香环系统，具有5到14个碳原子环成员，其中一个或多个碳原子环 成员独立地被一个或多个杂原子替换。在某些实施方案中，杂原子选 自S、 O或N。优选具有总共约5到约14个、更优选约5到约6个碳 原子环成员以及杂原子环成员(以及在该范围内的范围和特定碳原子数 的所有组合和再组合)的杂芳基。示例性的杂芳基包括但不限于吡咯 基，呋喃基，吡啶基，吡啶-N-氧化物，1，2,4-噻二唑基，嘧啶基，噻吩 基，异噻唑基，咪唑基，四唑基，吡嗪基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉 基，噻吩基，苯并噻吩基，异苯并呋喃基，吡唑基，刚哚基，嘌呤基， 咔唑基，苯并咪唑基和异巡<|唑基。杂芳基可通过碳原子或杂原子与分子的其余部分连接。
本文中使用的"杂芳基烷基"是指任选被取代的环状体系，其由 被杂芳基取代的垸基组成，其中杂芳基和垸基的定义如前所述。非限
制性例子包括例如2-(lH-吡咯-3-基)乙基，3-吡啶基甲基，5-(2H-四唑 基)甲基，和3-(嘧啶-2-基)-2-甲基环戊垸基。
本文中使用的术语"Pro" 、 "Ser" 、 "Gly" 、 "Lys"分别是指 氨基酸脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸和赖氨酸。
本文中使用的术语"氨基酸"表示包含氨基和羧基两者的分子。 氨基酸的例子包括a-氨基酸；即，由通式HOOC-CH(NH2)-(侧链)表示 的羧酸。氨基酸的侧链包括天然和非天然的部分。非天然氨基酸侧链 是在例如氨基酸类似物中可用于置换天然氨基酸侧链的部分。例如参 见，Lehninger， Biochemistry,第二版，Worth Publishers, Inc， 1975,第 73-75页，作为参考并入本文。优选的a-氨基酸包括甘氨酸，丙氨酸， 脯氨酸，谷氨酸和赖氨酸，具有D构型，L构型，或为外消旋物形式。
本文中使用的术语"GIc"是指葡萄糖。
本文中使用的术语"实质上富集的"，当是指立体异构体或立体 异构中心时，表示在混合物中一种立体异构体或一种立体异构中心以 至少约60%、优选约70%、更优选约80%、更优选约90%占优势存在， 更优选一种立体异构体或一种立体异构化中心为至少约95%。在一些 优选实施方案中，化合物是"实质上对映纯的"，那就是说， 一种立 体异构形式以至少约97.5%、更优选约99%、更优选约99.5%占优势。
文中使用的术语"有效量"是指本文所述的化合物的一定量，其 可治疗有效地用来抑制或治疗特定疾病、病症或病况的症状。这种疾 病、病症和病况包括但是不限于那些与JAK2活性有关的病理学状况，其中治疗包括例如通过用本发明的化合物接触细胞、组织或受体而抑 制JAK2的活性。因此，例如，术语"有效量"当与本发明的化合物结 合用于治疗脊髓增生病时，是指治疗通常与脊髓增生病相关的症状、 疾病、病症和病况。
本文使用的"可药用"是指在合理的医学判断范围内，适合接触 人和动物的组织而没有过度的毒性、刺激、变态反应或其它问题或并 发症，并与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/ 或剂型。
本文中使用的"可药用盐"是指本文公开的化合物的衍生物，其 中母体化合物通过被制成其酸盐或碱盐进行改性。可药用盐的例子包 括但是不限于碱性残基诸如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧 酸的碱盐或有机盐；等等。可药用盐包括从例如无毒的无机酸或有机 酸形成的母体化合物的常规的无毒盐或季铵盐。例如，这种常规的无 毒盐包括得自无机酸的那些盐，所述无机酸为诸如盐酸、氢溴酸、硫 酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸；和从有机酸制备的盐，所述有机酸为诸 如乙酸、丙酸、丁二酸、羟基乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、 柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨 酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲 苯磺酸、甲磺酸、乙垸二磺酸、草酸、羟基乙磺酸；等等。这些生理 学可接受的盐通过本领域已知的方法制备，例如，在含水醇中将游离 胺碱溶解在过量的酸中，或者用碱金属碱诸如氢氧化物或胺中和游离 羧酸。贯穿本文所述的化合物可以替换形式被使用或制备。例如，许 多含氨基的化合物可作为酸加成盐的形式被使用或制备。通常，这些 盐改善了化合物的分离性和操作性。例如，根据试剂、反应条件等的 不同而异，本文所述的化合物可例如作为其盐酸盐或甲苯磺酸盐的形 式被使用或制备。同晶型、所有的手性和外消旋形式、N-氧化物、水 合物、溶剂合物和酸盐水合物，也被涵盖在本发明的范围内。本文中 使用的"水合物"是指在分子形式中与水结合的本发明的化合物，艮P，
23其中H-OH键没有断裂，并且可由式R，H20表示，其中R是本发明的 化合物。给出的化合物可形成超过一种水合物，包括例如一水化物 (R，H20)或多水合物(R，nH20，其中n是〉1的整数)，包括例如二水合物 (R 2H20)、三水合物(R"H20)等等，或半水化合物，诸如例如R*n/2H20、 R*n/3H20、 R、/4H20等，其中n是整数。
本文中使用的"溶剂合物"是指在分子形式中与溶剂结合的本发 明的化合物；目卩；其中溶剂进行配位结合，并且可由式R，(溶剂)表示；
其中R是本发明的化合物。给出的化合物可形成超过一种溶剂合物， 包括例如单溶剂合物(R，(溶剂))或多溶剂合物(R，n(溶剂)，其中n是>1 的整数)，包括例如二溶剂合物(R"(溶剂))、三溶剂合物(R"(溶剂))等
等，或半溶剂合物，诸如例如R 2(溶剂)、R、/3(溶剂)、R、/4(溶剂)等
等，其中n是整数。本文的溶剂包括混合溶剂，例如甲醇/水，并因此， 溶剂合物可在溶剂合物内并入一种或多种溶剂。
本文中使用的"酸盐水合物"是指可通过具有一个或多个碱性部 分的化合物与至少一种具有一个或多个酸部分的化合物结合形成的复 合物、或通过具有一个或多个酸部分的化合物与至少一种具有一个或 多个碱部分的化合物结合形成的复合物，所述复合物进一步与水分子 结合以形成水合物，其中所述水合物的定义如前所述并且R表示本文 上面描述的复合物。
贯穿本文所述的化合物可以替换形式被使用或制备。例如，许多 包含氨基的化合物可作为酸加成盐的形式被使用或制备。通常，这些 盐改善了化合物的分离性和操作性。例如，根据试剂、反应条件等的 不同而异，本文所述的化合物可例如作为其盐酸盐或甲苯磺酸盐的形 式被使用或制备。同晶型、所有的手性和外消旋形式、N-氧化物、水 合物、溶剂合物和酸盐水合物，也被涵盖在本发明的范围内。
本文中使用的"患者"是指动物，胞哺乳动物，优选指人。
24本文中使用的"前药"是指经过特别设计用于使到达所需部位的 活性物质的量最大化的化合物，它们自身通常无活性或具有最小的所 需活性，但是通过生物转化被转化为生物活性的代谢物。
本文中使用的术语"立体异构体"是指具有相同的化学组成，但 是原子或基团的空间排列不同的化合物。
本文中使用的"N-氧化物"是指其中杂芳基环或者叔胺的碱性氮 原子被氧化得到带有正形式电荷的四价氮和带有负形式电荷的与氮连 接的氧原子的化合物。
本文中使用的术语"治疗"包括预防性治疗、治病性治疗和/或姑 息性治疗。
当任何变量在任何构成或在任何形式中出现超过一次时，其在每 次出现中的定义与其在所有其他出现中的定义是无关的。
取代基和/或变量的组合可被允许，只要这种组合获得稳定的化合 物即可。
相信本文使用的化学式和化学名正确地和精确地反映了基础化合 物。然而，本发明的性质和值不完全或部分地依赖于这些式子的理论 修正。因此，可以理解，本文使用的化学式以及归属于所对应的所述 化合物的化学名，不以任何方式意在限制本发明，包括将其限定到任 何的特定互变异构形式或限定到任何特定的光学或几何异构体，除非 明显定义了这种立体化学。
因此，在某些实施方案中，本发明涉及治疗脊髓增生病的方法， 包括对有需要的患者给用治疗有效量的JAK2抑制剂。在一些实施方案中，JAK2抑制剂是稠合的吡咯并咔唑。在某些实施方案中，稠合的吡 咯并咔唑是U引哚并咔唑，在其它实施方案中，其是茚并咔唑。在具体 实施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式I所示结构、或其立体异构体 或可药用盐的形式
其中
环B和F独立地为苯基或杂芳基；
W独立地为H;烷基；芳基；芳基烷基；杂芳基；杂芳基烷基；
-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10;或-0(CH2)pNR7R8;
R2独立地为H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含1-8个碳的垸基；含
2-8个碳的烯基；含2-8个碳的炔基；或含5-7个碳的单糖，
其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含L4个碳
的烷基、含2-5个碳的垸基羰基氧基或含l-4个碳的烷氧基；和
其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；
其中当X为CHR"或NR"时，则112和R"可任选地通过其2位 和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选 地分别被R"和R"取代；和连接呋喃的3位被R"和R"二取代；
R3， R4， R5和R6独立地为H;芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN;
-CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; -CH2OR14; -NR7R8; -NR10COR9; -NR10CO2R9; -NR10CONR7R8; -S(O)yR"; -C02R9 ; -COR9 ; -CONR7R8 ; -CHO ; -CI^NOR11 ; -CH=NR9 ; -CH=NNR12R13 ;-(CH2)pS(0)yR9 ;-CH2SR15 ;-CH2S(0)yR14 ; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8个碳的烷基；含2-8个碳的烯基；或含2-8个碳的炔基；
其中垸基、烯基或炔基各自任选独立地被l-3个R"取代； X是
含l-3个碳并任选被至少一个以下基团取代的亚垸基OH、 =0、 :NOR11、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -O(CH2)pOR10、 芳基、芳基垸基、杂芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、含l-8个碳的院 基、含2-8个碳的烯基、含2-8个碳的炔基、或含5-7个碳的单糖，
其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含1-4个
碳的烷基、含2-5个碳的烷基羰基氧基或含1-4个碳的烷氧基；和 其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代； -O陽；-S(0)y-; N(R16); CHR16; -CH2Z-; -Z-CHr;或-CH2ZCHr;
其中z为c(oru)(r11)、 o、 s、 c(=0)、 c^noru)或nru;
其中当X为CHR16或NR16时，则R2和R16可任选地通过其2位 和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选 地分别被R"和R"取代；和连接呋喃的3位被R"和R"二取代；A1 和A2独立地为H、 -OR11、 -SRU或-N(R")2;或者结合在一起形成=0、 =S或NRH的部分；
Bi和B^虫立地为H、 -OR11、 41111或-风1111)2;或者结合在一起形 成=0、 二S或二NR"的部分；
前提条件是A1和A2、或B1和B2的至少一对结合在一起形成=0;
W和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环烷基；
W独立地为含l-4个碳的烷基、芳基或杂芳基；
r1g独立地为h或含1-4个碳的烷基；
RH独立地为H、含1-4个碳的烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； 1112和1113独立地为H、垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；R"独立地为氨基酸的在除 去羧基的羟基之后的残基；R"独立地为含l-4个碳的烷基；
r"独立地为h、含1-4个碳的垸基、含2-8个碳的烯基、含2-8 个碳的炔基、芳基或杂芳基；其中烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基各自任选独立地被l-3个R"取代或者
当X为CHR"或NR"时，则r2和R"可任选地通过其2位和5 位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选地分 别被R"和R"取代；和连接呋喃的3位被1117和R"二取代；
R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-烷基或含2-6个碳的O-酰
基；
R"独立地为H;含l-4个碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y为OR19、 SOR2()、 NR"r22或SR23; N3; C02R15; S-GIc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;
^7、
CH=NNHC(=NH)NH2; H ; CH=NN(R26)2;或CH2NHCONH
或者R17和R18可以任选地结合在一起形成-ch2nhc02-、
-CH2OC(CH3)20-、 =0或陽CH2N(CH3)C02-;
R"独立地为H、含1-4个碳的垸基或含2-5个碳的酰基； R^独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或含氮原子的杂环垸基； R"和R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5个碳的酰基，前提条件是R"和R^中只有一个为Pro、 Ser、
Gly、 Lys或酰基；
R"独立地为芳基、含l-4个碳的烷基或含氮原子的杂环烷基；
R"和R"独立地为H;含1-6个碳的垸基；苯基；或含1-6个碳 的羟基垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基； R^独立地为芳基；
R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; .P(K))(OR")2;或-OR14;
尺28独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的垸氧基、含7-10个
碳的芳基垸基、-(ch2)por1()、 -((^2)1)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;r"独立地为h、含1-4个碳的烷基、含1-4个碳的烷氧基、含7-10
个碳的芳基烷基、-(ch2)por10、 -((^2){)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
P为l-4的整数；和
y为0、 1或2。
在一些实施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式II所示结构、或 其立体异构体或可药用盐的形式
W独立地为h;烷基；苯基；含7-10个碳的芳基垸基；5-6元杂
芳基；杂芳基垸基；-COR9; -OR1Q; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10; 10(CH2)PNR7R8;
R3， R4， R5和R6独立地为H;苯基；5-6元杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -S(0)yRu; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO; -CH-NOR11; -CH=NR9; -CH=NNR12R13; -(CH2)pS(0)yR9; -CH2SR15; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8个碳的垸基；含 2-8个碳的烯基；或含2-8个碳的炔基；
其中垸基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；
X为-CH-或N;
A^BA2独立地为H、 -OR11、 -SR11或-N(RH)2;或者，结合在一
其中-B^BB2独立地为H、 -OR11、 -SR"或-N(RU)2;或者，结合在一起 形成=0、 ^S或^NR"部分；
前提条件是A1和A2、或B1和B2的至少一对结合在一起形成-O;
W和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环烷基；
W独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；
R^独立地为H或含1-4个碳的垸基；
RU独立地为H、含1-4个碳的垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； 1112和R"独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；
R"独立地为氨基酸的在除去羧基的之后的残基； R"独立地为含1-4个碳的烷基； R"独立地为H、含l-4个碳的烷基、芳基或杂芳基； R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-烷基或含2-6个碳的O-酰
基；
R"独立地为H;含l-4个碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y为OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-Glc; CONR24R25 ;CH-NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH:NOR10 ;
CH2NHCONHR、
或者R17和R18任选地结合在 一 起形成-CH2NHCOr 、
-CH2OC(CH3)20-、 = 或-CH2N(CH3)C。2-;
R"独立地为H、含l-4个碳的垸基或含2-5个碳的酰基； R^独立地为含l-4个碳的烷基、芳基或含氮原子的杂环烷基； R"和1122独立地为H、含1-4个碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5个碳的酰基，前提条件是R"和R22中只有一个为Pro、 Ser、
Gly、 Lys或酰基；
R^独立地为芳基、含1-4个碳的烷基或含氮原子的杂环垸基；
CH=NNHC(=NH)NH:
30RM和R"独立地为H;含1-6个碳的烷基；苯基；或含1-6个碳 的羟基烷基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基； 1126独立地为芳基；
R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yRu; -C02R9; -CONR7R8;隱CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02nr12r13; -pocor11^;或-or14;
R"独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的垸氧基、含7-10个 碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1G-、 (CH2)pOC(^0)NR7r8或-(CH2)pNR7r8;
R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、含1-4个碳的垸氧基、含7-10
个碳的芳基垸基、-(ch2)por1q、 -(012){)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
p为l-4的整数；和 y为0、 1或2。
在某些其它实施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式III所示结 构、或其立体异构体或可药用盐
R3、 R4、 R5、 R6、 R17、 R18、 R28、 R"禾口 X的定义如关于式II化 合物的定义所述的。在一些优选实施方案中，R3， R4， RS和W各自为 H。
其中:
31在本发明方法的其它实施方案中，稠合的吡咯并咔唑是具有式III 所示结构的化合物，其中
R3， R4， R5和R6独立地为H;苯基；F; CI; -OR10; (CH2)pOR10; -NR7R8; -CHO; -(CH2)PNR7R8;或含l-8个碳的烷基； 其中烷基任选地被l-3个R"基团取代；
X为-CH-或N;
W和RS独立地为H或含1-4个碳的垸基；或者，与其所连接的氮
一起形成5-7元杂环烷基；
R"虫立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；
R^独立地为H或含1-4个碳的烷基；
R"独立地为H、含1-4个碳的垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； R^和R。独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基；
R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基；
R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-烷基或含2-6个碳的O-酰
基；
R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、CONHC6H5; CH2OH; CH2OCH3; CH2OC(CH3)3; CH2NH2; C02CH3;或CONR24R25;
R"和R"独立地为H;含l-6个碳的垸基；苯基；或含1-6个碳 的羟基烷基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；
R"独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH-NNR12R13; -CI^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;
R"独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的烷氧基、含7-10个
碳的芳基烷基、-(ch2)por1()、 -((^2)1)0(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、含1-4个碳的烷氧基、含7-10个碳的芳基烷基、-(CH2)pOR1Q、 -((3112)150(:(=0)忖117118或-(012)1^117118;
p为1-4的整数；和
y为0、 1或2。
在某些其它实施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有式III所示结构， 其中R3， R4, 115和R6各自独立地为H、苯基、F、 Cl、國OR10、 -NR7R8、 -((3112)1)117尺8或含l-8个碳的烷基，其中垸基任选地被l-3个R"基团取 代；或其立体异构体或可药用盐的形式。
在式III化合物的某些优选实施方案中，式III的吲哚并咔唑是实 质上对映纯的。在其中式III的吲哚并咔唑是实质上对映纯的优选实施
方案中，其具有一些结构
或其立体异构体或可药用盐，其中R3， R4， R5、 R6、 R17、 R18、 R28、 R"和X的定义如以上关于本文所述的式II的化合物和式III的实 施方案的定义所述的。在一些优选实施方案中，式III的B引哚并咔唑的 R3， R4， RS和W各自为H。在其它实施方案中
R3， R4， 115和R6独立地为H、 Cl、含1-4个碳的垸基、-OR10、 CH2OR10、 NR7R8、 CH2NR7r8或CONR7R8;
117和RS独立地为H或含1-4个碳的垸基；
F^独立地为H或含1-4个碳的烷基；
R17独立地为OH或含1-4个碳的O-正-烷基；
R"独立地为H、 CH2OH、 C02CH3、 C02CH2CH3、 C02CH2CH2CH3、 或C02CH(CH3)2;或者
R28独立地为CH3;和 R29独立地为H或CH3。
33在式I化合物的另外的实施方案中，稠合的吡咯并咔唑具有下式 I-A所示的结构、或其立体异构体或可药用盐的形式
式I-A
其中
W独立地为H;烷基；苯基；含7-10个碳的芳基烷基；5-6元杂
芳基；杂芳基垸基；-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR10; -0(CH2)pOR10;或-0(CH2)pNR7R8;
R2独立地为H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含l-8个碳的烷基；含 2-8个碳的烯基；含2-8个碳的炔基；或含5-7个碳的单糖，
其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含1-4个
碳的烷基，含2-5个碳的烷基羰基氧基或含l-4个碳的垸氧基；和 其中垸基、烯基或炔基任选地被1-3个1127基团取代； 其中当X为CHR"或NR"时，则112和R"可任选地通过其2位 和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选 地分别被R"和R"取代；和连接呋喃的3位被R卩和R"二取代；
R3， R4， R5和R6独立地为H;苯基；5-6元杂芳基；F; Cl; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -S(O)yR"; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNR12R13; -(CH2)pS(0)yR9; -CH2SR15; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8个碳的烷基；含 2-8个碳的烯基；或含2-8个碳的炔基；
其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；
X为CHR"或含1-2个碳并任选被至少一个以下基团取代的亚烷
34基OH、 =0、 =NOR"、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -0(CH2)pOR1G、芳基、芳基垸基、杂芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、 含l-8个碳的烷基、含2-8个碳的烯基、含2-8个碳的炔基、或含5-7 个碳的单糖，
其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含1-4个 碳的垸基、含2-5个碳的烷基羰基氧基或含1-4个碳的烷氧基；和 其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代； A!和A2独立地为H、 -OR11、 -SR"或-N(RU)2;或者，结合在一 起形成=0、 二S或NR"部分；
B^nB2独立地为H、 -OR11、 -81111或-1^1111)2;或者，结合在一起 形成=0、 ^S或NR"部分；
前提条件是A1和A2、或B1和B2的至少一对结合在一起形成=0; W和RS独立地为H或含l-4个碳的垸基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环烷基；
R"虫立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基； R"独立地为H或含l-4个碳的垸基；
R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； 1112和尺13独立地为H、垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；
R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基； R"独立地为含l-4个碳的烷基；
R"独立地为H、含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；或者当X为 CHR"时，则f和R"可任选地通过其2位和5位结合在一起形成连 接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选地分别被R"和1129取代；
和连接呋喃的3位被1117和R"二取代；
R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-垸基或含2-6个碳的O-酰
基；
R"独立地为H;含l-4个碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，
其中Y为OR19、 SOR20、 NR"R22或SR23; N3; C02R15; S陽GIc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ; CH=NNHC(=NH)NH2 ;H N
C二N H
;CH=NN(R26)2;或CH2NHCONHR16;
或者R17和R18任选地结合在 一 起形成-CH2NHCOr 、
-CH2OC(CH3)20-、 =0或曙CH2N(CH3)C02-;
R"独立地为H、含1-4个碳的垸基或含2-5个碳的酰基； R^独立地为含l-4个碳的烷基、芳基或含氮原子的杂环烷基； R"和R22独立地为H、含1-4个碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys
或含2-5个碳的酰基，前提条件是R"和R"中只有一个为Pro、 Ser、
Gly、 Lys或酰基；
R"独立地为芳基、含1-4个碳的垸基或含氮原子的杂环垸基；
R"和R"独立地为H;含1-6个碳的烷基；苯基；或含1-6个碳 的羟基垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基； RM独立地为芳基；
R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR1()COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR1QCONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yR"; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH-NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;
R"独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的烷氧基、含7-10个 碳的芳基烷基、-(CH2)pOR1()、 -(012)130(:(=0^117118或-((:112)1^117118;
R"独立地为H、含1-4个碳的垸基、含1-4个碳的烷氧基、含7-10
个碳的芳基烷基、-(ch2)por10、 -(0!2)150(:(=0^117118或-((:112)3117118;
p为1-4的整数；和 y为0、 1或2。
在式I-A的化合物的某些实施方案中，化合物具有以下结构其中-
RM虫立地为-C02R^ -COR9;含1-4个碳的垸基；其中垸基任选
地被1-3个尺27基团取代；
R3， R4， R5和R6独立地为H;苯基；CI; -OR10; (CH2)pOR10; -NR7R8; -(CH2)PNR7R8;或含l-6个碳的烷基；
其中烷基任选地被l-3个R^基团取代；
W和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环垸基；
W独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；
R^独立地为H或含1-4个碳的烷基；
RH独立地为H、含l-4个碳的垸基、含6-10个碳的芳基；
1112和R。独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基；
R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基；
R"独立地为H、含l-4个碳的烷基；
R"独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;
-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH^NOR11; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;隱PO(OR")2;或-OR14;
P为l-4的整数；和
y为0、 1或2。
在式I-A的化合物的其它实施方案中，化合物具有以下结构其中
W独立地为-C02R^ -COR9;含1-4个碳的垸基；其中垸基任选 地被l-3个R"基团取代；
W和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，以其所连接的氮 一起形成任选地包含另外的环氮原子的5-6元杂环垸基；
W独立地为含l-4个碳的烷基或苯基；
R^独立地为H或含1-4个碳的烷基； R"独立地为H、含l-4个碳的垸基； R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基； R"独立地为苯基；5-6元杂芳基；-OR1G; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;
-OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9; -NR1QC02R9;
-NR10CONR7R8; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -COR9;
-CH2OR7;或-OR14;
P为1-4的整数；和
y为0、 1或2。
本发明范围内的稠合的吡咯并咔唑还可由式IV表示。优选的式IV 衍生物在下文中被称为化合物IV-1到IV-4。由式IV表示的功能衍生 物式式IV
或其立体异构体或可药用盐的形式，其中
(a) W和R"各自独立地选自H、含l-6个碳的垸基、含1-3个碳 的羟基垸基和含3-6个碳的烯基，前提条件是W和R"不都为H;
(b) Ai和AS都是氢和R3、 R4、 RS和W各自独立地为H或者它们 最多两个为F; CI; Br; I; N02; CN或OH; NHCONHR7，其中R7 为C6Hs或含1-3个碳的烷基，前提条件是R1、 R2、 W和W中只有一 个为NHCONHR7; CH2OR7;含1-3个碳的烷基；CH2OCONHC2H5;
或NHC02CH3;禾口
(c) 当A^口八2二者结合在一起表示O时；贝U R3、 R4、 115和R6
各自为氢。
在本发明的多种方法中使用的优选的式IV化合物是表1中的那些 化合物IV-1到IV-4，其中取代基如下所示。
表1_
化合物(1)_^_ R16
IV-1 CH2CH=CH2 IV-2(2) CH2CH=CH2 IV-3(2) H IV-^_CH2CH2CH2OH
(1) R3、 R4、 115和116为氢。Ai和A2都为氢。
(2) 组分IV-2和IV-3的1.5-1.0的混合物。
本发明的特征还在于由下式V表示的化合物
CH2CH=CH2 H
CH2CH=CH2 CH2CH2CH2OH
39其中R5表示卣素、CH20CONHR"或NHC02R"(其中r"表示低 级垸基)；RS表示氢或卤素；和X表示C02CH3、 CH2OH或CONHR"(其 中R"表示氢、被羟基取代的低级垸基、或芳基)，前提条件是排除115= 卤素、R、氢和X=C02CH3或CH2OH的组合，以及R5=R3=卤素和 X=C02CH3的组合，以及R5=R3=Br和X=CONHC6H5的组合。式V化 合物的立体异构形式和可药用盐适用于本发明的方法中。在某些实施 方案中，稠合的吡咯并昨唑具有下式所示结构
式VI
其中X表示CH2S(0)R"(其中R"表示芳基或包含氮原子的杂环 基)、CH2SR16、 CH二NN(R")2(其中R"表示芳基)、CH2NHCONHR"(其 中R"表示低级烷基或芳基)或CH2C02CH3。式VI化合物的立体异构 形式和可药用盐适用于本发明的方法中。
本发明的特征还在于由下式VII表示的化合物、或其可药用盐:
40<formula>formula see original document page 41</formula>
式VII
其中112和R"之一为氢且另一个为烯丙基，或者它们都是烯丙基。 稠合的吡咯并咔唑还可是具有下式VIII所示结构的化合物、或其
可药用盐
式VIII
其中R5表示CH(SC6H5)2、 CH(-S-CH2CH2S-)、 CH2SR24(其中r24 表示苯并咪唑-2-基、糠基、2-二甲基氨基乙基或1H-l，2,4-三唑-3-基) 或CH:NR"(其中R"表示吡咯垸-l-基、吡啶-2-基氨基、胍基、吗啉基、 二甲基氨基或4-甲基哌嗪-l-基)。
在其它优选实施方案中，稠合的吡咯并咔唑是CH2OH
更优选地，上述的稠合的吡咯并咔唑是实质上对映纯的。在另外 的实施方案中，稠合的吡咯并咔唑是
H
CH2OH CEP-70I
CEP-701。
本文中使用的具有这一结构的化合物称为"CEP-701"。
用于本发明方法中的稠合的吡咯并咔唑可通过与可药用的无毒的 赋形剂和载体混合而被分别或组合配制成药物组合物。这种组合物可 被制备用于非肠道给药，特别是液体溶液或悬浮液形式；用于口服给 药，特别是液体剂、片剂或胶囊形式；或鼻内给药，特别是粉剂、滴 鼻剂或气雾剂形式。
该组合物可以方便地在单位剂型中给药并且可根据本领域已知的 的任何方法制备。这些方法例如在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., Easton， Pa., 1980)中描述。
用于口服给药的液体剂型包括可药用的乳剂、微乳剂、溶液、悬
42
o
H浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型可以包含本领 域常用的惰性稀释剂，诸如，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂诸 如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二 醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、 胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和山 梨糖醇酐的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀释剂之外，口服组合 物还可以包括助剂，诸如，润湿剂，乳化剂和助悬剂，甜味剂，调味 剂和增香剂。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和粒剂。 在这种固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性的可药用赋形剂或载
体诸如枸橼酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合(a)填料或增量剂诸如 淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂诸如例如羧甲 基纤维素藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯垸酮、蔗糖和阿拉伯胶；(C)湿润 剂诸如甘油，(d)崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂诸如石蜡；(f)吸收促进 剂如季铵化合物；(g)润湿剂诸如例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸 附剂如白陶土和膨润土；和(i)润滑剂诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、十二垸基硫酸钠十二垸基硫酸钠，及其混合物。在胶 囊、片剂和丸剂中，剂型还可包括缓冲剂。
还可使用相似类型的固体组合物作为在填充的软和硬明胶胶囊中 的填料，使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等的赋形剂。
还可使用相似类型的固体组合物作为在填充的软和硬明胶胶囊中 的填料，使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等等的赋形剂。活性化 合物还可与上述的一种或多种赋形剂处在微囊密封的形式中。在固体 剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉 混合。这种剂型如通常实践的那样还可包括不同于惰性稀释剂的另外 的物质，如制片用润滑剂和其它的制片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂中，剂型还可包括缓冲剂。它们可任选地包含遮 光剂并且还可是适当单独的活性成分或优先在肠道的某一部分中任选 地以延迟方式释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的例子包 括聚合物和蜡。
本发明的化合物的最佳剂量可根据诸如以下因素的不同而异脊 髓增生病的类型和进展程度、患者的总体健康状态、患者的年龄和体 重、化合物的功效和给药途径。化合物剂量的最佳化处在本领域普通 技术人员的范围内，并且在本文所提供范围内的值包括落在该范围内 的任何值。用于本发明方法中的制剂的活性成分当在血浆中的浓度为 约l到约20pM时是有效的，包括处在该范围内的任何值，包括但不限
于2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18 和19pM。在一些优选实施方案中，给用化合物以达到在血浆中的浓度 为约5到约15pM。在其它优选实施方案中，给用化合物以达到在血浆 中的浓度为约7.5到约15pM。
在本发明的某些实施方案中，化合物的剂量为每天200微克/千克 到约l克/千克。更优选地，化合物的剂量为每天250微克/千克体重到 约3毫克/千克体重。更优选地，化合物的剂量为每天约0.5毫克/千克 体重到约2.3毫克/千克体重。更优选地，化合物的剂量为每天约0.8毫 克/千克体重到约1.3毫克/千克体重。
在某些实施方案中，对于普通成人(约70千克)的日剂量为约20 亳克到约300，或约40毫克到约250毫克，或约40毫克到约100毫克。 更优选地，日剂量为约80毫克到约160毫克。日剂量通常可给用一天 一次、 一天两次、 一天三次或一天四次。在一些实施方案中，剂量给 药方案为约20到约120毫克， 一天两次。在其它实施方案中，剂量给 药方案为约20毫克到约100毫克， 一天两次。在另外的实施方案中， 剂量为约60毫克到约80毫克， 一天两次。
44在本发明的方法中，当给用治疗量的JAK2抑制剂时，在JAK2 抑制剂存在的条件下许多其它蛋白质的活性比不存在JAK2抑制剂时 的其它蛋白质的活性低。这些其它蛋白质是例如许多以下蛋白质 JAK2、 STAT5、 STAT3、 SHP2、 GAB2、 AKT和ERK。
本发明进一步通过以下实施例说明。提供实施例仅用于说明目的， 并且不被认为以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例
患者细胞和细胞系
HEL 92.1.7。 HEL 92.1.7人红系白血病细胞系购自TCC(TIB-180)， 并将细胞在含2 mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长，该培养 基经过调节含有1.5 g/L碳酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES和 l.OmM丙酮酸钠和10%的胎牛血清，如推荐的那样。CEP-701或媒介 物根据指示加入到完全培养基中并进行培养。
CD34+。在宾夕法尼亚大学癌症中心(the University of Pennsylvania Cancer Center),在被应允后从被诊断为MPDs的患者中收集周围血液。 通过Ficoll梯度离心(Pharmacia)分离血细胞。除去单核细胞层并洗涤。 将单核细胞与抗CD34免疫雌珠进行培养并使用磁单元分拣器 AutoMacs(Miltenyi Biotech,所有使用小珠和设备的规程根据制造商的 推荐进行)将CD34+细胞纯化。将CD34+细胞洗涤并计数。细胞在新鲜 时被使用或细胞作为在10% DMSO中的活细胞被冷冻。将CD34+细胞 在包含20。/。血清代用品(BIT 9500， Stem Cell Technologies, Vancouver) 的IMDM培养基中培养。将细胞与干细胞生长因子、白细胞介素6和 白细胞介素3培养3-5天用于初始扩增。在初始培养后，向培养基中加 入红细胞生成素。将细胞进一步扩增2-5天直到获得足够的细胞用于实 验。所有细胞因子得自R&DSystems。
使用上述的PCR和限制酶切消化方法分析慢性特发性骨髓纤维化
45(CIMF)患者的基因型。发现患者#648和#650携带V617F突变(由等位 基因特异PCR显示，图12)和BsaXl消化(图13)。在图14中，SCL PCR产物用作对照。当使用BsaXl消化时，496 bpSCL产物被切割成 356 bp、 110bp和30bp片段。
实施例1
CEP-701对JAK2激酶活性的抑制
采用时间分辨荧光(TRF)检测，在微量滴定板试验中，试验了 CEP-701抑制杆状病毒表达的JAK2的激酶活性的能力。首先将96孔 Costar高粘合板(Corning Costar #3922, Corning, NY)以每孔100微升涂 覆处在37。C下的含10 ng/mL的Neutravidin(Pierce #31000， Rockford， IL) 的Tris-缓冲盐水(TBS)达2小时。然后以每孔100微升涂覆处在37°C 下的含1 pg/mL的15-mer肽底物(生物素基-氨基-己酰基 陽EQEDEPEGDYFEWLE-酰胺，Infinity Biotech Research and Resource, Aston， PA)达另外1小时。然后向试验板中加入JAK2试验混合物(总体 积,0)iL/孔)，其由20 mM HEPES(pH 7.2)、 0.2 ATP、 1 mM MnCl2、 0.1。/。牛血清白蛋白(BSA)和不同浓度的CEP-701(在DMSO中稀释；在 试验中最终为2.5%的DMSO)组成。加入酶(15 ng/ml JAK2批号 JAK2[318], JA2-2.1)并在室温下允许反应进行20分钟。磷酸化产物的 检测如下进行以每孔100微升加入在包含0.05。/。土温20和0.25。/。BSA 的TBS中以1 :5000稀释的Eu-Nl标记的PY100抗体(PerkinElmer Life Sciences #AD0041, Boston, MA)。在室温下培养1小时，然后加入lOOfiL 的增强溶液(PerkinElmer Life Sciences #1244-105, Boston, MA)。将板温 和搅拌并在30分钟后，使用PerkinElmer EnVision 2100(or 2102)多标记 读板器测量所得溶液的荧光。在重复实验中产生抑制曲线并绘制成抑 制。/。-log10化合物浓度的曲线。如下通过将S形剂量-应答(可变斜率) 等式配合到GraphPad Prism中进行非线性回归进行数据分析
y=bottom +(top-bottom)/(l + lO(log IC50.x)*HiUslope)其中y是在给定浓度化合物下的抑制，X是化合物浓度的对数，
bottom是在最低供试化合物浓度下的抑制％，和t叩是在最高供试化合 物浓度下的抑制％。 bottom和top的值分别固定在0和100。将得自单 个曲线的ICso平均化并用ICso平均值报导。绘制CEP-701浓度-JAK2 活性的曲线(图1)。显示CEP-701的ICso为0.9士0.2nM。
实施例2
A.Val617Phe突变的等位基因特异PCR
细胞系和患者样品的基因型如E丄等，(2005) "Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders" Lancet 365:1054-106中所述进行。使用两种方法，包括等位基因特异PCR和 限制酶切分析，来确定V617F突变的状态。除非另作说明，否则根据 制造商的说明书，使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega)，从 粒细胞或单核细胞制备患者的DNA。除非另作说明，否则根据制造商 的说明书，使用得自Promega的PCR Core试剂盒进行PCR反应。
简而言之，在PCR反应(退火温度58'C， 38-44次循环)中，使 用常见的反向引物(5'-ctgaatagtcctacagtgttttcagtttca-3')(SEQ ID NO:l)和 两个正向引物对80-200 ng的DNA进行扩增。第一个是突变体特异引 物(5'-agcatttggttttaaattatggagtatatt-3')(SEQ ID NO:2)，其从3 '末端起第三 个核苷酸处包含故意错配以改善特异性并且其产生显示存在V617F突 变的 203 bp 产物。第 二 个正向引物 (5'-atctatagtcatgctgaaagtaggagaaag-3')(SEQ ID NO:3)从突变的和野生型 等位基因扩增为364 bp片段并用作内对照。结果如图2 (画面A)所 述。两个HEL 92样品都显示了内对照的扩增以及得自突变体等位基因 的203 bp产物。K562用作野生型对照。
B. JAK2基因型的限制酶基试验导致V617F置换的G~VT突变消 除了存在于野生型JAK2中的用于限制酶BsaXl的限制性位点。因此， 阻碍BsaXl识别V617F突变。为了评价细胞系和患者样品中的突变的存在，使用正向引物
(5'國gggtttcctcagaacgttga-3')(SEQ ID NO:4) 和 反 向 引 物 (5'-tcattgctttcctttttcacaa-3')(SEQ ID NO:5)，通过PCR(57。C ， 40-44次循 环)对200 ng的包括JAK2的617位的基因组DNA进行扩增。得到的 460 bp片段用BsaXl消化3-4小时并在2%琼脂糖凝胶上进行分析。野 生型等位基因产生241bp、 189bp和31bp的片段，而突变体等位基因 完整无损。得自HEL92细胞的扩增的DNA片段耐受BsaXl的消化， 而得自K562细胞的扩增片段完全被BsaXl消化。为了控制消化的完成， 将得自包含BsaX位点的人SLC gene的DNA片段进行扩增并用BsaXl 消化。正向引物(5'-tcctggggtcttctgtcttg-3')(SEQ ID NO:6)和反向引物 (5'隱cctgagaggcaatgggagta-3')(SEQ ID NO:7)扩增496 bp SLC产品，其被 消化形成356 bp、 110bp和30bp的片段。结果如图2 (画面B)所示。
实施例3
CEP-701对细胞增殖的作用
将纯化和扩增的CD34+细胞计数并铺板在96孔板中用于XTT试 验。将细胞用JAK2抑制剂或者媒介物处理24-72小时，并根据制造商 的建议使用XTT试齐U(Molecular Probes)分析相对细胞存活率。
将铺板在96孔板内的HEL 92丄7细胞(2X 104个/孔)用CEP-701 或媒介物处理24-72小时，并根据推荐通过MTS试剂(Promega)测定细
胞存活性。
测定用CEP-701处理的HEL 92丄7细胞的细胞存活率(图3，画面 A-D)。在画面A中，在胎牛血清(FBS)存在的条件下并用CEP-701处理 进行24小时培养后与未用药物处理所得存活率相比来评价细胞。 CEP-701使细胞存活率降低到约50%(使用3.0|liM的CEP-701)。在画面 B中，在胎牛血清(FBS)存在的条件下并用CEP-701处理进行48小时 培养后与未用药物处理所得存活率相比来评价细胞。CEP-701使细胞存活率降低到约25%(使用3.0^M的CEP-701)。在画面C中，在不存在 FBS的条件下与CEP-701进行24小时培养后来评价细胞。CEP-701使 细胞减少率降低到约50%(使用3.0pM的CEP-701)，其类似于画面A 中的图形。在画面D中，在不存在FBS的条件下与CEP-701进行48 小时培养后来评价细胞。CEP-701使细胞减少率降低到约25%(使用 3.0|aM的CEP-701),其类似于画面B中的图形。
图5表示CEP-701对在存在胎牛血清(FCS)和每24小时补充药物 的条件下生长的HEL细胞的存活率的作用。在该实验中，将HEL 92丄7 细胞暴露在药物下达72小时并在MTS试验中评价存活率。CEP-701 使细胞存活率降低到低于5%(使用l.O^M的CEP-701)。
MTS试验表明CEP-701抑制携带V617F突变的HEL 92细胞的生长。
图6表示在HEL 92细胞中，通过组蛋白/DNA释放试验测量的 CEP-701对诱导细胞程序死亡的作用。该试验表明CEP-701诱导细胞 程序死亡。
实施例4
CEP-701对信号路径的作用的分析
使用特异性抗体和从细胞系和培养的患者样品中制备的全细胞提 取物评价了 CEP-701对信号路径的作用。在以下的细胞裂解缓冲液中 制备全细胞提取物(20 mM Tris-HCl(pH 7.5)， 150 mM NaCl， 1 mM Na2EDTA， lmMEGTA， 1% Triton, 2.5 mM焦磷酸钠，1 mM卩-甘油 磷酸盐，1 mMNa3V04， 1 fig/ml亮肽素)，补充有蛋白酶抑制剂(Complete Mini, Roche Diagnostic)。测定了蛋白质浓度并将等量(10-30pg/泳道)在 SDS-PAGE凝胶上分开。将蛋白质转移到硝化纤维素滤器中并根据制 造商的推荐使用特异性抗体评价表达和/或磷酸化的水平。根据制造商 的说明书使用Supersignal West Pico System(Pierce)将斑点显色。通过免
49疫沉淀/蛋白质印迹规程测定JAK2的活化。
简而言之，根据推荐使用免疫沉淀Starter Pack(Amersham Biosciences),从250|ug的JAK2抗体的提取物中使JAK2发生免疫沉淀。 在蛋白质印迹后，使用磷酸酪氨酸特异性抗体4G10(Upstate)进行探针 探测评价JAK2的酪氨酸磷酸化。
图3画面A表示浓度渐增的CEP-701(从0.1到3.0fiM的CEP-701) 对STAT5磷酸化的剂量依赖性抑制。画面B表示浓度渐增的 CEP-701(从0.03到l.OjiM)对JAK2和STAT3的磷酸化的抑制。画面B 还表示BCIXl(JAK2/STAT5信号发放的下游效应器)的表达的剂量依赖 性抑制。
图7表示在暴露于浓度渐增的CEP-701下L0、1.5、和2.5小时后， STAT5的磷酸化的抑制。5个实验的平均抑制在底部显示。在HEL 92丄7细胞中对STAT5抑制的ICso为约10 nM，其将被解释为具有临 床意义上的对JAK2/STAT信号发放的抑制。图8表示在暴露于浓度渐 增的CEP-701下1.0、 1.5和2.5小时后，STAT3的磷酸化的抑制。5 个实验的平均抑制在底部显示。在HEL 92丄7细胞中对于STAT3抑制 的IC5。为约10nM，其将被解释为具有临床意义上的JAK2/STAT信号 发放的抑制。
图9表示在HEL 92细胞中，al-AGP对CEP-701介导的STAT5 活性的抑制的作用。如图9所述，1.0毫克/毫升的al-AGP使对STAT5 抑制的ICso改变为3)LiM。这些浓度在例如在80毫克剂量给药方案中在 体内可容易地实现。
实施例5
CEP-701对HEL 92肿瘤异种移植物的生长的作用。 在携带HEL92异种移植物的小鼠中评价CEP-701 (与媒介物对照
50相比)对瘤生长的作用。简而言之，每天两次皮下给用30毫克/千克的 CEP-701，并在图10所示的所选天数下评价肿瘤体积。瘤生长被
CEP-701抑制，并且在用CEP-701处理的小鼠中的肿瘤体积显著减小。
还在HEL 92异种移植物中评价了 CEP-701对JAK2/STAT信号发 放的作用。在该研究中，携带HEL.92肿瘤的动物接受了一剂 CEP-701(30毫克/千克，s.c.)，并通过蛋白质印迹在不同的时间点评价了 STAT5和STAT3抑制的动力学。如图11所示，CEP-701强烈地抑制 STAT5和STAT3磷酸化，在给药后第2-4小时观察到最大抑制。抑制 动力学与肿瘤内CEP-701浓度很好地相关，进一步证实了 CEP-701在 体内抑制JAK2/STAT信号发放的能力。
实施例6 患者样品
在XTT试验(图14)中显示了 CEP-701抑制从患者#648分离出的 CD34+细胞的生长。浓度渐增的CEP-701 (0.03(iM、 O.l(iM禾P 0.3|_iM) 在24小时(画面A)和48小时(画面B)使细胞生长减小。
图15表示对用CEP-701处理的得自患者#648的CD34+原代培养 物的激发荧光细胞分离器(FACS)分析。在画面A中，白色条形图显示 活细胞的数目。画面A中的黑色条形图显示细胞程序死亡的诱导，通 过测量锚定蛋白显示。在图15的画面B中，黑色条形图显示活的CD34+ 细胞的数目，其用浓度渐增的CEP-701处理24小时并然后被稀释到新 鲜的培养基中并培养另外72小时。使用锥虫蓝测定细胞计数。
图16表示CEP-701在得自患者#648的CD34+原代培养物中对 JAK2/STAT信号发放的作用。CD34+造血祖细胞从患者弁648中纯化并 且与浓度渐增(30nM、 100nM、 300nM和1000nM)的CEP-701如图所示 培养1小时。使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析、STAT3的表达和 磷酸化。为了评价JAK2活性，将JAK2免疫沉淀，然后使用抗磷酸酪氨酸特异性抗体(4G10)进行蛋白质印迹分析。在培养的携带V617F突变并得自MPD患者的CD34+前体细胞中，CEP-701显示抑制JAK2/STAT信号发放。
在培养的得自患者#648的CD34+细胞中评价了 CEP-701对SHP2、GAB2、 AKT和ERK的活化的作用。使用蛋白质印迹检测SHP2、GAB2(图17画面A)和AKT和ERK(图17画面B)的磷酸化和表达。将浓度渐增的CEP-701加入到得自患者#648的CD34+细胞的原代培养物中。使用的浓度是O(即，只有媒介物)、30、 100、 300和1000 nM的CEP-701 。 CEP-701显示抑制牵涉CD34+前体细胞的增殖和存活的多信号发放路径，暗示了在携带V617F突变的细胞中在受体水平下的广泛抑制。在画面B中，看家基因p-肌动蛋白的表达用作对照。
还在检测作为JAK2/STAT信号发放的下游靶标的STAT5的表达和磷酸化以及BCL-Xt的表达的试验中评价了得自患者弁648的细胞(图18)。将浓度渐增的CEP-701加入到得自患者#648的CD34+细胞的原代培养物中。使用的浓度是O(即，只有媒介物)、30、 100、 300和1000 nM的CEP-701。看家基因(3-肌动蛋白和亲环蛋白的表达用作对照。在这些细胞中，CEP-701显示抑制JAK2/STAT信号发放和Bclxl表达。延长暴露在CEP-701下(例如多次剂量给药)可导致STAT5表达的下调。
本领域技术人员可理解的是，有可能根据上述教导对本发明进行多种改进和改变。因此，可理解的是，在由权利要求书限定的范围内，本发明可以与本文所具体说明的不同方式被实践，并且本发明的范围意在涵盖所有的这些变体。
权利要求
1. 治疗脊髓增生病的方法，该方法包括对患者给用治疗有效量的作为JAK2抑制剂的化合物。
2. 权利要求l的方法，其中JAK2抑制剂是稠合的吡咯并咔唑。
3. 治疗脊髓增生病的方法，该方法包括对患者给用治疗有效量的下式所示的化合物、或其立体异构体或可药用盐的形式，其中环B和F独立地为苯基或杂芳基；W独立地为H;垸基；芳基；芳基烷基；杂芳基；杂芳基烷基；-COR9; -OR10; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)pOR10;-0(CH2)pOR!。；或-0(CH2)pNR7R8;R2独立地为H; -S02R9; -C02R9; -COR9;含l-8个碳的烷基；含2-8个碳的烯基；含2-8个碳的炔基；或含5-7个碳的单糖，其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含1_4个碳的垸基、含2-5个碳的烷基羰基氧基或含l-4个碳的烷氧基；和其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；其中当X为CHR16或NR16时，则R2和R16可任选地通过其2位和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选地分别被R"和！129取代；和连接呋喃的3位被R"和R"二取代；R3， R4， R5和R6独立地为H;芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN;-CF3; -N02; -0R1U; (CH2)pORlu; -0(CH2)pNR'R8; -OCORy;画OCONHR、-CH2OR14; -NR7R8; -NR1()COR9; -NR1()C02R9; -NR1()CONR7R8; -SCCOyR11;-C02R9 ; -COR9 ; -CONR7R8 ; -CHO ; -CH:NOR11 ; -CH=NR9 ;-CH=NNR12R13 ;-(CH2)pS(0)yR9 ;-CH2SR15 ;-CH2S(0)yR14 ;-(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8个碳的垸基；含2-8个碳的烯基；或含2-8个碳的炔基；其中垸基、烯基或炔基各自任选独立地被l-3个R"取代；X是含1-3个碳并任选被至少一个以下基团取代的亚烷基OH、 =0、二NOR11、 OR11、 -OCOR9、 -OCONR7R8、 -0(CH2)pNR7R8、 -O(CH2)pOR10、芳基、芳基烷基、杂芳基、-S02R9; -C02R9、 -COR9、含l-8个碳的烷基、含2-8个碳的烯基、含2-8个碳的炔基、或含5-7个碳的单糖，其中单糖的每个羟基独立地任选地被以下基团替代含1-4个碳的垸基、含2-5个碳的烷基羰基氧基或含1-4个碳的垸氧基；和其中垸基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；-O-; -S(0)y-; N(R16); CHR16; -CH2Z-; -Z-CH2-;或-CH2ZCH2-；其中z为c(or11)(1111)、 o、 s、 c(=o)、 c(二noru)或nru;其中当X为CHR"或NR"时，则112和R"可任选地通过其2位和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选地分别被R28和R29取代；和连接呋喃的3位被R17和R18 二取代；a'和八2独立地为h、 -or11、 -sr11或-n(rh)2;或者结合在一起形成=0、 二s或nrh的部分；B^PB2独立地为H、 -OR11、 -81111或^(1111)2;或者结合在一起形成=0、 二S或二NR"的部分；前提条件是A1和A2、或B1和B2的至少一对结合在一起形成=0;W和r8独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基；W独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；R"独立地为H或含1-4个碳的垸基；R11独立地为H、含1-4个碳的垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；仗12和R"独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基之后的残基；R"独立地为含l-4个碳的垸基；R"独立地为H、含1-4个碳的院基、含2-8个碳的烯基、含2-8个碳的炔基、芳基或杂芳基；其中垸基、烯基、炔基、芳基或杂芳基各自任选独立地被1-3个R27取代或者当X为CHR16或NR16时，则R2和R16可任选地通过其2位和5位结合在一起形成连接呋喃并且其中连接呋喃的2位和5位任选地分别被R^和R"取代；和连接呋喃的3位被R"和R"二取代；R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-烷基或含2-6个碳的O-酰基；R"独立地为H;含l-4个碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，其中Y为OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-GIc;CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;CH2NHCONHR'b;或者R17和R18可以任选地结合在一起形成-CH2NHC02-、-CH2OC(CH3)20-、 =0或-CH2N(CH3)C02-;R"独立地为H、含l-4个碳的垸基或含2-5个碳的酰基；R"独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或含氮原子的杂环烷基；R"和1122独立地为H、含1-4个碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys或含2-5个碳的酰基，前提条件是R"和R"中只有一个为Pro、 Ser、Gly、 Lys或酰基；R"独立地为芳基、含l-4个碳的烷基或含氮原子的杂环烷基；R"和R"独立地为H;含1-6个碳的垸基；苯基；或含1-6个碳的羟基垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；1126独立地为芳基；R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR1()COR9 ; -NR1()C02R9 ; -NR1()CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -P^OXOR11)"或陽OR";R"独立地为含l-4个碳的烷基、含l-4个碳的院氧基、含7-10个 碳的芳基烷基、-(CH2)pOR10、 -(CH2)pOC(=0)NR7R^-(CH2)pNR7R8;R^独立地为H、含1-4个碳的垸基、含1-4个碳的垸氧基、含7-10 个碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1()、 -(012)130(:(=0^117118或-(012)1^尺7118;p为1-4的整数；禾口y为0、 1或2。
4.权利要求3的方法，其中化合物具有下式所示的结构、或其立 体异构体或可药用盐的形式其中W独立地为H;垸基；苯基；含7-10个碳的芳基烷基；5-6元杂芳基；杂芳基烷基；-COR9; -OR1G; -CONR7R8; -NR7R8; -(CH2)pNR7R8; -(CH2)pOR1(); -0(CH2)pOR1();或-0(CH2)pNR7R8;R3， R4， R5和R6独立地为H;苯基；5-6元杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; CF3; -N02; -OR10; (CH2)pOR10; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9;誦OCONHR9 ; -CH2OR14 ; -NR7R8 ; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8; -SCOyi11; -C02R9; -COR9; -CONR7R8; -CHO;-CH-NOR11; -CH=NRy; -CH=NNR12R"; -(CH2)pS(0)yRy; -CH2SR"; -CH2S(0)yR14; -(CH2)PNR7R8; -(CH2)PNHR14;含1-8个碳的垸基；含 2-8个碳的烯基；或含2-8个碳的炔基；其中烷基、烯基或炔基任选地被l-3个R"基团取代；X为-CH-或N;A^口A2独立地为H、 -OR11、 -SR11或-N(R")2;或者，结合在一 起形成=0、 S或-NRH部分；B^卩B2独立地为H、 -OR11、 -81111或^(1111)2;或者，结合在一起 形成=0、 -S或二NR"部分；前提条件是A1和A2、或B1和B2的至少一对结合在一起形成K);W和RS独立地为H或含1-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环垸基；R"虫立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；R^独立地为H或含l-4个碳的垸基；R11独立地为H、含1-4个碳的垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； 1112和R"独立地为H、垸基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基；R"独立地为氨基酸的在除去羧基的之后的残基； R"独立地为含l-4个碳的烷基；R"独立地为H、含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基； R"独立地为OH、含1-6个碳的O-正-烷基或含2-6个碳的O-酰基；R"独立地为H;含l-4个碳的烷基；CONHC6H5; CH2Y，其中Y为OR19、 SOR20、 NR"R"或SR23; N3; C02R15; S-Glc; CONR24R25 ;CH=NNHCONH2 ;CONHOR10 ;CH=NOR10 ;CH2NHCONHR10;或者R17和R18任选地结合在 一 起形成-CH2NHCO -CH2OC(CH3)20-、 =0或-CH2N(CH3)CCV;CH=NNHC(=NH)NH:CH=NN(R26)2 ; 或R^独立地为H、含1-4个碳的烷基或含2-5个碳的酰基； R^独立地为含l-4个碳的烷基、芳基或含氮原子的杂环垸基； R"和1122独立地为H、含1-4个碳的烷基、Pro、 Ser、 Gly、 Lys或含2-5个碳的酰基，前提条件是R"和R22中只有一个为Pro、 Ser、Gly、 Lys或酰基；R"独立地为芳基、含l-4个碳的烷基或含氮原子的杂环烷基；RM禾P R"独立地为H;含1-6个碳的垸基；苯基；或含1-6个碳 的羟基垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基； R^独立地为芳基；R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; ■NR10SO2R9;陽S(0)yR"; -C02R9; —GONR7R8; -CHO; -COR9; —GH2OR7; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;國PO(OR")2;或國OR";R"独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的垸氧基、含7-10个 碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1Q-、 (CH2)pOC(二0)NR7r8或-(CH2)pNR7r8;R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、含1-4个碳的垸氧基、含7-10 个碳的芳基垸基、-(CH2)pOR1()、 -(0!2)]30(:(=0^117118或-((:112)1^117118;p为l-4的整数；和y为0、 1或2。
5.权利要求4的方法，其中化合物具有下式所示结构、或其立体 异构体或可药用盐的形式其中R3， R4， R5禾卩R6 虫立;t也为H;苯基；F; CI; -OR10; (CH2)pOR10;-NR7R8; -CHO; -(CH2)PNR7R8;或含l-8个碳的烷基； 其中垸基任选地被l-3个R"基团取代； X为-CH-或N;W和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；或者，与其所连接的氮 一起形成5-7元杂环垸基；W独立地为含l-4个碳的烷基、芳基或杂芳基； RW独立地为H或含1-4个碳的烷基；RH独立地为H、含1-4个碳的烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基； 仗12和R"独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环垸基；R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基；R"独 立地为OH、含1-6个碳的O-正-垸基或含2-6个碳的O-酰基；R"独立地为H、含1-4个碳的烷基、CONHC6H5; CH2OH; CH2OCH3; CH2OC(CH3)3; CH2NH2; C02CH3;或CONR24R25;1124和R"独立地为H;含1-6个碳的垸基；苯基；或含1-6个碳 的羟基垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9 ; -NR10CO2R9 ; -NR10CONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ; -NR10SO2R9; -S(0)yRu; -C02R9; -CONR7R8; -CHO; -COR9; -CH2OR7;-CH=NNR12Rlj; -CH^NOR11; -CH=NRy; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13; -PO(ORu)2;或-OR14;R"独立地为含l-4个碳的垸基、含l-4个碳的烷氧基、含7-10个碳的芳基烷基、-(ch2)por1()、 -(0!2){)0(:(=0^117118或-((:1"12)"1 7118;R"独立地为H、含1-4个碳的垸基、含1-4个碳的垸氧基、含7-10个碳的芳基垸基、-(ch2)por10、-(<:仏){)0(:(=0^117118或-((:^){^117118;p为1-4的整数；禾口y为0、 1或2。
6. 权利要求5的方法，其中R3， R4， 115和w各自独立地为H、 苯基、F、 Cl、 -OR1Q、 -NR7R8、 -CHO、 -(CH2)PR7R8或含1-8个碳的烷 基，其中烷基任选地被l-3个R"基团取代。
7. 权利要求4的方法，其中化合物具有下式所示结构、或其立体 异构体或可药用盐的形式其中R3， R4， 115和R6独立地为H、 Cl、含1-4个碳的烷基、-OR1G、 CH2OR10、 NR7r8、 CH2NR7rm CONR7R8;尺7和RS独立地为H或含l-4个碳的烷基；111(>独立地为H或含1-4个碳的烷基；R卩独立地为OH或含1-4个碳的O-正-垸基；R"独立地为H、 CH2OH、 C02CH3、 C02CH2CH3、 C02CH2CH2CH3 或C02CH(CH3)2;或者1128独立地为CH3;和R29独立地为H或CH3。
8.权利要求7的方法，其中化合物具有下式所示结构:<formula>formula see original document page 10</formula> 。
9.权利要求7的方法，其中化合物具有下式所示结构、或其立体异构体或可药用盐的形式其中(a) ie和R"各自独立地选自H、含l-6个碳的垸基、含l-3个碳 的羟基垸基和含3-6个碳的烯基，前提条件是W和R"不都为H;(b) A^卩A^P是氢和R3、 R4、尺5和116各自独立地为11或者它们 最多两个为F; CI; Br; I; N02; CN或OH; NHCONHR7，其中R7 为含1-4个碳的烷基，前提条件是R3、 R4、 W和R6中只有一个为 NHCONHR7; CH2OR1Q;含1-4个碳的烷基；CH2OCONHC2H5;或NHC02CH3;禾口(c)当A'和A2二者结合在一起表示O时；贝U R3、 R4、 115和R6各自为氢。
10.权利要求3的方法，其中化合物具有下式结构、或其立体异构体或可药用盐的形式其中R"独立地为-C02R、 -COR9;含1-4个碳的烷基；其中垸基任选 地被l-3个R"基团取代；R3， R4， 115和R6独立地为H;苯基；CI; -OR10; (CH2)pOR1(); -NR7R8; -(CH2)PNR7R8;或含l-6个碳的烷基；其中垸基任选地被1-3个R"基团取代；W和RS独立地为H或含l-4个碳的垸基；或者，与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；W独立地为含l-4个碳的垸基、芳基或杂芳基；R^独立地为H或含l-4个碳的烷基； RH独立地为H、含l-4个碳的烷基、含6-10个碳的芳基； 1112和R"独立地为H、烷基、含6-10个碳的芳基或杂芳基；或者， 与其所连接的氮一起形成5-7元杂环烷基；R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基； R"独立地为H、含l-4个碳的垸基；R27独立地为芳基；杂芳基；F; CI; Br; I; -CN; -N02; -OR10;-0(CH2)PNR7R8; -OCOR9;國OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR1QCOR9 ; -NR^COzR9 ; -NR1QCONR7R8 ; -NHC(=NH)NH2 ;-NRluS02Ry; -S(O)yR"; -C02Ry; -CONR'R8;扁CHO; -CORy; -CH2OR'; -CH=NNR12R13; -CH=NORu; -CH=NR9; -CH=NNHCH(N=NH)NH2; -S02NR12R13;隱PO(ORU)2;或陽OR"; p为l-4的整数；和y为0、 1或2。
11.权利要求IO的方法，其中化合物具有下式结构、或其立体异构体或可药用盐的形式其中W独立地为-C02R^ -COR9;含1-4个碳的垸基；其中垸基任选 地被l-3个R"基团取代；R7和RS独立地为H或含1-4个碳的垸基；或者，以其所连接的氮一起形成任选地包含另外的环氮原子的5-6元杂环垸基；W独立地为含l-4个碳的烷基或苯基； R"独立地为H或含1-4个碳的烷基； R"独立地为H、含l-4个碳的垸基；R"独立地为氨基酸的在除去羧基的羟基后的残基；R27独立地为苯基；5-6元杂芳基；-OR1G; -0(CH2)pNR7R8; -OCOR9; -OCONHR9; O-四氢吡喃基；-NR7R8; -NR10COR9; -NR10CO2R9; -NR10CONR7R8; -NR10SO2R9; -SCCOyR11; -C02R9; -CONR7R8; -COR9; -CH2OR7;或-OR14;p为l-4的整数；禾口y为0、 1或2。
12. 权利要求3的方法，其中所述脊髓增生病选自真性红细胞 增多症(PV)、特发性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纤维化(MMM)、特发性骨髓纤维化(CIMF)、未分类的脊髓增生病(uMPDs)、 嗜酸性白细胞增多综合征(HES)和系统性肥大细胞增多症(SM)。
13. 权利要求8的方法，其中所述脊髓增生病选自真性红细胞 增多症(PV)、特发性血小板增多(ET)、伴骨髓外化生的骨髓纤维化 (MMM)、特发性骨髓纤维化(CIMF)、未分类的脊髓增生病(uMPDs)、 嗜酸性白细胞增多综合征(HES)和系统性肥大细胞增多症(SM)。
14. 权利要求13的方法，其中化合物以每天约0.8毫克/千克体重 到约1.3毫克/千克体重的量给用。
15. 权利要求13的方法，其中化合物以约60毫克到约80毫克的 量每天两次给用。
全文摘要
本发明提供了在哺乳动物中治疗脊髓增生病、脊髓发育异常综合征和其它其中JAK2的活化对病理学有贡献的疾病的方法，该方法包括对哺乳动物给用有效量的稠合的吡咯并咔唑衍生物，其中稠合的吡咯并咔唑衍生物抑制JAK2的活化。
文档编号A61K31/553GK101489562SQ200780027662
公开日2009年7月22日 申请日期2007年7月20日 优先权日2006年7月21日
发明者布鲁斯·A·鲁杰里, 帕维尔·多布然斯基 申请人:赛福伦公司