泰伐洛星作为抗病毒剂的用途的制作方法

专利名称：泰伐洛星作为抗病毒剂的用途的制作方法
专利说明泰伐洛星作为抗病毒剂的用途 本发明涉及一种抗生素在制备抗病毒药剂中的用途。本发明还涉及一种治疗病毒感染的方法，包括将一种抗生素给予病毒感染的受试者。
泰伐洛星(tylvalosin)是乙酰基异戊酰泰乐菌素(acetylisovaleryltylosin)的临时INN名称，是一种大环内酯类抗生素。含泰伐洛星的产品被称为爱乐新

(

)。它被用于多种治疗当中，特别是用于治疗农场动物的多种细菌感染。泰伐洛星是一种泰乐菌素(tylosin)衍生物，具有下式
其中R是异戊酰。
当以大规模方式尤其是集约方式进行家畜类动物饲养时，它们趋向于患某些疾病。这些疾病还往往会通过家畜快速传播。一种这样的疾病是猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。PRRS是由病毒PRRSV引起的，并感染所有年龄段的猪。它具有呼吸和生殖两种体征，并且被认为每年造成全世界猪产业数亿英镑的损失。
PRRS经常与细菌感染并发，特别是与猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(M-hyo)感染并发。这种感染普遍存在于猪群中并能引起肺炎。当猪同时感染了M-hyo和PRRSV时，肺炎会变得非常严重。如今，爱乐

(泰伐洛星)在患有和未患有PRRS的猪中均被用于治疗M-hyo。
本发明人已经意外地发现，爱乐

(泰伐洛星)本身可用于治疗PRRSV。本发明人已经发现，爱乐

(泰伐洛星)对所述病毒有直接效应。
迄今为止，爱乐

仅被用于治疗细菌感染，例如M-hyo。爱乐

(泰伐洛星)还没有被用于治疗病毒感染。虽然爱乐新

(泰伐洛星)已被用于治疗患有PRRS的猪体内的M-hyo，但是除了它对所述细菌感染有效果之外，并不知道它还对所述病毒有效果。
抗生素对病毒感染有效应不是通常现象。泰伐洛星是大环内酯类抗生素。其他大环内酯类对病毒有极其不同的效应。替米考星(tilmicosin)已经被发现可有效地对抗一些包括PRRSV的病毒。然而，替米考星在抗病毒能力的细胞培养物测定中的毒性比泰伐洛星大的多。而且，与泰伐洛星最密切相关的抗生素——泰乐菌素，对PRRSV没有效应，并且不知道它对其他病毒有任何的效应。
根据本发明，提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐在制备用于预防或治疗病毒感染的药剂中的用途。
如上文指出的，泰伐洛星是一种被称为3-O乙酰基-4＂-O-异戊酰泰乐菌素的大环内酯类抗生素。泰伐洛星是本领域中熟知的。泰伐洛星的衍生物和代谢物包括与泰伐洛星密切相关的的任何化合物，或者在泰伐洛星溶于溶液中或被给予受试者时所形成的任何化合物。泰伐洛星的衍生物和代谢物包括大量被发现作为与泰伐洛星(特别是溶于溶液中)有关的物质的化合物，例如3-O-乙酰脱碳糖泰乐菌素(Acetyldesmycosin)、3-O-乙酰泰乐菌素、3，4＂-二-O-乙酰泰乐菌素、a-O-乙酰基-4＂-O-丙酰泰乐菌素、3-O-乙酰基-4＂-O-异戊酰大菌素(Isovalerylmacrocin)、3-O-乙酰基-4＂O-丁基泰乐菌素、3-O-乙酰基-4＂-O-异戊酰瑞洛霉素(isovalerylrelomycin)、4＂-O-异戊酰泰乐菌素、3，20-二-O-乙酰基-4＂-异戊酰瑞洛霉素和3，4″′-二-O-乙酰基-4＂-O-异戊酰泰乐菌素。泰伐洛星可以为爱乐新

的形式。
当泰伐洛星以可药用酯的形式存在时，优选它的烷基酯。当泰伐洛星以可药用盐的形式存在时，可以使用任何合适的盐。优选与有机酸形成的盐，特别是与诸如抗坏血酸、羟乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸的酸形成的盐。
功能性衍生物、代谢物、酯和盐以与泰伐洛星相同的方式发挥功能，也就是说，它们对于具体的病毒感染有类似的效应。
特别优选的是，本发明涉及泰伐洛星或者其酯或盐在制备用于预防或治疗病毒感染的药剂中的用途。
术语病毒感染的意思是宿主中存在病毒颗粒。具体来说，它的意思是在受试者中存在正常情况下不出现于该宿主中的病毒颗粒，或者在所述宿主中是致病的或会引起疾病的病毒颗粒。
预防病毒感染的意思是，当与暴露于病毒后未经治疗宿主的预期状态相比较时，减少宿主中病毒颗粒的数目，减少或防止宿主中病毒颗粒的复制，减少或防止病毒复制的细胞病变效应，减少或防止所述病毒侵入细胞质，或者减少或防止病毒感染的病理效应或体征/症状。
未经治疗的宿主是没有接受根据本发明制备的药剂的宿主。
所述预期状态是暴露于病毒后未经治疗的宿主中可能的病毒颗粒数目、细胞病变效应的水平、病理效应或者体征/症状。本领域技术人员将能够预测这一点。
对病毒感染治疗的意思是，当与治疗前的状态相比较时，减少宿主中病毒颗粒的数目，减少或防止宿主中病毒颗粒的复制，减少或防止病毒复制的细胞病变效应，减少或防止所述病毒侵入细胞质，或者减少或防止病毒感染的病理效应、临床体征或症状。
当宿主中病毒颗粒的数目得到减少，宿主中病毒颗粒的复制得到减少或防止，病毒复制的细胞病变效应得到减少或防止，所述病毒侵入细胞质得到减少或防止，或者病毒感染的病理效应、临床体征或症状得到减少或防止时，那么所述减少优选是统计学上显著的。例如，优选的减少为至少25％，更优选至少30％，还更优选至少35％，最优选至少40％。
宿主为高等生物，病毒使用其细胞进行复制。所述宿主可以为人或动物。所述宿主优选地为动物，特别是家畜动物，例如牛、马、家禽或猪。所述宿主特别优选地为猪。或者，所述宿主优选地为人。
所述病毒优选地为使用内体途径或溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
术语内体途径和溶酶体途径是本领域中熟知的。它们是指被某些病毒使用来侵入细胞的机制。为了启动复制，所有病毒都必须有侵入靶细胞的途径。病毒通常以两种途径做到这一点，通过在细胞质膜处的直接机制，或者通过细胞内摄作用侵入诸如内体(endosome)或溶酶体的细胞区室中。使用内体和溶酶体侵入细胞的病毒还必须与所述内体膜或溶酶体膜融合或者透过所述膜，以释放至细胞质中。
内体是携带通过胞吞作用新摄入的物质的细胞器。该术语在本领域中是熟知的。
溶酶体是含降解酶的细胞器。该术语在本领域中是熟知的。
许多使用内体途径或溶酶体途径的病毒需要特定的pH，目的是经历构象变化，所述构象变化会触发与内体膜融合及细胞入侵。
不希望拘囿于具体的理论，本发明人相信泰伐洛星会进入细胞、在内体和溶酶体中富集，并影响这些内体和溶酶体中的pH。本发明人相信，内体或溶酶体pH的这种变化可阻止所述内体或溶酶体中的病毒颗粒与所述内体膜或溶酶体膜的融合，从而阻止所述病毒侵入细胞质和复制。
所述病毒优选是使用晚期内体途径或溶酶体途径的病毒。
晚期内体是一种前溶酶体细胞器(pre-lysosomal organelle)。术语晚期是指胞吞的分子被送递至所述晚期内体中所耗的时长。晚期内体比早期内体更圆，并且位于靠近核的地方。晚期内体具有比早期内体更酸的pH。术语晚期内体在本领域中是熟知的。
所述病毒优选是使用受Rab7调控的内体途径或溶酶体途径的病毒。
Rab蛋白是存在于某些细胞区室的细胞质面上的小鸟苷三磷酸酶(small GTPase)。它们具有调节通过这些区室膜的运输的功能。Rab7具有调节晚期内体和溶酶体中运输的功能。
所述病毒优选地是需要内体或溶酶体内的pH低于6.5、优选低于6、更优选低于5.5、还更优选低于5、最优选低于4.5的病毒。
可以使用pH敏感染料(例如在中性pH下发蓝色荧光且在低pH下发黄色/绿色荧光的染料)测量内体或溶酶体的pH。蓝色黄色的比值可提供内体/溶酶体pH的一个量度(Diwu，Chen，Zhang，Klaubert andHaughland(1999)Chemistry and Biology，第6卷，第7期，411-418)。
一种病毒是否使用内体途径或溶酶体途径实现细胞侵入是普遍已知的。在这一点未知的不常见情况下，本领域技术人员可以通过在存在已知会改变内体pH或溶酶体pH的化合物时测试病毒侵入细胞，或者通过使用缺失特定Rab蛋白的突变体，可以确认病毒是否使用内体途径或溶酶体途径，检验该途径的哪一部分被使用，或者确认pH依赖性或Rab蛋白依赖性。例如，可以使用以下的化学抑制剂 ·氯喹或氯化铵，它们通过作为质子池(proton sink)来升高内体pH；以及 ·诺考达唑(nocodazole)，它将微管解聚，并阻断从早期内体到晚期内体的转换。
如果病毒在存在氯喹或氯化铵时不能侵入细胞，那么可以认为它是pH依赖的，需要酸性pH来感染细胞。如果是诺考达唑阻止病毒感染细胞，那么可以认为它使用晚期内体途径或溶酶体途径侵入细胞，其侵入的这些途径被诺考达唑阻断。
或者，可以使用以下的显性负突变体 ·rab5 S34N突变体，它阻断从质膜中网格蛋白包被的小窝到早期内体的转换，以及 ·rab7 T22N突变体，它阻断从早期内体到晚期内体的转换。
被rab5 S34N突变体抑制的病毒需要在约pH6.5时通过早期内体。被rab7 T22N突变体抑制的病毒需要在约pH5时通过晚期内体。
所述病毒可以是，例如来自任何以下科的病毒腺病毒科(Adenoviridae)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、微小核糖核酸病毒科(Pieornaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和披膜病毒科(Togaviridae)。
再者，所述病毒可以是，例如来自任何以下属的病毒哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、非洲猪瘟病毒属(Asfarvirus)、汉坦病毒属(Hantavirus)、环状病毒属(Circovirus)、冠状病毒属(Coronavirus)、黄病毒属(Flavivirus)、瘟病毒属(Pestivirus)、肝炎病毒属(Hepacivirus)、甲型流感病毒(Influenza virusA)、贫病毒属(Isavirus)、细小病毒属(Parvovirus)、肠道病毒属(Enterovirus)、鼻病毒属(Rhinovirus)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、轮状病毒属(Rotavirus)和甲病毒属(Alphavirus)。
具体来说，术语病毒可以指任何一种或多种的以下病毒或者它们的任何组合腺病毒7、PRRSV、流感(包括人、禽、猪、马、牛和狗流感)、鲑鱼贫血病毒(salmon anaemia virus)、猪瘟(classical swine fever)、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲猪瘟病毒、普马拉病毒(Puumalavirus)、传染性支气管炎病毒、传染性肠胃炎、SARS CoV、马堡病毒(Mraburg virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、西尼罗河病毒(West Nilevirus)、黄热病病毒(yellow fever virus)、蜱传脑炎病毒(tick borneencephalitis virus)、牛病毒性腹泻病毒(bovine diarrhoea virus)、犬细小病毒、柯萨奇B3病毒(Coxsackie B3)、柯萨奇B5病毒(Coxsackie B5)、禽呼肠孤病毒(avian reovirus)、轮状病毒、塞姆利基森林病毒(Semlikiforest virus)和2型猪环状病毒(porcine circo type 2)。
所述病毒优选为PRRSV。
或者，所述病毒优选不是PRRSV。
在另一个备选方案中，所述病毒优选地为流感，特别是人流感，具体地是甲型(A)或乙型(B)人流感毒株，特别是甲型人流感毒株。
优选的病毒的详细情况在表6给出。
此外，本发明提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐在制备用于治疗任何一种或多种的以下病毒(包括它们的任一组合)的药剂中的用途腺病毒7、PRRSV、流感(包括人、禽、猪、马、牛和狗流感)、鲑鱼贫血病毒、猪瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲猪瘟病毒、普马拉病毒、传染性支气管炎病毒、传染性肠胃炎、SARSCoV、西尼罗河病毒、马堡病毒、埃博拉病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、犬细小病毒、柯萨奇B3病毒、柯萨奇B5病毒、禽呼肠孤病毒、轮状病毒、塞姆利基森林病毒和猪环状病毒2型。
另外，本发明提供了泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐在制备用于预防或治疗本文中定义的病毒感染和预防或治疗细菌感染的药剂中的用途。
所述病毒感染的预防或治疗可以与所述细菌感染的预防或治疗同时进行，或者在其之后或之前进行。
术语细菌感染的意思是在宿主中存在细菌。具体来说，它的意思是在受试者中存在正常情况下不出现于该宿主中的细菌或在所述宿主中是致病的或会引起疾病的细菌；或者在所述宿主的部位中存在正常情况下不出现的细菌。
预防细菌感染的意思是，当与暴露于细菌后未经治疗宿主的预期状态相比较时，减少宿主中细菌的数目；减少或防止宿主中细菌的复制；或者减少或防止细菌感染的病理效应或者临床体征或症状。
未经治疗的宿主是没有接受根据本发明制备的药剂的宿主。
所述预期状态是暴露于细菌后在未经治疗的宿主中可能的细菌数目、病理效应或者临床体征或症状。本领域技术人员将能够预测这一点。
对细菌感染治疗的意思是，当与治疗前的状态相比较时，减少宿主中细菌的数目；减少或防止宿主中细菌的复制；或者减少或防止细菌感染的病理效应或者临床体征或症状。
所述细菌感染可以是对泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐治疗敏感的任何感染。具体来说，所述细菌感染可以是任何一种或多种以下细菌的感染 支原体属(Mycoplasma)的种(猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)、猪滑液囊支原体(M.hyosynoviae)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、鸡毒支原体(M.gallisepticum)、滑液囊支原体(M.synoviae)、火鸡支原体(M.meleagridis)、牛支原体(M.bovis)、牛鼻支原体(M.bovirhinis)) 鼻气管鸟杆菌(Orninthobacterium rhinotracheale) 支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica) 胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae) 多杀性巴斯德氏杆菌(Pasteurella multocida) 溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica) 马红球菌(马棒状杆菌)(Rhodococcus(Corynebacterium)equi)链球菌(Streptococci)(猪链球菌(Strep.suis)、化脓性链球菌(Strep.pyogenes)) 葡萄球菌(Staphylococci)(金黄色葡萄球菌(Staph.aureus)、表皮葡萄球菌(Staph.epidermidis)) 猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteria) 多毛短螺旋体(Brachyspira pilosicoli) 细胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis) 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) (梭菌属(Clostridium)的多个种) 白喉杆菌(corynebacterium diphtheriae) 触酶气球菌(Aerococcus catalasicus) 粘乳产碱菌(Alcaligenes viscolactis) 藤黄微球菌(Micrococcus luteus) 黄色微杆菌(Microbacterium tlavum) 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 立克次氏体属种(Rickettsia spp) 衣原体属种(Chlamydia spp) 李斯特菌属种(Listeria spp) 红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae) 汉赛巴通体(Bartonella henselae) 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) 无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、乳房链球菌(Strep.uberis) 坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum) 钩端螺旋体属种(Leptospira spp) 所述细菌感染优选地为支原体种的感染，特别是猪肺炎支原体感染。
许多病毒感染经常与其他病毒感染和/或细菌感染联合出现，使用一种药剂即能治疗不止一种感染将是特别有用的。例如，猪商业化生产的最重要经济疾病之一是被称为猪呼吸道综合症(PRDC)的疾病。它是多因素的，涉及许多的病毒和细菌，包括PRRSV、2型猪环状病毒、猪流感、猪冠状病毒和伪狂犬病病毒(奥叶兹基氏病(Aujeszky’s))，以及细菌病原体猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴斯德氏杆菌、猪链球菌和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。从而，当所述病毒感染是PPRSV和/或猪流感的感染时，所述细菌感染优选地是猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴斯德氏杆菌、猪链球菌或支气管败血性博德特氏菌中的一种或多种的感染。
在牛中有类似的呼吸道疾病综合症，这种综合症与牛病毒性腹泻病毒(BVD)、副流行性感冒(parainfluenza)(PIV)、牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytical virus)(BRSV)、传染性牛鼻气管炎(infectious bovine rhinotracheitis)(IBR)及巴斯德氏菌(Pasteurella)相关。牛支原体(Mycoplasma bovis)也可能会加重这种疾病。
因此，当所述病毒感染是牛病毒性腹泻病毒的感染时，所述细菌感染优选地是溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)杆菌或牛支原体的感染。
在家禽中有许多低致病的禽流感病毒，这些病毒与在鸡毒支原体也存在时很大增加的疾病相关。高死亡率和发病率出现于双重感染的群体中。
因此，当所述病毒感染是禽流感的感染时，所述细菌感染优选地是鸡毒支原体感染。
人的流感病毒感染可使该个体易于受第二细菌的感染，所述细菌例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性链球菌(Streptococcihaemolyticus)、肺炎球菌(Pneumococci)、铜绿假单胞菌(Pseudomanoasaeruginosa)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。
因此，当所述病毒感染是人流感的感染时，所述细菌感染优选地是金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌中的一种或多种的感染。
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是呼吸道疾病的常见的诱因(common cause)，它与流感病毒和呼吸道合胞病毒的共同感染已被报道，这是因为有这样的事实，即肺炎支原体在流感爆发中可重叠感染。
因此，或者说，当病毒感染是流感的感染时，所述细菌感染优选地为肺炎支原体的感染。
本发明还提供了一种预防或治疗病毒感染的方法，包含将泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐，或者含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐的药物组合物给予已感染病毒的受试者。
所述方法同时还用于治疗或预防细菌感染。
在本发明的方法中给予的药物组合物包含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐，以及任一药用载体、佐剂或运载体(vehicle)。可用于所述药物组合物中的可药用载体、佐剂和运载体包括，但不限于，离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘油、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇以及羊毛脂。
可用通过以下方式给予所述药物组合物口服、经肠胃外、通过吸入喷雾、经直肠、经鼻、含服、经阴道、经局部、经皮肤或经植入型药盒。本发明的药物组合物可以包含无毒可药用的任何常规载体、佐剂或运载体。本文使用的术语肠胃外的包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。
所述药物组合物可以为无菌注射制剂的形式，例如为无菌注射用的水性悬液或油性悬液。可以根据本领域的已知技术使用合适的分散剂或湿润剂(例如吐温80)及助悬剂配制该悬液。该无菌注射用制剂还可以为溶于可肠胃外用的无毒稀释剂或溶剂的无菌注射用溶液或悬液，例如为溶于1，3-丁二醇的溶液。甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液在可以应用的可用运载体及溶剂的范围内。另外，无菌不挥发性油通常被用作溶剂或助悬介质。基于本文的目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。在注射剂的制备中可使用脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，也可使用天然的可药用油，例如橄榄油或蓖麻油(特别是以它们的聚氧乙烯化的形式)。这些油溶液或悬液还可以包含长链的醇稀释剂或分散剂，例如Ph.Helv或类似的醇。
可以以任何可口服的剂型经口服给予所述药物组合物，所述剂型包括，但不限于，胶囊、片剂以及水性悬液和溶液。在用于口服的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当通过口服给予水性悬液时，所述活性成分可与乳化剂及助悬剂结合。如果需要，可添加某些甜味剂和/或增香剂和/或着色剂。
还可以以用于直肠给药的栓剂的形式给予所述药物组合物。这些组合物可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂(excipient)混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体而在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放所述活性组分。这种材料包括，但不限于，可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
可以以鼻气雾剂或吸入剂给予所述药物组合物。这种组合物可根据药物配制领域熟知的技术制备并且可被制成溶于盐水的溶液，并应用苯甲醇或其他适宜的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物，以及/或者本领域中已知的其他增溶剂或分散剂。
所述受试者可以是任何病毒感染的受试者。具体而言，所述受试者可以为人或动物。所述宿主优选地为动物，特别是家畜动物例如牛、马、家禽或猪。所述宿主特别优选地为猪。或者，所述宿主优选地为人。
下面将参照以下附图仅通过示例的方式详细描述本发明，其中

图1所示为存在爱乐新

(泰伐洛星)的情况下，暴露于PRRSV后感染的细胞数目的测定结果； 图2所示为存在爱乐新

(泰伐洛星)的情况下，暴露于流感后感染的MDCK细胞数目的测定结果； 图3所示为存在爱乐新

(泰伐洛星)的情况下，暴露于流感后感染的Caco-2细胞数目的测定结果； 图4所示为存在爱乐新

(泰伐洛星)的情况下，暴露于流感后感染的HeLa细胞数目的测定结果； 图5所示为时间和浓度对泰伐洛星在HRT-18细胞中的细胞内积聚的效应。a)将HRT-18细胞用0.5、5或50μg/mL泰伐洛星孵育4或24小时。采集双份的培养基样品(白色柱和浅灰色柱)和细胞样品(黑色柱和深灰色柱)。培养基中的浓度显示为μg泰伐洛星/mL培养基，而细胞中的浓度为μg泰伐洛星/mg细胞。b)计算每个样品中泰伐洛星的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(样品1为黑色柱，样品2为白色柱)； 图6所示为泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在HRT-18细胞中的细胞内积聚。a)将HRT-18细胞用10μg/mL每种抗生素孵育4或24小时。在每个时间点采集双份细胞样品(白色柱和黑色柱)，并采集一份培养基样品(灰色柱)。培养基中的浓度显示为μg大环内酯/mL培养基，而细胞中的浓度为μg大环内酯/mg细胞。b)计算每种大环内酯的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(样品1为黑色柱，样品2为白色柱)； 图7所示为泰伐洛星在极化的Caco-2细胞中的细胞内积聚和跨上皮运输。将Caco-2细胞用顶室(apical chamber)(a)或底外侧室(basolateral chamber)(b)中的100μg/mL泰伐洛星孵育30分钟(浅灰色柱)、60分钟(黑色柱)、120分钟(白色柱)和240分钟(深灰色柱)。在每个时间点采集双份细胞样品并从两个室中采集双份培养基样品。培养基中的浓度显示为μg泰伐洛星/mL培养基，而细胞中的浓度为μg泰伐洛星/mg细胞。在将泰伐洛星加入至顶室(c)和底外侧室(d)的情况下，计算样品的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(样品1为黑色柱，样品2为白色柱)。对在顶室给药后的底外侧室培养基(e)和在底外侧室给药后的顶室培养基(f)取样，并将泰伐洛星浓度以投入量百分比的形式绘图； 图8所示为泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在极化的Caco-2细胞中的细胞内积聚和跨上皮运输。a)将Caco-2细胞用顶室中的10μg/mL泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星孵育30分钟(浅灰色柱)、60分钟(黑色柱)、120分钟(白色柱)和240分钟(深灰色柱)。在每个时间点收集双份细胞样品并从两室中收集双份培养基样品。培养基中的浓度显示为μg大环内酯/mL培养基，而细胞中的浓度为μg大环内酯/mg细胞。b)计算样品的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(样品1为黑色柱，样品2为白色柱)。c)对在顶室给药后的底外侧室培养基取样，并将抗生素浓度以投入量百分比的形式绘图； 图9所示为泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在猪肾上皮细胞中的细胞内积聚。a)将LLC-PK1细胞用10μg/mL每种抗生素孵育图例中所示的时间。在每个时间点采集双份细胞样品和培养基样品(灰色柱为32分钟样品，白色柱为75分钟样品，黑色柱为120分钟样品)。培养基中的浓度显示为μg大环内酯/mL培养基，而细胞中的浓度为μg大环内酯/mg细胞。b)计算每种大环内酯的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(灰色柱为32分钟样品，白色柱为75分钟样品，黑色柱为120分钟样品)；以及 图10所示为大环内酯抗生素在猪白细胞和鸡白细胞中的细胞内积聚。a)将猪白细胞用10μg/mL泰伐洛星或泰乐菌素孵育10或20分钟。在孵育20分钟后，将加载大环内酯的细胞转移至培养基中，并继续孵育30分钟。在每个时间点采集双份细胞样品和培养基样品(灰色柱为10分钟冲洗，白色柱为20分钟冲洗，黑色柱为30分钟冲洗)。培养基中的浓度显示为μg大环内酯/mL培养基，而细胞中的浓度为μg大环内酯/mg细胞。b)计算每种大环内酯的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(灰色柱为10分钟，白色柱为20分钟)。c)估计冲洗之后所述细胞中剩余的大环内酯量，计算所述细胞中的保留量％并绘图(黑色柱为30分钟冲洗样品)。d)将鸡白细胞用10μg/mL泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星孵育15、30或60分钟。在每个时间点采集双份细胞样品和培养基样品(灰色柱为15分钟，白色柱为30分钟，黑色柱为60分钟)。培养基中的浓度显示为μg大环内酯/mL培养基，而细胞中的浓度为μg大环内酯/mg细胞。e)计算每种大环内酯的细胞内浓度细胞外浓度的比值并绘图(灰色柱为15分钟，白色柱为30分钟，黑色柱为60分钟)。
图11所示为爱乐新

(泰伐洛星)、替米考星和泰乐菌素对MDCK细胞的流感病毒感染的效应。
图12所示为爱乐新

(泰伐洛星)对感染后PRRSV扩散的效应。图13所示为各种化学药品(氯丙嗪(chlorpromazine)、氯喹(chloroquine)、细胞松弛素D、诺考达唑(Nocodazole))和爱乐新

(泰伐洛星)对PRRSV的效应。
图14所示为各种剂量的氯喹对PRRSV、EAV(马动脉炎病毒(equinearteritis virus))和FCV(猫杯状病毒(feline calicivirus))复制的效应。
图15所示为爱乐新

(泰伐洛星)对流感病毒(Udorn毒株)的效应 a)细胞单层中病毒感染细胞的百分率 b)用于在用爱乐新

(泰伐洛星)预处理或未处理的细胞中定量病毒滴度的噬菌斑测定。PRRSV病毒的复制在处理的细胞单层中被抑制，仅检测到残留的病毒接种物。
图16所示为各种大环内酯对VR2332(美洲I型PRRSV毒株)复制的效应。
图17所示为VR2332侵入的测定结果。
图18所示为泰伐洛星对HeLa细胞和HT29细胞的病毒感染的效应。
图19所示为测试泰伐洛星对内体pH的效应的吖啶橙测定的结果。
实施例 实施例1 PRRSV测定 MA 104细胞经爱乐新

(泰伐洛星)或替米考星预处理4小时。然后在存在泰伐洛星或替米考星的情况下将细胞暴露于PRRSV。然后所述细胞经PBS冲洗3次以除去未结合的病毒，并加入含泰伐洛星或替米考星的新鲜培养基。将所述细胞继续孵育24小时，随后用4％甲醛进行固定。使用猪多克隆抗PRRSV一抗以及FITC-标记的抗猪二抗，通过间接免疫荧光检测病毒感染。使用Leica共聚焦显微镜检测免疫荧光。通过DAPI染色的细胞核，将显示(由FITC染色产生的)绿色荧光的细胞记作阳性。
实施例2 流感测定 将各种浓度的泰伐洛星加入至MDCK细胞、HeLa细胞或CaCo-2细胞达2或4小时。然后将细胞暴露于甲型流感病毒PR8毒株(感染复数为10)。然后在4小时后将所述细胞用4％甲醛固定，并用兔抗NP一抗及Alexa Fluor 488抗兔二抗对流感核蛋白进行染色。使用Leica共聚焦显微镜检测免疫荧光。通过DAPI染色的细胞核，将显示(由AlexaFluor 488染色产生的)绿色荧光的细胞记作阳性。
实施例3 比较爱乐新、泰乐菌素和替米考星的细胞内积聚和跨上皮运输 在3种细胞类型——即上皮细胞(肠、肾)和白细胞中，测试了大环内酯抗生素泰伐洛星、替米考星和泰乐菌素进入细胞及在细胞内积聚的能力。泰伐洛星(3-乙酰基4-异戊酰泰乐菌素)快速地进入所有3种细胞类型，并且在白细胞的细胞质中达到最大浓度。它还通过顶室表面或底外侧室表面进入极化的Caco-2上皮细胞，在所述细胞内富集并被运输至对侧面。有相对少的泰乐菌素进入所有细胞类型中，而替米考星进入细胞并在细胞内积聚的能力处于前两者之间。对泰伐洛星的较多摄取可能与存在异戊酰基团有关。虽然这3种抗生素都是大环内酯类，但是至少在分布这方面它们显示出了差异，这与其治疗临床疾病的效力有关。
已知大环内酯抗生素可穿透细胞并在其中富集。这种弱碱性抗生素被捕捉到细胞的酸性环境中，特别是溶酶体中(Tulkens，1991)，并且也可能会在其他胞内细胞器中富集。然而，在不同大环内酯之间和不同细胞类型之间，进入细胞及在细胞内富集的程度是不同的(Bosnar et al.，2005，Labro，1993)。现有技术已经报道了替米考星可在细胞内富集(Scorneaux and Shrycock，1998a，b)。
声称有相似效力的3种大环内酯抗生素为乙酰基异戊酰泰乐菌素(Tylvalosin，ECO Animal Health)、泰乐菌素(Tylan，Elanco AnimalHealth)和替米考星(Pulmotil，Elanco Animal Health)。泰伐洛星在最近已经通过集中程序在欧盟(EU)范围内被批准用于治疗及预防猪中的地方流行性肺炎(猪肺炎支原体)，用于治疗回肠炎(胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis))，以及用于治疗及预于猪痢疾(赤痢螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae))。它在某些非EU国家中被用于治疗及预防鸡中的支原体病(鸡毒支原体、滑液囊支原体(Mycoplasma synovae))。替米考星被用于治疗猪的由肺炎支原体引起的肺炎，以及被用于治疗鸡群中与鸡毒支原体相关的呼吸道感染。泰乐菌素被用于预防及控制地方流行性肺炎，用于预防及控制或者治疗猪痢疾，以及被用于治疗及控制胞内劳森菌。它还被用于控制鸡中的鸡毒支原体的S6毒株。
因此，肠上皮细胞和呼吸道上皮细胞显示为这些病原体的靶标。有几项关于大环内酯对先天免疫系统或非特异性免疫系统的效应的报道(Ianaro et al.，2000；Labro，1993；Labro，2000；Sunazuka et al.，(2003))。在体内参与对抗微生物疾病的两种主要的吞噬细胞类型是巨噬细胞和嗜中性粒细胞(鸡中为嗜异性粒细胞)。来源于血单核细胞的巨噬细胞是寿命相对较长的细胞，而嗜中性粒细胞寿命较短。现有技术已知两种细胞类型在先天免疫系统中都是重要的。
研究了这三种抗生素在肠上皮细胞、上皮细胞及白细胞(WBC)为代表的多种细胞类型中的摄取和富集。该研究使用了已建立的人肠上皮细胞系(HRT-18和Caco-2)，这是因为这两个细胞类型保持了体内肠上皮细胞的某些性质。将将Caco-2细胞培养于半透膜上时，它可形成极化的单层(使它们具有顶室表面和底外侧室表面)。可将培养基同时置于所述半透膜之上及之下，并可以使用这些细胞研究分子的跨上皮运输。肠上皮细胞参与肠(肠内腔)摄取抗生素。使用猪肾细胞作为上皮细胞类型的实例，并且还使用了鸡WBC和猪WBC。
材料和方法 抗生素储液 获取的泰伐洛星为酒石酸盐形式的水溶性产物(ECO AnimalHealth)。根据分析认证(certificate of analysis)，用于口服溶液的泰伐洛星颗粒剂中活性成分泰伐洛星(3-乙酰基4-异戊酰泰乐菌素)占70.71％。在此报告全文中，泰伐洛星是指活性成分乙酰基异戊酰泰乐菌素。Tylan Soluble(ELANCO Animal Health)形式的泰乐菌素被用作酒石酸盐。使用Pulmotil AC(ELANCO Animal Health)形式的替米考星。替米考星源自于泰乐菌素B部分的发酵产物。
细胞系 HRT-18、Caco-2和LLC-PK1细胞来自于ECACC。HRT-18细胞被培养于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中。Caco-2细胞被培养于补充有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM中。LLC-PK1细胞被培养于含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Medium199培养基中。
猪白细胞和鸡白细胞的制备 将猪血收集于肝素包被的BD vacutainer(6)中。将20mL血与30mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)在50mL锥形离心管中混合。重复该过程以得到3支这样的管。在2050×g下离心所述混合物10分钟。将白细胞与下面的一些红细胞收集到50mL锥形离心管中。加入PBS至大约50mL。制备63％的Percoll溶液，如下6.3mL Percoll(Sigma)、1.0mL1.5M NaCl、2.7mL H2O。向两支50mL锥形离心管的每管中添加10mL63％的Percoll。使25mL经重悬的白细胞小心地铺在每份Percoll溶液的上方。形成了清晰的界面。将该材料在3000×g下离心10分钟。在PBS/Percoll界面处出现清晰的白细胞带。将白细胞收集于PBS(50mL)中，并在500×g下离心10分钟。将细胞的片状沉淀物再悬浮于培养基(含青霉素和链霉素的格拉斯哥极限必需培养基(Glasgow minimumessential medium))中。使用锥虫蓝进行活细胞计数。
将用于分离猪WBC的相同方法用于鸡WBC，不同之处是制备肝素(100I.U./mL)并将其与等体积的鸡全血混合。
泰伐洛星在HRT-18细胞中的细胞内积聚的时间和浓度效应 在存在0.5、5或50μg/mL泰伐洛星的情况下，于6cm组织培养皿中孵育HRT-18细胞。在4小时后，从培养箱中取出每种泰伐洛星浓度的两个平皿，并取出无抗生素的两个平皿。取出培养基样品(约1mL)，置于贴上标签的Eppendorf管中，并放置在-20℃下保存。然后将剩下的培养基移除。每个细胞单层用PBS冲洗两次，每次冲洗使用大约5mL。使用2mL塑料注射器的注射器内芯轻轻地刮下所述细胞。在平皿中添加PBS(500μL)，并使用微量加液器将细胞轻轻地转移至该培养基中。然后将该样品置于Eppendorf管中，并在台式离心机(Biofugepico，Heraeus instruments)中于8000×g下离心13秒。形成了明显的细胞片状沉淀物。使用微量加液器移除上清液，将细胞材料置于贴上标签的Eppendorf管中在-20℃下保存。在大约24小时后，从培养箱中取出剩余的组织培养皿，并如上述用于4小时样品的方式进行处理。然后将包括4小时样品在内的所有样品在-70℃下保存。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在HRT-18细胞中的细胞内积聚 如上述制备HRT-18细胞，并使用第42代。将抗生素(泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星)储液稀释于生长培养基中，并将10μg/mL的每种抗生素添加至汇合的细胞单层中。将所述细胞在37℃下于5％ CO2的氛围中培养4小时或24小时。按照上文所述，收集培养基和细胞并就抗生素对其进行测定。
在Caco-2细胞中的细胞内积聚及跨上皮运输 将Caco-2细胞以每孔0.8×106个细胞的密度接种于0.4μm孔尺寸的Transwell Clear filter 6孔板上。在顶室和底外侧室中用2mL培养基孵育细胞。每2天换一次培养基，持续10-14天。在第7、10和/或14天使用Millicell ERS装置(Millipore)测量跨上皮的电阻，以识别所述细胞何时已被极化。>1000Ω的读数说明细胞已被极化。
在不同时间点——上限至240分钟，将不同的药物(100μg/mL)置于顶室或底外侧室中，收集顶室和底外侧室中的培养基以及细胞，并分析其大环内酯含量。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在猪肾细胞中的细胞内积聚 将LLC-PK1细胞在6cm2的塑料组织培养皿中用10μg/mL的不同大环内酯孵育。在30、75和120分钟时，如上文所述收集细胞及培养基。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在猪白细胞和鸡白细胞中的细胞内积聚 将细胞用10mg/mL的每种抗生素孵育。将所有管置于37℃的旋转混合仪上。在附注中所述的时间采集上清液样品和细胞样品。在每个时间点针对每种抗生素使用双份样品。
对含泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星的样品的分析 将所有上清液样品和细胞样品冰冻(大约-20℃)运输至YorkBioanalytical Solutions(York，England)用于分析。简而言之，称量0.25g的缓冲液(含10％ FCS的RPMI培养基)至聚丙烯管中。将50μL体积的合适的工作溶液添加至质量控制(QC)样品中。将甲醇(50μL)添加至每个空白样品中，用于制备校准标准物、回收样品和试剂空白物。将体积为2.5mL的0.1M磷酸盐缓冲液添加至每个样品中，旋转混合大约1分钟，然后在4℃下于3220×g离心10分钟。
对于液液纯化阶段，将上清液的等分试样(100μL)转移至聚丙烯管中。通过添加0.1M NaOH将pH调整至pH8-8.5，并旋转混合。添加乙酸乙酯(5mL)，在罩盖后将整个混合物摇晃10分钟，然后在4℃下于3220×g下离心10分钟。
将乙酸铵(20mM；未调整pH(pH native))-甲酸(1000:3，v/v)(100μL)添加至2mL聚丙烯收集板的每个孔中。将所述乙酸乙酯的等分试样(100μL)转移至所述聚丙烯收集板上，在氮气中蒸发(40℃)，直至乙酸乙酯完全蒸发而乙酸铵被剩下。在除校准标准物之外的每个孔中添加甲醇(100μL)。
在含校准标准物的每个孔中，添加100μL的合适的校准工作溶液。然后将样品旋转混合至少10分钟，上样至具有串联质谱分析的液相色谱。所述的方法适用于所述培养基样品(以及所述校准标准物和质量控制样品)。
对于所述细胞，将样品管称重，并添加100μL乙腈。将所述样品旋转混合10秒，然后在4℃下于10285×g下离心5分钟。将所述样品转移至聚丙烯管中，原始样品管经0.1M磷酸盐缓冲液(1mL)冲洗。将其转移至所述聚丙烯管中。进行1mL的第二次冲洗，然后进行0.5mL的最后一次冲洗。这时所述聚丙烯管与所述液体萃取结束时处于同一个阶段，但存在细胞而不存在培养基。然后将其用于上述的样品制备过程。使所述原始样品管干燥(即蒸发掉任何剩余的溶剂)，然后再次称重以确定所述样品中细胞的重量，以使得每克细胞中的浓度得以确定。
结果 泰伐洛星在HRT-18细胞中的细胞内积聚的时间和浓度效应 进行初步实验来检验随时间不断增加的浓度对泰伐洛星在肠上皮细胞系HRT-18中的细胞内积聚的效应。如图5a中显示的，泰伐洛星被快速地(在4小时内)摄取至HRT-18细胞中，与培养基中的浓度成正比。所述细胞积聚了高浓度的泰伐洛星——至少585μg/g细胞。对于泰伐洛星在培养基中的全部3种初始浓度，细胞浓度培养基浓度的比值(在图5b中显示)都是大约1:12。在24小时的孵育后得到类似的结果，但该比值更小。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在HRT-18细胞中的细胞内积聚 本发明人接着比较了泰伐洛星与相关的大环内酯——泰乐菌素和替米考星在HRT-18细胞中的细胞内积聚。如图6a中显示的，泰伐洛星更为快速地进入HRT-18肠上皮细胞。在4小时的时候检测到61.8μg泰伐洛星/mg细胞的平均值，而在相同的时间点仅检测到7.24μg替米考星/mg细胞的平均值。在24小时时出现57.6μg泰伐洛星/mg细胞和32.45μg替米考星/mg细胞的平均值。在这两个时间点，泰乐菌素都不容易进入HRT-18细胞。细胞内细胞外的比值在图6b中显示。在4小时后，泰伐洛星积聚得到了在细胞内富集5.13倍的平均值。仅在一个替米考星样品中出现富集，且为1.32倍。在24小时后，泰伐洛星(5.34倍)和替米考星(4.64倍)的平均浓度比值类似。泰乐菌素没有能力进入HRT-18上皮细胞意味着该浓度比值小于1。
泰伐洛星在极化的Caco-2细胞中的细胞内积聚和跨上皮运输 本发明人接着检验了泰伐洛星在另一种肠上皮细胞系——Caco-2中的细胞内积聚。这些细胞当在透化的支持物上培养时，可分化并被极化由于它们在细胞之间形成紧密连接，这导致形成了顶(上)室膜以及底外侧(侧和下)室膜。
图7a显示了当在顶室培养基中添加泰伐洛星的时候，泰伐洛星在细胞中以及顶室和底外侧室的培养基中的浓度。图7b显示了当在底外侧室中添加泰伐洛星的时候的相似的结果。泰伐洛星显示出快速地进入极化的Caco-2细胞。在顶室给药后30分钟检测到428μg泰伐洛星/mg细胞的平均细胞内浓度(图7a中的浅灰柱)，在底外侧室给药后检测到493μg泰伐洛星/mg细胞的平均细胞内浓度(图7b中的浅灰柱)。在顶室给药后，细胞中的泰伐洛星浓度在60分钟和120分钟之间达到最大值(559.5-620μg泰伐洛星/mg细胞)，然后在240分钟时减少到375μg泰伐洛星/mg细胞。已接受经底外侧室给予泰伐洛星的细胞没有达到与在经顶室给药情况下的相同的细胞内浓度水平。在孵育30分钟后达到平均最大浓度值，所述细胞内浓度在该时刻后降低，在240分钟时降至155.5μg泰伐洛星/mg细胞。
所述细胞内细胞外的比值显示于图7c和7d中。在顶室给药后(图7c)，泰伐洛星快速地在Caco-2细胞中富集，在30分钟后得到4.64的比值。该比值在60分钟和120分钟之间出现峰值(10.23-15.58的平均值)，然后在240分钟时降低到5.85的平均值。在底外侧室给药后，泰伐洛星也显示出快速富集——仅在30分钟后就出现7的平均细胞内细胞外的比值。但在该时刻后，所述比率在240分钟后降低至3.57。
本发明人还检验了与给药位点相对的室(即在将泰伐洛星添加至顶室时为底外侧室)中的培养基，来研究泰伐洛星是否能被运输通过所述极化的上皮细胞。如图7e(顶室给药)和7f(底外侧室给药)中所示的，在相对的室中检测到相似的泰伐洛星水平——240分钟后泰伐洛星水平达给药室的19％(图7e)或22.05％(图7f)。泰伐洛星在相对的室的培养基中的浓度增加与在所述细胞内检测到的泰伐洛星水平降低一致，这说明细胞内浓度的降低可能是由于泰伐洛星进入到细胞对侧的培养基中所致。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在CaCo-2细胞中的细胞内积聚和跨上皮运输 进行了相似的实验来比较泰伐洛星与泰乐菌素和替米考星的细胞内积聚和跨上皮运输，但是本发明人仅检验了顶室给药后的效应。如图8a中显示的，泰伐洛星再次显示了快速的进入及积聚，在120分钟后达到42.2μg泰伐洛星/mg细胞的最大平均浓度值。如前文，泰伐洛星的细胞内浓度在240分钟的时间点降低(至34.3μg泰伐洛星/mg细胞的平均值)。泰乐菌素不能容易地进入极化的Caco-2细胞——在240分钟后仅检测到1.86μg泰乐菌素/mg细胞。替米考星显示出比泰伐洛星慢的进入及积聚。在120分钟时的平均细胞内浓度为8.6μg替米考星/mg细胞(与在相同时间点的42.2μg泰伐洛星/mg细胞相比)。在240分钟时，替米考星达到16.05μg替米考星/mg的平均浓度。
图8b中所示的细胞内细胞外的比值显示，泰伐洛星快速地在所述极化的Caco-2细胞中富集。泰乐菌素不在这些细胞中富集，替米考星显示了居于它们之间的效应，具有较低的富集动力学，但在240分钟后达到相似倍数的富集(泰伐洛星富集3.49倍，替米考星富集2.5倍)。
图8c中所示的数据表明，泰伐洛星可比泰乐菌素或替米考星被更有效地转移至底外侧室流体中。在与泰伐洛星孵育240分钟后，底外侧室所含有的泰伐洛星其平均值为顶室值的10.47％。与之相对的是，泰乐菌素的平均值为顶室值的0.52％，替米考星的平均值为顶室值的1.08％。
泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在猪肾细胞中的细胞内积聚 通常用泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星处理的宿主动物为猪和家禽。本发明人检验了这些大环内酯在猪肾上皮细胞系LLC-PK1的细胞内积聚。如图9a显示的，泰伐洛星快速地进入LLC-PK1细胞并在其中积聚，在75分钟后检测到53.95μg泰伐洛星/mg细胞的平均浓度，与之相对的是2.41μg泰乐菌素/mg细胞和4.98μg替米考星/mg细胞。如图9b中所示的，在120分钟时，泰伐洛星达到8.9的最大细胞内细胞外的比值。泰乐菌素根本不在LLC-PK1细胞中富集，替米考星在120分钟时显示出1.7倍富集。
泰伐洛星和替米考星在猪白细胞和鸡白细胞中的细胞内积聚 本发明人还检验了所述大环内酯在从鸡和猪分离的白细胞中的细胞内积聚。泰伐洛星快速地进入猪白细胞中(图10a)。在10分钟后检测到57.4μg泰伐洛星/mg细胞的平均浓度，与之相对的是31.25μg替米考星/mg细胞。在20分钟时检测到这些值几乎没有增加——此时检测到61.45μg泰伐洛星/mg细胞和36μg替米考星/mg细胞。如在图10b中所示的，泰伐洛星的平均细胞内细胞外的比值为8.68，与之相对的是替米考星的为4.33。在20分钟分钟后，两种抗生素均出现相似的比值。当将加载了抗生素的细胞置于无抗生素的培养基中时，会出现抗生素被运输至细胞外。两种抗生素保留在所述细胞中的量相似，大约为14-15％(图10c)。因此，在这些条件下从细胞中流失了大多数的抗生素。
哺乳动物嗜中性粒细胞在鸡中的等价细胞类型是嗜异性粒细胞。从鸡血分离白细胞并用于测试抗生素的积聚。如图10d中所示的结果表明，泰伐洛星快速地在细胞内积聚。在15分钟时细胞中的泰伐洛星浓度具有89.8μg泰伐洛星/mg细胞的平均值，对于该测试而言，在60分钟后这达到122.9μg泰伐洛星/mg细胞的最大值。泰乐菌素能进入这些细胞，泰乐菌素的细胞内浓度显示从15分钟时的10.1μg泰乐菌素/mg细胞增加至60分钟时的32.1μg泰乐菌素/mg细胞。替米考星再次显示出居于它们之间的效应，并且从15分钟时的37.1μg替米考星/细胞增加至60分钟时的71.3μg替米考星/mg细胞。
所述细胞内细胞外的比值(图10e)显示，在15分钟时，泰伐洛星的细胞内浓度是培养基中浓度的约18倍。在60分钟后检测到19倍富集。替米考星和泰乐菌素都在细胞中富集，但这在实验的时间阶段中有变化，替米考星从约4.2变化至8倍，泰乐菌素从2.65变化至约4.7。
讨论 抗生素在细胞中的摄取及积聚可能是影响病毒复制的一个重要因素。病毒复制只在细胞内部进行，这是因为病毒需要细胞的机制进行复制。通常不认为抗生素会影响病毒复制。然而，在本例中意外地发现爱乐新

(泰伐洛星)可影响PRRSV和甲型流感的复制。大环内酯之间进入细胞的比较数据可帮助解释对病毒复制影响可能的差异。
在这些研究中，本发明人研究了三种大环内酯——泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星——在人和猪上皮细胞以及鸡和猪白细胞(WBC)中的摄取及细胞内积聚。它们表明泰伐洛星能够以比泰乐菌素或替米考星更大的程度进入到所有细胞类型中并在其中富集。然而，由于在细胞之间存在培养基(细胞间流体)，因而这些数据明显低估了细胞内富集的程度(Scorneaux and Shryock，1999)。另外已经证明大环内酯定位在酸性细胞区室内，特别是溶酶体内(Tulkens，1991，Carbon，1995)。这些区室在上皮细胞系的细胞溶质体积中占相对小的比例，因此抗生素的局部浓度将较高。
研究泰伐洛星在肠上皮(HRT 18)细胞中积聚的初步实验表明，抗生素被有效地富集达到直接依赖于培养基中浓度的水平。比较泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星在HRT-18细胞和LLC-PK1细胞中的摄取及富集的进一步实验证明，它们的表现之间有显著差异。最显著的差异是泰乐菌素不能有效地进入这两种细胞系，并且不被富集。因此，根据HRT-18数据可预期，泰乐菌素通过肠上皮细胞被摄取进入宿主慢于泰伐洛星。体内数据(Okamoto et al.，1981)已显示口服给予泰伐洛星产生比泰乐菌素更高的血液水平。虽然泰伐洛星和泰乐菌素有紧密相关的分子结构，但它们的表现之间明显地有着显著差异。3-乙酰基泰乐菌素(未发表的数据)和泰乐菌素以相同方式表现的结果支持这样的观点，即存在于泰伐洛星(3-乙酰基-4”-异戊酰基泰乐菌素)中的疏水性异戊酰基基团对于其被有效摄取及随后在酸性区室中积聚是重要的。替米考星在进入细胞速率/积聚方面居于它们之间，但达到的最终水平与泰伐洛星达到的水平很相似。这可能反应了替米考星的居于中间的疏水性。报道的所述药物的pKa值与在酸性区室例如溶酶体中的质子化和积聚全都相符。泰乐菌素甚至经过24小时仍不能被积聚可能反映出它通过质膜及细胞内细胞器膜这两种膜的能力有限。
使用Caco-2细胞进行的大环内酯抗生素的摄取及分泌的研究可推广至在HRT-18细胞上的工作。Caco-2细胞是人结肠癌细胞。这种上皮细胞呈现出成熟肠上皮细胞的特性，包括微绒毛、紧密连接、酶例如小肠水解酶、营养素运载体以及膜蛋白，所述膜蛋白例如CTFR、ICAM-1、白细胞介素-1受体、白细胞介素-6受体和α抗胰蛋白酶受体(Varilek etal.，1994，Kaiserlian et al.，1991，Zweibaum et al.，1983，Sood et al.，1992，Molmenti et al.，1993)。这些特征使得它们很适宜用于评估药物以定向的方式通过上皮的能力。
已经在多项研究中使用了极化细胞，以检验多种不同类型的分子的进入路径和运输，所述分子包括免疫球蛋白和白蛋白(Ellinger et al.，2001，Maples et al.，1997，Antohe et al.，1997)。这些细胞还已经被用于研究病毒的极化侵入和释放(Cordo et al.，2005，Chu and Ng 2002，Rossenet al.，2001，Jarvis et al.，1999)。
在本研究中，Caco-2细胞的结果证明，对于顶室给药和底外侧室给药来说，泰伐洛星在30分钟时(所使用的第一个时间点)都被快速富集。使用两种给药途径得到类似的值，表明在两个室表面有类似的摄取机制。泰伐洛星穿过细胞至相对表面，并释放于培养基中。因此，在顶室表面给予的抗生素可以在底侧室培养基中被检测到。这种效应随时间而增加，使得在4小时后总泰伐洛星量的约20％已被运输。考虑到少量的细胞参与该运输，这看起来是一个有效的过程。泰伐洛星顺浓度梯度移动。出现该现象的机制是未知的。泰乐菌素不在Caco-2细胞的细胞内富集，替米考星显示出介于两者之间的表现——没有发生快速进入，但该抗生素随时间在细胞内富集，并且适度的量被运输通过上皮。
这项使用肠上皮细胞的体外工作表明，抗生素能在体内被从肠道运输至躯体并也能被从躯体运输至肠道。已经证明大环内酯克拉霉素(clarithromycin)和阿奇霉素(azithromycin)也是这样。Nightingale(1997)报道，阿奇霉素通过肝途径与一些胆汁分泌物一块被排出，并且也通过分泌至肠道中而被直接排出。该经肠路径被认为排出了总给药剂量的30-35％。该作者认为克拉霉素经肝脏和肾脏清除，另外还经肠道清除，经肠道清除导致排出该大环内酯总剂量的约10％。
以前的研究已强调，大环内酯在嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞中摄取增加并被更多地积聚。本发明人的数据证明，仅在孵育10分钟后，泰伐洛星就快速地进入鸡白细胞和猪白细胞中并在其中积聚。该摄取大于所观察到的泰乐菌素或替米考星的摄取。嗜中性粒细胞的一个主要功能是吞噬致病性生物体。装载抗生素的细胞通过增加细胞内的杀伤能力，能够更好地从宿主中清除敏感性生物体。而且，通过将抗生素释放至临近的周围培养基中，所述细胞使得在局部产生高浓度的抗生素，这使得细胞外杀伤得以发生。
在本研究中，本发明人的技术使得可以比较泰伐洛星和替米考星在猪WBC中的摄取。泰伐洛星被猪白细胞(大多数为嗜中性粒细胞)快速地摄入，仅在10分钟孵育后就得到9的IC:EC比。替米考星也快速地进入猪WBC，但是达到的富集程度较低(×4)。在使用禽WBC时，泰伐洛星在15分钟内达到高IC:EC比，约×18，并且该比值得到了维持。泰乐菌素和替米考星也都被富集，但是所达程度较低。
已经证明大环内酯对先天免疫系统有效应，包括通过导致嗜中性粒细胞凋亡增加(Chin et al.，1998)以及降低嗜中性粒细胞至感染部位的募集(Ianaro et al.，2000)而减轻炎症。这些效应还可协助宿主预防与发炎相关的病状。
存在多种不同的分子可籍由其进入细胞的机制。它们包括沿浓度梯度的被动扩散(对于脂溶性分子)、主动运输以及各种形式的胞吞作用(如Pelkmans and Helenius 2003、Stuart and Ezekowitz 2005描述的网格蛋白介导的、细胞膜穴样凹陷介导的胞饮作用、巨胞饮作用和吞噬作用)。已经研究了大环内酯抗生素向细胞内移动，但是这方面的信息很有限。许多研究不能区分通过质膜进入胞质溶胶的过程以及在酸化囊泡中积聚的过程。进入胞质溶胶可能是一种被动的、浓度梯度依赖的过程。已经证明大环内酯的摄取在碱性pH中会更大。这证实了这样的观点，即不带电荷分子倾向于被动扩散。在4℃下不发生大环内酯类的积聚；这可能因为在该温度下酸化内体和溶酶体的质子泵没有活性，而不是因为质膜的活化过程被抑制，但是阿奇霉素仍在代谢抑制剂预处理的细胞内富集的现象(Gladue and Snider，1990)说明，已经存在的pH梯度应该足以使得大环内酯在内体和溶酶体中积聚。因此，低温效应可能会归因于低pH在这些细胞器中的损耗，或者更有可能被归因为质膜结构的重组，该重组减缓扩散的效果比根据温度对扩散速率的正常效应所预计的更显著。分子在不存在特异性通道或运载体的情况下通过膜的能力较强地依赖于它们在膜脂质相中的“溶解”能力。因此，疏水性可能是大环内酯进入及积聚效率的关键决定因素，在某些情况下pKa值也起作用。该公开中报道的泰伐洛星的性质与其具有异戊酰基团和7.6的pKa的情况相符。
有关抗菌活性和有效的细胞积聚之间关系的问题是复杂的。Carbon(1995)认为，对于一种给定类型的细胞和给定类型的细胞内感染，很难预测抗微生物药物在体内发挥作用所必需的真实的细胞内浓度。然而，一个关键的考虑因素是所述细菌和所述积聚所述抗生素的细胞之间的空间关系。就大环内酯如泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星而言，有三种类型的相互作用是值得特别关注。第一种类型涉及那些细胞内细菌，它们能够在内体/吞噬溶酶体的低pH环境中存活。在这种情况下，药物在酸性区室中的积聚使之高度有效。第二种类型的相互作用涉及从囊泡逃离进入胞质溶胶。在这种情况下，抗生素在囊泡中的积聚将仅在细菌逃离前有相关性，但囊泡积聚的物质可提供用于向胞质溶胶释放的抗生素池。第三种形式的相互作用涉及细菌通常结合于“宿主”细胞的细胞质膜上的细胞外紧密相互作用。在这种情况下，积聚也将仅当细胞作为缓慢释放至周围环境中的药物池时有相关性。在该文件中描述的泰伐洛星的性质与对和细胞有任何这些类型关系的细菌的抵抗效力是相符的。
通过用其他有效积聚的、相对疏水的大环内酯的实验来说明从体外特性进行外推的困难性。因此，阿奇霉素的细胞摄取相对较高(该摄取比其他大环内酯的摄取慢)，但是这并未伴有效力的增加(Labro，1996)。类似地，已经报道了替米考星的高的胞内胞外的比值(Scorneaux andShryock，1998a，b，1999)，但其效力并不突出(特别是在使用商业剂量的情况下)，如Reeve-Johnson等人(1997a，b)用鸡的支原体病上所证实那样。这种抗生素——被发现具有较高细胞内富集并能相对容易地通过细胞膜——可能已经被预期可高效地对抗例如支原体。还需要确定的是，3′乙酰基4′异戊酰泰乐菌素分子的什么性质可解释其对一系列重要的细胞相关病原体的特异性效力。
本发明人使用来自猪(PK)的上皮细胞的结果给出了与使用人细胞(HRT-18、Caco-2)的结果类似的结果。事实上，该结果很明确，泰伐洛星又一次快速地在细胞内富集，而泰乐菌素没有富集且替米考星具有介于它们之间的性质。
因此，虽然替米考星衍生自泰乐菌素的B部分，并且泰伐洛星衍生自A部分，但是本研究中呈现的数据表明了所述大环内酯分子的细胞摄取中有显著的差异。3′乙酰基4′异戊酰泰乐菌素由于具有异戊酰基团而与3′乙酰基泰乐菌素(3AT)不同。泰伐洛星快速穿透细胞的能力可能是由于该异戊酰基团，这被来自本研究的数据所证明并且也被来自以前研究(Tsuchiya et al.，1981)的数据所证明，所述以前的研究说明泰伐洛星与泰乐菌素或3AT相比更加亲脂。3AT是泰伐洛星的主要代谢物，并且在细胞内形成。可以推测，该代谢物与泰伐洛星相比具有降低的出细胞的能力。3AT仍是有代谢活性的并且可能比所述母体分子在细胞中保持更长时间，这样的事实可能在临床上是有利的。
实施例4 接着实施例1，进行了实验来检验泰伐洛星对马流感毒株Miami(与人PR8毒株和Udorn毒株比较)的MDCK细胞感染的效应。MDCK细胞用1μg/ml泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星预处理4小时。然后在存在所述药物的情况下用PR8、Udorn或Miami(感染复数为10)感染细胞。感染后将细胞固定4小时，并且通过对流感核蛋白的间接免疫荧光评定感染。结果在图11中显示。
泰伐洛星(1μg/ml)抑制了92％马流感毒株Miami对MDCK细胞的感染、76％马流感毒株Udorn对MDCK细胞的感染，并完全抑制了PR8感染。
实施例5 进行实验来检验泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星对PRRSV感染和以低复数感染后细胞扩散的效应，并且还检验了在感染后添加所述药物的效应。
用PRRSV以0.01的感染复数(moi)感染MA104细胞(在第一轮应感染大约10％的细胞)。在感染8小时后，添加1μg/ml的泰伐洛星、泰乐菌素和替米考星。在感染后28小时收获细胞，并通过间接免疫荧光评定感染。显示每次处理的病毒阳性细胞数目的结果在图12中示出。
如上述，0.01的感染复数应感染大约10％的细胞。然而，所述病毒在28小时后将已完成第一轮感染，并且将已经感染了邻近细胞。本发明人已经发现，在感染后10小时可检测到低水平的病毒抗原。该检测值在感染后16-20小时会增加，并且至24小时时在邻近细胞中可检测到低水平的表达。
在感染后8小时添加药物将对原发感染没有效应(即对投入病毒的侵入没有效应)。但它可能通过其他机制直接或间接地作用于病毒复制，并还可能在第二轮感染中作用于病毒侵入，第二轮感染即原发感染的细胞产生的病毒感染邻近细胞。
感染8小时后添加爱乐新

(泰伐洛星)抑制了PRRSV感染，将感染降低至1％的病毒阳性细胞。爱乐新

(泰伐洛星)似乎抑制了病毒复制(检测到更少的感染的细胞)，阻止病毒向邻近细胞的扩散，并且还减少了未处理细胞/感染细胞中出现的旁观者效应(bystander effect)，其中邻近细胞未显示出病毒抗原表达的放大。
实施例6 进行实验来确定泰伐洛星是否对马动脉炎病毒(EAV)有效应。本发明人发现，EAV感染未被泰伐洛星或诺考达唑阻断，这说明EAV不会被运输到晚期内体中。
实施例7 用于检验当在感染前和后多个时间添加的已知的PRRSV感染抑制剂时其效应的研究 当在感染前4小时加入时，氯丙嗪、氯喹、诺考达唑、细胞松弛素D和爱乐新

泰伐洛星)抑制了原发的PRRSV感染，因此没有观察到扩散。
当在感染时添加时，氯丙嗪、氯喹、细胞松弛素D和泰伐洛星抑制了原发的PRRSV感染，因此没有观察到扩散。诺考达唑未抑制原发感染。诺考达唑处理的细胞仍旧产生长突起(long processes)，这表明虽然它们含有微管但它们的产生不依赖于微管。
当在感染后2或4小时添加时，仅爱乐新

(泰伐洛星)抑制了感染初始位点的感染以及扩散。氯丙嗪处理的细胞显示了初始位点的感染，但该药物似乎阻止了扩散。诺考达唑对感染没有效应(由于毒性它对扩散的影响也是不清楚的)，并且再次观察到了包含病毒的长突起。由于检测到了感染的细胞，因此细胞松弛素D对原发感染没有效应，然而长突起不复存在并且不能检测到扩散。这说明，该突起是由肌动蛋白聚合驱动，并且对于病毒从初始感染位点向外扩散是必需的。当在感染后添加时，氯喹对于原发感染或病毒扩散没有效应。
结果在图13中示出。
实施例8 比较PRRSV、EAV和FCV对氯喹的敏感性 为了成功感染其宿主细胞，猫杯状病毒、马动脉炎病毒和PRRSV都需要内体酸化。用例如氯喹的药物升高内体pH已经证明这一点。氯喹是弱碱，并通过隔离质子来升高内体pH(即CQ浓度越大将隔离越多的质子并将pH升至更高)。升高CQ浓度的效应在图14中示出。这些数据表明，需要相对低浓度的CQ(低于5μM)来抑制PRSV感染，这说明适度升高内体pH对于抑制病毒侵入是足够的。FCV的抑制需要高浓度的CQ(等于及高于200μM)，并且EAV被等于及高于50μM的CQ所抑制。更高浓度的CQ说明，需要增大pH升高幅度来抑制FCV和EAV。这些数据都表明，与EAV或FCV(即在早期内体中)相比，PRRSV需要通过pH低得多的内体(即在晚期内体中)。
实施例9 PRRSV的US毒株 本发明人还用VR2332感染MA104细胞(PRRSV的US毒株)来检验泰伐洛星对感染的效应。结果在图16中示出。将MA104细胞用所示浓度的爱乐新

泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星预孵育4小时。然后在存在药物的情况下将细胞用VR2332以10的感染复数感染。然后将细胞孵育20小时。通过间接免疫荧光评定感染。
将结果与前文所检验的欧洲毒株的结果相比较。
实施例10 VR2332(PRRSV的US毒株)侵入测定 将MA104细胞用氯丙嗪、氯喹、诺考达唑或细胞松弛素D预处理30分钟；或者用泰伐洛星、泰乐菌素或替米考星预处理4小时。然后将细胞用VR2332以10的感染复数感染并孵育过夜。
图17中所示的结果表明，PRRSV的US毒株也对泰伐洛星敏感，而对泰乐菌素不敏感。替米考星在所使用浓度下显示了部分的抑制。
实施例11 泰伐洛星对HeLa细胞或HT29细胞的病毒感染的效应高复数及低复数的病毒 本文工作已经显示，泰伐洛星处理的HeLa细胞对病毒感染具有高度抗性。本发明人已经用多种病毒重复了该测定，并将此与HT29细胞(一种通常用于肠胃道病毒感染的细胞系)的病毒感染相对比。以高复数(以考察侵入)及低复数(以考察病毒在细胞单层中的扩散)添加病毒。
将细胞用泰伐洛星、泰乐菌素、替米考星和氯喹处理4小时。然后将细胞用病毒以10的感染复数感染4小时，或者以0.1的感染复数感染16小时。
泰伐洛星抑制了流感病毒的侵入及柯萨奇B5病毒的侵入。氯喹也抑制了所有三种病毒的侵入。泰乐菌素和替米考星无效应。EV11未受任何处理的影响。
泰伐洛星和氯喹抑制了低复数的流感病毒感染和柯萨奇B5病毒感染。泰乐菌素和替米考星无效应。在低复数测定中，EV11令人意外地被泰伐洛星所抑制。泰伐洛星似乎会抑制病毒扩散，这是因为通过免疫荧光可以观察到感染的初始位点，而观察不到继发位点。结果在图18中示出。
实施例12 流感病毒的时程 将MDCK细胞培养于有盖玻片或无盖玻片的24孔板中(在盖玻片上培养的细胞用于免疫荧光测定)。将细胞用1μg/ml的泰伐洛星处理4小时。然后用Udorn(感染复数为0.1)感染细胞。
在4、8、16和24小时的时候收集样品。
图15a显示免疫荧光测定的结果，15b显示噬菌斑测定的结果。在两项测定中，爱乐新

(泰伐洛星)在24小时的测定周期中都抑制了流感毒株Udorn的感染。
实施例13 吖啶橙测定 吖啶橙是一种染料，导致细胞除酸性区室(例如内体)以外均发绿色荧光，所述酸性区室由于染料的质子化及绿色荧光的猝灭而呈现红色。升高内体pH的物质将阻止红色荧光的出现。在多种细胞系中确定了爱乐新

和其他大环内酯抗生素对吖啶橙的内体染色的效应(参见图19)。首先使用DAPI染色对生长于玻璃盖玻片上的一片细胞区域进行选择。该染色将细胞的细胞核显示为蓝色。该选择步骤有助于减少结果中的任何偏差。然后用落差荧光显微镜上的绿色和红色滤光片检查约20个细胞。确定红斑(内体囊泡)的数目。计数吖啶橙染色的内体的平均数目。泰乐菌素对任一细胞系的内体中pH的升高没有很大影响。爱乐新

(泰伐洛星)和替米考星对RAW细胞有类似的效应。然而，爱乐新

(泰伐洛星)在上皮细胞中比替米考星有更大的效应。
这些结果显示，爱乐新

(泰伐洛星)升高内体中的pH。PRRSV需要酸性条件来进行融合并侵入细胞质膜。pH升高可阻止该融合过程以及随后的病毒侵入及细胞内增殖。
实施例14 泰伐洛星控制PRRSV的效力的确定 材料和方法 实验设计 所有研究步骤和动物管理由爱荷华州立大学动物管理和使用委员会(Iowa State University Institutional Committee on Animal Care andUse)批准并依照该委员会的指导方针。
68只10-12日龄杂交的去势公猪(barrow)从血清反应阴性的且未接种PRRSV或猪肺炎支原体的群中产生，这由主要研究人员选定。在到达时对所有猪进行标记并称重。将猪分成4组，每组16只(表1)。由统计学家将猪分组——使用区组(通过重量)随机化将猪分组，使得组之间在猪重量方面平衡。将每组单独圈养，但是在隔离设施中相同的房间内。在每个板面上有喂食器和乳头饮水器，因此猪在整个试验过程中都可以自由进食和饮水。另外四只猪在试验前被处死，没有被纳入本试验中。
每个处理组有两个圈，每圈8只猪。在这些猪到达时，给其喂食市售的浓缩药物饮食，该饮食没有任何已知污染物或杀虫剂，且每吨含50克卡巴氧(Mecadox)(Philbro Animal Health)。所有猪在到达后依照标签的指导用头孢噻夫盐酸盐(

，Pfizer Inc.)处理3天。
生产参数 在达到时及试验的第0、7、14、17和28天时对各个猪称重，来评估体重增加(平均日增重)。
临床评估 每天就临床呼吸体征对猪进行评定，持续10天，所述体征包括如先前描述的咳嗽和呼吸频率增加1。评分为0＝正常；1＝应激时轻度呼吸困难和/或呼吸急促；2＝休息时轻度呼吸困难和/或呼吸急促；3＝应激时中度呼吸困难和/或呼吸急促；4＝休息时中度呼吸困难和/或呼吸急促；5＝应激时重度呼吸困难和/或呼吸急促；以及6＝休息时重度呼吸困难和/或呼吸急促。另外，任何观察到的咳嗽均记作0＝不咳嗽以及1＝咳嗽。由兽医或有资质人员进行这些观察。
治疗 三组猪均接受含3种不同浓度泰伐洛星的药物饲料，泰伐洛星由ECO Animal Health提供。在从试验的第0天至试验的第28天的整个试验过程中，这三组中的猪均接受药物饮食。给第4组喂食同样的无药物饲料。
饲料测定 在试验的第17天和28天收集1磅代表性饲料样品。在试验开始时没有收集饲料样品。所有样品用代号、采样位点、记录号(protocolnumber)、采样日期及签名标记，并置于塑料冰袋中。饲料的重量为大约0.5kg。收集双份样品。一组样品置于干冰上运送至ECO AnimalHealth，以在分析实验室进行化验，第二份样品保存于取样地点。
攻击步骤 用2ml高毒力PRRSV毒株VR2385的培养基以1×105组织培养感染剂量(TCID)50的接种剂量经鼻内给予所有的猪。
尸检 在试验的第17天时(感染后的10天)对来自每个处理组的6只猪进行尸检，并且在试验的第28天时(感染后的21天)对剩余的猪进行尸检。在试验的第17天时从每圈随机选择两只猪进行尸检，并且在试验的第28天时对剩余的猪(n＝10)进行尸检。在给予一种AVMA核准的安乐死溶液(Fatal-Plus，Vortech Pharmaceuticals，Dearborn，MI)后将猪放血。用镊子夹住气管和肺，将它们从猪身上取出。就与先前所述的PRRSV相符的宏观损伤对肺进行评估。无菌条件下收集气管拭子(tracheal swab)，用于使用标准的微生物学方法的细菌分离。将肺用50ml含抗生素(9μg庆大霉素、100U青霉素/ml和100μg链霉素/ml)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌洗。
收集并处理每个肺叶的一部分，用于进行组织病理检验。如先前所述对组织病理损伤进行评分。简言之，0＝无微观损伤；2＝中度多病灶间质性肺炎；3＝中度弥散性间质性肺炎；以及4＝重度间质性肺炎。如先前所述对免疫组织化学进行评分。简言之，0＝无PRRSV抗原阳性细胞；1＝1-10个阳性细胞/视野；2＝11-30个阳性细胞/视野；3＝31-100个阳性细胞/视野；以及4＝>100阳性细胞个/视野。
实时PCR 在试验的第0、10、17、21和28天收集用于PCR的血液。
使用QIAamp Viral RNA Mini试剂盒(QIAGEN)依照厂商说明书提取总RNA，并将其溶解于60μl洗脱液中。将该RNA提取物在-80℃下保存直至进行实时RT-PCR扩增。
用于定量PRRSV的正向引物和探针是ORF7区。将该探针用荧光报告染料——6-羧基荧光素(FAM)在5′端标记，并将猝灭染料——BlackHole Quencher 1(BHQ_1)在3′端标记。在Rotor-Gene RG-300(CorbettResearch，Sydney，AU)上使用实时RT-PCR进行PRRSV定量。20μl反应混合物的组成为10μl 2×TaqMan Universal PCR主混合缓冲液(master mix buffer)(Applied Biosystems，Foster City，CA)；0.1μlSuperscript III逆转录酶(200U/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)；0.2μlRNaseout(40U/μl)(Invitrogen，Carlsbad，CA)；2μl最佳浓度的正向引物和反向引物；0.8μl最佳浓度的TaqMan探针；2.9μl无DNase/Rnase水以及2μl RNA标准物的10倍稀释物或2μl提取自每个样品的总RNA。在以下条件下进行扩增55℃下45分钟，95℃下10分钟；然后进行45个循环，每个循环为95℃下15秒及60℃下60秒。在每一轮扩增结束读取荧光。所有标准稀释物和未知样品均有两个重复。当相关系数(r2)>0.99时，则接受该标准曲线。通过比较投入样品RNA的循环阈(CT)值和不同稀释度的标准RNA的CT值实现对PRRSV定量。
血清学 在到达时以及在试验的第0、17和28天采血。使用市售的ELISA测定法(HerdChekPRRS；IDEXX Laboratories，Westbrook，ME)确定PRRSV抗体水平。
统计分析 首先对数据进行归纳(使用平均值、标准差和直方图)，来评定数据质量和分布假设。将数据处理为连续值(包括评分的平均值)或者离散值(例如评分)。某些数据是每天重复测量的(温度和呼吸评分)，并先通过用最大评分值或平均评分值简化各个猪的值来分析，然后作为单变量数据来分析。所有其他重复测量结果都被横向(cross-sectionally)分析。依据数据类型及分布使用ANOVA、Kruskal-Wallace非参数ANOVA或卡方检验分析所述数据。在统计显著性全局检验(omnibus test)后，使用Tukey HSD调整(连续数据)或Bonferroni调整(离散数据)进行后续的成对检验。第17天的ADG变量是一个例外，对于该变量而言，各个组次之间全局检验是统计学显著的，但调整的成对检验显示无显著性。对于这种情况，报告了无调整的成对检验。已对肺叶数据取平均。
结果 生产参数 通过体重和平均日增重(ADG)(表2)评定猪的整体生长表现。没有观察到在任何一组的任何一只猪的平均体重中存在统计学差异。在第17天，组4中猪的平均日增重与组1中猪相比有显著差异。在该试验的任何时间点均没有观察到其他差异。
临床疾病 对临床疾病的评分总结于表4中。记录下每只猪的临床呼吸评分和直肠温度记录在一段时间内的最大值，然后分析这些最大值的平均值。另外分析了平均直肠温度的均值。对于呼吸评分，组1和2中的猪具有比在组3和4中所观察到的分值显著低的分值。对于最大直肠温度，组3中的猪具有比所有其他组都显著高的平均直肠温度的均值。然而，没有观察到在每组的平均直肠温度中存在差异。
宏观、微观和免疫组织化学(IHC)评分 微观肺损伤评分总结于表5中。没有观察到任何组中的宏观肺损伤评分的平均值存在差异。在该试验的40只猪中均观察到与细菌感染相符的肺炎。这还可能影响该试验中PRRSV肺炎的严重度。
组1中的猪与所有其他组相比，在初次尸检时具有显著低的微观损伤评分值。在第二次尸检时没有观察到微观损伤评分值中存在差异。
支气管淋巴结、扁桃体以及肺(2个切片的平均)的免疫组织化学评分在组之间均没有表现出统计差异。
细菌学 从大多数猪的呼吸道中分离到了支气管败血性博德特氏菌。另外，培养大量动物来评估是否存在猪支原体。其中，从23只猪中的7只中分离到了猪鼻支原体。
实时PCR(RT-PCR)测定 RT-PCR的结果总结于表5中。在试验第10天观察到差异，组3和4中PRRSV RNA的拷贝数水平显著高于组2中的水平。另外，在相同的时间点，组4中PRRSV RNA的水平比显著高于组1。在试验的任一点均没有观察到PRRSV血清RNA水平中存在其他差异。在攻击前的试验第0天没有检测到PRRSV RNA。
血清学 所有猪在试验的第0天时都是血清抗体阴性。在试验第17天，组1和2中的两只猪以及组3和4中各有一只猪保持对PRRSV抗体的血清反应阴性。所有其他猪都是血清反应阳性的。所有剩余的猪在试验结束时都是血清反应阳性的。
讨论 PRRSV仍是猪产业的一个重大的问题。ECO Animal Health关注于评定爱乐新

(泰伐洛星)减少与PRRSV感染相关的临床疾病和病毒血症的能力。在以下两个方面中观察到有差异，即试验第17天的平均日增重，以及通过呼吸评分和最大直肠温度测量的临床疾病的严重度。另外，在试验第10天——即接种PRRSV后的3天，组之间的PRRSV RNA水平有差异。没有观察到其他的水平差异，但是各个组中所测量到的RNA水平变化范围较宽，这使得难以对数据进行解释。值得注意的是，在增大平均日增重以及减少临床疾病和病毒血症水平方面，较低剂量的爱乐新

(泰伐洛星)似乎是最有效的。
对于PRRSV诱导的肺炎，观察到泰伐洛星有较弱的效应。没有观察到猪的宏观肺炎的严重度有差异，但PRRSV肺炎在这个攻击模型中是相当严重的。再者，与病毒血症、临床疾病及平均日增重的情况一样，给予低剂量的泰伐洛星似乎能更有效地控制疾病，这表现为在初次尸检时减少的微观损伤。
该研究表明，低剂量的泰伐洛星看起来似乎可减少与PRRSV感染相关的临床疾病和病毒血症。
表1.用PRRSV感染且喂食爱乐新

(泰伐洛星)的猪以及未治疗对照的实验设计。
表2.用PRRSV感染且喂食爱乐新

(泰伐洛星)的猪以及未治疗对照的平均日增重(磅)(±标准误差)。

A，B＝列中具有不同字母的平均值有统计学差异。
＊p-值表示列中治疗组之间的统计差异。
表3.用PRRSV感染且喂食爱乐新

(泰伐洛星)的猪以及未治疗的对照的临床疾病的总结。
A，B＝列中具有不同字母的平均值有统计学差异。
＊p-值表示列中治疗组之间的统计差异。
表4.用PRRSV感染且喂食爱乐新

(泰伐洛星)的猪以及未治疗对照的微观PRRSV肺损伤评分的平均值(±标准误差)。

A，B＝列中具有不同字母的平均值有统计学差异。
＊p-值表示列中治疗组之间的统计差异。
表5.用PRRSV感染且喂食泰伐洛星的猪以及未治疗对照的实时逆转录酶多聚酶链反应测定(RT-PCR)的平均值(±括号中的标准误差)。

＊ND＝未检测到 A，B＝列中具有不同字母的平均值有统计学差异。
＊p-值表示列中治疗组之间的统计差异。
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权利要求
1.泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐在制备用于预防或治疗病毒感染的药剂中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述病毒是一种使用内体途径或溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
3.根据权利要求2的用途，其中所述病毒是一种使用晚期内体途径或溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
4.根据权利要求3的用途，其中所述病毒是一种使用溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
5.根据权利要求3的用途，其中所述病毒是一种使用晚期内体途径来感染宿主细胞的病毒。
6.根据权利要求2-5任一项的用途，其中所述病毒需要内体或溶酶体内的pH低于6.5。
7.根据前述权利要求任一项的用途，其中所述病毒为哺乳动物腺病毒属、动脉炎病毒属、非洲猪瘟病毒属、汉坦病毒属、环状病毒属、冠状病毒属、纤丝病毒属(Filiovirus)、黄病毒属、瘟病毒属、肝炎病毒属、甲型流感病毒、贫病毒属、细小病毒属、肠道病毒属、鼻病毒属、正呼肠孤病毒属、轮状病毒属或甲病毒属。
8.根据前述权利要求任一项的用途，其中所述病毒选自腺病毒7、PRRSV、流感、鲑鱼贫血病毒、猪瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲猪瘟病毒、辛诺柏病毒(Sin Nombre)、四角病毒(Four Corners)、普马拉病毒、传染性支气管炎病毒、传染性肠胃炎、SARS CoV、西尼罗河病毒、马堡病毒、埃博拉病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、犬细小病毒、柯萨奇B3病毒、柯萨奇B5病毒、禽呼肠孤病毒、轮状病毒、塞姆利基森林病毒和2型猪环状病毒。
9.根据权利要求8的用途，其中所述病毒为PRRSV。
10.根据权利要求8的用途，其中所述病毒为流感。
11.根据权利要求1-8任一项的用途，其中所述药剂还用于预防或治疗细菌感染。
12.根据权利要求9或10的用途，其中所述药剂还用于预防或治疗细菌感染。
13.根据权利要求11的用途，其中当所述病毒感染是PPRSV或猪流感的感染时，所述细菌感染是猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、多杀性巴斯德氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcussuis)和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)中的一种或多种的感染。
14.根据权利要求11的用途，其中当所述病毒感染是牛病毒性腹泻病毒的感染时，所述细菌感染是溶血性曼海姆氏(巴斯德氏)杆菌(Mannheimia(Pasteurella)haemolytica)或牛支原体(Bordetellabrochiseptica)的感染。
15.根据权利要求11的用途，其中当所述病毒感染是人流感的感染时，所述细菌感染是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性链球菌(Streptococci haemolyticus)、肺炎球菌(Pneumococci)、铜绿假单胞菌(Pseudomanoas aeroginosa)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)中的一种或多种的感染。
16.根据权利要求11的用途，其中当所述病毒感染是禽流感的感染时，所述细菌感染优选是鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)感染。
17.一种治疗病毒感染的方法，包括将泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐，或者含泰伐洛星或者其功能性衍生物、代谢物、酯或盐的药物组合物给予已感染病毒的受试者。
18.根据权利要求17的方法，其中所述病毒是一种使用内体途径或溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
19.根据权利要求18的方法，其中所述病毒是一种使用晚期内体途径或溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
20.根据权利要求19的方法，其中所述病毒是一种使用溶酶体途径来感染宿主细胞的病毒。
21.根据权利要求20的方法，其中所述病毒是一种使用晚期内体途径来感染宿主细胞的病毒。
22.根据权利要求17-21任一项的方法，其中所述病毒需要内体或溶酶体内的pH低于6.5。
23.根据权利要求17-22任一项的方法，其中所述病毒为哺乳动物腺病毒属、动脉炎病毒属、非洲猪瘟病毒属、汉坦病毒属、环状病毒属、冠状病毒属、黄病毒属、瘟病毒属、肝炎病毒属、甲型流感病毒、贫病毒属、细小病毒属、肠道病毒属、鼻病毒属、正呼肠孤病毒属、轮状病毒属或甲病毒属。
24.根据权利要求17-23任一项的方法，其中所述病毒选自腺病毒7、PRRSV、流感、鲑鱼贫血病毒、猪瘟、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、非洲猪瘟病毒、辛诺柏病毒、四角病毒、普马拉病毒、传染性支气管炎病毒、传染性肠胃炎、SARS CoV、西尼罗河病毒、马堡病毒、埃博拉病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、犬细小病毒、柯萨奇B3病毒、柯萨奇B5病毒、禽呼肠孤病毒、轮状病毒、塞姆利基森林病毒和2型猪环状病毒。
25.根据权利要求24的方法，其中所述病毒为PRRSV。
26.根据权利要求25的方法，其中所述病毒为流感。
27.根据权利要求17-26任一项的方法，其中所述方法还用于预防或治疗细菌感染。
全文摘要
本发明涉及大环内酯类抗生素泰伐洛星作为抗病毒剂的用途。泰伐洛星对于PRRSV的治疗特别有用。
文档编号A61K31/7042GK101511374SQ200780033220
公开日2009年8月19日 申请日期2007年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者A·P·A·莫克特, T·D·K·布朗, A·D·斯图亚特 申请人:埃科动物健康有限公司, 剑桥大学技术服务公司