专利名称：：用于调控细胞存活的方法
技术领域：
：本发明涉及信息的实际应用，所述的信息是关于血小板调节领域中的细胞凋亡的调节。具体而言，本发明涉及Bcl-2家族的成员、它们的调节剂、以及更宽泛而言的能够有效调控细胞凋亡的药理学制剂。本发明提供了新的靶标、方法和制剂以用于调控与血小板或其前体有关的相互作用。具体而言，本发明思考了在治疗或预防与遗传性或获得性血小板增多或血小板减少(例如但不限于血管病或出血疾病)有关的状况时使用的方法和制剂。本发明进一步涉及制备和储存血液和血液衍生物的方法和制剂、以及调控尤其是血小板更新率、止血、凝块形成、组织重塑和痊愈的方法。
背景技术：
：在本叙述内容的结尾处收集了在本说明书中作者所引用的出版物的目录详情。的信息)或者引用任何已知的事物，不能并且不应该成为承认或者以任何方式提示，这些现有的出版物(或者由该出版物所得到的信息)或者已知的事物形成了本说明书所涉及的致力领域中的一部分公知常识。血小板是在血液中循环的巨核细胞的无核小碎片，并且主要参与诸如血液凝结和伤口痊愈之类的功能。血小板由巨核细胞产生，其中所述的巨核细胞为在骨髓和脾中发育形成的大型多倍体细胞。巨核细胞脱落下血小板，从而进入到血流中，血小板循环大约10天(人)(Leeksma"a/.，Nature,〃J:552-553，1955)，然后被主要存在于肝和脾中的网内皮系统破坏。与所有谱系的血细胞类似，数量呈稳定状态的成熟血小板是血小板生成和破坏之间达到平衡的结果。在正常个体中，对这些细胞的增殖、分化、存活和清除的精确控制确保了动态平衡的保持，并减小了出血(由血小板数量减少造成)或血栓症(由血小板过量生成造成)的可能性。如果这种精确的平衡被扰乱，血小板减少或血小板数量低会随之发生。由于血小板减少会导致潜在的致命性出血事件，所以在临床上，特别是在血液病和肿瘤实践中，血小板减少是常见问题。血小板减少可以先天发生，并伴有多种已经定义的遗传性紊乱(Drachman，Blood，390-398,2004)，但是在临床上所见的大部分的血小板减少是由其他原因所导致的结果。对于进行癌症化疗的患者而言，血小板减少是主要的问题。与细胞毒性药物有关的血小板减少的急性事件除了将患者置于紧急的危险之中外，其还可以迫使修改剂量或治疗撤除，因此会减弱治疗效力。此外，在骨髓增生异常综合症(MDS)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)和慢性肝病中还经常遭遇血小板减少，并且血小板减少与病毒感染(特别是AIDS)有关(Kuter，Blood，歲3457-3469，2002)。在这些更慢性疾病中，血小板减少可能是由于缺陷性血小板的产生或升高的血小板破坏所导致，而这通常是自体免疫应答的结果。针对血小板数量低的治疗方法包括血小板输注和潜在地施用血小板生成素。血小板介导的血栓症是导致血管疾病(例如心血管疾病、脑血管疾病、和外周血管疾病)的主要机制。控制血小板的水平或活性是抗血栓症治疗的必要部分。诸如阿司匹林、非甾体抗炎剂、P-内酰胺抗生素、奎納定、钓通道阻断剂、噻氯匹定、氯吡格雷和阿昔单抗之类的抗血小板剂被用于治疗心肌梗塞和缺血性卒中、或者它们随后的并发症，但是需要更有效且更安全的药物。在患有诸如骨髓增生疾病、慢性肺部阻塞性疾病和原发性血小板增多之类状况的受试对象中，观察到趋血栓阻塞性状态。在过去20年，已经相当详细地对细胞凋亡的分子调节进行了表征(Marsdene"人，A画.Rev.Immunol.,W:71-105，2003)。细胞凋亡是由天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族执行的。在健康细胞中，许多半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以非活性形式存在，并响应于诱导细胞凋亡的两个主要信号传导途径而活化。其中第一个途径是由发育指令、细胞因子撤除和其他应激刺激诱导的，并且由Bcl-2蛋白质家族调节，其中所述的Bcl-2蛋白质家族包括促细胞凋亡成员(例如Bax、Hrk、Bim)和促存活成员(例如Bcl-2、Bcl-xJ。第二个细胞凋亡途径涉及与死亡受体(例如Fas)结合的配体，从而使得死亡诱导性信号传导复合体形成。Bcl-2蛋白质家族在调节发育程序性及应激诱导性细胞死亡中起到中心作用(Adams,GenesDev.,J7:2481-2495，2003;Daniala7.，Cell,L6:205-219，2004)。所述家族中与Bcl-2最密切相关的并且包括Bc卜Xl(Boiseeta/.，Cell,74:597-608，1993)、Bc卜w、Mcl-l和Al在内的一个亚类促进了特定细胞的存活。该亚类蛋白质保持细胞存活，直至其活性通过与远系相关的促细胞凋亡唯BH3域蛋白质(例如Bim、Bad或Bid)的直接结合而被中和为止(Huangefa/，Cell,旭839-842，2000)。虽然可能的是，诸如Bc卜XL之类的促存活蛋白质控制了第二类促细胞调亡家族成员(即，多结构域蛋白质Bax和Bak)的作用，但是这些蛋白质的精确的生物化学作用是有争议的(Adams,2003Daniale"厶，2004(卿ra);WillisandAdams,Curr.Opin.Cell.Biol.，77:617-625,2005)。所述蛋白质在介导细胞凋亡中可能通过以下过程来起到实质作用(ChengWa人，Mol.Cell.,《705-711，2001;Lindstena厶，Mol.Cell.,沃1389—1399，2000;Rathmel1a7.，NatureImmunology,932-939，2002;Zonga/.，GenesDev.,1481—1486，2001)，所述的过程为破坏诸如线粒体外膜之类的细胞内膜，由此促进诸如细胞色素C(其通常被隔离在细胞器中)之类的促细胞凋亡形成因子释放到细胞质中，从而促进了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性(Greene纟a厶，Science,JOi":626-629，2004;Greenefa/.，Science,^7:1309-1311，1998;Yang"a/.，Science,iVJ:1129—1132，1997)。我们对血小板数量的分子控制的理解是不完全的，并且遗传性血小板减少的许多情况尚不能解释(Drachman，2004(s叩ra))。已经假定，对循环血小板数量的主要生理学控制为通过网状内皮系统进行的血小板的产生和血小板的破坏。在这种设想下，循环系统中的血小板存活已经被认为是代谢能力(即，血小板对其前体巨核细胞的需要)的函数，并且在血小板的水平和活性的调控中，细胞死亡机制在传统上被认为起到较少的作用或者不起作用。发明概述在本说明书的全文中，除非总有说明，应将术语"包括/包含"理解为是指涵盖了给定元素或整体、或者多个元素或整体的组，但不排除任何其他元素或整体、或者多个元素或整体的组。核苷酸和氨基酸序列通过序列标识符序号(SEQIDN0:)表示。SEQIDNO:后的数字对应于序列标识符〈400M(SEQIDNO:1)、<400>2(SEQIDN0:2)，等。序列标识符的概况由表1所提供。序列表在权利要求书后提供。基因和其他基因材料(例如mRNA、构建体等)由斜体字表示，而它们的蛋白质表达产物由非斜体字形式表示。因此，Bc卜&为5c7-z的表达产物。术语"Bc卜x,或"Sc7-f、"Bak"或、"Bax"或"&y，用于涵盖任何生物种类中的所有功能相似的同源物。对导致小鼠血小板减少的突变进行基因筛选使得对作为血小板存活的重要调节剂的促存活Bcl-xl进行鉴定。当Bc1-Xl在基因或者化学上功能不足时，循环中的血小板的水平就会下降，这是由于它们的寿命减短所导致。具有Sc7-i的突变等位基因的小鼠品系是血小板减少的，并且与假说(即，Bcl-x^为控制血小板存活的主要存活因子)一致，具有特异靶向的"c7-z基因的小鼠也受到类似的影响。因此，控制血小板存活在控制循环中的血小板的数量方面(其与调节巨核细胞分化和血小板产生不同)具有重要的作用。如本文所公开的那样，Bel-xj呆持了血小板的存活，并且如果Bel-x^的活性不足，血小板的寿命期以及由此导致的循环中的血小板的总数量都会减少。由Bel-^控制的下游促细胞凋亡细胞死亡介质的缺失会逆转由于Bc卜&的损失所诱导的血小板减少。具体而言，除去Bak会逆转由于损失Bel-xt而导致的血小板数量的损失，由此表明，促存活Bcl-xt和促细胞凋亡Bak之间的平衡是体内血小板存活的主要决定因素。Bak+血小板在体内具有增快的半衰期，即，它们会更快地从循环系统中清除。具体而言，Bak的损失将血小板的t增大约40%,即由47小时达到67小时(参见图6C)。除去与Bak相关的分子后，Bax还具有增长血小板寿命期的作用，但是只能达到较小的程度。因此，本发明提供了调控血小板数量和/或存活的方法，该方法包括施用有效量的调控细胞凋亡的制剂。在一些实施方案中，所述的方法为体外方法。在其他实施方案中，所述的方法为体内方法或离体方法。包括细胞因子和药理学制剂在内的大量制剂(例如反义分子、小肽、非肽类抑制剂或结合分子)是本领域的技术人员已知的，在除了血小板以外的多种细胞类型中，这些制剂激动或拮抗了影响细胞凋亡途径中的所述的分子。在另一种形式中，本发明提供了细胞凋亡调节剂在治疗或预防与血小板低于正常水平或高于正常水平相关的状况中的用途。在另一实施方案中，本发明提供了所述的治疗剂在制备用于治疗或预防血小板减少或血小板增多的药剂中的用途。在另一实施方案中，本发明提供了在用于治疗可表征为血小板非正常水平或高于正常水平的状况中的制剂。在一些实施方案中，所述的制剂(分子、化合物等)调控了血小板的功能或活性，例如血小板的凝集能力、分泌致密颗粒储存物的能力、表达表面标记物的能力以及粘附血浆分子(例如纤维蛋白原或vonWillebrand因子)的能力。因此，例如，本发明提供了在治疗高凝状态中使用的促进细胞凋亡的制剂。在另一实例中，本发明提供了在治疗血小板减少中使用的对细胞凋亡进行负调节的制剂。因此，例如，施用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的抑制剂。在另一实例中，考虑了促进血小板或其前体(巨核细胞)中Bcl-i的水平或活性的制剂。根据本发明的一个实施方案，细胞凋亡调控剂有效地靶向或调控了Bcl-2多肽家族中促存活和/或促细胞凋亡成员的活性。在一些实施方案中，所述的制剂调控了Bel-2细胞凋亡途径，特别是Be1-xjBak和/或Bcl-xjBax介导的细胞凋亡途径。在示例性的实施方案中，所述的制剂有效地调控了Bel-Xt和/或Bak和/或Bax的活性。具体而言，通过增加相对于促细胞凋亡分子的促存活分子活性来增强血小板的数量或存活。例如，如实施例5所示，在哺乳动物受试对象中，促细胞凋亡Bak的损失改善了血小板减少的情况。类似地，BH3域模拟型ABT-737会产生Bak介导的和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的杀死血小板的情况，而这种情况可以在Bak不存在或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂存在的条件下来预防(参见实施例7)。Bax的拮抗剂还可以延长生存能力。这在(例如)实施例7中示出，其中对促细胞调亡制剂在缺乏Bak和/或Bax的小鼠中的作用进行测试。在Bak不存在的条件下，一个^s;r等位基因的损失使得血小板难以完全受到ABT-737的控制。基因和其他基因材料(例如inRNA、构建体等)由斜体字表示，而它们的蛋白质产物由非斜体字形式表示。因此，Bak多肽为Aair基因的产物。在任何动物中，优选在哺乳动物种类中，斜体字或非斜体字形式用于涵盖同源物和功能变体。在一些优选的实施方案中，本发明涉及Bcl-2家族成员的人同源物。在一些实施方案中，题述方法可用于(例如)治疗与血小板减少有关的状况、以及用于增强血小板在血液衍生产物中的生存能力。关于血小板减少，在一些实施方案中，其为遗传性血小板减少。在其他实施方案中，血小板减少为获得性的。因此，考虑了多种方法来用于增强或保持血小板的生存能力或寿命期这些方法包括施用有效量的对细胞凋亡进行负调控的制剂。在示意性的实施方案中，所述的抗细胞凋亡制剂为在本文所公开的细胞筛选物中鉴定得到的制剂。在示意性的实施方案中，所述的制剂选自在图10中列出的皮质甾类分子中的一种，或者包括图io列出的大体结构。如本文所述，所述的制剂强烈地抑制了杀哺乳动物细胞(其暴露于细胞凋亡诱导量的Bc1-Xl拮抗刑)的情况。在一些其他实施方案中，所述的制剂增大了Bel-x"Bak在细胞中的比例。在其他实施方案中，所述的制剂为Bc卜&介导的细胞凋亡途径的激动剂或Bcl-xt的激动剂。在特殊的实施方案中，所述的制剂为Bak和/或Bax的拮抗剂，或者为Bak和/或Bax活性的下游效应器的拮抗剂。在其他实施方案中，所述的制剂抑制了细胞凋亡诱导制剂的吸收或细胞活性。在一些实施方案中，所述的制剂(激动剂或拮抗剂)为小分子、抑制性RM、抗体、适体、肽、折叠体、拟肽物质(包括环状拟肽物质)、或者限制性肽。根据本发明，被鉴定为抗细胞凋亡的分子(即，在本文所述的细胞筛选物中，增强哺乳动物细胞的存活、生存能力、半衰期或寿命期的那些制剂)可用于增强哺乳动物细胞(包括但不限于血小板)的存活、生存能力、半衰期或寿命期。上述方法包括离体施用，例如将所述的制剂给予包含血小板的血液产物，例如全血或血小板制备物。上述方法还包括体内施用。就施用而言，在一些实施方案中，将所述的制剂施用给遭受正在发展中的血小板减少或处于正在发展中的血小板减少的危险中的受试对象。在示意性的实例中，所述的受试对象为接受任何形式的化疗(例如细胞毒性药物，包括抗体或抗原结合分子)的对象。血小板生存能力或存活的一个量度为循环系统中血小板的数量或半衰期，另一个量度为受试对象的年龄概况，即，平均年龄。血小板在体外或体内的生存能力的其他指标在实施例12中有所描述。在所述方法的一些实施方案中，血小板的半衰期增长。在其他实施方案中，血小板经离体储存。在示意性的实施方案中，所述的半衰期增长约40%。由此，本说明书描述了治疗或预防受试对象中血小板减少的方法，该方法包括鉴定出遭受血小板减少或处于血小板减少危险中的受试对象；以及向经鉴定的受试对象施用对血小板的细胞凋亡进行负调控的制剂。如上文所述，在一些实施方案中所述的制剂增大了Bcl-xL:Bak在血小板中的比例。在一些实施方案中，所述的制剂为Bcl-xt介导的细胞凋亡途径的激动剂或者为Bcl-XL的激动剂。由于Bak和Bax在血小板中要比Bel-x更稳定，所以特定的实施方案中考虑了施用Bak和/或Bax的拮抗剂。在一些实施方案中，所述的制剂为Bcl-xt的结合Bak的部分或其变体或其模拟物，或者为Bc卜Xl的结合Bax的部分或其变体或其模拟物，或者为Bcl-^的结合Bak和Bax的部分或其变体或其模拟物。在其他实施方案中，所述的制剂为基因沉默制剂。备选地，所述的制剂为Bak和/或Bax活性的下游效应器的拮抗剂，或者为抑制血小板中细胞凋亡诱导制剂的吸收或细胞内活性的制剂。在一些实施方案中，所述的制剂为细胞凋亡形成因子的抑制剂。就一些实施方案而言，所述的制剂(激动剂或拮抗剂)为小分子、抑制性RNA、抗体、适体、肽、拟肽物质、或者限制性肽。在另一方面中，通过降低促存活分子(较好地为促细胞凋亡分子)的活性，血小板的数量和/或存活降低。在示例性的实施方案中，Bc1-Xl被Bc1-2同源结构域模拟制剂(例如BH3同源结构域模拟制剂)抑制或者拮抗，并且血小板的数量和/或存活下降。在另一实施方案中，增强或激动Bak活性，会直接或间接地导致血小板细胞凋亡增多。对血小板数量进行负调节可用于(例如)治疗或预防与血栓症有关的状况。因此，在所述方面的宽泛的实施方案中，考虑了减少血小板的存活、寿命期、半衰期或生存能力的方法，所述方法包括施用有效量的增强细胞凋亡的制剂。在一些实施方案中，所述的制剂为Bcl-x^介导的细胞凋亡途径的拮抗剂，包括Bcl-XL多肽活性的拮抗剂。在其他实施方案中，所述的制剂为Bak多肽活性的激动剂，或者为Bax多肽活性的激动剂，或者为Bak和Bax多肽活性的激动剂。在一些实施方案中，本发明所述的制剂在Bak和/或Bax与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性之间的Bcl-XL途径中发挥作用，在这种情况下，所述的制剂为Bak和/或Bax活性的下游效应器的激动剂。在其他实施方案中，所述的制剂为IAP(细胞凋亡抑制剂)拮抗剂。在其他实施方案中，所述的拮抗剂为BH3结构域模拟制剂或基因沉默制剂，或者小分子。在其他实施方案中，所述的制剂(激动剂或拮抗剂)为小分子、抑制性RNA、抗体、适体、肽、拟肽物质、或者限制性肽。用于减少血小板存活、寿命期、半衰期或生存能力的方法包括体内或离体施用所述的制剂。在一些实施方案中，就体内或离体施用而言，将所述的制剂施用给在施用前经血小板增多的受试对象。在另一方面中，由于较成熟的血小板比较幼嫩的血小板更易受到Bcl-x^拮抗剂的攻击，所以在供给血液或血小板之前，将Bcl-Xl拮抗剂施用给血液或血小板供者，以便减小被供给血液或血小板中血小板的平均年龄。对于体内应用而言，将上述制剂施用有需要的受试对象以治疗或预防血小板增多。因此，考虑了一种治疗或预防受试对象中血小板增多的方法，该方法包括鉴定出遭受血小板增多或处于血小板增多的危险中的受试对象；以及向经鉴定的受试对象施用促进血小板细胞凋亡的制剂。在一些实施方案中，所述的制剂为Bcl-xt介导的细胞凋亡途径的拮抗剂，例如Bc卜xt的拮抗剂。在另一实施方案中，所述的制剂为Bak和/或Bax的激动剂，或者为Bak和/或Bax活性的下游效应器的激动剂。在一些实施方案中，所述的Bcl-x^介导的细胞凋亡途径的拮抗剂为BH3结构域模拟物。在另一实施方案中，所述的制剂为小分子、抑制性RNA、抗体、适体、肽、拟肽物质、折叠体、或者限制性肽。根据血小板受到细胞凋亡调控剂的攻击性被增强的情况，可以以这样的量或者在这样的时间内施用题述的制剂，其中所述的量或时间会影响血小板但不会影响其他哺乳动物的细胞，因此有效地区分开靶细胞。因此，在一个实施方案中，以可以有效地谦导无核血小板发生细胞凋亡、但基本上不会资导有核细胞发生细胞凋亡的量和/或时间施用所述的制剂。在另一实施方案中，所述的制剂调控以细胞程序性死亡终结的所述途径中的其他成分的活性。例如，对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性进行负调节或者增强IAP活性的制剂可用于促进血小板的生存能力。合适的制剂是本领域的技术人员已知的，或者可以通过现有的篩选方法或其经修饰方法来鉴定。在另一实施方案中，下游效应器包括细胞色素C、Apaf-1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。虽然使用Bel-x^、Bak或Bax对本发明进行了举例说明，但是本发明没有被如此限定，并且可以扩展到所有的功能性同源物、功能性同功型或功能性变体，包括Bc卜Xl、Bak或Bax的片段。在一些实施方案中，Bcl-2多肽家族中的促存活和/或促细胞凋亡成员受到调节。促细胞凋亡调节剂包括Bak，Bok(Mtd)，Bax，Bad,Bid,Bik(Blk)，Hrk(DP5)，BNIP3，Bim，Puma，Noxa，Mule(Lasu/ARF-BPI)和Bmf。促存活成员包括Bcl-2，Mcl-l，Bc卜w，Bc卜Xl，Bcl-B和Al(人类中为Bfl-1)。在其他实施方案中，靶向一种或多种Bel-2的家族成员。在一些实施方案中，多种制剂调控了两种或多种Bcl-2的家族成员。在其他实施方案中，共施用一种或多种不同的制剂以增强效力。优选的制剂降低了细胞凋亡并拮抗了Bax和/或Bak或者细胞凋亡途径中Bax和/或Bak下游的分子。所提及的共施用包括两种或多种制剂的同时、依次和/或间隔施用。在相关的实施方案中，本发明考虑了多种组合物的用途，其中所述的组合物包括Bc1-Xl或Bak和/或Bax多肽、或者其类似物、或者Bc卜x^或Bak和/或Bax多肽的变体或调控Bc卜Xl和/或Bak和/或Bax的水平或活性来在受试对象中或在体外对血小板的水平进行正调节或负调节的制剂。在一个具体的实施方案中，调控Bcl-Xl或Bak和/或Bax的水平或活性的制剂包括核酸分子，通过该核酸分子可产生Bc卜Xl或Bak或Bax多肽或肽。在另一实施方案中，本发明提供了在治疗和/或预防与血小板减少或血小板增多有关的状况中使用的调控细胞凋亡的制剂。传统上，所述的制剂为组合物，其包含所述的制剂、以及一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或赋形剂。所述的制剂还可以与另外的细胞凋亡调控剂(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂、或血小板水平或活性的调控剂，例如阿司匹林)联合使用。因此，本发明提供了组合物、或者双组分或多组分药物组合物，其中在一种实施方案中，所述的双组分药物或多组分药物包含至少一种血小板细胞凋亡调控剂和一种血小板功能抑制剂。在另一实施方案中，施用血小板保护性抗细胞凋亡制剂作为在(例如)癌症治疗方案中使用的细胞凋亡刺激剂的助剂。在另一方面中，本发明提供了对用于在体外或体内调控血小板水平或寿命期的制剂进行筛选或测试的方法。在一些实施方案中，对多种制剂增长或降低血小板存活、寿命期、生存能力或半衰期的能力进行测试。在一些实施方案中，对多种制剂调控本文所鉴定的Bcl-2家族靶标、或者在导致细胞凋亡途径中的Bcl-2家族成员下游的分子的活性的能力进行测试。在优选的实施方案中，选择这样的制剂，该制剂通过降低Bak和/或Bax的水平或活性、或者在Bax或Bak介导的细胞凋亡途径下游的分子的水平或活性来对细胞凋亡进行负调控。本发明还提供了经修饰的非人类的动物和经分离的细胞，这些动物或细胞在一种或多种Bcl-2家族基因中包含造成部分损失的功能突变。本发明提供了进一步产生小鼠品系的方法，该方法包括将本文所述的Bc卜XL突变体小鼠与不同品系的小鼠杂交，从而产生进一步突变体以用于测试。本发明还提供了筛选或测试受试对象中Bcl-2家族基因(例如^A和^7基因)或它们的基因或蛋白质调节分子(其为受试对象中血小板减少或血小板增多的特定的基因基础的指示)的突变情况的方法。其他方法涉及测定受试对象中促存活分子与促细胞凋亡分子的比例。可以使用能影响本发明所鉴定的靼标的任何制剂来调控血小板的存活、生存能力或半衰期。本发明的方法包括筛选调控了血小板存活、寿命期或生存能力的制剂的方法，该方法包括(u使所述的制剂与包含靶标的系统接触，其中所述的耙标选自Bc卜Xl和/或Bak或Bax多肽，以及5c/-;r，"ai:或5n基因序列；以及(U)测定所述制剂与所述靶标之间的复合体的存在情况，所述靶标的活性的变化情况，或者所述靶标的活性的指示剂活性水平的变化情况。在一些实施方案中，所述的方法包括篩选能够增强血小板和/或其他哺乳动物细胞的存活、寿命期或生成能力的分子。在示意性的实施方案中，所述的方法包括(i)使所述的分子与细胞结合；(ii)将所述的细胞与能够拮抗所述细胞中的促存活Bcl-2家族分子、并诱导细胞凋亡的一种或多种制剂接触；(iii)相对于对照品，测定在所述分子存在下细胞存活(生存能力、寿命期、半衰期)的变化情况；以及(iv)选择能够增强细胞存活(生存能力、半衰期)的分子。在一些实施方案中，所述的方法进一步包括将得自(iv)中的所选的分子与血小板结合，从而相对于对照品，测定在所述分子存在下血小板细胞存活(生存能力、半衰期)的变化情况。为了有利于筛选，在一些实施方案中，例如通过降低一种或多种促存活Bel-2家族成员的水平或活性来对所述的细胞进行修饰，从而增强其对细胞凋亡诱导剂的敏感性。在其他实施方案中，通过基因打断来对所述的细胞进行修饰，从而使其缺少一种或多种促存活Bcl-2的家族成员。在示意性的实施方案中，所述的细胞为得自多细胞有机体的Mcl-l缺陷型细胞，而所述的制剂为Bc卜xt拮抗剂。在其他实施方案中，所述的方法包括鉴定出在所述细胞中Bel-2的家族蛋白的调控情况。本发明的制剂和组合物包括(例如)小的或大的、有机或无机化学分子，肽，多肽，经修饰的肽(例如限制性肽)，折叠体，拟肽物质，环状拟肽物质，蛋白质，脂质，碳水化合物或核酸分子(包括反义分子或其他基因沉默分子)。小分子通常具有小于500道尔顿的分子量。大分子通常包括分子量大于500道尔顿的整个多肽或其他化合物。制剂可以包括本文所定义的天然形成的分子或其变体(包括类似物)，或者非天然形成的分子。其他組合物包括细胞、组织或器官组合物。具体而言，本说明书思考了经修饰的血小板群体，以用于向有需要的受试对象进行施用，其中所述的血小板包括离体储存的、以及与细胞凋亡拮抗剂接触以增大血小板半衰期的血小板群体。在一些实施方案中，所述的制剂包括Bcl-xt激动剂或Bak拮抗剂。本说明书进一步思考了在治疗或预防血小板减少中使用的细胞凋亡抑制剂。所述的制剂被考虑单独使用或者与其他治疗方法联合使用。一种其他的治疗方法为癌症的治疗方法。在具体的实施方案中，在治疗或预防血小板减少中，细胞凋亡抑制剂增大了血小板中Bel-xL:Bak的比例。在其他实施方案中，所述的细胞凋亡抑制剂用于增长储存的血小板的半衰期。备选地，细胞凋亡促进剂被用于减小被储存血小板的平均年龄，其中在供给血液前，使用细胞凋亡促进剂处理血液或血小板供者，或者被用于治疗或预防血小板增多。本发明进一步思考了制剂盒，该制剂盒包含用于治疗或预防血小板减少或者用于增长被储存血小板的生存能力或半衰期的细胞凋亡抑制剂。本说明书进一步考虑了用于治疗或预防血小板减少的组合物，该组合物包含能够抑制或延迟或负调控血小板细胞凋亡的有效量的制剂。在一些实施方案中，所述的制剂增大了血小板中Bel-x^:Bak的比例。在其他实施方案中，考虑了用于增长被储存血小板的半衰期的组合物，该组合物包含能够抑制被储存血小板的细胞凋亡的、有效量的制剂。在其他实施方案中，考虑了用于治疗或抑制血小板增多的组合物，该组合物包含能够促进血小板的细胞凋亡的有效量的制剂。上述概述不是并且也不应该以任何方式视为是对本发明所有实施方案的穷举性的叙述。有些附图包含彩色的代表物或实体。彩色版的附图可以通过请求得自专利权人或者得自合适的专利局。如果得自专利局可以征收一定的费用。图l提供了示出&/-^中经分离和分子鉴定的突变情况的数据图。(A)为得自ENU-诱变的BALB/c雄鼠的810G:后代在7周龄时外周血中的血小板计数。每个圆圏代表一只单独的小鼠。图中示出了尸/"0和？/"f谱系的首建鼠。证实了三种其他血小板减少0°/〃7，户"/《和户"i7)的遗传性；这些谱系均处于基因图谱序列中的不同阶段。尸/〃7被定位在染色体11中，并鉴定出在编码Gplba的基因中发生了突变。户/"《绘制于染色体16上的间隔中，而尸"i7则被指定在图谱区域中。没有鉴定出引起血小板增多的遗传性突变。(B,C)为分别绘制的^c/-/，(B)和Ac/-(C)的单倍型。示出了所用的标记物以及它们在2006年4月UCSC小鼠基因组中的位置。所定义的重组事件以灰色阴影显示；通过遗传性测试证实的那些以粗体显示。在JCCA19和D2Mit500之间的16.3Mb的间隔被定义为^c/-/":在JCCA9和D2MU139之间5c/-/""的候选间隔被优化为1.9Mb。(D，E)为示出在万c/-/〃"(D)或(E)突变杂合的动物中核苷酸变化的DNA序列电泳图语。进一步测序确定，在亲代BALB/c品系或C57BL/6定位品系中均不存在/VHf和/VW。中的突变。酪氨酸15和异亮氨酸182(在尸/^^和？〃"语系中取代的残基)分别被保留在小鼠和人Bcl-XL之间。图2提供了示出类似于5"-/""和^/-/冊突变体小鼠的、缺少一个Bcl-x等位基因的小鼠为血小板减少情况的数据的图形。(A)为在野生型C57BL/6，"c/-;r+/—，&7-2+/—，"c/i—/_或J/c7-r"雄鼠中血小板计数的自动分析。缺失一个Sc7-;r等位基因使得血小板的数量明显减少。使用双侧非对称t-检验比较测试结果。*p<0.05。(B)为减少的5c/-/，血小板的寿命期。在使用生物素N-羟基琥珀酰亚胺注射后的0，4，8，12，24，28，48，72和96h，由5c/-/'"。小鼠取得外周血液样品。野生型(&/-//+)血小板表现出t^为57h，这与已经公开的观察结果一致(BergerefW.,Blood4446-4452，1998),而在杂合子中，^/-/諸突变使得tw呈剂量依赖的方式降低至24h，在&/-/"纯合子小鼠中，tw2以剂量依赖的方式降低至10h。(C)Sc7-;r突变缩短了血小板的寿命期。在所显示的基因型小鼠中，血小板的半衰期如(B)中测定。与野生型(*/-//+)同窝出生对照小鼠血小板的半衰期相比，与&/-/""突变类似，或^/-1缺失(化/-^勺还会降低也会降低血小板的半衰期。卞关于小鼠遗传背景的详细信息将在试验过程中提供。(D)在^r/-,中具有突变的小鼠中血小板半衰期缩短为固有缺陷。将得自所示基因型小鼠的生物素化血小板采用一定方式转移到指定基因型的未经处理的受者中，并且它们由循环系统中的清除率可如(B)中测定。(E)Bcl-xt的损失增大了血小板的更新率，从而成比例地形成幼嫩的血小板群体。网状血小板的百分率可通过^f吏用噢唑橙染色来测定(KienastWa/.，Blood，":116-121，1990);每个符号都代表单个的小鼠。(F)血小板的产生不会由于"c/-;r的突变而削弱。网状血小板的绝对数量可通过使用噻唑橙染色并在稳定状态下测量血小板数量来测定。(B)、(C)和(D)中的数据表示在各时间点下5-8只小鼠的平均值土SD。图3提供了示出&/-/脂和^/-//"《的突变使得8(;1-&蛋白质不稳定的数据图。(A)为在Bc1-Xl上/，和突变的位置。两种突变(蓝色所示)被定位在小鼠Bcl-xJ浅灰色)与BimBH3肽(红色)(1PQ1)形成的复合体中的3维结构上(Liuefa/.，I讓unity,M341-352，2003.)。Y15(尸"2访部分暴露于溶剂中，而I182(户7"。被完全隐藏，它们都不会参与形成Bc1-Xl的BH3结合槽。使用PyM0L制作所述的结构图(DeLano,W.L.2002ThePyM0LMolecularGraphicsSystem;http:〃雨.pymol.org)。(B)由z的尸/"〃和等位基因编码的突变体蛋白质还能结合Bax和Bak。FLAG标记的野生型Bcl-xL、或者/V"0(Y15C)和/V〃f(1182N)突变体在293T细胞中与HA标记的Bax(上方)或Bak(下方)共表达，并且使用小鼠单克隆抗FLAG(FL;M2克隆)、-HA(HA.11克隆)、或者不相关的对照抗体(-GluGlu)来对包含TritonX-100的裂解物进行免疫沉淀。使用针对FLAG(9H1)或HA(3F10)的大鼠单克隆抗体探测斑点。(C)尸/"0和尸/H6突变使Bc1-Xl不穗定。图3C上Bcl-xt户/〃f蛋白质的基础表达减少。使用由所示基因型的原代MEF制备的等价裂解物对Bc1-XlMcl-l,Bak或Actin(装载对照)进行免疫印迹处理。图3C下针对所示的蛋白质，探测由野生型或5c/-/'","。原代MEF制备的等价裂解物，其中所述的原代MEF在广谱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂qVD.OPh(50nM)存在下在暴露于50pg/mL环己酰亚胺(蛋白质合成抑制剂)后经历0-24h。所示的数据代表了所分析的各种基因型的至少2个细胞系。(D)5c7-y或"c/-//mMEF易受蛋白质合成抑制作用的影响。在50lig/mL的环己酰亚胺中暴露0-30h后，得自野生型、Z"w或"W〃""小鼠的代表性的原代MEF的生存能力(通过PI排除法来测定)。数据代表了代表性细胞系的平均值士SD。卞-<1%生存能力。图4提供了示出引发急性血小板减少的BH3模拟物ABT-737的数据图。(A)以腹膜内注射的方式向野生型C57BL/6小鼠注入单剂量的ABT-737(75mg/kg;红色箭头所示)。使动物流血2-24h，然后测定血小板数量。所有经过注射的小鼠都表现出血小板数量明显减少，并且在注射后的大约4h时达到最低点(<30%正常值)；每个符号都代表小鼠。(B)在使用单剂量的ABT-737后血小板的恢复。在使用单剂量的ABT-737(红色箭头所示)之后的2-96h测定血小板的数量(蓝色的符号表示；左侧轴)。注意，到第3天完全恢复，到第4天回弹至血小板增多。橙色符号代表了血清TPO的水平(右侧轴)。(C)为由ABT-737引发的周期性急性血小板减少。在每隔一周施用单剂量的ABT-737(红色箭头所示)之前以及之后的8h测定血小板的数量。每次，所述药物都使血小板数量可比较地减少。在恢复过程中，基线数量向上浮动。(D)ABT-737选择性地对老化的血小板产生作用。在使用单剂量的ABT-737之后，经噻唑橙染色的血小板的代表性流式细胞概况(红色箭头所示)表明经ABT-737处理后幼嫩(网状)血小板的比率(蓝色表示的％)增大。(E)同步血小板。单剂量抗血小板血清(APS;蓝色箭头所示)的处理激起了急性重度血小板减少(血小板数量红色符号；左側轴)。在恢复过程中，新合成的幼嫩血小板是较大的，这可由增大的平均血小板体积(蓝色符号；右側轴)表明。(F)幼嫩的血小板对ABT-737具有抗性。使用APS对野生型C57BL/6小鼠进行处理，然后在第2天或第7天向这些小鼠注射ABT-737(红色箭头所示)。测定血小板的绝对数量以及网状血小板的°/。。图4F上示出了在注射ABT-737之前或之后在经过噻唑橙染色后的代表性流式细胞概况。图4F下示出了在注射ABT-737前或注射ABT-737后的2h时血小板的数量。(B)、(C)、(E)和(F)中的数据表示了在各时间点时3-6只小鼠的平均值土SD。图5提供了示出引发急性血小板细胞凋亡的BH3模拟物ABT-737的数据图。(A)为血小板中Bel-2家族蛋白质的表达情况。针对Bcl-XL，Mcl-l，Bc卜2，Bak，Bax或Actin(负载对照)，探测由50网或5pg血浆制备的裂解物，其中所述的血浆富集有小鼠血小板或MEF。(B)Bc1-Xl的基因消除使ABT-737诱导的血小板减少恶化。使用单剂量的ABT-737处理野生型C57BL/6,Sc7-Z或^;/-//-小鼠(75mg/kg;红色箭头所示)，此后在2-24h时测定血小板的数量。(C)ABT-737激发了血小板中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性。对细胞裂解物中的全长且完整的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(p32;图5C上)、裂解法的p17片段(图5C中)或凝溶胶蛋白(图5C下)进行免疫印迹处理，其中所述的细胞裂解物由新分离的或新培养的血小板制备而来，这些血小板未经过处理，或者是在广谱半胱氨酸天冬氨酸抑制剂qVD.OPh(50一(单独的qVD.OPh)或依托泊苷(IO^M)存在或不存在下在ABT-737中暴露过。ABT-737会诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3完全活化以及凝溶胶蛋白裂解(其可部分地被qVD.OPh阻断)。(D)ABT-737激发了Bak介导的、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的培养物中血小板损失。在未进行处理，或者是在qVD.OPh(50^M)(单独的qVD.OPh)或依托泊苷(IOpM)存在或不存在下暴露于ABT-737(1juM)之后，对野生型C57BL/6或A3irv—血小板进行计数。数据代表了使用由各种基因型的6只小鼠汇集得到的血小板在4个独立的试验中归一化的血小板数量(未经处理的-100%)的平均值±SD。(E)人类血小板表现出容易以半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖的方式受到ABT-737(1nM，作用1或2h)的影响。(F)Bak的缺乏保护血小板免受ABT-737的影响。使用单剂量的ABT-737(75mg/kg;红色箭头所示)对野生型C57BL/6,^2i「—z-勘yz—小鼠进行处理，此后在0-24h时测定血小板的数量。在早期时间点(至多4h)时，5si:—z小鼠未受ABT-737的影响，而iai^a/〃小鼠则完全受到保护。在(B)和(F)中的数据代表了在各时间点时至少6只小鼠的平均±SD。图6提供了示出血小板中Bak为促存活Bcl-XL的主要靶标的数据图。(A)编码Bak的基因的缺失导致血小板减少。野生型C57BL/6，勘Z—，5"—/_或iai—^a^-小鼠中血小板数量的自动分析表明万ai:的损失使血小板的数量明显增多；^z的作用不大。(B)为/_血小板中正常血小板的亚显微结构。得自野生型(图6B上)或^3扩—(图6B下)小鼠的代表性血小板的透射电子显微图像。(C)&irv—血小板具有增长的寿命期。所示基因型小鼠中的血小板的半衰期如上文所述的方法测定(数据未示出)。数据代表了得自8只小鼠的平均值±SD。(D)^i:的基因消除阻止了由Bcl-x^的功能损失性突变而引起的血小板减少。对具有所示基因型的小鼠的血小板数量进行比较。一个^i:等位基因的缺失阻止了^/-;r+小鼠的血小板减少，而两个等位基因的损失产生了无法与由单独的^i缺失而产生的血小板减少区别的血小板减少。因此，5ai:在遗传上位于"c7-t的下游。(E)在混合的遗传背景下，杂合的5c7V或^/-/〃"突变体小鼠中的血小板减少可通过^ai:的损失来阻止，并通过Ac7-义的组成性缺乏而恶化。*p<0.05;采用双侧非对t-检验来进行(A，D，E)中的统计学分析。图7提供了在Bcl-XL户"i^和Bc卜XL户7〃f中Bcl-xt失去稳定性的数据图。(A)使用抗FLAG抗体(M2)对稳定表达经FLAG标记的野生型Bcl-x^(蓝色柱状图)、尸"W(绿色柱状图)或尸/H6(红色柱状图)突变体的5c/-MEF多克隆库进行染色，并使用FITC缀合的抗小鼠二级抗体检测免疫荧光。通过黑色柱状图显示(用载体感染的MEF的)对照着色情况。(B)使用50jng/mL的环己酰亚胺将(A)中所述的细胞库处理0-24h，并通过PI排除法测定它们的生存能力。数据示出了由代表性试验得到的平均值。(C)为在使用0-100^iM的依托泊苷处理后的24h时(A)中所述的细胞库的生存能力。注意由野生型Bcl-XL提供的保护比由Bcl-x,"。或Bc卜x，"所提供的保护更强。数据示出了得自代表性试验的平均值土SD。(D)为通过Mcl-l和Bcl-Xt调节Bak的模型(Willisa/.，2005(wprs))。然而Bim可以与Mcl-1和Bel-Xl結合并中和Mc卜l和Bc1-Xl，从而引起Bak介导的细胞凋亡，另一种唯BH3蛋白质Noxa只能够结合Mcl-l。因此，除非Bc卜xt也是无活性的，否则Noxa不能有效地杀灭。(E)Bcl-x，"具有弱的促存活活性。在使用表达Bims或Noxa的逆转录病毒感染后的24h，通过PI排除法测定稳定表达野生型或突变体Bc1-Xl(如A中所述)的万c/1—AMEF的生存能力(Chene"/.，Mol.Cell.,77:393-403，2005)。Bims能够计数野生型或突变体Bcl-xL(灰色柱)的过表达。Noxa通过使Mc卜l(唯一剩下的控制Bak的促存活蛋白)失活来杀灭载体对照AMEF。当引入野生型Bcl-xL(或者Bcl-x〃^突变体)时，由于过表达的Bel-&(其由Noxa所备用(参见图7D))能够保持使Bak受控，所以Noxa不再能杀灭。与此截然不同的是，Bcl-x，"在很大程度上是无活性的。数据示出了得自代表性试验的平均值±SD。图8为示出得自Bc卜x突变体小鼠的细胞系对细胞凋亡的敏感性的数据图形。(A)得自野生型、/，〃，或/""〃""小鼠的原代MEF对使用广谱激酶抑制剂星孢菌素(1Q|nM)进行的处理同等敏感。通过PI吸收测定生存能力；数据表示代表性细胞系的平均值士SD。卞-<1%生存能力。(B)在环己酰亚胺(IOOng/mL)存在下将得自所示基因型小鼠的细胞因子依赖性骨髓(FDM)细胞(Ekertetal.，J.Cell.Biol.，165:835-842,2Q04)培养l-48h，并通过PI排除法及使用AnnexinV-FITC染色来测定它们的生存能力。数据代表了在至少3个独立的试验中测试得到的3个独立衍生的细胞系的平均值±SD。图9为示出ABT-737不影响血小板凝集的数据图形。对使用1]LiMABT-737预温育lh(绿色的线)或未经温育(红色的线)的人血小板富集的血浆(250x107L血小板)进行血小板凝集，然后使用(A)胶原(4]ug/ml)或(B)ADP(10^iM)进行刺激。注意，ABT-737不诱导血小板凝集，或者影响与激动剂的作用。BH3模拟化合物不会改变对也经过测试的其他激动剂(即为肾上腺素、花生四烯酸或利托菌素)的应答(数据未示出)。图10为针对能够增强细胞生存能力、存活或寿命期的制剂，在目标细胞筛选中所鉴定的制剂的结构图。表格说明表1提供了对本说明书中所提及的SEQIDNO的说明。表2提供了氨基酸的亚类。表3提供了示例性的氨基酸取代。表4提供了本发明所考虑的非天然氨基酸的列表。表5示出了ABT-737对体外造血祖细胞形成的影响。将得自C57BL/6小鼠骨髓的细胞(25，000)用含有G-CSF、IL-3和EPO的软琼脂培养7d，然后进行染色和计数。在第1、3和5天加入盐水或ABT-737。在所用的最高浓度下，对巨核细胞的集落形成影响较小，而其他集落的形成也未受影响。G:粒细胞集落；GM:粒细胞/巨噬细胞集落；M:巨噬细胞集落；E。嗜酸性粒细胞集落；Meg:巨核细胞集落。总集落数为两个培养物的平均值；巨核细胞集落的数量代表了4种独立培养物的平均值士SD。表6提供了带有Bc卜x突变体等位基因的小鼠的血液分析结果。发明详述本发明部分依据这样的另人惊奇且意想不到的发现，即，可以使用能够调控内在细胞凋亡程序的生理学或药理学制剂来对血小板的存活进行体外和体内调节。因此，本发明提供调控血小板的数量和/或存活的方法。该方法包括施用有效量的能够调控细胞凋亡的制剂。该制剂直接或通过抑制或增强本身可直接促进或减少细胞凋亡的分子来促进或减少细胞、组织或受试对象中的细胞凋亡。通过靼向细胞凋亡的保守性介质，可以延长或减短血小板的存活。除非已经作出了清楚的陈述，否则本说明书中所述的各种实施方案有待于经过必要的修正之后再应用于每一个其他的实施方案中。如技术人员所理解的那样，可以根据本发明定靶细胞凋亡程序中的多种调节剂或效应器(包括细胞凋亡诱导剂、抑制剂，在一些实施方案中，效应器例如为效应器分子的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族)。Bcl-2的分子家族及其在细胞凋亡中的作用已经成为大量研究的主题。大量的细胞凋亡调节剂已经被鉴定(例如参见Baell的综述，Biochem.Pharmacol.,"(5-6):85卜863，2002;Fesik，Nat.Rev.Cancer,1):876—885，2005;Schimmer，CellDeathDiffer.,"(2):179-188，2006)。例如，促进细胞凋亡的制剂包括BH3模拟制剂，例如肽(例:i口参见Cosulicha人，CurrentBiology,7:913—920，1997;Diaz"a/.，J.Biol.Chem.，272:11350—11355，1997;HoiingerWa厶，J.Biol.Chem.,"4:13298-13304，1999;0ttiliee"人，JournalofBiologicalChemistry,272:30866-30872，1997;Schimmera人，CellDeathDiffer.,《725-733，2001;Shangary，Biochemistry,9485-9495，2002;Wanga/.，CancerResearch,6ft1498—1502，2000b);限制性肽(例如参见Walenskya/.,Science,1466-1470,2004&WO2004/058804，在此以引用方式全文并入本文)；折叠体(例如参见Sadowsky，J.Am.Chem.Soc.，"7(34):11966-11968，2005);以及小型有机化合物，例如抗霉素A(例如Tzunge"/.，Nat.Cell.Biol.,J:183-191，2001)，BH3I(例如Degtereva7.,Nat.Cell.Biol.，J:173—182，2001)，四癌菌素A(例如Nakashimae"厶，CancerResearch,6ft1229—1235，2000)，多酚(包括棉子酚)(例如Kitadaa/.，J.Med.Chem.，4259-4264，2003),阿朴棉子酚(例如Becattini，2004),HA14-1(例如WangWa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,夕7:7124-7129，2000a),化合物6(例如Enyedye"/.,J.Med.Chem.，":4313-4324，2001)，ABT-737(例如01tersdorf"a/.,Nature,4^5:677—681，2005),三联苯系化合物(例如Yin,LAm.Chem.Soc.,"7(15):5463-5468，2005),如在WO2006/002474中公开的作为a-螺旋状模拟物的苯酰脲化合物(所述文献在此以引用方式全文并入本文)，以及如(例如)在2006年4月6日提交的USSN60/789982中公开的苯并噻唑《汙生物(所述文献在此以引用方式全文并入本文)。在另一方法中，靶向通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性来抑制细胞凋亡的细胞凋亡抑制剂(IAP)分子。IAP拮抗剂(也称为SMAC/Diablo激动剂)在(例如)Oost，J.Med.Chem.，47(18):4417—4426，2004;Wang，J.Biol.Chem"iW46):48168-48176，2004;Vucic，Biochem.J.，，(Pt1):11—20，2005;以及Franklin,Biochemistry,"(27):8223-8231，2003中有所描述。在详细描述本发明之前，应该理解，除非另作说明，否则题述发明不限于成分的具体配方、歸选方法、剂量方案等，因为这些都是可以变化的。还应该理解本文所采用的术语仅是为了达到描述具体实施方案的目的，而无意于进行限定。如本文说明书中所用，除非文中内容清楚地做出了相反的说明，否则单数形式的"一"、"该"和"所述的"包括复数方面。因此，例如，参见"Bcl-2家族成员"，其包括一个Bcl-2家族成员、以及两个或多个Bcl-2家族成员；等等。术语"化合物"、"分子"、"活性制剂"、"药理学制剂"或"生理学制剂"、"药剂"、"制剂"和"药物"都用于指可诱导期望的药理学和/或生理学效应的化学化合物。所述的术语还涵盖了本文明确提及的那些活性制剂的可药用的及药理学活性成分，其包括(但不限于)盐、酯、酰胺、药物前体、活性代谢物、类似物等。当使用术语"化合物"、"活性制剂，，、"药理学活性制剂，，、"药剂"、"活性物质"和"药物"时，应该理解它们包括所述的活性制剂本身以及可药用的药理学活性的盐、酯、酰胺、药物前体、对映体、代谢物、类似物等。术语"制剂"不应该仅被解释成无机化学化合物，而应该被扩展至肽、多肽和蛋白质、以及遗传分子(例如RNA、DNA和其化学类似物)。术语"调控剂"为可调控细胞凋亡的制剂、分子、药理学活性制剂、药剂、活性物质和药物的实例。"有效量"是指至少部分达到所需应答而需要的量。对于人类受试对象而言，有效量在大约0.lng/kg体重/剂量至lg/kg体重/剂量的范围内。在一些实施方案中，所述的范围为大约lja至lg、大约lmg至lg、lmg至500mg、lmg至250mg、lmg至50mg或者1y至lmg/kg体重/剂量。将剂量方案调整为适于事态的紧急情况，并且可以将剂量方案调整为产生最佳的治疗剂量。例如，可以每日、每周、每月或其他合适的时间间隔提供多个剂量。参见"调控"、"经调控的，，或"调控剂"等，其包括负调控、抑制、拮抗、降低或减少，以及正调控、增大、增强、激动、延长、刺激或提高，以及具有这些作用的制剂。这些术语在本文中使用具体是指"细胞凋亡"、存活、寿命期、半衰期、生存能力和细胞功能、或者活性。可以使用多种细胞测试方法来对细胞的这些属性中的一种或多种属性进行评估或定量。例如，血小板的多种不同功能的测试在诸如实施例10之类的实施例中有所描述。在一个实施方案中，本发明提供了调控受试对象中血小板或其前体的教量和/或存活的方法，该方法包括向受试对象施用有效量的制剂，其中所述的制剂能够调控Be卜Xl和/或Bak和/或Bax多肽或其功能变体的活性，或者能够调控Bcl"^和Bak和/或Bax多肽之间的相互作用。在另一实施方案中，所述的制剂调控了Bax和/或Bak多肽的活性。能够受益于本发明的方法或组合物的任何受试对象或动物也被包含在内。术语"受试对象"包括(但不限于)人和非人的灵长类动物、动物、牲畜动物、伴侣动物、实验室试验动物、被捕获的野生动物、爬行动物和两栖动物、鱼、鸟等。本发明最优选的受试对象为人类受试对象。不管是人还是非人的生物体，受试对象可以指患者、个体、对象、动物、宿主或受者。Bel-XL和Bak和/或Bax多肽及其功能变体之间的"相互作用，，包括(但不限于)Bc卜&和Bak和/或Bax或其功能变体或其同源物之间的结合、以及通过一种或多种中间物Bcl-2家族成员的相互作用。Bcl-XL和Bak和/或Bax之间的结合是通过(例如)BH3结构域进行的，因此，模拟了Bak和/或Bax的BH3结合活性的制剂还调控了Bel-Xl和Bak和/或Bax之间的相互作用。在一些实施方案中，拮抗Bcl-xi的制剂会有效地激动Bak和/或Bax的活性，并且拮抗Bak和/或Bax的制剂会有效地激动Bc卜x。在另一实施方案中，本发明提供了增加受试对象中血小板或其前体的数量和/或存活的方法，该方法包括施用有效量的制剂，其中所述的制剂能够增大Bc1-Xl的水平或活性，或者能够降低Bak和/或Bax(血小板中)的水平或活性，或者能够降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的水平或活性。在另一实施方案中，本发明提供了降低血小板或其前体的数量和/或存活的方法，该方法包括向受试对象施用有效量的制剂，其中所述的制剂能够减少Bcl-^的水平或活性，或者能够增加血小板中Bak和/或Bax的水平或活性，或者能够增加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的水平或活性。在另一方面中，本发明提供了增强血小板体外存活的方法，该方法包括将血小板在体外与能够对细胞凋亡进行负调控的制剂接触。在一个实施方案中，所述的制剂调控了Bcl-x^或Bak和/或Bax的活性。在另一实施方案中，所述的制剂抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性，或者促进了诸如IAP多肽之类的细胞凋亡蛋白质的内生抑制剂的活性。调控革巴标(例如包括肽、多肽、核酸或细胞)的"活性"包括指分子/细胞的水平或数量、或者靶标的浓度、或者靶标或细胞的功能活性。优选的靶标属于Bcl-2家族的多肽，或者其编码基因序列，或者下游细胞凋亡效应器分子。其中，特别考虑Bcl-^、Bax和Bak以及BchL/Bak/Bax途径。多肽的活性可以通过增大编码DNA或RNA的转录或翻译的水平来增强。多肽的活性还可以通过降低转录或翻译的水平(例如通过抑制启动子或增强子的活性，或者通过采用反义/siRNA策略，目前这些都是本领域中的常规技术)来降低。因此，在一些实施方案中，血小板中促存活或促细胞凋亡多肽的水平可以通过施用制剂(例如编码功能型多肽的基因构建体)来调控，其中通过所述的制剂可以产生所述的多肽或其调节剂。在另一实施方案中，基因/靶向构建体编码了靶多肽的表达调节剂，例如反义分子、启动子或增强子。本发明所属领域的技术人员能理解多种策略可用于将基因构建体或多肽/肽构建体传递至细胞内，以用于调控细胞内的多肽活性或者部分核酸的活性。术语"基因材料"、"基因构建体"、"基因型式"、"核酸"、"核苷酸"和"多核苷酸"包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合的聚合物、正义和反义链，并且可以为化学或生物化学修饰的或者可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基，这些都可以容易地被本领域的技术人员所理解。这些修饰包括(例如)标记物；曱基化；使用类似物(例如吗啉环)取代一个或多个天然形成的核普酸；核苷酸间修饰，例如不带电的连接体(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)、带电的连接体(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂的部分(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和经修饰的连接体(例如OC-异头核酸等)。此外，还包括这样的合成分子，该分子模拟了多核苷酸通过氢键和其他化学相互作用而与指定序列结合的能力。此类分子是本领域已知的，并包括(例如)其中在分子主链中肽连接体取代了磷酸酯连接体的那些。本发明进一步考虑了包含重组构建体的重组核酸，其包含5c/-;r或A"或5ai基因或它们中任一者的功能变体的全部或部分。所述的重组构建体能够在宿主细胞中自发复制。备选地，所述的重组构建体能够整合到宿主细胞的染色体DNA中。这种重组多核苷酸包含基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，根据多核苷酸的来源或操作，所述多核苷酸(i)会不与天然相关的全部或部分的多核苷酸相关；(n)会与除了天然连接的多核苷酸以外的多核苷酸相连；或者(iii)不会天然形成。在根据本发明的核酸包括RM的情况下，对所示的序列应该被解释为是指其中U取代了T的RM等价物。这种构建体可用于增高Bcl-^或Bak的水平，或者通过(例如)反义手段或RNAi介导的基因沉默方法对Bc1-Xl或Bak和/或Bax的水平进行负调节。如本领域的技术人员所公知的那样，所述的构建体还可用于形成动物模型以及具有经修饰的Bc卜Xl或Bak和/或Bax等位基因的细胞。至本叙述内容的结尾，简要地描述了所述的动物和细力包、以及包含这种动物和细月包的组合物。如本领域的技术人员所知道的那样，反义多核苷酸序列是阻止和减少细胞凋亡的内生或生理学调节剂表达的有用制剂。备选地，如Summerton等人(AntisenseandNucleicacidDrugDevelopment,7:187-195，1997)所述，可以使用吗啉。反义分子可以干扰核酸分子的任何功能。被干扰的DNA的功能可以包括复制和转录。复制和转录可以得自(例如)内生细胞模板、载体、质粒构建体等。待干扰的RNA的功能可以包括多种功能，例如RNA至蛋白质翻译位点的易位；RNA至细胞内位点的易位，其中所述的位点远离于RNA合成的位点；由RNA的蛋白质翻译；形成一种或多种RNA种类的RNA的剪接；以及与RNA有关的催化活性或复合体形成(该过程可由RNA进行或者可通过RM来促进)。这种对耙核酸功能进行干扰的一个优选的结果是调控细胞凋亡促存活或促细胞凋亡调节剂(例如Bc1-Xl和/或Bak)的表达。虽然优选形式的反义化合物为单链反义寡核苷酸，但是在多种物种中，引入双链结构(例如双链RNA(dsRNA)分子)已经显示出诱导了基因或其相关基因产物的功能发生有利且由特异性反义链介导的降低。在题述发明的内容中，术语"寡聚化合物"是指包含多个单体单元的聚合物或寡聚物。本发明中术语"寡核苷酸"是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)、或其模拟物、嵌合体、类似物和同源物的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然形成的核碱基、糖和共价核苷(主链)间键构成的寡核苷酸、以及具有功能相似的非天然形成部分的寡核苷酸。这种经修饰或取代的寡核苷酸通常由于其具有期望的性质(例如增强的细胞吸收、对耙核酸增强的亲和性以及在核酸酶存在下增强的稳定性)而比天然形式的寡核苷酸优选。通常，与^/-jr或勘i:和/或mRNA的开放阅读框内的核苷酸杂交的核酸酶抗性硫代磷酸酯会诱导RMseH介导的降解。根据本发明上述方面的基因制剂或组合物优选地包含约8至约80个核碱基(即，约8至约80个连接的核苷)。本领域的普通技术人员将理解核碱基的长度为<image>imageseeoriginaldocumentpage36</image>本发明具体的化合物。在一些实施方案中，本发明的制剂包括Bel-Xl或Bak或Bax或其功能片段或其功能变体，或者基因形式的"c/-t或^i:或""基因或其功能部分或其功能变体，或者它们的互补形式。本发明提供了包含"c/-i或^i或Aj，或者Bc1-Xl或Bak或Bax(即，基因或蛋白质形式的分子)或其功能变体的组合物，该组合物在用于调控与血小板和/或血小板的存活有关的相互作用中实质性增强或降低了Bc1-Xl或Bak和/或Bax的活性。这些组合物可以被i殳计成体外或体内施用。本发明的调控剂可以为化学制剂，例如合成或重组的分子、多肽、肽、经修饰的肽或蛋白质、脂质、糖蛋白或其他天然或非天然形成的分子、其变体、衍生物或类似物。备选地，可以使用诸如DNA(gDNA,cDNA)，RNA(正义RM，反义RNA，mRNA，tRNA，rRNA，小干扰RM(SiRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微小RNA(miRNA)，小核仁RNA(SnoRNA)，小核(SnRNA)核酶，适体，DNA酶或其他核糖核酸酶类型的复合体之类的基因制剂。根据本发明上述方面的制剂可以直接与Bel-x"》c7-x，Bak，Ai，Bax或Ai相互作用。因此，可以方《更地^f吏用(例如)抗体或肽、寡糖、折叠体、拟肽物质或类似物，并且可以方便使用的其他此类的生物分子。备选地，可以采用基因机制间接调控Bel-x""c/-i,Bak，Ai:，Bax或^^的活性。此外，多种策略和反应剂都^皮充分地记载，并且包括了用于转录前或转录后沉默的机制。本发明特别考虑了反义分子的表达或共抑制、或者RNAi或siRNA或shRNA或DNA本发明还考虑了适体。在多种应用中，RNA和DNA适体可以代替单克隆抗体(Jayasena，Clin.Chem.，W(9):1628-1650，1999;Morrisa人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，夕i"(6):2902-2907，1998)。适体为核酸分子，其具有通过除了传统的Watson-Crick碱性。适体在(例如)美国专利No.5，475，096;5，270，163;5，589，332;5，589，332;和5，741，679中有所描述。已经通过SELEX研发出的识别其非核酸靶标的DNA和RM适体的数量逐渐增多，并且已经表征(Golde"/.,A麵.Rev.Biochem.，"763-797.1995;Bachere"人，DrugDiscoveryToday,J(6):265-273，1998)。在一些实施方案中，如上文所述，调控Ac/i或&1或化i基因、或者Bel-x或Bak或Bax多肽的水平或活性的制剂可以4汙生自Bcl-x，5c7-i，Bak或5ai:，Bax或5"或者为它们的变体。备选地，它们可以在体外或体内篩选中被识别。天然产物、结合性合成的有机或无机化合物、肽/多肽/蛋白质、核酸分子和文库、或噬菌体、剂。天然产物包括得自珊瑚、土壤、植物、海洋或南极环境中的那些。可以特异性地乾向或筛选Bel-2家族成员的多个结构域，例如Bcl-2同源结构域，促细胞凋亡或促存活Bcl-2家族多肽的BH1，BH2，BH3或BH4结构域。在一些实施方案中靶向，Bcl-2蛋白质的BH3结合域或者Bak或Bax蛋白质的Bc卜2结合域。在其他实施方案中，可以乾向BH1或BH1结构域。备选地，可以草S向目标蛋白质的独特区域，从而提供更高的选择性。因此，在一些实施方案中，考虑了使血小板中Bc1-Xl的失活的Bak或Bax的变体。在一些实施方案中，将待测试的制剂与包含Bc1-&，Bak或Bax多肽或肽、或者万c/-;r，^ir或^x基因序列的系统接触。然后，测试以下方面制剂与靶标之间的复合体的存在情况；靶标活性的变化情况；或者靶标活性指示剂的活性水平的变化情况。竟争性的结合测试以及其他高通量的筛选方法在本领域中是公知的，并且在(例如)国际公开No.W084/03564和W097/02048中有所描述；Bcl-xL结合分子在(例如)W02002/072761中有所描述。在一些实施方案中，Bel-Xl可用作Bak和/或Bax的竟争性结合剂。在其他实施方案中，Bak和/或Bax可用作Bel-Xl的竟争性結合刑。在另一实施方案中，细胞测试被用于鉴定保持血小板生存能力的化合物。这些方法包括在待测试化合物存在下，温育对细胞凋亡诱导制剂敏感的细胞；然后将所述细胞与细胞凋亡诱导制剂接触；并测定未发生细胞凋亡的活细胞的存在情况。在一些实施方案中，所述的细胞对一种或多种Bcl-2家族成员(例如包括Bcl-2，Bc1-Xl，Bcl-w,Mcl-1和Al)的拮抗剂(例如BH3结构域模拟制剂)是敏感的。在其他实施方案中，所述的细胞对Bc卜Xl或Mcl-1的拮抗剂是敏感的。在另一实施方案中，所述Bcl-XL的拮抗剂为ABT-737。在一些实施方案中，所述的细胞为血小板或成纤维细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))。在优选的实施方案中，所述的细胞为这样的细胞，其中Mcl-l或Bcl"^的水平或活性部分地或完全地受到负调节，这是由本领域已知的方法形成的。在一些实施方案中，采用化学、基因或基因沉默(RNAi)的方法对Mcl-1或Bcl-XL的水平进行负调节。例如，可使用CDK抑制剂(例如R-细胞周期蛋白依赖激酶))或蛋白质合成抑制剂(例如环己酰亚胺)可以降低Mcl-l的水平。基因策略包括通过缺失全部或部分的基因、或者通过将外源DNA插入到基因中、或者通过使用外源启动子来表达转基因，从而形成功能等位基因的损失。还可以使用条件突变体技术。基因沉默提供了用于抑制基因功能的方便的程序。Mcl-l反义寡核苷酸在(例如)国际公开No.W02006/099667中有所描述，该文献全文并入本文。使用ABT-737或等效的BH3结构域模拟制剂可以方便地减少Bc1-xl的水平或活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供了鉴定可以保持血小板生存能力的化合物的方法，该方法包括在待测试化合物存在下，温育对Bcl-Xt或Mcl-l的拮抗剂敏感的细胞；将所述的细胞与Bcl-xt或Mcl-l的拮抗剂接触；以及测定活性细胞的存在情况，该存在情况表明所述的化合物能够阻断由Bel-xt或Mcl-1的拮抗剂诱导的细胞死亡并保持细胞的生存能力。在另一实施方案中，所述Bcl-x^的拮抗剂为ABT-737或者其类似物。在一些实施方案中，对Bel-&的拮抗剂敏感的细胞为Mcl-l缺陷型细胞。在其他实施方案中，对Mcl-1的拮抗剂敏感的细胞为Bel-Xl缺陷型細胞。然后，对经过初步篩选所鉴定的化合物进行测试，从而测定它们对靶标的作用。例如，在Mcl-1棵细胞且Bax棵细胞以及Mcl-1棵细胞且Bak棵细胞中测试化合物，从而证明所述的化合物通过Bax或Bak或者其他的下游乾标起作用。如果需要的话，接着按照所述的方式对其他的下游靶标进行测试。在一个实施方案中，考虑了筛选可以增强血小板和/或其他哺乳动物细胞的存活、寿命期或生存能力的分子的方法，该方法包括(i)将所述的分子与细胞结合；(n)将所述的细胞与一种或多种能够拮抗细胞中促存活Bcl-2家族分子并诱导细胞凋亡的制剂接触；(iii)相对于对照，测定在所述分子存在下细胞的存活(生存能力、寿命期、半衰期)的变化情况；以及(iv)选择能够增强细胞存活(生存能力、半衰期)的分子。在一些实施方案中，所述的方法包括将得自(iv)中的所选分子与血小板结合，从而相对于对照，测定在所述分子存在下血小板的细胞存活(生存能力、半衰期)的变化情况。在其他实施方案中，所述的方法包括将得自(iv)的所选分子与靶类型的细胞结合，从而相对于对照，测定在所述分子存在下细胞的细胞存活(生存能力、半衰期)的变化情况。在另一实施方案中，考虑了用于筛选能够调控细胞的细胞凋亡的分子的方法，该方法包括(a)将所述的分子与所述的细胞结合；以及(b)鉴定所述细胞的Bcl-2家族蛋白质的调控情况，其中Bcl-2家族蛋白质的调控表明所述的分子调控了所述细胞的细胞凋亡。在另一实施方案中，考虑了筛选能够调控钿胞的Bcl-2家族蛋白质的分子的方法，该方法包括(a)将所述的分子与所述的细胞结合；以及(b)鉴定所述细胞的细胞凋亡是否被调控，其中细胞凋亡的调控表明所述的分子调控了Bel-2家族蛋白质。在一些实施方案中，本发明的方法在步骤a)和b)之间进一步包括对所述的细胞进行处理以诱导细胞凋亡的步骤。所述的细胞可以用能够降低Bcl-2蛋白质家族的促存活成员(例如Bel-Xl和/或Mcl-l)的水平和/或活性的制剂进行处理。在一些实施方案中，所-2蛋白质家族的促细胞凋亡成员(例如Bak和/或Bax)的水平和/或活性的制剂进行处理。在一些其他的实施方案中，在步骤a)的细胞中，降低了至少一种Bcl-2家族促存活成员的水平和/或活性。在步骤a)的细胞中，可以降低Bcl-2家族(选自Bc1-Xl，Bcl-2，Bc卜w，Mcl-l，Al和Bcl-B)1至6个成员之间的水平和/或活性。可以降低Bc1-Xl和/或Mcl-l的水平和/或活性。在一些实施方案中，在步骤a)的细胞中，降低了至少一个Bcl-2蛋白质家族促细胞凋亡成员的水平和/或活性，例如，可以降低Bak和/或Bax的水平和/或活性。在示意性的实施方案中，降低了Mcl-l和Bak的水平和/或活性。在其他实施方案中，降低了Mcl-1和Bax的水平和/或活性。在一些实施方案中，所述的方法在体外进行。在其他实施方案中，所述的方法在体内进行。高通量的筛选方案被广泛使用，例如在Geysen中所述的那些(国际公开No.W084/03564)。简而言之，在固体基底(例如塑料针或一些其他的表面)上合成大量的(例如)小肽测试化合物。通过多种方法检测结合的多肽。与在珠子上合成肽(其形成了肽文库，其中每个珠子都为单个的文库成员)有关的类似方法在美国专利No.4,631,211中有所描述，并且相关的方法在国际公开No.W092/00091中有所描述。基于珠子的方法的明显改进涉及使用独特的鉴定标记(例如寡核苷酸或电泳标记)来标记每个珠子，从而有利于各文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些经改进的基于珠子的方法在国际公开No.W093/06121中有所描述。另一种化学合成篩选方法涉及在表面上合成肽(或者拟肽物质)的阵列，其中在所述的阵列中，各种独特的肽序列均位于分开的并且是预定的位置处。各文库成员的特性通过其在阵列中的空间位置来鉴定。在其中预定分子与反应性文库成员之间发生结合相互作用的情况下，测定处于所述情况下的阵列中的位置，由此，基于空间位置测定反应性文库成员的序列。这些方法在美国专利No.5,143,854;国际公开No.WO90/15070和WO92/10092;以及Fodoreta人，Science,767，1991中有所描述。能够使核酸与其表达的多肽相连的显示系统是特别有用的。用于分离大型文库的所需成员的选择方案在本领域中是已知的，其可以由噬菌体表达技术来代表。其中多种肽序列表达于纤维状噬菌体的表面上的此类系统可用于创建抗体片段(以及编码该抗体片段的核苷酸序列)的文库，从而用于体外选择和扩增与靶抗原结合的特异性抗体片段。将编码Vh和、区域的核苷酸序列与编码前导信号(其指导所述的核苷酸序列进入到Aco//的外周原生质空间中)的基因片段相连，并且所得的抗体片段(其通常与噬菌体外壳蛋白质(例如pin或pvni)融合)被表达于噬菌体的表面上。备选地，抗体片段表达于x噬菌体衣壳(噬菌体)的外表上。基于噬菌体的表达系统的优点在于，可以通过使包含细菌细胞中的所选文库成员的噬菌体进行生长来简便地扩增所选的文库成员。此外，由于编码所述多肽文库成员的核苷酸序列被包含在噬菌体或噬菌体载体中，所以测序、表达和随后的基因操作均相对简单。相应的技术被用于小型有机分子的结合性文库中。已经测定出Bcl-xt，Bak和Bax的三维结构，这有助于^:计调控细胞凋亡的结合制剂。对Bcl-x^和/或Bak和/或Bax或这些分子中每一个的变体、衍生物或类似物的一个或多个结合位点的结构进行三维重视，以根据形状、反应性、电荷电位等鉴定顺利相互作用或结合的相互作用分子。在优选的方面中，技术人员可以篩选化合物的三维结构数据库，从而鉴定出具有与一个或多个结合位点相拟合的官能团的那些化合物。可以围绕这些结构来形成结核性化学文库，从而鉴定出对Bc1-Xl，Bak和/或Bax结合位点具有高的结合亲和性的化合物。然后，在拟合操作中，使用(例如)Docking软件程序将通过筛选化合物的数据库或文库而鉴定得到的制剂与Bc卜Xl，Bak和/或Bax结合位点的三维重视图拟合。"在生物信息学中"，可以在潜在的调控剂的实际合成和测试之前，针对其结合Bcl-x^Bak或Bax活性位点的能力，对该调控剂进行评价。可以通过(例如)形状的互补程度(通过对相互作用的能量进行估计)来评估与多个位点结合的所述实体的拟合性质(Menge"/.，J.Corap.Chem.，"505-524，1992)。与细胞凋亡途径的成分(包括Bc1-Xl和/或Bak和/或Bax)相关联的化学实体的设计通常涉及考虑两个因素。以考虑Bel-Xl和Bak作为实例，所述的化合物必需能够在物理和结构上与Bel-a或Bak相关联。在Bel-x^或Bak与其相互作用的伴侣的结合中起重要作用的非共价分子相互作用包括氢键、范德华和疏水相互作用。第二，所述的化合物必需能够呈现允许其与Bcl-^或Bak结合的构象。虽然，所述化合物的某些部分没有直接参与到与Bcl-x^或Bak的这种结合中，但是这些部分仍可以影响所述分子的整体构象。所述的构象要求包括整体三维结构、以及化学实体或化合物相对于所有活性位点或部分活性位点的取向，或者包含多个化学实体(其直接与Bcl-x^或Bak相互作用)的化合物的官能团之间的间隔。如上所述，一旦以最佳方式选择或设计出结合化合物，接着就可以在其一部分原子或侧基中进行取代从而改善或修饰其结合性质。通常，初始取代是保守性的，即，替换基团具有与原始基团大约相同的尺寸、形状、疏水性和电荷。当然应该理解的是，应该避免本领域已知的会改变构象的成分。通过一系列步骤，可以以计算方式评价和设计推定的结合制剂，其中在所述的步骤中，针对化学实体或片段与一个或多个结合位点结合的能力来对其进行篩选和选择。然后，将所选的片段或化学实体以多种取向定位，或者"空间对接，，到目标结合位点中。可以使用诸如QUANTA和SYBYL之类的软件、然后通过利用了标准的分子力学场(例如CHARMM或AMBER)的能量最小化和分子动力学来完成空间对接。专业计算机程序可用于选择所关注的片段或化学实体。这些程序包括(例如)GRID(牛津大学，Oxford,UK),5MCSS(分子模拟机构，USA),AUT0D0CK(斯克里普斯研究所，USA),DOCK(加州大学，USA),XSITE(伦敦大学学院，UK)和CATALYST(Accelrys)。帮助技术人员关联化学实体或片段的有用的程序包括CAVEAT(加州大学，USA)，3D数据库系统和H00K(分子模拟机构，USA)。新的配体设计方法包括在LUDI(分子模拟机构，USA),LEGEND(分子模拟机构，USA),LeapFrog(Tripos公司)SPROUT(利兹大学，UK)等中所描述的那些。基于结构的配体设计在本领域中是公知的，并且有多种策略可以利用，这些策略可以建立在结构信息上从而测定可以有效调控细胞凋亡途径中多种成分(包括Bcl-x"Bak或Bax)活性的配体。分子建模技术包括在Cohene"7.，J.Med.Chem.，組-<W，1990，和Naviaa/.,CurrentOpinionsinStructuralBiology,2:202-2101992中所描述的那些。可以使用标准的同源建模技术以便测定未知的三维结构或分子复合体。同源建模涉及使用一种或多种相关蛋白质分子、其分子复合体或部分的结构坐标来构建未知结构的模型。可以通过针对已知分子中同源结构元件的三维结构对其三维结构有待解析的蛋白质的共同部分或同源部分进行拟合，来进行同源建模。可以利用氨基酸序列的特性、同源二级结构元件和/或同源三级折叠来确定同源性。同源建模可以包括使用其相关结构有待解析的那些结构中的氨基酸残基(或其他成分)进行替换来重建部分或全体三维结构。利用这些三维结构，研究者鉴定出推定的结合位点，随后鉴定或设计出与所述的结合位点相互作用的制剂。然后，针对对目标分子的调控效果来篩选这些制剂。在一些实施方案中，对结合制剂进行设计，使其结合的变形能不大于约10kcal/mole，更优选的是不大于7kcal/mole。可以利用计算机软件来评价化合物的变形能和静电相互作用。所述的软件例如有Gaussian98，AMBER，QUANTA,CHAR醒，INSIGHTII，DISCOVER,AMSOL和De脂。可以使用本领域的技术人员已知的高通量技术来形成和筛选小型有机分子库。例如，参见美国专利No.5，763，263和美国申请No.20060167237。结合性合成提供了有用的方法，其中合成了非常多的相关化合物，这些化合物在母结构的共同结构或亚结构中具有不同的取代。此类化合物通常为非寡聚体，并且在它们的基础结构和功能中是相似的，而在(例如)链长、环的大小或取代的数量或模式方面是不同的。如上文所述，还可以构建虛拟库，并且在本领域已知的生物信息学(例如参见美国申请No.20060040322)或者体外或体内测试中对多种化合物进行测试。在另一个方面中，所述的制剂可衍生自核酸分子。关于万c/-x，^i或^i基因的核苷酸序列，术语功能形式或变体、功能等价衍生物或同源物包括这样的分子，该分子在定义温度下或在一定范围的条件下，在中度或高度严谨的条件下，在全部或部分的基因分子上，与"c/i，Air或化i基因或其互补形式选择性杂交，或者该分子与定义了Sc7-i，&1或^3z基因的核苷酸序列具有大约60%至90%或98%的序列一致性。示意性的"c7i或5si:核苷酸序列包括具有SEQIDNO:1或5或它们的互补物或校正形式(小鼠或人5c/-amRNA)所列的、以及SEQIDNO:3或7(小鼠或人&1mRNA)或它们的互补物或才交正形式所列的核苷酸序列的那些。示意性的^z核苷酸序列包括具有SEQIDNO:9或它们的互补物或校正形式所列的核苷酸序列的那些。但是，为了避免被质疑，应该注意术语'？c/-i基因"或""ai:基因"或"&,基因"清楚地涵盖了包含调节区域在内的所有形式的基因，其中所述的调节区域例如有表达编码序列所需的那些区域、以及包含探针和引物在内的基因组形式或特异性的片段、以及包含所述片段或其部分的构建体、以及cDNA或RNA以及它们的一部分。术语"功能形式"或"变体"、"功能等价衍生物"或"同源物"包括具有这样的氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQIDNO:2，4，6,8或10所示的Bc1-Xl或Bak或Bax多肽具有大约60%的序列一致性。示例性的Bcl-x或Bak氨基酸序列包括具有SEQIDNO:2(小鼠Bcl-xJ，SEQIDNO:4(小鼠Bak)，SEQIDNO:6(人Bcl-xJ或SEQIDNO:8(人Bak)所列序列的那些。示例性的Bax氨基酸列于SEQIDNO:10(人Bax)中。本文所述的"中度严谨，，包括并涵盖了至少约16v/v。/。至至少约30v/vy。的曱酰胺和至少约Q.5M至至少约G.9M的盐用于杂交，以及至少约0.5M至至少约0.9M的盐用于洗涤条件，或者高度严谨，其中所述的高度严谨包括并涵盖了至少约31v/v。/。至至少约50v/v%的曱酰胺和至少约0.01M至至少约0.15M的盐用于杂交，以及至少约0.OIM至至少约0.15M的盐用于洗涤条件。通常，洗涤是在Tm-69.3+0.41(G+C"/。下进4亍的(Marmur"".,J.Mol.Biol.，109，1962)。但是，错配碱基对的数量每升高1%，双链体DNA的L就会降低1°C(Bonnerefa/.,Eur.J.Biochem.，^!'83，1974)。在上述杂交条件下，甲酰胺是可任选的。因此，特别优选的严谨水平定义如下低度严谨为6xSSC緩沖剂，0.1%w/vSDS,25-42°C;中度严谨为2xSSC緩冲剂，0.1%w/vSDS,在20'C至65。C的范围内；高度严谨为0.1xSSC緩沖剂，0.1%w/vSDS，至少65。C的温度。在一些实施方案中，编码Bcl-xt或Bak多肽的核酸分子包含SEQIDNO:1，3，5，7或9所列的核苷酸序列，或者为在中度或高度严谨的杂交条件下与其杂交或其互补形式的核苷酸序列。优选的是，所述的杂交区域为长度约12至约80或更多的核碱基。更优选的是，在特定核苷酸序列和参照序列之间的百分一致性为约60%、或65%、或约70%、或约80%、或约85%,更优选的是为约90%的相似性，或者大于约95%、96%、97%、98%、99%或更高的相似性。在60%至100%之间的百分一致性被涵盖在本发明的范围内。"参照序列"为长度为至少12、但往往为15至18并且通常为至少25或更多(例如30个)的单体单元(包括核苷酸和氨基酸残基)。由于两种多核苷酸均可以包含(1)在两种多核普酸之间相似的序列(即，仅是完整多核苷酸序列的一部分)；以及(2)在两种多核苷酸之间是不同的序列，所以通常通过在"对比窗口"上比较两种多核普酸的序列来进行两种(或多种)多核苷酸之间的序列比对，从而鉴定和对比出序列相似的局部区域。"对比窗口"是指用于与参照序列进行比较的通常为12个连续残基的概念性节段。与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，所述的对比窗口可以包含约20%或更少的添加或缺失(即，间隙)，从而使两种序列达到最佳的比对。可以通过计算机化地运行算法(GAP，BESTFIT，FASTA,以及在theWisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI，USA)或者通过检查以及采用所选多种方法中的任意一种方法而形成的最佳比对(即，在对比窗口上所得的同源性百分比达到最高)来进行用于比地对比窗口的序列的最佳序列比对。还可以参照在(例如)Altschul"a人，Nucl.AcidsRes.",3389,1997中所公开的BLAST系列的程序。序列分析的详细讨论可以在Unit19.3ofAusubela/.,C"ive/7f/Vc^oco/s//#o/ecu/arA/o/c^jJohnWiley&SonsInc，1994-1998，Chapter15)中找到。例如，核苷酸序列之间的序列一致性百分率可通过以下过程计算得到，所述的过程为在对比窗口上比较两个最佳排列的序列，测定其中在两种序列中都具有的一致的核酸碱基(例如A，T，C，G，I)的位置的数量从而得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以对比窗口(即，窗口大小)的位置总数，以及将所得的结果乘以100从而得到序列一致性的百分率。就本发明的目的而言，"序列一致性"应该被理解为"匹配百分率，，，其是使用了所述软件所附参考手册中使用的标准缺省的DNASIS计算机程序(Version2.5，用于windows操作系统；得自HitachiSoftwareengineering公司，SouthSanFrancisco,California,USA)而计算得到的。类似的注释适用于氨基酸序列的序列相似性。在一些实施方案中，本发明考虑了全长Bel-Xl或Bak或Bax、或者这些多肽的生物活性部分的用途。生物活性Bc卜Xl或Bak或Bax部分包含一个或多个结合结构域。全长多肽的生物活性部分可以为长度为(例如)4，5，6，7,8，9，10，11,12,13，14，15,16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，40，50，60，70，80，90，100，120，150，300或更多的氨基酸残基的多肽。本发明的Bel-Xl或Bak或Bax多肽包括包括所有生物活性或功能天然形成形式的Bcl-^或Bak或Bax、及其生物活性部分和这些蛋白质的变体或衍生物。例如，Bcl-x^或其功能变体(包括激动剂或拮抗剂)可以作为传递构建体(其被设计可以进行合适的细胞内靶向)的一部分以蛋白质的形式被传递至血小板。本发明还考了了所述的相互作用的分子的变体形式。"变体"多肽包括由天然蛋白质通过以下过程而衍生得到的蛋白质，所述的过程为在天然蛋白质的N末端和/或C末端缺失(也称为截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或者在天然蛋白质中在一个或多个位点处取代一个或多个氨基酸。本发明所涵盖的变体蛋白质为有生物活性的，即，它们仍具有天然蛋白质的至少一种生物活性。此类变体可以由(例如)基因多态性或通过人为处理得到。天然Bc卜x，Bak或Bax多肽的生物活性变体与天然蛋白质的氨基酸序列具有至少40%,50%,60%，70%，通常至少为75%，80%，85%,优选为约90%至95%或更高，并且更优选为约98%或更高的序列相似性，这可由本文其他处所述的序列比对程序使用缺省参数来测定得到。Be1-xL或Bak多肽的生物活性变体通常可以与所述的多肽具有多至100、50或20个不同的氨基酸残基，或者合适的具有少至1-15个不同的氨基酸残基，少至1-10个(例如6-10)不同的氨基酸残基，少至5个、少至4、3、2或甚至1个不同的氨基酸残基。可以通过多种方式(包括氨基酸取代、缺失、截短和插入)来改变Bcl-xt，Bak或Bax多肽/肽。用于这种处理的方法是本领域公知的。例如，可以通过向编码DM中引入突变来制备Bcl-x或Bak或Bax多肽的氨基酸序列变体。用于形成突变和改变核苷酸序列的方法是本领域乂^知的。例如参见Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《么488—492，1985)，Kunkela厶，(MethodsinEnzymol.，"4:367-382，1987)，美国专利No.4,873,192，Watson".("MolecularBiologyoftheGene",第四版，Benjamin/Cummings,MenloPark,Calif.，1987)，并且这些文献在本文中都有引用。关于合适的氨基酸取代(其不会影响所关注蛋白质的生物活性)的指导方法可以在Dayhoff等人的模型中找到(Natl.Bio齢d.Res.Found,5:345-358,1978)。用于筛选结合性文库(通过点突变或截短得到)的基因产物的方法、以及针对基因产物(其具有所选的性质)筛选cDM文库的方法是本领域已知的。此类方法适用于快速筛选通过多肽的组合突变形成而得到的基因文库。可以将递归整体突变(Recursiveensemblemutagenesis)(REM)法(一种增大文库中功能突变体频率的技术)与所述的筛选测试结合使用来鉴定有用的多肽变体(Arkin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,約7811-7815，1992;Delgravea/"ProteinEngineering,6327-331，1993)。如下文更加详细讨论的那样，保守性取代(例如一个氨基酸与另一个具有相似性质的氨基酸互换)是理想的。与参照氨基酸序列相比，变体Bc卜Xl，Bak或Bax多肽可以在沿着其序列的多个位置处包含保守性的氨基酸取代。"保守性的氨基酸取代"是指这样的取代，其中所述的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，这些氨基酸残基家族通常可以分为如下亚类酸性在生理学pH下，由于损失了H离子而使得残基具有负电荷，并且该残基被水性溶液所吸引，从而使得在肽处于生理学pH的水性介质中时，所述的残基会在包含该残基的肽构象中寻求表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。碱性由于在生理学pH下或者在其一个或两个pH单元(例如组氛酸)中残基与H离子结合而使得该残基具有正电荷，并且该残基被水性溶液所吸引，从而使得在肽处于生理学pH的水性介质中时，所述的残基会在包含该残基的肽构象中寻求表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电荷的在生理学pH下，残基带有电荷，因此该残基包括具有酸性侧链或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。疏水性在生理学pH下，残基不带电荷，并且该残基被水溶液所排斥，从而使得当肽处于水性介质中时，所述的残基会在包含该残基的肽构象中寻求内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。如本文所示，Bcl-Xt的BH4结构域中酪氨酸的取代或者Bcl-xt多肽的BH2结构域中异亮氨酸的损失会深刻改变该多肽的体内活化能力。中性/极性在生理学pH下，残基不带电荷，但是该残基不被水溶液完全排斥，这样当肽处于水性介质中时，所述的残基会在包含该残基的肽构象中寻求内部位置。具有中性/及性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。本说明书还将某些氨基酸表征为"小型"的，这是由于这种氨基酸的侧链不是足够大，从而使得其即使不具有极性基团，也能够赋予疏水性。脯氨酸是个例外，"小型"氨基酸是指当至少一个极极性基团没有位于侧链上时具有三个碳或更少的那些。具有小型侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。由于基因编码的二级氨基酸脯氨酸对肽链的二级构象的已知的影响，所以该脯氨酸是一种特殊的情况。脯氨酸的结构与所有其他天然形成的氨基酸不同，这是因为其侧链与a氨基以及ct碳的氮键合。但是，多种氨基酸的相似的矩阵(例如在如Dayhoffefs人，1978和byGonnet"".，Science,篇(5062):1443-1445，1992中公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)在与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸具有相同的基团中包含了脯氨酸。因此，就本发明的目的而言，脯氨酸被归类为"小型"氨基酸。氨基酸残基还可以针对残基的侧链取代基而进一步分为以下亚类环状或非环状、以及芳香族或非芳香族这些自我说明的类别，并且可以分为小型或大型的亚类。如果残基共包含4个碳原子或更少(羧基碳也包含在内)，则认为该残基为小型残基，前体条件是存在其他极性取代基；如果不存在其他极性取代基，则碳原子总数为3个或更少的残基被认为是小型残基。当然，小型残基通常为非芳香族的。根据氨基酸残基的结构性质，该氨基酸残基可能分为两个或多个类别。针对天然形成的蛋白质氨基酸，根据所述方案的亚类示于表2中。保守性的氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族幾基側链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰氨基侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和蛋氨酸。例如，合理地认为使用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、使用谷氨酸取代天冬氨酸、使用丝氨酸取代苏氨酸、;斤得变体多肽的性质产i较大影响:i否氨基酸变化会产生有功能的Bel-Xl或Bak多肽可以容易地通过检测其活性来确定。可以容易估计的活性是技术人员已知的，并且包括用于测定结合情况或者二聚或寡聚化情况(通过(例如)Biacore、动力学、亲和性和下拉分析检测)的测试。保守性的取代示于示例性取代标题下的表3中。更优选的取代示于优选取代的标题下。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过以下过程完成，所述过程为选择在保持(a)取代区域中肽主链的结构、(b)在靶位点处分子的带电性或疏水性、或者(c)侧链的体积的作用上没有显著差异的取代。在引入取代之后，针对生物活性篩选变体。备选地，可以根据侧链的特性，将用于进行保守性取代的相似氨基酸归入三个类别中。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，它们都具有带电的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay，G.，Biochemistry,thirdedition,Wm.C.BrownPublishers(1993)中所述。因此，Bc卜i或Bak多肽中所预计的非必需氨基酸残基通常被得自相同侧链家族中的另一种氨基酸残基替换。备选地，可以通过(例如)饱和突变形成沿着多核苷酸编码序列的全部或部分随机引入突变，并可以针对亲代多肽的活性筛选所得的突变体，从而鉴定出保持所述活性的突变体。在编码序列中突变形成后，可以以重组方式表达所编码的肽，并且可以测定所述肽的活性。因此，本发明还考虑了天然形成的Bcl-xL,Bak或Bax等肽序列或者它们生物活性片段的变体，其中所述的变体通过一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代而与天然形成的序列不同。通常，变体显示出与(例如)在SEQIDNO:2，4，6,8或10的任意一项中所列的参照Bcl-Xt或Bak多肽序列具有至少约50，55，60，65，70，7580，85，90，91，92，93,94，95，96，97，98，99%的一致性。此外，本发明考虑了这样的序列，该序列通过l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18,19,20，30，40，50或更多氨基酸的添加、缺失或取代而与天然或亲代序列不同，但是该序列保留了参照Bcl-xt或Bak多肽的某些性质。本发明的变体Bc1-Xl,Bak，Bax多肽还包括这样的多肽，该多肽由在本文所述的严谨条件下(特别是在高度严谨条件下)与A^i:或""多肽序列杂交的多核苷酸或其非编码链编码。在一些实施方案中，变体多肽与Bcl-x"Bak或Bax多肽序列具有至少1个但少于50，40，30,20，15，10，8，6，5，4，3或2个不同的氨基酸残基。在另一实施方案中，变体多肽与SEQIDNO:2，4，6，8或10的任意一项中所示的相应序列具有至少1%但少于20°/。，15°/，10%或5%不同的残基。如果这种比较需要进行比对，则应该将多个序列排列成具有最大的相似性。(认为得自缺失或插入、或者错配的"环凸"序列是不同的。)在一个实施方案中，所述的不同为在非必需残基或保守性取代处的差异或变化。对得自多种哺乳动物物种的Bc1-Xl，Bak或Bax蛋白质进行的序列比对用于证明保守的残基。"非必须"氨基酸残基为这样的残基，该残基是由实施方案的多肽的野生型序列改变得到，但没有破坏或实质上改变该多肽的一种或多种活性。合适的是，所述的改变没有实质性地改变所述活性中的任何一种活性，例如，所述的活性为野生型的至少20%，40%,60%70%或80%。"必需"氨基酸残基为这样的残基，当该残基由本发明多肽制剂的野生型序列改变得到时，存在这样的结果，亲代分子的活性被破坏，其活性不到野生型活性的20%。在其他实施方案中，变体多肽包括这样的氨基酸序列，该氨基酸序列与由(例如)SEQIDNO:2，4，6，8或10所列多肽的相应序列具有至少约50%，55%,60%，65%,70%,75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%95%，96%,97%，98%或更高的相似性，并且变体多肽具有Bc卜Xl，Bak或Bax多肽的至少一种活性。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的过程制备多肽制剂。例如，所述的多肽可以通过包括以下步骤的过程制备，所述的步骤为(a)制备包含核苷酸序列的嵌合构建体，其中所述的核苷酸编码了Bcl-xl，Bak或Bax多肽或其功能变体中的至少一部分，并且可操作地与一个或多个调节元件连接；(b)将所述的嵌合构建体引入宿主细胞；(c)培养所述的宿主细胞使其表达Bcl-XL，Bak或Bax多肽或它们的变体；以及(d)由所述的宿主细胞中分离出Bc1-Xl，Bak或Bax多肽或这些多肽中的任意一种多肽的变体。在示意性的实施例中，所述的核苷酸序列编码了SEQIDNO:2，4，6，8或10中所列序列或它们的变体的至少一部分。可以使用在(例如)Sambrook,e"7.，(1989，supra),特别是第16和17部分；Ausubele"入，(1994supra)，特别是第10章和16章；以及Coligan，CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE(JohnWiley&Sons,Inc.1995-1997),特别是第1、5和6章中所述的标准方案方便地制备重组多肽。备选地，多肽制剂可以通过化学合成方法合成，所述的化学合成方法例如为采用在(例如)AthertonandShephard(sw;ra)的第9章以及在Robergeefa/,,(Science,^f义202，1995)中所述的溶液合成方法或固相合成方法。构象限制性肽的合成在(例如)国际公开No,WO2004106366中有所描述。术语"衍生物，，和"变体"可以互换使用，并且不论涉及基因分子还是蛋白质分子，所述的那些术语都包括突变体、片段、类似物以及杂交体、嵌合体或融合分子和糖基化变体作为合适的部分。特别有用的变体保留了亲代分子的功能活性，并且具有位于Bcl-札Bak或Bax氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。优选的是，所述的变体具有功能活性，或者备选地，所述的变体调控了Bc卜Xl，Bak或Bax的功能活性。如本文所述，^c/-i，"ai:或^;r基因的局部、部分或片段^皮定义为具有至少约10个核苷酸、优选的为约13个核苷酸或者更优选的为至少约20个核苷酸的最小尺寸，并且可以具有至少为约35个核苷酸的最小尺寸。所述的定义包括10至35个、以及大于35个核苷酸范围内的所有尺寸。因此，所述的定义包括这样的核酸，该核酸分子具有12，15，20，25，40，60，1QQ，200，500个核苷酸，并且具有500至由SEQIDNO:1，3，5，7或9或其补体形式所示数量之间的任何数量的核苷酸。对于Bcl-XL，Bak或Bax多肽的局部、部分文献。取代的变体通常在所述蛋白质内的一个或多个位点处包含一个氨基酸与另一个氨基酸的互换，并且可以被设计成对抗蛋白水解的裂解来调控所述多肽的一种或多种性质(例如稳定性)，而不会使其他功能或性质造成损失。可以基于所涉及残基在极性、带电性、溶解性、疏水性、亲水性和/或良性性质方面的相似性来进行氨基酸取代。优选的取代为这样的取代，该取代是保守性的，即，一个氨基酸被相似形状和电荷的另一种氨基酸替换。保守性的取代是本领域公知的，并且通常包括在以下范围内的取代甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及酪氨酸、苯丙氨酸。在蛋白质结构中，可以在多种结构的相互结合能力没有发生明显损失的情况下用其他氨基酸取代某些氨基酸，其中所述的多种结构例如有抗体的抗原结合区域、底物分子上的结合位点或者在与所述多肽发生相互作用的蛋白质上的结合位点。正是由于蛋白质的相互作用能力和性质定义了蛋白质的生物功能活性，所以可以在蛋白质序列及其相应的DNA编码序列中进行某些氨基酸的取代，并仍获得具有相似性质的蛋白质。在进行这些变化的过程中，可以考虑氨基酸的亲水性指数。在赋予蛋白质以相互作用的生物学功能过程中，疏水氨基酸指数的重要性通常被本领域所理解(KyteWa7.,J.Mol.Biol.,JJ7.'105-132，1982)。备选地，可以根据亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。在赋予蛋白质以相互作用的生物学功能过程中，亲水性的重要性通常被本领域所理解(美国专利No.4,554,101)。疏水指数或亲水性在设计多肽中的用途在美国专利No.5，691，198中有进一步的讨论。已经鉴定出多种Bcl-2蛋白质的3-D结构。术语"同源物"在本文中广泛地指功能或结构相关的分子，包括得自其他物种的那些。例如，已经描述了起拮抗剂Bel-2作用的Bcl-2多肽的病毒同源物(White,CellDeathandDifferentiation,":1371-1377，2006)。本文中所参考的"模拟物"包括碳水化合物、核酸或肽模拟物，并且该术语意指这样的物质，该物质具有允许该物质作为功能类似物来发挥作用的构象特征。肽模拟物可以为模拟了蛋白质二级结构元件的含肽分子(JohnsonWW.,〃户ep〃f/e7w/77#/迈6〃"〃^/ofec/w3o/c^7a/2d户/ar鹏c/,尸ezzwfoa/.,edsChapmanandHall,NewYork,1993)。肽模拟物可以通过针对模拟了Bcl-2多肽功能活性的肽分子来筛选随机的肽文库(例如噬菌体表达或结合性文库)而鉴定得到。备选地，可以使用模拟物设计、模拟物合成和模拟物测试。通过蛋白质对碳水化合物和脂质的识别在许多生物系统中是重要的事件，并且基于碳水化合物和/或脂质模拟物(其可以破坏特异性的识别过程)的化学疗法的发展成为快速出现的领域。核酸模拟物包括(例如)含有N3'--P5'氨基磷酸酯核苷酸间键(其替代了天然形成的RNA03'—P5'磷酸二酯基团)的RNA类似物。酶模拟物包括催化抗体或它们的编码序列(其还可以为人源化的)。可以通过鉴定出乾分子的所述残基(其对于功能而言是重要的)将肽或非肽模拟物作为Bcl-x^Bak或Bax的功能类似物来形成。建模技术可用于设计能够与靶分子相互作用并且能够改善药理学性质的分子。合理性药物设计允许形成所关注生物活性多肽的结构类似物或者形成小分子的结构类似物，使它们(例如激动剂、拮抗剂、抑制剂或增强剂)与所述的结构类似物相互作用从而塑造出这样的药物，该药物(例如)为所述多肽的更有活性或更稳定的形式，或者(例如)能够在体内增强或干扰多肽的功能。例如参见Hodgson(Bio/Technology，义.19-21,1991)。在一种方法中，人们首先要通过NMR光i脊法、x-射线结晶法、计算机建模或者最通常的是通过多种方法的组合来测定所关注蛋白质的三维结构。关于多肽结构的有用信息还可以通过基于同源蛋白质的结构进行建模来获得。此外，可以通过丙氨酸扫描法来分析推定的肽或多肽制剂(Wells,MethodsEnzymol.，M么'2699-2705，1991)。在这种技术中，氨基酸残基被Ala替代，并测定对所述肽的活性所产生的影响。以这种方式分析所述肽的每一个氨基酸残基，从而测定所述肽的重要区域。考虑该模拟物针对唯BH3蛋白质模拟物结合Bc1-Xl的疏水槽并由此防止Bc1-Xl抑制Bak功能的能力。例如，如在W02006/002474中所公开的那样，苯甲酰脲衍生物提供了用于与Bc卜2多肽进行相互作用的ct螺旋拟肽物质的构架。在另一实例中，三联苯衍生物提供了BakBH3结构域的oc螺;旋拟肽物质，如YinWaA，2005(swpra)所述。此外，还可以分离出通过功能测试方法选择的靶标特异性抗体，然后解析其晶体结构。原则上，这种方法形成了药物核心，随后基于所述药物核心进行药物设计。可以通过针对功能型药理学活性抗体来形成抗独特型抗体(抗-ids)从而完全绕过蛋白质晶体学。作为镜像的镜像，希望抗-ids的结合位点为原始受体的类似物。然后，可以使用抗-ids来由化学或生物学方法形成的多种肽库的库中鉴定并分离多种肽。然后，将所选的肽作为药物核心。简而言之，可以设计或筛选出这样的模拟物，该模拟物具有增强的活性或稳定性，或者可以以更容易和/或更经济的方法得到。在一些实施方案中，多种类似物具有增强的稳定性和活性，或者具有减小的不利的药理学性质。还可以对类似物进行设计，使得它们具有增强的穿越生物膜或仅与特异性底物相互作用的能力。因此，类似物可以保留一些亲代分子的功能特征，但是可以具有改进的特异性或者能够实施用于本发明(即，用于向受试对象进行施用)的新的功能。在另一方面中，考虑了激动剂或拮抗剂的类似物。本文所考虑的肽或多肽制剂的类似物包括(但不限于)侧链的修饰，在肽、多肽或蛋白质合成过程中非天然氨基酸和/或它们的衍生物的掺入，交联剂的使用，以及对蛋白质分子或它们的类似物施加构象限制的其他方法。本发明所考虑的侧链修饰的实例包括通过以下方法的氨基的修饰，所述的方法例如有还原性烷基化，通过与乙醛反应，然后用NaB仏还原；使用甲基乙亚氨酸酯进行胺化；使用乙酸酐进行乙酰化；使用氰酸酯对氨基进行曱氨酰化；使用2，4，6-三硝基苯硫酸(TNBS)对氨基进行三硝基苯化；使用琥珀酸酐和四氢邻苯二曱酸肝对氨基进行酰化；以及使用吡喷醛-5-磷酸对赖氨酸进行吡啧化、然后用NaB出还原。精氨酸残基的胍基可以通过使用诸如2，3-丁二酮、苯曱酰曱醛和乙二醛之类的制剂形成杂环浓缩产物来进行修饰。羧基可以通过形成O-酰基异脲进行碳二亚胺活化来进行修饰，随后衍生形成(例如)相应的氨基化合物。巯基可以通过以下方法进行修饰，所述的方法例如有使用珙乙酸或碘代乙酰胺进行羧曱基化；将过甲酸氧化成磺基丙氨酸；使用其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺反应；使用4-对氯汞基苯曱酸盐、4-氯汞基苯基硫酸、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基酚和其他汞化物形成汞衍生物；在碱性pH下使用氰酸盐进行曱氨酰化。色氨酸残基可以通过以下方法进行^修饰，所述的方法例如有使用N-溴代琥珀酰亚胺进行氧化或者使用2-羟基-5-硝基苄基溴化物或硫苯基卣化物对p引味环进行烷基化。另一方面，酪氨酸残基可以通过使用四硝基曱烷进行硝化从而形成3-三硝基酪氨酸衍生物来改变。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过使用碘乙酸衍生物进行烷基化或者使用焦碳酸二乙酯进行N-乙氧羰化来完成。不限于)使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、乌氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-曱基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D异构体。本文所考虑的非天然氨基酸的列表示于表4中。交联剂可以用于(例如)稳定3D构象，可以使用同源双功能交联剂，例如具有(CH2)J'司隔基团的双功能酰亚胺酯，其中n-l至n=6;戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯；以及异源双功能制剂，该异源双功能制剂通常包含诸如N-羟基琥珀酰亚胺之类的氨基反应性部分以及诸如马来酰亚胺或二硫代部分(SH)、或者碳二亚胺(C00H)之类的另一种特异性反应性部分。此外，肽可以通过(例如)掺入Ca和N。-甲基氨基酸以及在氨基酸的C。和Ce原子之间引入双键来进行象造限制。考虑能够调控细胞凋亡的经构象限制的肽，例如在WO2006/00034中所述的唯BH-3蛋白质才莫拟物。因此，与Bcl-2蛋白质的疏水袋结合的分子的螺旋构象可以通过在序列中两个氨基酸残基之间共价键合的连接体来稳定。用于本发明的制剂(例如肽或者小型有机或无机分子、碳水化合物、脂质或核酸分子)可以容易地与靶向化合物缀合，从而允许直接将制剂传递至血小板或血小板前体。合适的靶向制剂是本领域的技术人员已知的，并且包括抗体或其抗原结合片段。抗体及其形成以及治疗是本领域的技术人员公知的。用于形成抗体的示例性方案在Coliganefa/"CurrentProtocolsinImmunology"(JohnWiley&Sons,1991)和Ausubel"a/"CurrentProtocolsinMolecularBiology"(1994-1998)中提供。抗体可以为多克隆或单克隆抗体、片段，包括免疫球蛋白分子的Fv，Fab，Fab'和F(ab02部分。可以方便地使用合成的Fv片段，包括根据(例如)美国专利No.5,091,513中所述而制备的合成的单链Fv片段。其他结合分子包括一个可变区结构域(称为dAb)，或者包含单链的微抗体(其包含在美国专利No.5，837，821中所公开的完整抗体的必需元件)。在其他实施方案中，抗原结合分子包含针对一个或多个抗原的多结合位点(例如多scFv)。在其他实施方案中，抗原结合分子为由非免疫球蛋白衍生的蛋白质框架，其具有针对特定抗原(例如血小板表面蛋白质部分)所选的互补决定区。在另一实施方案中，考虑了根据权利要求1至13的任意一项中所述的用于增强或保持血小板生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用一种制剂、或包含式1所示制剂的组合物、或包含选自图10所示制剂(a)至(d)中的一种制剂的组合物。因此，考虑将细胞凋亡抑制剂或细胞凋亡延迟制剂、或者包含这些制剂的组合物用于治疗或预防血小板减少，其中所述的制剂包含式1所列的结构。在另一实施方案中，考虑将细胞凋亡抑制剂或细胞凋亡延迟制剂、或者包含这些制剂的组合物用于增强储存的血小板的生存能力或存活，其中所述的制剂包含式1所列的结构。在另一实施方案中，题述制剂被用于保护用于移植的组织或器官的生存能力。通过本发明的方法鉴定的分子可以调控细胞凋亡。如本文所用，术语"调控"是指改变或调整。因此，细胞发生细胞凋亡的速率可以被改变或调整。细胞凋亡的速率可以增大或降低。即，可以使细胞的寿命更长或更短。备选地或此外，Bcl^蛋白质家族成员的水平和/或活性可以被调控，并且可以被增大或降低。即，可以使Bcl-2家族成员的水平和/或活性更大或更低。所述的分子可以直接或间接调控细胞凋亡和/或Bc卜2家族成员的水平和/或活性。例如，所述的分子可以与Bcl-2蛋白质家族成员结合。备选地，所述的蛋白质可以与另一种分子结合，其中所述的另一种分子反过来与Bcl-2蛋白质家族成员结合。例如，所述的分子可以间接调控细胞凋亡和/或Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性。小分子ABT-737为拮抗促存活Bel-Xl的BH3模拟药物。其选择性地靶向Bcl-2，Bc卜Xl和Bcl-w，但不会靶向其他促存活蛋白质Mcl-l或Al。备选地，所述的分子可以通过与Bel-2蛋白质家族下游的另一种分子(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)结合来调控细胞凋亡。所述的分子可以为Bcl-2蛋白质家族成员的激动剂或拮抗剂。如本文所用，术语"激动剂"是指提高不同分子的活性的分子。术语"拮抗剂"是指与另一种分子的作用相对抗的分子。因此，所述的分子可以对细胞凋亡和/或Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性进行正调节或负调节。力(特别是哺乳动物细胞的生存能力，例如在治疗或预防多种疾病)中具有一定的用途。在示意性的实例中，特别考虑了以下疾病细胞凋亡介导的疾病、细胞减少、炎性疾病、自体免疫疾病、破坏性骨病、增殖疾病、传染性疾病、变性疾病、与细胞死亡有关的疾病、酒精过量摄取疾病、病毒介导的疾病、葡萄膜炎、炎性腹膜炎、骨关节炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、血管球性肾炎、风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、Grave疾病、自体免疫胃炎、糖尿病、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性嗜中性白血球减少症、血小板减少、慢性活性肝炎、重症肌无力、炎性肠疾病、Crohn疾病、4艮屑病、特应性皮炎、瘢痕、移植物抗宿主疾病、器官移植性排斥反应、骨质疏松症、白血病和相关疾病、骨髓增生异常综合症、多发性骨髓瘤相关性骨疾病、急性髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病、转移性黑素瘤、Kaposi肉瘤、多发性骨髓瘤、失血性休克、脓血病、感染性休克、烧伤、志贺氏菌病、Alzheimer疾病、Parkinson疾病、Huntington疾病、朊毒病、脑缺血、癲痫症、心肌疾病、缺血病、急性和'隄性心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、动脉硬化症、冠状动脉旁路移植、脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化症、HIV相关脑炎、老化、脱发、由于中风而引起的神经损坏、溃疡性结肠炎、外创性脑损伤、脊髓损伤、曱型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、其他形式的病毒肝炎、药物(例如朴热息痛)诱导的肝病、黄热病、登革热、日本脑炎、肝病、酒精肝、肾病、多嚢肾病、幽门螺杆菌相关的胃和十二指肠溃疡疾病、HIV感染、肺结核、脑膜炎，以及治疗与冠状动脉旁路移植有关的并发症。更具体而言，通过本发明的方法鉴定的分子可用于保持器官的生存能力，所述的器官例如(但不限于)肾、心脏和心脏瓣膜、肺、肝脏、皮肤、角膜、血管和其他脉管、骨、腱和其他骨骼肌肉组织、胰腺、肠等。在一些实施方案中，如此鉴定的分子可用于延长患者或库存血液中血小板的存活、以及治疗或预防心肌梗塞、再灌注损伤、栓塞性中风，从而使神经组织的损失最小、预防在高剂量化疗和全身放疗之后的肠毒性(粘膜炎)、肝炎和其他形式的肝功能衰竭、以及导致组织损伤(例如类风湿性关节炎、贫血症、嗜中性白血球减少症、由于精子生存能力降低而导致的不育、以及由于黑素细胞损伤而导致的早年白发(用于头发色素细胞))的炎性疾病。在一些实施方案中，所述的细胞为除了血小板细胞以外的其他细胞。用于鉴定对Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性、和/或细胞凋亡的调控情况的细胞，以及待处理或其寿命期有待保持或增长的细胞可以为包含一种或多种Bel-2蛋白质家族成员的任何细胞(即，多细胞有机体中的任何细胞)。由于Bcl-2蛋白质家族成员或其同源物可以在诸如线虫、小鼠和人之类的有机体中找到，所以所述的细胞可以得自任何多细胞有机体。因此，所述的细胞可以得自人或者对于人而言具有经济重要性和/或社会重要性的哺乳动物，例如除了人以外的食肉动物(例如猫和狗)、猪类(家猪、公猪和野猪)、反刍动物(例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)、马、鸟(包括濒危的被保持在动物园中的那些种类的鸟)和家禽，并且更具体的驯养家禽例如有鸡类，如火鸡、小鸡、鸭、鵝、珍珠鸡等，这是由于它们对于人而言也具有经济重要性。所述的术语没有注明具体的年龄。因此，得自成人和新生有机体的细胞应被包含在本发明的范围内。待治疗的细胞可以为具有核的任何细胞，包括(但不限于)成纤维细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞、肝细胞、成肌细胞、成骨细胞、破骨细胞、淋巴细胞、角化细胞、间皮细胞和肌肉细胞。备选地，所述的细胞可以为无核的，即，不具有核，因此其不具有DNA。无核细胞的实例包括血红细胞(红血球)和血小板(凝血细胞)。在一些实施方案中，所述的细胞缺乏Bcl-2蛋白质家族的一种或多种促存活成员。在其他实施方案中，所述的细胞缺乏Bcl-2蛋白质家族的一种或多种促细胞凋亡成员。在一些实施方案中，所述的细胞为Mcl-1缺陷性细胞。缺乏所述蛋白质的细胞可以通过本领域已知的方法形成。例如，已知为"基因打断，，的技术通过使用突变体等位基因替换所述的基因来选择性地使其他正常细胞中的基因失活。已经研发出用于完成诸如酵母和小鼠之类有机体细胞的基因打断(也称为基因敲除或基因沉默)的有效方法。这些方法依赖于同源重组，其中相似性序列的区域与DNA节段互换。"同源重组"是指在同源核苷酸序列位点处两种核酸分子之间的核酸区域的互换。插入到细胞中的外源DNA可以打断任何基因，这些基因通过互换节段而至少部分是同源的。如果特定基因的核苷酸序列是已知的，则可以对该基因进行打靶。在一些实施方案中，外源DNA可以定位于靶向构建体中。靶向构建体为人工构建的可以被转移到所选细胞中的基因材料的节段。所述的耙向构建体可以整合到宿主细胞基因组中能够增强或抑制(部分或完全)特定基因表达的位置处。所述的靶向构建体可以使用本领域已知的标准的方法制得。例:i口,》口在SambrookandRussell，#o7eci//ar670/7//2fJL36arator/船/7wa7，3rdEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001;Ausubel(ed)，(7"rreii1rofoco/s//#o7ec"7ar^.。7^7，5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002)中所述的那些。靶向构建体的发展有助于其引入到本发明方法中使用的细胞中。用于将靶向构建体引入(体内或体外)到宿主细胞中的多种技术是本领域已知的，并且包括(但不限于)微注射、病毒介导的转移、以及电穿孔。为了调控细胞凋亡和/或Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性，将所述的分子在体外或体内与细胞结合。将所述的分子与所述的细胞结合可以通过本领域已知的方法来实现。在一些实施方案中，已经从有机体中分离出所述的细胞，并将所述的分子与所述的细胞在体外进行结合。在其他实施方案中，未从有机体中分离出所述的细胞，并将所述的分子与所述的细胞在体内进行结合。所述的分子可以直接与所述的细胞结合，即，直接施加到细胞上。备选地，所述的分子可以间接地与所述的细胞结合，即，将所述的分子注入到有机体的血流中，然后这些血流会将所述的分子带入所述的细胞中。可以采用细胞测试来鉴定出能够调控细胞凋亡和/或Bel-2蛋白质家族成员的水平和/或活性的分子。这种方法包括在测试分子存在下，温育对细胞凋亡诱导分子敏感的细胞；以及测定未发生细胞凋亡的活细胞的存在情况。如果所述的分子调控了Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性，则可以通过测定所述的细胞是否发生细胞凋亡来鉴定该分子。备选地，如果所述的分子调控了细胞的细胞凋亡，则可以通过测定Bel-2蛋白质家族成员的水平和/或活性来鉴定该分子。已经发明了许多不同的方法来检测细胞凋亡，所述的方法例如有活体细胞染料(曙红、台盼蓝、阿尔玛蓝)的吸收情况、TUNEL(TdT介导的dUTP切口末端标记)分析、ISEL(原位末端标记)、以及用于检测细胞群或单个细胞中DNA片段的DNA梯带分析、测定质膜变化情况的Annexin-V染色、细胞凋亡相关蛋白质(例如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)的检测(包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性或活化作用)、Bel-2家族蛋白质、p53、Fas和FADD。这些都是技术人员所知的技术。类似地，用于检测Bcl-2蛋白质家族成员的水平和/或活性的许多方法是技术人员已知的。例如，可以通过(例如)层析技术由细胞中纯化出蛋白质，并将该蛋白质与由尚未经历本发明方法的细胞中纯化得到的蛋白质相比较。可以将本发明的小型或大型化学制品、多肽、核酸、抗体、肽、化学类似物或模拟物配制到根据常规的药物配混技术制备得到的药物组合物中。例如参见Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.(1990，MackPublishing,Company,Easton，PA，U.S.A.)。所述的组合物可以包含活性制剂或者该活性制剂的可药用的盐。这些组合物除了包含一种活性物质以外，还包含可药用的赋形剂、栽体、緩沖剂、稳定剂或本领域已知的其他材料。这些材料应该是无毒的，并且不应该干扰所述活性组分的效力。才艮据施用(例如静脉内、口服、鞘内、神经外膜或胃肠外)所需的制备物的形式，所述的栽体可以采取多种形式。对于口服施用而言，可以将所述的化合物配制到固体或液体制备物中，例如胶嚢、丸剂、片剂、锭剂、粉末、悬浮液或乳液。在制备口服剂型的所述组合物的过程中，可以使用任何可用的药物介质，例如，在口服液体制备物(例如悬浮剂、酏剂和溶液)的情况下为水、乙二醇、油、酒精、调味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等；或者在口服固体制备物(例如粉末、胶嚢和片剂)的情况下为诸如淀粉、糖、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘结剂、分解剂之类的载体。由于片剂和胶嚢在施用时具有方便性，所以片剂和胶嚢代表了最有利的口服剂量单元的形式，在这种情况下显然可以使用固体药物载体。如果需要的话，可以通过标准的技术对片剂进行糖包衣或肠包衣。可以将活性制剂囊封起来，从而使其稳定地通过胃肠道，同时4吏其通过血脑屏障。例如参见国际专利公开No.W096/11698。对于胃肠外施用而言，可以将所述的化合物溶解于药物载体中，并以溶液或悬浮液的形式施用。示例性的合适的栽体为水、盐、右旋糖溶液、果糖溶液、乙醇、或者动物油、植物油或合成来源的油。所述的载体还可以包含其他组分，例如防腐剂、悬浮剂、增溶剂、緩沖剂等。所述的活性制剂优选的是以治疗有效量进行施用。施用的实际量以及施用的速率和时间过程取决于待治疗疾病的性质和严重程度。治疗处方(例如所决定的剂量、时间选择等)是在普通从业者或专业人员的责任范围内，并且通常要考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送的位置、施用的方法以及从业者已知的其他因素。技术和方案的实例可以在Remington'sPharmaceuticalSciences,备选地，靶向疗法可以用于通过使用诸如抗体或细胞特异性配体、递送载体或模型位点之类的靶向系统来将活性制剂以更加特异性的方式递送至产生或蓄积血小板的组织，例如骨髓、肺、脾、血管系统。鉴于多种原因，靶向是合乎需要的，所述的原因例如为如果所述的制剂具有不可接受的毒性，或者如果在其他情况下需要非常高的剂量，或者在其他情况下所述的制剂不能进入靶细胞中，则可以避免靼向才几体的其他区域。不釆用直接施用所述的那些制剂，则所述的制剂可以在靶细胞中形成，例如在病毒载体(例如上文所述的那些)或者在基于细胞的递送系统(例如在美国专利No.5，550，050以及国际专利公开No.WO92/19195，WO94/25503，WO95/01203,WO95/05452，WO96/02286，WO96/02646，WO96/40871,WO96/40959和WO97/12635中所述的那些)中形成。所述的栽体可以被靶向至目标细胞中，或者表达产物的表达被限定在特定的细胞、发育阶段或细胞周期阶段中。将基于细胞的递送系统设计成植入到患者体内的所需靶位置处，并且所述的基于细胞的递送系统包含用于靶制剂的编码序列。备选地，所述的制剂可以以前体形式施用，该前体形式通过由待治疗细胞产生的活化制剂或者通过被靶向到待治疗细胞中的活化制剂而转换成活性形式。例如参见欧洲专利申请No.0425731A和国际专利公开No.WO90/07936。根据本发明的所述方面，可以使用包含5c/-1，勘i:或&,多核苷酸的基因组合物处理表现出经修饰的5c/-i，^i:或"^基因序列的受体对象的细胞。向具有突变体或改变形式的基因的细胞提供野生型或经增强的Bel-xL，Bak或Bax功能，在这种情况下，会弥补所述的缺陷。可以将载体中的野生型等位基因引入到细胞中，使得所述的基因保持在染色体外。备选地，可以使用人工染色体。通常，所述的载体可以与宿主基因组结合，并在其中表达。根据通常接受的方法(例如由Friedman(In:7力ei"ap/尸orCe"e〃c"/sea5"e，T.Friedman,Ed.，OxfordUniversityPress,pp.105-121,1991)或Culver(Ce/7er力erap/..爿尸r/迈er尸orP力y"'ci'a/2S，2ndEd.,MaryAnnLiebert，1996)所述)进行基因治疗。合适的载体是已知的，例如在美国专利No.5,252,479、国际专利公开No.W093/07282和美国专利No.5,691,198中公开的那些。本领域已知的基因转移系统可用于实施本发明的基因治疗方法。这些方法包括病毒和非病毒转移方法。非病毒基因转移方法是本领域已知的，例如化学技术(包括磷酸钙共沉淀)、机械技术(例如微注射)、通过脂质体而进行的膜融合介导的转移、DNA的直接摄取、受体介导的DNA转移以及核转染。病毒介导的基因转移可以与采用脂质体进行递送的体内直接基因转移相结合。在基因治疗方法中的表达载体是指包括这样的构建体，该构建体含有足以表达多核苷酸的序列，而所述的多核苷酸已经在所述的栽体中被克隆。在病毒表达载体中，所述的构建体包含足以支持包装该构建体的病毒序列。如果所述的多核苷酸编码了(例如)Bcl-xu则表达将会产生Bcl-x"如果所述的多核苷酸编码了正义或反义多核苷酸或核酶或DNA酶，则表达将会产生正义或反应多核苷酸或核酶或DNA酶。至此，就这一点而言，表达并非必须使蛋白质产物被合成。除了被克隆到表达栽体中的多核苷酸以外，所述的载体还包含在真核细胞中有功能的启动子。所克隆的多核苷酸处于该启动子的控制之下。通常，合适的真核启动子是确定的。可以通过使DM通过聚赖氨酸与蛋白质配体缀合来实现受体介导的基因转移。根据相应配体受体在靶类型的细胞/组织的细胞表面上的存在情况来选择配体。肝细胞表面上的受体可以有利地被靶向。如果需要的话，可以将这些配体-DNA缀合物直接注射到血液中，并定向于耙组织，在此形成受体结合以及DNA-蛋白质复合体的内化。为了克服DNA在细胞内被破坏的问题，可以包含与腺病毒共感染，从而石皮坏内涵体的功能。在本发明的其他相关方面中，已经确定，Bcl-x"Bak或Bax的水平或活性的改变对血小板的存活具有深刻的影响。因此，目前可以通过针对Bc1-Xl和/或Bak和/或Bax的水平或活性的变化情况、或者万c/-i和/或^i:和/或A2J基因的特异性突变或畸变情况(例如曱基化事件)，来监测受试对象，从而对与低于正常或高于正常的血小板数量有关的状况的易感性进行诊断。术语"基因"以其最广泛的含义使用，并且包括与基因的外显子相对应的cDNA。本文所指的"基因"还被用来包括以下方面(i)由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(即，内含子、5，-和3，-非翻译序列)构成的传统基因组基因；或者(n)与基因的编码区(即，外显子)和5，-和3，-非翻译序列相对应的mRNA或c親。失去Bcl-x^，Bak或Bax功能。在一些实施方案中，基因中的修饰会影响转录、翻译或翻译后加工，并因此会影响Bcl-x"Bak或Bax的水平或活性。在一些实施方案中，Ac/-z中的突变位于BH4和/或BH1，BH2或BH3编码结构域中；^i:或Asi中的突变位于BH1，BH2或BH3结构域中。有多种突变检测筛选方法是可利用的，这些方法是本领域的技术人员已知的。可以使用允许在测试核酸序列与对照核酸序列之间进行精确对比的任何方法。扫描方法包括测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、单链构象多态性(SSCP和rSSCP，REF-SSCP)、化学裂解方法(例如CCM、ECM、DHPLC和MALDI-TOFMS)、以及DNA芯片技术。用于筛选预定突变的特异性方法包括等位基因特异性寡核苷酸法(ASO)、等位基因特异性扩增法、竟争性寡核苷酸引物法、寡核苷酸连接测试、碱基特异性引物延伸、斑点印迹测试以及RFLP-PCR。这些方法和其他方法的优势以及弱点在Sambrook，C力a;7"rU，M/eci//ar"0/2//^，2001中有所综述。此外，甲基化鉴定测定法是本领域已知的，该方法用于检测5-甲基胞嘧夂是最有利的，如在Rein""，NucleicAcidsResearch,26(10):2255—2264，1998中所综述的那样。此外，胞嘧啶甲基化的检测在国际公开No.WO00/70090和WO03/000926中有所描述。本发明提供了诊断受试对象中与血小板减少或血小板增多有关的状况的方法，并且本发明进一步提供了测定受试对象发展出这些状况的易感性的、基于基因或蛋白质的方法。本发明的诊断和预后方法检测和估计了在野生型^7-1和/或Asir和/或A3i基因或座位中的畸变情况，从而确定是否产生了经修饰的多肽，或者多肽是否是过度产生的或是产生不足的。在基因或座位中的术语"畸变"涵盖了所有形式的突变，包括在编码区和非编码区的缺失、插入、点突变和取代。所述的畸变还包括基因甲基化模式的变化。点突变可以形成终止密码子、移码突变或氨基酸取代。体细胞突变是指仅在某些组织(例如在肿瘤组织中)中发生但不会在种系中遗传的那些突变。种系突变可以在任何机体组织中发现并且是遗传性的。可以针对万c/-x和/或勘i:和/或^x基因中的突变情况测试人或其他哺乳动物的任何组织，来查明易染与血小板减少或血小板增多有关的状况的体质。可以通过测试得自受试对象机体的任何组织的DNA来测定突变情况。此外，可以通过针对5c7-z和/或Asi:和/或Ax基因的突变情况测试胎儿细胞、胎盘细胞或羊水，从而完成出生前的诊断。可以通过多种手段检测野生型等位基因的变化情况(例如通过点突变、缺失或曱基化)。用于检测5c/i和/或勘l和/或勘^基因中畸变情况的有用的诊断技术包括(但不限于)荧光原位杂交(FISH)、PFGE分析、DM印迹分析、斑点印迹分析和PCR-SSCP。此外，DNA微芯片技术是有用的。直接DNA测序(人工测序或自动化荧光测序)可以检测序列的变化情况。另一种方法为单链构象多态性测试方法(SSCP)(Oritae"厶，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,2776-2770，1989)。这种方法可以最优化地检测出大部分的DM序列变化。在研究的基础上，SSCP方法的这种可以发生的、增大的通量使得其成为有吸引力的且可行的备选方法来指导用于突变检测的测序。然后，对在SSCP凝胶上流动性发生变化的片段进行测序，从而确定DNA序列变化的确切性质。其他基于两条互补DNA链之间错配的检测情况的方法包括夹板变性凝胶电泳(CDGE)(Sheffield<3人，Am.J.Hum.Genet.，'699-706，1991)、异源双链体分析(HA)(Whiteefa/.，Genomics,7么'301-306，1992)以及化学错配裂解法(CMC)(GrompeWa人，Pro"Natl.Acad.Sci.USA，仏.5855-5892，1989)。可以检测出调节区域中的突变情况或者可能包含大的缺失、重复或插入的其他方法包括蛋白质截断测试法或不对称测试法。检测DNA序列变化情况的方法的综述可以在Grompe(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《《.5855-5892，1993)中找到。其他用于证实野生型或突变体5c7-i和/或^i:和/或^si等位基因的测试方法有变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartelle〃人，Nucl.AcidsRes.，7&'2699-2705，1990;Sheffield3人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，《《'232-236，1989);核糖核酸酶保护测试(Finkelsteine"人，Genomics,7..167-172,1990;Kinszlere"厶，Science,1366-1370,1991);变性HPLC;等位基因特异性寡核苷酸法(ASO杂交)(Conner"a/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^.'278-282，1983);识别核苷酸错配的蛋白质(例如Acoh'突变S蛋白质)的使用(Modrich，Ann.Rev.Genet"229—253，1991);以及等位基因特异性PCR(RuanoWa/.,Nucl.Acids.Res.",8392，1989)。对于等位基因特异性PCR而言，使用了与具体序列的3，末端杂交的引物。如果不存在特定的突变，则观察不到扩增产物。此外，还可以使用扩增受阻突变体系(ARMS),如在欧洲专利公开No.0332435和Newtowna/.(Nucl.Acids.Res.77..2503—2516，1989)中公开的那些。此外，还可以使用等位基因特异性探针筛选通过使用PCR或其他扩增反应扩增得到的5c/i和/或"ai:和/或化i基因的核酸序列。这些探针为核酸寡聚体，每一个寡聚体都包含具有已知突变的基因序列的区域。通过使用等位基因特异性探针池，可以筛选PCR扩增产物，从而鉴定出Ac/-x和/或^ir和/或A^基因中之前鉴定的突变的存在情况。可以在(例如)尼龙过滤器上进行等位基因特异性探针与所扩增的Ac/i和/或Air和/或"az序列的杂交。在严谨杂交条件下与特定探针发生的杂交表明，在所述组织中，与等位基因特异性探针相同的突变的存在。此外，微芯片技术可用于本发明。在这些技术中，在位于硅芯片或其他固体支承体(例如聚合物薄膜或栽玻片)上的阵列中，建立数千种不同的寡核普酸或cDNA探针。使用报告分子(例如焚光标记)对待分析的核酸进行标记，然后使该核酸与芯片上的探针杂交。还可以使用这些核酸微芯片来研究核酸-蛋白质的相互作用情况。使用这些技术，人们可以测定所分析的核酸序列中突变的存在情况，或者人们可以测定所关注的一种或多种基因(例如编码生物化学途径中的产物的基因)的表达水平。所述的技术在多种出版物(包括Haciae"/.(NatureGenetics,K:441-447，1996)和Shoemakerefs/.(NatureGenetics,",450-456，1996))中有所描述。此外，还可以4十对野生型Bcl-x，Bak或Bax蛋白质的变化进行篩选来鉴定野生型"c/i和/或&1和/或"a义基因的变化情况。例如，可以使用与Bcl-x,Bak或Bax发生免疫反应的单克隆抗体来由受试对象中筛选样品。水平、大小上的变化或者关联抗原的缺乏表明了突变情况。此外，还可以使用对突变体等位基因产物具有特异性的抗体来检测突变体基因产物。可以在本领域已知的任何方便的形式下进行所述的免疫学检测。这些检测包括蛋白质印迹、免疫组织化学测试、以及ELISA和RAPID测试。在免疫测试中使用单克隆抗体是特别优选的，这是由于具有大量且均质产生这种抗体的能力。用于产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系制备物可以通过将永生细胞系与淋巴细胞(其被免疫制备物(即，包括Bc卜Xl，Bak或Bax多肽)所敏化)融合而得到，或者可以通过本领域的技术人员所公知的技术来得到。(例如参见Doui1lardWa厶，BasicFactsaboutHybridomas，in(7o邵e/2fl7M/o尸/迈/z7w70/057Vol.II，ed.bySchwartz,1981;Kohlera/.，Nature,^^..495—499，1975;Kohlera/.，EuropeanJournalofImmunology,<5>511-519，1976)。在另一方面中，本发明提供了特别用于发展或测试本文所述的制剂的、经修饰的动物或细胞。经基因修饰的动物(例如本文所述的PLT20或PLT16突变体)及其细胞提供了敏化系统，以便研究在缺失Be1-2/Bak/Bax途径的情况下，一系列细胞凋亡修饰剂的作用。细胞或构建体可以冷冻储存，并且可以与使用说明书一起售出。在一些实施方案中，所述的经修饰的动物为经基因修饰的，包括在促存活或促细胞凋亡基因、或者Ac/-^化l或^i基因中的突变，例如功能部分损失的突变。术语"经基因修饰的"是指基因组的水平发生变化，在本文中是指这样的细胞或动物，该细胞或动物在其基因组内含有一个或多个已经改变的特定基因。备选的情况可以为单个碱基的变化，例如点突变，或者可以包括通过多种技术(例如采用了同源重组的那些)而得到的基因的整个部分的缺失。基因修饰包括调节区域的改变、其他多个拷贝的内源或外源基因的插入、使用外源基因或基因区域的插入或取代、等等。因此，改变包括由多个核酸形成的单一的插入、缺失、取代或它们的组合，从而导致基因的功能受到部分损失。可以使用具有一个或多个经修饰的等位基因的细胞和动物作为模型系统，来研究基因产物的作用和/或在这些功能受到损伤时来测试具有治疗制剂潜力的物质。可以在整个动物的突变形成后，或者在种系细胞或受精印经过处理后来选择用于测试治疗制剂的动物。在测试物质被施加到细胞中后，测定细胞的表现型。可以对细胞的任何特征进行评估。因此，经基因修饰的动物或细胞包括得自转基因动物，"基因敲入"或"基因敲除"的动物，条件变体或其他突变体或容易受到共抑制、基因沉默或RNAi的引入的影响的细胞或动物。方便地，最初使用靶向基因构建体来在细胞或有机体中产生经修饰的基因序列。靶向构建体通常但不会专门地通过同源重组来修饰靶序列。备选地，可以使用人工染色体来引入经修饰的基因序列。使用本领域公知的方法来产生打靶构建体或其他构建体，并将这些构建体引入到目标细胞中，其中所述的方法在分子生物学试验指南(例i口Sambrook，#o/eci/7arC/o/^'/^v^Za6oratoiy#a/7i/<2/，3rdEdition,CSHLP，CSH，NY,2001;Ausubel(Ed)Cwrre/2t户ro&co"/刀#。/ecw/ar肠/ow，5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002)中有所描述。使用本领域公知的技术来形成经基因修饰的有机体，其中所述的4支术在(例j口)Hogana入,^a/7/;u/a"'/7gf力eMoi/se^z/6r/o.'JL26ar"or/他/7wa/，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,CSHNY,1986;Mansour"a/.，Nature,，348-352，1988;Pickert，7>a/75^e/7/cj/72'迈a/7bc/加/owJZa6or"or/〃s7^ooir，AcademicPress,SanDiego，CA，1994中有所描述。本发明提供了产生经基因修饰小鼠突变体的方法，该方法包括使用所述的技术修饰本文所述的小鼠突变体。通过以下非限定实施例来进一步描述本发明。实施例1哞的iTf^致j&V、炎减^'在野生型小鼠中，进行全基因组突变篩选(KileWa人，Nat.Rev.Genet.，6557-567，2005)，以鉴定出导致血小板减少的突变。使用化学诱变剂N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)处理雄性BALB/c小鼠，并使该小鼠与未经处理的BALB/c雌鼠交配。在7周龄时，将第一代(GJ后代小鼠放血，并在第9周时，将表现出循环血小板数量低于900xlOVjLiL(正常范围的下限)的小鼠再次放血。多只G:小鼠表现出持续的血小板减少(参见图1A),通过使这些小鼠与野生型BALB/c小鼠交配来测试各种情况下这些小鼠的遗传可能性。在7周龄时，将得自上述交配小鼠的G2后代放血，并且证实5代谱系都存在血小板数量低的动物分离出了导致血小板减少(~600x10ViaL)的可遗传的显性突变(参见表6)。通过标准的定位克隆方法，将这些突变中的两个突变(表示为户/W。和/V〃"定位于2号染色体的远端。精细定位分别将(参见图1B)和/V〃f(参见图1C)的候选区域精确于16.3和1.9Mb的重叠区间。对候选基因的外显子和拼接连接区域进行直接测序，并在得自尸"M(参见图1D)和户/〃6(参见图1EH普系的受影响动物中鉴定出^/-i基因中的突变。在？〃M的情况下，预示出A-至-G的转变，从而导致在Bel-Xl的第15个残基处半胱氨酸取代了酪氨酸(其为Ac7-;r座位编码的主要蛋白质)。在尸/"6的情况下，预示了T-至-A转换的突变，从而导致在残基182位处天冬酰胺取代了异亮氨酸。实施例2^/-/'"。和^/-/""小處类似，万c/-力^潜^V、篇A乂益小我减，种Bcl-xL(Boise"a/.，1993)为Bc卜2蛋白质家族(其调节了发展中的程序性以及应激诱导性的细胞死亡，包括Bcl-2，Bc卜w，Mc卜l和Al)的促存活成员(Adams，2003(卿ra);Daniale/1a入，2004(s叩ra))。由具有"c/-x的户〃i^和尸/〃6等位基因的小鼠所表现出的血小板减少表明，Bc1-Xl有助于保持血小板的数量。为了证实Bel-Xl的作用，消除5c/i基因的其他缺陷(例如异常剪接、显性活化)并排除导致血小板减少的连接的ENU诱导的突变，对经过特异性改造而缺乏Bc1-Xl的动物进行检测(Motoyamaeta/，Science,繞1506-1510，1995)。^;/-/—小鼠发育正常,并以所期望的孟德尔频率出生(Motoyamaefa/，1995(sw/7/a))。与和/〃""小鼠类似，动物与野生型动物(~1，100xlOVpL)相比，表现出血小板数量明显降低(860xlOViaL)，从而证明"c/-;r的单倍剂量不足会导致血小板减少(参见图2A)。与&/-/""//;""动物(只观察到有较少的这种动物出生)和"c/-yz—小鼠(其在怀孕中期死亡(Motoyama""，1995)不同，&/-//",'"小鼠以所期望的孟德尔频率出生，并存活至至少6个月龄，由此表明Ac7-z的这种等位基因为下效等位基因(hypomorphic)，而不是功能的完全损失。除了脾脏红血球生成温和升高以外(数据未示出)，万c/-/，w^小鼠在造血区间内未显示出任何其他的显著异常(参见表6)，并且与具有"c7-z的其他等位基因的动物(Kasai"".，DevBiol雄202-216，2003)截然不同的是，雄鼠是可生育的，从而表明精子的形成没有被明显的损害。值得注意的是，纯合子小鼠中的血小板数量被进一步减少至野生型同窝出生小鼠血小板数量的大约25%(参见表6),由此表明，就血小板数量而言，Bcl-XL增加的减少形成了表现型梯度。血小板减少并非为类Bc卜2促存活蛋白质失活的一般结果与化/-i突变体小鼠不同，在"c/-/A，^7-#/_和#^-广—动物中血小板的数量是正常的(参见图2A)。实施例3在万c/ij^f伴V、厲哞^V、我清餘^遽芈增义在5c/i突变体小鼠的骨髓和脾中充沛的巨核细胞生成驳斥了血小板生成缺陷为血小板减少的主要原因的说法。在小鼠和5c/-/〃w"e同窝出生小鼠中，巨核细胞祖细胞的数量是正常的(数据未示出)。在andSc/-y〃""小鼠中，成熟的巨核细胞少量增多，而在S"-f^纯合子小鼠中，成熟的巨核细胞微量增多(数据未示出)。在所有^/i突变体小鼠中，它们在形态学上是正常的，并且表现出与野生型配对鼠相似的倍性概况(数据未示出)。此外，得自突变体小鼠的巨核细胞祖细胞在体外并非倾向于自发的细胞凋亡，并且与野生型配对鼠相同，在体内，它们都会由应激诱导的血小板减少中顽强地恢复过来(数据未示出)。这些数据表明，"c7-i的突变不会明显地损害血小板的生成。检测脾脏隔离的增加是否会造成血小板数量的减少。然而，由纯合子^卜/"^，小鼠中移出脾脏仅会部分地校正血小板减少(由367±41至516±63x10ViliL,与野生型同窝出生小鼠中的1，279±200至1，650±136x107pL相对比)，表明异常的脾脏功能不能从根本上造成血小板数量低。然后，检测Bcl-i在其作为促存活调节剂的能力中是否会直接影响血小板的命运。已经详尽论述，Bcl-xt功能发生降低的血小板可能会在成熟前死亡，然后与野生型血小板相比，这些血小板会以尽快的速率由血液中除去。通过跟踪体内生物素标记的血小板的命运(Aultet".,Exp.Hematol.，":996-1001，1992),确定5c/-/膀的突变会以剂量依赖的方式减少血小板的半衰期(参见图2B)。肋/t的一个突变体等位基因会使正常血小板的半衰期(t1/2)降低约50%(~57h至24h)，，而两个等位基因的突变会引起t^进一步降低至小于12h(参见图2B)。类似地，得自万c/-/〃，和Z小鼠的血小板还表现出血小板的寿命期缩短(参见图2C)。为了证明在由循环半衰期所反应的血小板固有性质中发生的那些变化，进行了交互性过继转移。在SO州"。和/'","。血小板转移到野生型受者中后，与野生型血小板相比，这些血小板的清除速率更快(参见图2D),并且这些血小板与在未经处理的小鼠中所见到血小板半衰期是不可区分的。与此相反，转移到"c/-x+/+，"c7-//w"tf或AW","。小鼠中的野生型血小板的清除是相同的，而与受者的表现型无关(参见图2D)。通过使用噻唑橙(其为一种充满RNA的"网状"幼嫩血小板的标记物)进行染色来检测循环血小板的年龄概况(Aultefa7.，1992Kienast"".，1990(卿ra))。&/-义中户/"〃和？/〃f的突变使得阳性细胞的比率以剂量依赖的方式增加(参见图2B),从而表明具有这些突变的小鼠中血小板群是相对幼嫩的。这与它们缩短的整体寿命期一致。在"c/-/州"。或^/-/"靡"。小鼠中，网状血小板的绝对数量与野生型小鼠中的网状血小板的绝对数量相当(参见图2F),再次支持了*/-^的突变不会显著损坏血小板生成的结论(参见表6，数据未示出)。实施例4/，和Ac/-/，^f炎与^7-y,-小鼠相反的是，纯合子/諸詢。小鼠中，不发生严重的早期发育缺陷的情况证明，在大多数类型的细胞中必需具有足量的Bc卜xt以保持存够的存活。户〃"和户""突变都不会直接影响Bel-Xl的BH3结合槽(参见图3A)(对于功能而言，该结合槽为重要的区域)(Adams，2003(sw;7rs);Liu"a/.，2003(sw/7ra);Sattlere"入，Science,"J:983-986，1997)。与所述的情况相一致，在很大程度上，突变体Bcl-^蛋白质与细胞凋亡的必要下游介质(Bax或Bak)的结合能力(Chenge"人，2001(卿ra)jUndstenWa/.，2000(w/7ra))表现为并未受到影响(参见图3B)。当突变体Bcl-^蛋白质在细胞系(包括永生Ac/-Z—小鼠胚胎成纤维细胞)中过表达时，该蛋白质不具有组成型的细胞毒性，相反，与野生型Bc1-Xl相比，该蛋白质是不稳定的(数据为示出)。同样地，测定到，在得自小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，内源性全长Bel-XL的稳定性(正常"~18h)会适度地降低(U~12h)(参见图3C)。甚至在^^-,，〃"细胞中的内源性Bcl-^的基础水平也发生降低，这与这种待降解的Bel-^突变体形式的倾向性一致(参见图3C，7A)。有趣地是，由于Bc1-Xl和Mc1-1(其为促细胞凋亡Bak的两种限制物(Willisefa人，2005(i^;ra)))在经过环己酰亚胺处理后均发生降解(参见图3C),所以当蛋白质的合成受到抑制时，Bcl-^的不稳定会特异性地敏化MEF发生细胞凋亡(参见图3D,7B，8B)。与此相反，在经过上述处理后甚至24h仍保持有Bak。由于对于Bak介导的细胞凋亡而言，需使所述的两种促存活蛋白质(Bc1-Xl和Mcl-l)失活(WillisWa人，2005),所以稳定性更强的野生型Bcl-xL可以在经过环己酰亚胺处理之后(参见图3D,7B)、甚至在Mcl-l被降解时(参见图3C)，仍能够延长存活。与此相反，所述突变对其他破坏信号(其不会直接影响蛋白质的合成，利用使用使用广谱激酶抑制剂星孢菌素进行处理)的敏感性方面，突变不会产生影响(参见图8A)。因此，/簡和Ac/-/""为编码不稳定蛋白质的"c/-;r的下效等位基因。当新蛋白质的合成受到限制时，这些突变的影响是最明显的，这潜在地说明了为什么它们产生了这种突出的血小板表现型，即，具有有限的合成新蛋白质的能力的细胞类型(Booyse"a7.Biochim.Biophys.Acta.，"7:660-663，19681Denis"".，Cell,7":379-391，2005;Kieffere/a/.，Eur.J.Biochem.，嵌189-195，1987;Weyriche"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,5556-5561，1998)。实施例5模拟^合參,放,慈V、炎减>'如果在体内需要Bcl-^来维持血小板的存活，则推断在野生型小鼠中对Bcl-^的活性进行药理学拮抗将会引发血小板死亡，并导致血小板减少。小分子ABT-737为拮抗促存活Bc1-Xl的BH3模拟药物(01tersdorfe"/.,2005)。其选择性地靶向Bcl-2，Bcl-xL和Bcl-w,但不会耙向其他促存活蛋白质Mc卜l或Al(Oltersdorfefa人，2005(sw/ra);vanDelftWa/.，CancerCell,Jft389-399，2006)。到目前为止，据报道该小分子在小鼠中是良好耐受的，并证明了对抗某些肿瘤细胞系(特别是得自小细胞肺癌或淋巴瘤的那些)的单制剂的效力(Oltersdorf"".,2005(卿ra))。在向野生型C57BL/6小鼠注入单剂量ABT-737(但不具有媒介物对照)的两个小时内，血小板的数量降至不到正常水平的30%,并且在4小时时达到最低点(参见图4A，数据未示出)。血小板减少呈现出剂量依赖性(数据未示出)，并且血小板的数量在处理后的第3天逐渐恢复达到正常的水平(参见图4B)。即使每天注射ABT-737，仍能够观察到这种发现(与血小板生成素(TP0)的持续产生有关)(参见图4B)。当使ABT-737持续14天时，直到治疗停止，血小板的水平保持在正常水平的~60-70%(数据未示出)。与此相反，当每周给予ABT-737时，急性血小板减少继而以循环方式发生(参见图4C)，并且血小板的数量在干涉时期恢复。有趣地是，当通过噻唑橙染色检测在给予ABT-737之后循环血小板的年龄概况时，注意到网状血小板的比率短暂增多(参见图4D)。这表明，老年血小板可能更容易受到药物的影响。为了研究这种可能性，使用抗血小板的血清(APS)处理小鼠，从而以人工方式使血小板的生成同步。在24小时时，在给予APS之后血小板的数量快速降低至几乎不可检测的水平，然后经过7天的过程恢复(参见图4E)。在这种恢复过程中，噻唑橙的概况急剧变化，主要在给予APS之后的第2天形成了新的网状血小板的大量同源群(参见图4F)。随着群的老化，网状血小板群在给予APS之后的第7天降低至几乎正常的水平。新合成的幼嫩血小板(在给予APS之后的第2天)高度抵抗ABT-737的作用(参见图4F)。与此形成尖锐对比的是，老化的血小板(在给予APS之后的第7天)在体内更易受到ABT-737的影响，从而证明所述的药物主要对老的血小板起作用。药物是导致血小板减少的公知的原因。除了由细胞毒性制剂所导致的骨髓抑制以外，血小板减少通常是免疫介导的。通常，在这种情况下，在最初暴露于药物之后的7-10天发生血小板减少，并且通过连续的处理而不可避免地恶化(Georgeefa/.，Ann.Intern.Med.，W义886-890，1998)。与此相反，ABT-737的作用极快速(参见图4A)，并且尽管治疗仍在进行，在治疗小鼠中血小板的数量也会部分恢复(数据未示出)，从而表明用于维持血小板水平的新型变阻器已经确立。已经观察到，在处理小鼠中，TPO的水平和巨核细胞的生成是正常的，或者可能甚至升高(数据未示出)。此外，当在体外在祖细胞培养物中对ABT-737进行测试时，发现对所形成的多种巨核细胞集落没有影响(数据未示出)。因此，与在药物损伤血小板形成或者引发免疫介导的破坏时所观察到的良好表征的效果截然不同的是，本文所述的结果指向ABT-737(作为促细胞凋亡分子的实例)对血小板的直接细胞毒性作用。实施例6w谬#芋應扇凝天冬我^蛋冷^j&v、炎亡如所预期的那样，Bel-i(而非Bel-2)的无效等位基因的杂合性恶化了ABT-737诱导的血小板减少(参见图5B)。在所培养的血小板中，暴露于ABT-737会引发半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解和完全活化、以及凝溶胶蛋白的裂解(一种已知的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的底物)(参见图5C)。此外，用广谱抑制剂qVD.OPh(Casertae"/.，Apoptosis，《345-352，2003)抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(其为细胞凋亡的下游效应器(Thornberryefa人，Science,房:1312-1316，1998))会部分地改善ABT-737对培养物中的小鼠血小板(参见图5D)和人血小板(参见图5E)的细胞毒性作用。当然，离体暴露于ABT-737不会引发血小板的活化，或者不利地影响血小板响应于ADP或胶原蛋白而凝集的能力(参见图9)。实施例7^^关攻吝7由JA7W摩,致V、我减乂，为了研究对Bel-&的拮抗是怎样通过半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶来引发对血小板的破坏的，考虑了该蛋白酶活性的潜在的分子靶标。最可能的候选物为多结构域促细胞凋亡家族的成员Bax和Bak，这是因为已经显示出这些成员为在半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶下游起作用的细胞凋亡性细月包死亡的必要介质(ChengWa/.，2001(swpra);Lindstene"/.，2000(卿rs);Rathmelle"人，2002(,ra);Zongeta/.,2001U叩ra))。此外，Bcl-Xt具有通过直接结合所述的细胞死亡介质而保持Bak处于控制之中的能力(参见图3B;参见上文讨论)(Willises/.,2005(s叩ra))，由此阻制了其下游作用。因此，检查了ABT-737在缺乏上述蛋白中的任一种蛋白或这两种蛋白都缺乏的小鼠中的作用。Bak的缺乏明显减弱了ABT-737对培养中血小板生存能力的作用(参见图5D),并且显著緩冲了ABT-737的体内细胞凋亡作用(参见图5F)。虽然单独的Bax的损失具有较少的影响(数据未示出)，但是Bak的完全缺乏与另外的一个勘义等位基因的损失会使得血小板完全难以受到ABT-737的控制(参见图5F)。这些数据表明，ABT-737作为Bcl-XL拮抗剂的实例通过中和Bcl-x^的促存活作用而积极诱导了对血小板的取杀过程，由此得到了关键的促细胞凋亡介质Bak的未受限制的作用，以及程度较轻的Bax的未受限制的作用。实施例8^^V、炎哞，傻细應源亡""^傻存活"c7-A的f要乾标由于下游效应器Bak和Bax的缺失保护了血小板对抗ABT-737诱导的灭杀作用，所以对这些分子在正常血小板动态平衡中的作用进行检测。在稳定状态下，Bax缺陷型小鼠中的血小板数量与野生型小鼠中血小板的数量是不可区分的(参见图6A)。与此相反，小鼠表现为血小板的数量明显增多(参见图6A)。Ai:-z-血小板在形态学上是正常的(参见图6B),并且小鼠不具有可能会造成血小板增多的缺陷(例如脾功能减退)。因此重要的是发现了在这些动物中，血小板的半衰期(通过体内标记检测法测定)增大了近50%(参见图6C,数据未示出)。在带有突变的5c/-i，Ai:和/或&i等位基因的组合的小鼠中，检测血小板计数和半衰期。引人注意的是，一个Ai:等位基因的损失援救了小鼠中的血小板减少(参见图6D)。即使在Ac7-/〃小鼠中具有减少的Bc卜x^两个&i:等位基因的缺乏也会延长血小板的半衰期(参见图6C)并导致与在Bak缺陷型动物中所见的情况相似的血小板增多(c.f.参见图6D和6A)。此外，在杂合的&/-/，或&/-//〃《小鼠中所见的血小板减少通过组成型缺乏其他5c/-i等位基因而恶化，并通过损失一个^3i:等位基因而逆转(参见图6E)。因此，^i:在生物化学上(Willise"厶，2005(参见图3，5)和遗传上(参见图6)位于5c7-z的下游。实施例9##保持细應^存雜力的合參迷/f细^谬逸血小板是不易受到离体操作的影响的。因此，为了鉴定出可促进细胞存活(包括增长的寿命期/生存能力)的化合物(制剂)，使用了对细胞凋亡诱导制剂敏感的细胞。例如，使用其中Bel-xt为Bak的关键控制物的细胞来筛选能够抑制细胞死亡的小分子或其他化合物(制剂)，即使是在Bel-x^失活时也如此。此类化合物可用于保持细胞的生存能力。在一个实施例中，将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)改造成缺乏Mc1-1，该Mcl-l是Bak的另一种控制物(Willise"入，2005(^/p/\s))。除非Mcl-l也是失活的，使用(例如)ABT-737使Bc1-Xl失活并不能使細胞死亡(vanDelftefa/.，2006"w/ra))。在组成型缺乏Mcl-1的情况下，MEF对(例如)ABT-H7是高度敏感的。在多种情况下，对Bak的唯一制动器是Bc卜x"其可以通过作为Bel-Xl的有效抑制刑的化合物ABT-737来废止。因此，针对能够阻断由ABT-737诱导的对Mcl-l缺陷型MEF的灭杀作用的化合物来篩选化合物文库。此类化合物可以直接阻断ABT-737或者细胞死亡介质Bak和/或Bax的作用。在一个非限定性实例中，将Mcl-1无效MEF植入到底面平坦的96孔板中。在12-24h之后，加入最终浓度为0.1，l和10—的文库化合物，并温育2h，然后加入ABT-737(100nM)或载体媒介物。24h后使用阿尔玛蓝染色对细胞的生存能力进行评分，并在4h后读取。将文库化合物或ABT-737不存在情况下的细胞生存能力作为阳性对照。将在文库化合物和ABT-737不存在下缺乏生存能力的细胞作为阴性对照。在不具有ABT的情况下，惰性化合物显示出使细胞的生存能力正常。在文库化合物存在、但ABT-737不存在下，细胞毒性化合物显示出使细胞生存能力降低。阳性细胞数显示，在ABT-737和文库化合物存在下，细胞的生存能力增强，而阴性化合物显示，在文库化合物和ABT-737存在下，细胞的生存能力降低。对多个独立的细胞系和培养中的血小板测试阳性细胞数。在一些实施方案中，所述的化合物可以通过阻断ABT-737的细胞吸收或者抑制ABT-737在细胞中的作用来发挥作用。在其他实施方案中，所述的化合物通过直接抑制Bak和/或Bax，或者间接抑制Bak或Bax或其下游细胞凋亡效应器分子来发挥作用。此外，还对经修饰的小鼠(具有经修饰的Bcl-2家族基因)实施所述的方法，从而使筛选更敏感，并检测出各种阳性制剂的分子靶标。实施例10补茏的试验过程以每周给予一次的方式，向雄性BALB/c小鼠腹膜内注射3个100mg/kg剂量的ENU(亚硝基-N-乙基脲，SigmaN3385lgisopac)。在8周中，使经处理的小鼠恢复生育能力，然后使其与未经处理的BALB/c雌鼠交配，从而生出第一代(G:)后代。在G!小鼠7周龄后，由该小鼠的眼球后静脉丛收集血液，并转移至装有EDTA钾(Sarstedt)的管中，然后使用Advia120自动化血液(Haemtological)分析器(Bayer)来检测外周血液中血小板的数量。通过使受影响的动物与野生型C57BL/6小鼠异型杂交来对户/WO和戶/W6突变进行定位。针对血小板的数量筛选由这些交配小鼠产生的Fi后代，然后将受影响的F:小鼠与野生型C57BL/6小鼠异型杂交，从而产生R子代。在各种情况下，从40只F2动物中收集基因组DM,并使用具有80种简单序列长度多态性(SSLP)标记物的板进行全基因组扫描。通过使用MIT和内部CA重复标记物以增大的密度来分析其他的减数分裂产物，从而精确化候选时间间隔。裙靡0由尾部活组织提取出基因组DNA,然后对该DNA进行PCR扩增。为了除去引物以及未整合的核苷酸，使用ExoSAP-IT(USB)，根据制造商提供的说明书处理经PCR后得到的反应物，然后将该反应物通过Sephadex柱过滤。然后,使用BigDyeTerminatorv3.0(AppliedBiosystems)对扩增子直接进行测序。A濕为、浙通过使用人工或自动化(Advia120)的计数技术，测定红细胞比容、血小板和白细胞的数量以及差异。在大多数的试验中，除了图1A和6E所示的数据以外，所述的数据均由雄鼠收集得到。使用由100ng/mL鼠千细胞因子、10ng/mL鼠IL-3和4单位/mL人EPO构成的混合物刺激处于lmL0.3%的琼脂(含于补充有新生小牛血清(20%)的DMEM中)中的2.5xl(T个成人骨髓细胞或5x104个脾细胞的克隆培养物，并在37匸下，在完全潮湿的气氛(空气中含有10%的C02)中温育7天。将琼脂培养物固定，并依次用乙酰胆碱酯酶、罗克沙尔坚牢蓝和苏木精染色；在x100400的放大倍数下测定各集落中的细胞组合物。通过人工计数方法计数得自胸骨和脾切片(经苏木精/曙红染色后)中的巨核细胞的数量。在最少10个高倍视野(x200)中进行评分。羞小我^#餘#浙使用600pg溶于緩冲剂(含有140mMNaCl和10%DMS0)中的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-生物素)(Sigma)对小鼠进行静脉内注射。在各时间点处，分离出全部的鼠尾血液，并将该血液与BSGC緩沖剂(116mMNaCl，13.6raM柠檬酸三钠，8.6mMNa2HP04，1.6raMKH2P04，0.9raMEDTA，11.1mM葡萄糖)混合。将1j^L当量的血液在平衡盐溶液(BSS:149mMNaCl，3.7mMKCl，2.5mMCaCl2，1.2mMMgS04:7.4raMHEPES，1.2mMKH2P04，0.8mMK2HP04，3%小牛血清)中洗涤，在1,210g下沉淀10分钟，并使用与FITC缀合的大鼠抗CD41(BD)和与藻红蛋白缀合的链霉亲核素(BD)在冰上染色lh。将50，000个与别藻蓝蛋白缀合的珠子(流式细胞学标准品)加入到每个样品中，从而有助于对血小板的绝对数量进行定量。将样品再次于BSS中洗涤，并在LSR流式细胞仪(BD)上进行流式细胞计数。通过大小和CD41的染色情况将血小板与其他细胞区分开；经生物素标记的血小板为藻红蛋白阳性的。摩,y^小农脊移j法使用600mg溶于緩冲剂(含有140raMNaCl和10%DMSO)中的N-羟基琥珀酰亚胺生物素(NHS-生物素)(Sigma)对小鼠进行静脉内注射。在注射生物素后30分钟，使用肝素化的注射器收集小鼠心脏血液，并将2mL的血液与5mL的BSGC緩沖剂混合。将所得的血液在600g下离心3分钟，并在各时间点时移出5mL富集血小板的血浆。在1210g下沉淀汇集的富含血小板的血浆10分钟，并再次悬浮于154mMNaCl中，然后静脉注射到受者小鼠中。在注射后的各时间点处，从受者小鼠中分离出血液，并按照上文所述进行分析。河炎j&V、炎^^记使用蓉唑橙对网状血小板进行染色。反应物包含1|LlL血液、50inL噻唑橙(O.1pg/mL，溶于PBS中)、0.25^L与藻红蛋白缀合的CD41抗体(BD)和9PBS。将反应物在室温及黑暗条件下温育15分钟，然后通过加入lmL的PBS1。/。PFA进行固定。基于大小和CD41的表达情况可以将血小板与其他细胞区别开。将200pL兔抗小鼠血小板的血清(APS;IntercellLot号6309)以l:60的稀释度腹膜内注射到各只小鼠中。动參试验所有的动物试验都遵守墨尔本健康研究理事会动物伦理委员会(MelbourneHealthResearchDirectorateAnimalEthicsCommittee)的规章标准，并由该委员会所认可。缺乏Bc卜Xl(MotoyamaWs/，1995(si/;ra))，Bc卜2(Veisefa/.,Cell,75:229-240，1993)，Bcl—w(Print"a7.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，夕J:12424—12431，1998)，Bax(Knudson"a/.，Science,，96-99，1995)和Bak(Lindstene"/.，2000(swprs))的小鼠如上文所述。它们最初是在混合的C57BL/6x129Sv背景(使用129SvES细胞用于基因乾向)下产生的。在本研究中，这些品系的小鼠在使用前都经过与C57BL/6小鼠回交至少10代。在近交C57BL/6背景下形成缺乏Mc卜l的小鼠，并且该小鼠在其他处具有详细的描述(PNK,AStrasserandPBouillet，manuscriptinpreparation)。简而言之,由C57BL/6(克隆75A5)BACDNA制备lc7-J靼向构建体，并且4.6kb#c7-J编码区域的侧翼为通过电穿孔进入到C57BL/6ES细胞中的loxP位点，并将其注射到129胚泡中。在种系传递建立之后，将毛色嵌黑的子代与表达Cre重组酶的C57BL/6转基因小鼠交配，从而得到yf/c卜广-小鼠；成功的切除通过PCR表现型来证明。在近交BALB/c背景下，诱导Plt20和Plt16突变，并与C57BL/6回交。在本研究中使用的所有"c7-/諸和"c/-/""小鼠都是在混合的背景下的，其与C57BL/6小鼠经过至少2代、但不多于6代的回交。尽管在亲代C57BL/6和BALB/c品系之间没有观察到血小板数量具有显著差异(这与之前的报道一致(Kileets/.，Mamm.Genome,/《81-85，2003;Petersefa/.，Physiol.Genomics.,":185-193,2002))，仍将同窝出生的小鼠用作合适的对照。j&V、炎炎桌產豸定将全血收集到柠檬酸钠(3.2%)中，并通过在室温下在800rpm下离心12分钟得到富含血小板的血浆。然后，通过在室温下将剩余的血液在3，000rpm下离心15分钟，从而得到血小板贫瘠的血浆。使用血小板贫瘠的血浆将血小板的数量调节至250xIOVL。将经过稀释的血小板富集的血浆放置于被加温至37。C并经搅拌的凝集计比色杯中，同时在4个通道的血小板凝集计中测定穿过血浆的光透射情况。在得到基线测定值之后，加入ADP或胶原蛋白(均得自EdwardKeller)以诱导凝集。i小我减,^为N^f使用非肝素化的毛细管由眼球后窦收集血液，并将其转移至Eppendorf管中，然后在室温下温育2h。将所得物在5，500rpm下离心20分钟之后，将所得的上清液在相同的条件下再次离心，然后收集血清。4吏用QuantikineMouseTPOImmunoassay制剂盒(R&DSystems),根据制造商的说明书，通过酶联免疫吸附测试法(ELISA)测定血小板生成素的水平。^裙细^^流式'细^仅分^f将得自大腿骨的骨髓沖洗到2mL的CATCH培养基(溶于不含有钙和镁的HBSS中的0.38%柠檬酸钠，1mM腺苷，2mM茶碱，3pg/mL前列腺素L)中，并使用移液管进行轻轻的分散。将细胞悬浮液过滤通过100的细胞过滤网，从而除去细胞团和碎片，然后在RT下在400g下离心4分钟。在将所得物再次悬浮与lmL的CATCH(使用含有5%FBS的PBS以1:1进行稀释)中之后，通过将细胞与对抗CD16和CD32的抗体预温育来阻断抗体的非特异性结合。将细胞用与FITC缀合的抗CD41抗体在水上标记30分钟，然后用4mL的CATCH(使用含有5%FBS的PBS以1:1进行稀释)洗涤。将所得物在RT、400g下离心4分钟之后，将所得的细胞再次悬浮于lmL的低渗碘化丙啶(50ng/mL，溶于O.1%柠檬酸钠中)中，然后在冰上温育15分钟。然后加入核糖核酸酶，直至其最终浓度为50pg/mL，在RT下温育30分钟之后，将细l包过滤通过100iam的细胞过滤网，并进行分析。^f贞微裙法将富含血小板的血浆在溶于0.1M二曱胂酸盐緩冲剂(含有2mMCaCl)中的10体积2.5%戊二醛和2.0%曱醛中稀释，并将得自股骨的骨髓冲洗到上述溶液中。在固定1.5h之后，将样品用0.1M的二曱胂酸盐緩沖剂洗涤两次，然后在1%四氧化锇/0.1M二曱胂酸盐緩沖剂中后固定lh。将样品用緩沖剂洗涤，然后通过一系列浓度等级的乙醇脱水，在用环氧丙烷进行中间脱水，接着4吏用GlauertEMBED树脂混合物进行逐渐的树脂过滤从而进入到环氧丙烷中，然后再使用纯树脂进行过滤。之后，将样品放置于具有纯树脂的BEEM胶嚢中，并在60'C下治疗2天。切下500pm厚的切片，并使用曱苯胺蓝复染色。随后，切下60nm薄的切片，并使用1%的水性乙酸铀酰和Reynold柠檬酸铅水溶液染色。使用透射电子显微镜观察网格。使用Gatan2kx2kCCD照相机获取数字图像。或这#建沐如上所述，将用于FLAG标记的野生型或突变体小鼠Bcl-Xh以及HA标记的人Bax或Bak的哺乳动物表达载体亚克隆到pEFPGKpuro或pEFPGKhygro中(Chenet".，2005;Huang""，EMBO.J.，764628-4638，1997;O'Connora/.，EMBO.J.，77:384-395，1998)。通过亚克隆到pMIG载体中制得用于人Bims和人Noxa的逆转录病毒表达构建体(Chena/.，2005(^//ra))，以及通过亚克隆到pMIH载体中制得用于野生型或突变体小鼠Bel-^的逆转录病毒表达构建体(MSCV-IRES-潮霉素)(vanDelftWa/.，2006"w/7ra))。通过测序证实了所有的构建体，并且寡核苷酸和构建体的详细情况可得自作者。遂织培#、勿應ys亡谬,、逆橫,秀病毒惑染以及细應源亡趁^将细胞系(HEK293T:永生的人胚胎肾细胞系，PhoenixEcotropic包装细胞，以及小鼠胚胎成纤维细胞"MEF")培养与补充有10%胎牛血清的Dulbecco，sModifiedEagles(DME)培养基中，在某些情况下，所述的培养基补充有250L-天冬酰胺和502-巯基乙醇。按照之前所述的方法，由E13-14.5胚胎得到所有的MEF(ChenWa/.，20050"prs);WillisWa/.，2005(s"jwa))。按照之前所述，在高水平的IL-3存在下，通过将E14.5胎儿肝脏单细胞悬浮液与表达HoxB8逆转录病毒的成纤维细胞共培养而得到IL-3依赖性(因子依赖性骨髓-FDM)细胞系(Ekerte,a人，2004(wpw))。通过使用pMIH逆转录病毒对所述的细胞进行逆转录病毒感染而形成表达Bcl-x^或其突变体的细胞(ChenWa人，2005(w/ra))。按照之前所述，使逆转录病毒构建体瞬时转染到PhoenixEcotropic包装细胞中，并使用病毒上清液感染细胞(Chenefa人，2005(swpra))。通过加入lmg/mL的潮霉素来选择进行表达的细胞汇聚物。使用ABT-737(至多5—，AbbottLaboratories(Oltersdorf"a/.，2005(M/ra))、依托泊戒(至多100joM,Pharmacia)或星孢菌素(IOhM，Sigma)诱导细胞死亡；此外，在某些试验中还加入50qVD.OPh(EnzymeSystems)。通过流式细胞M义(用于排除了多典化丙突:的细胞)或者通过使用血球计数器进行人工计数来测定细胞的生存能力。^€瘦沉/定、龙嫂伊遊和名嫂染g在包含1%TritonX-100(TX-100)的裂解緩冲剂(20mMTris-pH7.4，135mMNaCl，1.5mMMgCl2，1raMEGTA，10%甘油)中制备细胞裂解物，其中所述的裂解緩冲剂补充有蛋白酶抑制剂(RocheandSigma)。按照之前所述，^f吏用对抗FLAG(M2:Sigma)或HA(HA.11:CRP)的小鼠单克隆抗体进行免疫沉淀(Chen"a/.，2005"叩ra);Huang"a/，1997(卿ra);O'Connor"a人，1998);使用小鼠抗-Glu-Glu(MMS-115R:CRP)进行对照免疫沉淀。通过SDS:PAGE(Novexgels:Invitrogen)分辨蛋白质，并将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后使用大鼠单克隆抗HA(3F10:Roche)和抗FLAG(9H1，(Wilson-Annana/.，J.Cell.Biol.,7^:877-888，2003)的抗体通过免疫印迹进行检测。用于免疫印迹的其他抗体为小鼠单克隆抗Bel-xL(2H12;BD)、抗Bcl-2(克隆7;BD)、抗人Bc卜2(Bcl-2-100)、抗肌动蛋白(AC40;Sigma)、抗Bax(2D2和5B7:Sigma)、抗Mcl-l(克隆22:BD);大鼠单克隆抗Mcl-l(14C11;DHuang，未公开)、兔多克隆抗Bak(B5897:Sigraa)、抗Mcl-l(Rockland)、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(585;giftofY.Lazebnik)、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的裂解的p17片段(AB3623;Chemicon)、抗凝溶胶蛋白(DKwiatkowski赠送)(Kothakota"a/.，Science,"《294-298，1997);仓鼠单克隆抗小鼠Bcl-2(3F11;BD)。二级抗体包括与HRP缀合的抗大鼠或抗仓鼠的IgG(SouthernBiotech)、抗小鼠或抗兔的IgG(Chemicon)、以及抗小鼠IgGFcY链的特异性抗体(JacksonImmunoResearch)。-使用增强化学发光法(ECL;GEHealthcare)检测所述的蛋白质。此外，通过使用小鼠单克隆抗FLAGM2抗体进行免疫染色、然后与FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(lOng/mL;SouthernBiotech)温育，来检测经FLAG标记的Bel-i的表达情况；使用FACScan(BD)分析所述的样品。以每日单剂量的给予方式，向小鼠腹膜内注射75mg/kg的ABT-737。将ABT-737(1g/mL，溶于DMS0)原溶液在由30%丙二醇，5%Tween80以及65%D5W(5%右旋糖水溶液)形成的混合物(pH4-5)中稀释；DMS0的最终浓度小于1%。庠伴j&V、炎^/试使用肝素化的注射器由所示的小鼠中收集血液，并以l:5在具有lmg/mL的前列腺素12的葡萄糖柠檬酸緩沖盐(bufferedsalineglucosecitrate)中稀释。在具有知情同意书的情况下获得人全血(获得伦理文员会(theInstitutionalReviewBoard)的认可)。获得富含血小板的血浆，并在室温下与药物或对照物温育至2h。使用血球计数器以人手方式对血小板进行三次计数。实施例11本文所示的这些结果确定，Bcl-x^为血小板存活的主要的内稳态调节剂。与此相反，其他类Bel-2的促存活蛋白质没有起到重要的作用。Bcl-&在体内或体外的基因或药理学拮抗作用使得血小板的存活和寿命期对剂量的依赖性减少，但是在Bcl-2，Bcl-w或Mcl-1中发生突变则不会如此。此外，由于BH3模拟化合物ABT-737没有靶向这些促存活Bel-2家族成员，所以没有考虑促存活Mcl-1或Al在体内的作用(Oltersdorfa厶，2005(swpra);vanDelfta/.，2006)。Bel-Xl在保持血小板存活中的独特作用与其在血小板形成中所提出的相关作用不同。Bel-2在造血区间的过表达导致血小板减少(0gilvya/.，1999(Si/pra))，而编码促细胞凋亡唯BH3蛋白质Bim的基因发生缺失也会发生血小板减少(Bouilleta/.，1999(w/ra))。此外，Bc1-Xl或Bc卜2在巨核细胞中的过表达损害前血小板的形成(DeBottone"入，Blood纖1310-1317，2002;KaluzhnyWa/.，2002(wpra))。考虑到活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是血小板脱落所必需的这些证据，上述数据表明了在大量的"副细胞凋亡，，(Thielee"厶，Acta.Haematologica.,夕7:137-143，1997)的细胞质再造(其中巨核细胞开始产生血小板，所述的细胞质再造如同在垂死细胞中，见察到的细胞质起泡的过程)中的细胞凋亡的机制。虽然对血小板生物形成有确切贡献的多种细胞凋亡调节剂仍有待确定，但是本文可以得出这样的结论，Bcl-x^并非绝对为巨核细胞增殖和分化所必需的。此外，也研究了细胞凋亡调节剂在血小板脱落过程中的作用。在非限定性实施方案中，本文提出，血小板继承而来的Bc1-Xl的量确定了其寿命期。由于经过一段时间后Bel-Xl被降解，所以会达到阈值，此时促细胞凋亡Bak被释放，并且血小板细胞凋亡净皮诱导。以基因或药理学方式抑制Bel-^会加速"分子时钟"，由此带领至进入点，从而进入细胞死亡以及随后进行的循环系统中血小板的清除。所述的模型由本文所述的观察结果所支持，其中所述的观察结果为Bcl-xt和Bak具有不同的半衰期在新蛋白质合成缺乏的条件下，BclU匕Bak更快降解。考虑到它们有限的合成能力，因此期望所有其他的方面是同等的，即，在老化的血小板中，相对于Bak,Bel-^不会遭遇无情的减少。事实上，之前的报道表明，在储存于37。C下的血小板中，Bak的水平是稳定的(Browneta人，J.Biol.Chem.，2":5987-5996，2000)，Bel-xL的水平随时间流逝降低(Bertinoa人，Transfusion(Paris),857-866，2003)。必然的结果为，与较幼嫩的对应血小板相比，含有较少Bel-x^的较老的循环血小板更容易受到ABT-737作用的影响，并且我们的试验(使用抗血小板血清，然后进行ABT-737处理)清楚地表明了所述的情况。这可能解释了，在每天使用ABT-737进行处理的小鼠中，血小板的数量几乎恢复到正常值，而每周接受所述药物的小鼠则表现为急性发作血小板减少，并在两次注射之间分散有血小板完全恢复的情况。在持续抑制Bc1-Xl的情况下，血小板的年龄概况大概发生了变化，这样循环群中主要包括更难以受到ABT-737控制的幼嫩细胞。在每周注射后，随着药物的清除血小板的年龄概况反而恢复到正常，因此循环中的血小板群对ABT-737是正常敏感的(normosensitive)。拮抗血小板中的Bcl-xt的制剂会导致血小板减少，这成为临床上抑制Bel-Xt的替代生物标记物。因此，本研究证明，用于细胞程序性死亡(细胞凋亡)的内在机制调节了无核血小板的寿命期。血小板的存活以及由此得到的寿命期取决于抑制促细胞凋亡蛋白质Bak和/或Bax的促存活Bcl-x"之前已经才艮道，无核细胞质能够发生细胞凋亡(Jacobsonefs人，EMBO.J.，":1899-1910，1994)。据我们所了解，血小板为不仅能够进行细胞程序性死亡、而且其寿命期可以通过促存活和促细胞凋亡因子之间的相互作用来控制的非操作性无核细胞的第一实例。所述的研究表明，在控制血小板存活的重要基因中发生的突变说明了遗传性或获得性血小板减少和血小板增多的某些情况。通过抑制细胞凋亡来促进血小板存活的策略在患有血小板减少的某些患者中是有利的。与此相反，患有血栓形成状况或血小板增多的患者将受益于使用促进细胞凋亡的制剂(例如BH3模拟物，如ABT-737)而进行的处理，从而促进血小板破坏并由此预防与未受控的凝集有关的后遗症。本发明提供了用于在输注前处理和储存血小板的方法。在离体中所观察到的血小板生存能力的快速降低涉及细胞凋亡过程-血小板储存损伤(Lie"入，Transfusion(Paris),^ft1320-1329，2000)。事实上，虽然在储存于37。C下的人血小板中Bc1-Xl的水平降低，但是在经过在22。C下的常规血库储存过程的血小板中Bc1-Xl的水平似乎没有降低(BertinoWW.，2003)。根据我们的发现，保持Bc1-Xl:Bak和/或Bax的平衡以有利于Bel-x"将为重要的机制，通过该机制，血小板的生存能力在于室温下和低温下的储存过程中得以保持。因此，通过使用用于稳定Bel-xt或抑制Bak和/或Bax的细胞凋亡抑制剂可以预计在储存并且甚至可能在输注后的过程中血小板的生存能力发生有价值的改善。例如，可以将通过促进Bcl-^的水平和/或活性而抑制细胞凋亡的制剂，与已经收集以用于离体储存及随后向有需要的受试对象进行施用的血小板相接触。可以将用于促进Bcl-Xt而有利于Bak和/或Bax的制剂在由供者收获血小板的过程中(例如通过将所述的制剂供入到收集容器中)加入到血小板中。备选地，可以在血小板的离体储存过程中或者在血小板的再输注给受试对象的过程中加入制剂。类似地，可以将拮抗Bak和/或Bax的水平和/或活性的制剂与将进行离体储存从而在其后向有需要的患者进行施用的血小板相接触。可以将细胞凋亡抑制剂与血小板相接触，从而增强可以向受试对象进行施用的储存的血小板的半衰期、生存能力或存活。例如，所述的制剂可以将储存的血小板的半衰期或存活增大10%或更大、20%或更大、30°/或更大、40%或更大、以及50%或更大。在另一实施方案中，所述的制剂可以将促细胞凋亡制剂的活性抑制20%或更大、30%或更大、40%或更大、50%或更大、60%或更大、70%或更大、80%或更大、或90%或更大。多个研究组已经对抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(下游破坏酶)是否可以有效地延迟与储存有关的血小板生存能力的降低进行了检测。即使酶活性发生了减小，但是对血小板的生存能力仍几乎不产生影响(Bertinoefa/.，2003Brownefa/.，2000Cohene"厶，Th函b.Res.，7":387-393，2004;Lie"/.，2000(w;ra))。这可能反映了一些抑制剂的半衰期短，或者在完全破坏半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性方面发生失效，这是因为低水平的活性就足以造成细月包凋亡(Methot,efa/.，J.Exp.Med.，"义199-207，2004)。更可能的是，即使完全抑制了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的活性，也不能防止由活化的Bak诱导的细胞器(特别是线粒体)损坏(Greena/.，2004(s";ra))。在该实施方案的一个方面中，在Bcl-xL:Bak和/或Bax轴的水平下抑制细月包凋亡级联过程被建议用于克服这种重要的限制。实施例12iV、炎W^存錄力和^然W检灣血小板功能的检测在(例如)Goncalvesa/.，J，Biol.Chem.，278(37):34812，2003;Maxwell"a/.，J.Biol.Chem.,279(31):32196，2004;Manginefa7.，J.Biol.Chem.，278(35):328802003;以及Bakimere"/.，J.Clin.Invest.,89(5):1558，1992中有所描述。特别重要的是下文所述的检测。i)标准的血小板功能检测a)血V、炎凝桌一这种相对简单的技术涉及在血小板活化物质存在下搅拌血小板悬浮液，并监测能够精确地监测溶液中血小板团块(凝集)的装置中光透射的变化。该检测可用于测定主要血小板整合素otmP3(GPIIb-IIIa)的粘附功能的变化。b)^^,杀:##放^趁*一血小板致密颗粒中储存有多种核苷酸(ADP和ATP)以及血小板的其他小分子活化剂(血清紧张素、肾上腺素和组胺)。这些分子在血栓发展过程中由血小板释放出来，并且在保持血小板活化中起到主要作用。检测"C血清紧张素的释放为检测致密颗粒分泌物中的缺陷的简单且可靠的方法。c)^4'^^^/"炎法一检测血小板活化的多种标记物(例如GPIIb-IIIa的活化、P选择素的释放以及的磷脂酰丝氨酸的暴露)的表面表达在定义血小板活化途径中的特异性异常中是重要的。这些标记物表达中的缺陷通常分别与血小板凝集、a-颗粒的分泌以及促凝剂功能的异常有关。d)盏7、丧輪/^#^的检游一可以对血小板与多种基质(包括纤维蛋白原和vonWUlebrand因子)之间的相互粘附作用进行分析。结合诸如全内反射荧光法和荧光显微技术之类的成像技术，这些检测系统可以对细胞形态、受体动力学和近膜处信号事件中的变化进行同时分析。这些检测方法可特别用于定义膜流动性中的变化、现有时空信号传递事件以及细胞骨架的变化。H)基于体外流动的血栓症模型a)与趟^^j&舍多成f冷^^/^的j^V、我一这些检测涉及在宽泛的血液流动条件下，分析血小板与经纯化的vonWillebrand因子、胶原蛋白或纤维蛋白原的粘附情况。所述的简化流式检测法帮助定义在血小板粘附应答中的特异性异常和所涉及的可能受体。b)在j&發歩成4面J:j&V、我j&趁的移4—该检测方法涉及将天然或抗凝全血灌注到经胶原蛋白或纤维蛋白原/vWf包被的表面上，以及使用共聚焦显微镜检测血栓生长的3D动力学。c)就动炎,悉V、威活/A/#况一通过使用钙指示剂染料，我们可以监测到钙流量(血小板活化的敏感标记物)与血小板形态学及粘附动力学同时发生变化。这是一种用于检测血小板粘附和活化情况的时空动力学的强力检测系统。d)在岸伴i#皇尹/^Wj^V、^j^趁^多成一该检测方法涉及灌注天然或抗凝全血通过得自啮齿动物或人组织样品的经分离的血管节段。通过机械或光化学手段，使用FeCl3诱导血管损伤，并使用多种活细胞成像技术检测血小板血栓的形成情况。这是一种可用于检测在与血小板和白细胞的血管反应性中所发生的潜在变化的有用技术，从而形成扩大的血栓形成应答。iii)体内血栓症的模型a)Fo/"fj&發症模型一Folts模型主要在大型动物中使用，并且被认为是黄金标准试验血栓症模型之一。该模型适用于研究小鼠颈动脉血栓形成。所述的模型涉及在动脉狭窄区域造成反复的挤压损伤，从而使血小板暴露于内皮下血栓形成成分以及高剪切应力(其为促进血栓生长的两个重要因素)下。小鼠中闭塞性血栓的发展通常在血管损伤的2-3分钟内发生，并且血管的机械搅动导致血栓的栓塞以及正常血液流动的恢复。血栓的持续形成及移动会导致循环流动减慢(CFR)，其为Folts模型的特有特征。血栓为特征性的血小板富集，而CFR的消除则是血小板功能障碍/抑制的标志特征。b)迨席##型一此外，电解血栓症模型主要用于大型动物中，并在较大的血管中导致发展成血小板富集的血栓。所述的模型适用于使小鼠的非狭窄形态的颈动脉产生电解损伤。电解损伤导致整个厚度的血管损伤，从而引发在小鼠中形成血小板富集的血栓(由组织学所证实)(其最终闭塞动脉15-20分钟)。与Folts模型相似，电解模型为评估血小板功能缺陷的优异系统。c)^^<^银^#藝一Folts和电解模型的局限是不能直接显现血栓生长的动力学。已经使用活体显微镜来显现在激光诱导血管损伤之后在小鼠的肠系膜小动脉中的血栓的发展。在这种模型中，将肠系膜由腹部取出，并通过脉沖氮染色激光器(440nm;MicropointLaserSystem,PhotonicsInstruments,StCharles,IL)诱导的损伤定位于小动脉的内腔表面上。该模型通过调整激光的强度而得到分级的血管损伤。可以使用倒置LeicaDMIRB显微镜直接观察血小板的粘附和凝集以及血栓发展的全部动力学。本模型在定义血小板粘附功能的缺陷方面是经过良好表征的。实施例13#c7-J无效勿應的检-1.绪论在Mc卜l(+)细胞中，通过化合物ABT-737诱导细胞凋亡。所述的细胞可以通过通用的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Q-VD-OPH的作用而被救助。本检测方法有助于发现具有与Q-VD-OPH的作用相当的其他化合物。总而言之，使细胞在第l天分裂，从而使其在第2天具有60-80%汇合率。在第2天，以确保至检测的第4天细胞不会汇合的密度，将所述的细胞接种到检测板中。将检测板在室温下温育20-60分钟，然后转移到37X:下，使得边缘效应最小化。鉴于同样的原因，在温育器中，检测板不再叠堆于彼此的顶部。在第3天，将所述的细胞首先用Q-VD或WEHI文库化合物进行处理。将所得的细胞在文库化合物存在下温育2小时，然后使用ABT-737进行处理。最后，在第4天，将所得的细胞在CellTitre-BlueCellViabilityAssay存在下温育4小时。所得的产物包含刃天青，其由活性细胞代谢成试卣灵。在4小时后，测定试卣灵的水平。2.反应物、消耗品和仪器使Mc卜l(—"小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在Iwaki75(^2组织培养烧瓶(cat#3U3-075)中生长。使MEF在FMA培养基中生长，其中所述的FMA培养基由以下成分构成89%廳Kelso10。/。热灭活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03)1%lOmM天冬酰胺(Flukacat#11149).275^1的1:2000稀释的2-巯基乙醇被加入到最终体积为500ml的FMA(Sigmacat#M7522;在MT-PBS中稀释)中FMA在4。C下储存，并在37。C下使用。使用FMA培养基、MT-PBS(Parkvillestores)和胰蛋白酶(Parkvillestores)培养MEF，并收获该细胞。所有的反应物都是在4'C下储存，并在37。C下使用的。对于检测而言，将细胞接种于仅含有1%FCS的FMA培养基中。其中所述的培养基由以下成分构成98%醒Kelso(Parkvillestores).1%热灭活的胎牛血清(FCS)(Hyclonecat#SH30396.03).1%lOmM天冬酰胺(Flukacat#11149)275|ia的1:2000稀释的2-巯基乙醇被加入到最终体积为500ml的FMA(Sigmacat#M7522;在MT-PBS中稀释)中将检测物接种于具有平坦且清晰的底面的、Corning384孔组织培养级的黑色平板(DKSHAustraliaP/Lcat#3712)中。在Matrical384孔的5(^1V底培养板中制备化合物(cat#MP101-2-PP)。使用得自BeckmanCoulter的密封箔(cat#538619)将所述的化合物板密封过夜储存。将AnalaR级DMSO用于化合物的制备和滴定(Merckcat#1.02952.2500)。将台盼蓝溶液(0.4%)(SigmaT8154)用于细胞计数。CellTitre-Blue细胞生存能力检测仪得自Promega(cat#G8081)，并在-20。C下储存、在37X:下使用。将Q-VD-OPH通用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂(MPBiomedicalscat.#OPH109)用作阳性对照。Multidrop384(ThermoLabsystems)用于将细胞接种于检测板中，并向细胞中加入CellTitre-BlueTM生存能力反应物。将ZymarkScicloneALH3000系统用于加入对照物和化合物。WallacEnVision板读取器(PerkinElmer)用于在入^535nm/入^590nm下测定荧光。3.方法3.1第1天一细胞分裂由细胞中吸出培养基，然后将所得的细胞用10ml温暖的MT-PBS洗涤。将PBS吸出，并将2ml的胰蛋白酶加入到烧瓶中。将该烧瓶放置于37。C下，直到细胞分离为止。使用FMA培养基(6ml)洗涤烧瓶底部的胰蛋白酶和细胞。将全部的容量转移至50ml的离心管中，并在250xg下离心3分钟。吸出上清液，然后将沉淀再次悬浮于4ml10°/。的FCSFMA中。将1毫升的这种细胞悬浮液加入到装有"ml10%FCSFMA培养基的干净的75ci^烧瓶中，由此以1:4进行分裂。根据之后几天的检测所需的细胞的数量，通过将剩余细胞悬浮液转移到其他75cii^烧瓶中来重复上述过程。用条形码对第2天使用的检测板进行标记。3.2第2天一接种检测板及制备对照板重复第1天的方案，直至细胞沉淀的时间点，并吸出上清液。将沉淀再次悬浮于10ml1%的FCSFMA中。在1.5ml的管中，使用800^1水、lOOjnl细胞悬浮液和IOOjliI台盼蓝溶液制备1:10的稀释液。将所得的细胞涡旋混合，然后使用血球计数器进行计数。计算在所需的体积中获得2xl(T个细胞mr(在装有50pl培养基的每个孔中具有1000个细胞)的密度所需的稀释液，并在1%的FCSFMA中进行稀释。使用Multidrop系统将细胞接种于检测板的所有384个孔中。建立所述的系统，从而将50pl的细胞悬浮液递送至每个孔中。使用无菌盒头(cassettehead)，并在使用前用无菌蒸馏水充分漂洗。将检测板在室温下静置60分钟，然后在37。C/5。/。C02下放置过夜。其中检测板并非堆叠放置。在Matrical化合物板中建立Q-VD-OPH和ABT-737板。使用原溶液浓度为12.5mM(其为在25一细胞中形成的最终浓度)的Q-VD。将10^1的这种原溶液^t置于23和24到的孔I-P中。在所有剩余的孔中，分配有lO)nl的DMSO。ABT-737的原溶液浓度为10mM，并以10^M(其为在20nM的细胞中形成的最终浓度)用于所述的化合物板中。由此，进行1:1000的稀释，然后将10jal的稀释液分配到除了23A-D,24A-D，23I-L和241-L以外的384孔Matrical板的所有孔中。将DMSO(10pl)分配到所述的16个孔中。然后，将这两种板用箔密封，并在12。C下储存过夜。3.3第3天一处理所述的细胞1.由冰箱中取出文库板，并在使用前使其在室温下解冻30-60分钟(注意加入Q-VD-0PH的过程花费了~60分钟，使得在加入Q-VD-0PH的同时4吏所述的板可以解冻)。Itisimportantthatthe2.建立Zymark系统。开启HEPA过滤器单元，检查针工具以确保其是干净的且无负载的，然后使用吸墨纸、乙醇和DMSO建立平台(参见图表l)。3.将Q-VD-OPH加入到细胞中。为了进行该操作，将Q-VD-OPH板放置在平台(参见图表l)上，并使该板的Al角面对其中EnVision计算机所坐落的空间角落。将检测板放置在前方Twister的叠堆l中(参见图表l)。在Zymark台式计算机上,打开ClaraExecutionManager。通过点击"Initialize"按钮，使所有的部件初始化。一旦完成初始化过程，l更由ApplicationChain窗口中移除任何旧应用程序，并按照以下所述的次序添加以下的软件(对于每个应用而言，你需要输入运行的号，即，你要处理的检测板的号)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload一旦所述的过禾呈就绪并确i人，寸更会出现MaterialInitialization屏幕，并确认。然后出现一个ZymarkStackStorage系统窗口，并访问配置菜单。选择"New",然后选择"ControlAddition"，并确认。再次访问配置菜单，并对"ControlAdditionRestack"程序重复所述的过程。一旦完成上述过程，便点击Clara上的"Run"按钮，由此开始运行。在运行结束时，将检测板留在堆叠器上，并将Q-VD-OPH板由Zymark平台上取下。4.然后开始加入文库化合物。将所述的化合物板放置在后方Twister的叠堆1中，并使Al面对MiniTrak(参见图表1)。由Clara的ApplicationChain中移除旧的应用程序，并按照以下的次序添加新的软件，并且对于每个应用而言，输入运行的号1.PintoolAdditionCorning2.PintoolUnload一旦完成上述过程，4更可以确认，然后检查MaterialInitialization窗口并确认。然后出现一个ZymarkStackStorage系统窗口，并访问配置菜单。选择"New"，然后选择"ControlAddition"，并确认。一旦完成上述过程，便点击Clara上的"Run"按钮，由此开始运行。在运行结束时，将检测板再盖上，并返回至37°C/5%C02，再持续剩余的2小时(从向第一个检测板中加入化合物开始计时一对于运行20个板而言，通常大约30分钟)。将文库板再盖上并返回至冰箱中储存。7.在2个小时的温育结束时，加入ABT-737。将Q-VD板》丈置在所述的平台上(参见图表1)，并使该板的Al角面对其中EnVision计算机所坐落的空间角落。将检测板放置在前方Twister的叠堆1中。在Zymark台式计算机上,打开ClaraExecutionManager。通过点击"Init.ialize"按钮，使所有的部件初始化。一旦完成初始化过程，便从ApplicationChain窗口中移除任何旧的应用程序，并按照以下所述的次序添加以下的软件(对于每个应用而言，你需要输入运行的号，即，你要处理的检测板的号)1.ControlAddition2.ControlAdditionRestack3.PintoolUnload一旦所述的过程就绪并确i人，^f更会出现MaterialInitialization屏幕，并确认。然后出现一个ZymarkStackStorage系统窗口，并访问配置菜单。选择"New"，然后选择"ControlAddition"，并确认。再次访问配置菜单，并对"ControlAdditionRestack"程序重复所述的过程。一旦完成上述过程，便点击Clara上的"Run"按钮，由此开始运行。在运行结束时，将检测板再盖上，并返回至37t:/5%C02,然后从Zymark平台上移出ABT-737板。8.关闭HEPA过滤器，DMSO和乙醇储存器已空且耗尽，然后按照以下的程序清洗针工具-在VP清洗溶液中浸渍10x;在VP清洗溶液中静置5分钟；blot-在MQ水中浸渍10x;blot-在100%乙醇中浸渍10x;blot3.4第4天一生存能力分析将CellTitre-BlueTM加温至37。C,然后使用Multidrop将lO^il的CellTitre-BlueTM加入到测试板的各孔中。然后使所述的板返回至37°C4小时，然后加载到EnVision板读取器中。进行生存能力测试，然后将所得的数据输入至Abase(IDBS)中以用于分析。实施例14^爱试对虞#谬逸參^J^定犮^类翁寧使用在实施例13中列出的方法筛选已知化合物的文库。初步分析结果显示出了多种活性分子，其为皮质类甾醇并符合以下结构式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage102</formula>式l——可以是单键或双键A=H或F、B=H、CH3、F或OHR=H或C2-C6AcylR,=H，OH或OC2-C6AcylR2=H，Me或R,和R2形成二氧戊烯环具体而言，这些制剂(参见图10)能够显著地抑制ABT-737对Mcl-1无效MEF细胞的灭杀作用。因此，这些制剂适用于增强或延长血小板生存能力寿命期或存活的本发明的方法中。此外，所述的制剂在延长或保持其他细胞寿命期的治疗干预中具有广泛的应用。本领域的技术人员将会理解，本文所述的发明除了本文具体描述的那些以外，容易形成多种变体和修改形式。应该理解本发明包括所有这些变体和修改形式。本发明还包括在本说明中所提及或叙述的所有步骤、特征、组合物和化合物(单独地或结合地)，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有的组合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>表2减^凝亚类亚类—酸性碱性带电荷的小型极性/中性茅^类参询鋩承々的戎差氨基酸天冬氨酸，谷氨酸非环状的精氨酸，赖氨酸；环状的组氨酸天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸，苏氨酸，脯氨酸天冬酰胺，组氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸天冬^麽，各减教應激疯凝，镄减^，#;*^^，^桌^,末丙^凝，惑桌^表3<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表4非常规氨基酸的代码非常规氨基酸代码非常规氨基酸代码a-氨基丁酸AbuL-N-甲基丙氨酸Nmalaa-氨基-a-曱基丁酸MgabuL-N-甲基精氨酸Nmarg氨基环丙烷羧酸CproL-N-曱基天冬酰胺NmasnL-N-曱基天冬氨酸Nmasp'氨基异丁酸AibL-N-甲基半胱氨酸Nmcys氨基冰片基羧酸NorbL-N-甲基谷氨酰胺NmglnL-N-甲基谷氨酸Nmglu环己基丙氨酸ChexaL-N曱基组氨酸Nmhis环戊基丙氨酸CpenL-N-曱基异亮氨酸NmileD-丙氨酸DalL-N-曱基亮氨酸NmleuD-精氨酸DargL-N-甲基赖氨酸NralysD-天冬氨酸DaspL-N-曱基蛋氨酸NmmetD-半胱氨酸DcysL-N-甲基正亮氨酸NmnleD-谷氨酰胺DglnL-N-曱基正缬氨酸NmnvaD-谷氨酸DgluL-N-曱基鸟氨酸NmornD-组氨酸DhisL-N-曱基苯丙氨酸NmpheD-异亮氨酸DileL-N-曱基脯氨酸NmproD-亮氨酸DleuL-N-曱基丝氨酸Mms6rD-赖氨酸DlysL-N-曱基苏氨酸NmthrD-蛋氨酸DmetL-N-甲基色氨酸NmtrpD-鸟氨酸DornL-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸DpheL-N-甲基缬氨酸NmvalD-脯氨酸DproL-N-曱基乙基甘氨酸NraetgD-丝氨酸DserL-N-甲基叔丁基甘氨酸NmtbuD-苏氨酸DthrL-正亮氨酸NleD-色氨酸DtrpL-正缬氨酸NvaD-酪氨酸DtyrD-缬氨酸DvalD-a-甲基丙氨酸DmalaD-a-曱基精氨酸DmargD-a-曱基天冬酰胺DmasnD-a-曱基天冬氨酸DmaspD-a-甲基半胱氨酸DmcysD-a-甲基谷氨酰胺DmglnD-a-曱基组氨酸DmhisD-a-曱基异亮氨酸DmileD-a-曱基亮氨酸DmleuD-a-曱基赖氨酸DmlysD-a-甲基蛋氨酸DmmetD-a-曱基鸟氨酸DmornD-a-曱基苯丙氨酸DmpheD-a-曱基脯氨酸DmproD-a-曱基丝氨酸DmssrD-a-甲基苏氨酸DmthrD-a-曱基色氨酸DmtrpD-a-甲基酪氨酸DmtyD-a-曱基缬氨酸DmvalD-N-曱基丙氨酸DnmalaD-N-甲基精氨酸DnmargD-N-甲基天冬酰胺DnmasnD-N-曱基天冬氨酸DnmaspD-N-曱基半胱氨酸DnmcysD-N-甲基谷氨酰胺DnmglnD-N-甲基谷氨酸DnmgluD-N-曱基组氨酸Dnmhisa-曱基-氨基异丁酸酯Maiba-甲基，-氨基丁酸酯Mgabua-甲基环己基丙氨酸Mchexaa-曱基环戊基丙氨酸Mcpena-甲基-a-萘基丙氨酸Manapa-曱基青霉胺MpenN-(4-氨基丁基)甘氨酸NgluN-(2-氨基乙基)甘氨酸NaegN-(3-氨基丙基)甘氨酸NornN-氨基-oc-曱基丁酸Nmaabua-萘基丙氨酸A卿N-千基甘氨酸NpheN-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸NglnN-(氨基曱酰基甲基)甘氨酸NasnN-(2-羧乙基)甘氨酸NgluN-(羧曱基)甘氨酸NaspN-环丁基甘氨酸NcbutN-环庚基甘氨酸NchepN-环己基甘氨酸NchexN-环癸基甘氨酸NcdecN-环十二烷基甘氨酸NcdodN-环辛基甘氨酸NcoctN-环丙基甘氨酸NcproN-环十一烷基甘氨酸NcundN-(2，2-联苯乙基)甘氨酸NbhmN-(3,3-联苯丙基)甘氨酸NbheN-(3-胍乙基丙基)甘氨酸NargN-(1-羟乙基)甘氨酸NthrN-(幾乙基))甘氨酸NserD-N-曱基异亮氨酸DnmileN-(咪唑基乙基))甘氨酸NhisD-N-曱基亮氨酸DnmleuN-(3-e引哚基乙基)甘氨酸NhtrpD-N-曱基赖氨酸DnmlysN-曱基—Y—氨基丁酸酯NmgabuN-曱基环己基丙氨酸NmchexaD-N-曱基蛋氨酸DnmmetD-N-曱基鸟氨酸DnmorriN-曱基环戊基丙氨酸NmcpenN-甲基甘氨酸NalaD-N-曱基苯丙氨酸DnmpheN-曱基氨基异丁酸NmaibD-N-曱基脯氨酸DnmproN-(l-甲基丙基)甘氨酸NileD-N-曱基丝氨酸DnmserN-(2-曱基丙基)甘氨酸NleuD-N-曱基苏氨酸DnmthrD-N-曱基色氨酸DnmtrpN-(1-曱基乙基)甘氨酸NvalD-N-曱基酪氨酸DnmtyrN-甲基-萘基丙氨酸NmanapD-N-曱基缬氨酸DnmvalN-曱基青霉胺NmpenY-氨基丁酸GabuN-(r羟苯基)甘氨酸NhtyrL-卜丁基甘氨酸TbugN-(硫代甲基)甘氨酸NcysL-乙基甘氨酸Etg青霉胺PenL-高苯丙氨酸HpheL-a-甲基丙氨酸MalaL-a-曱基精氨酸MargL-a-曱基天冬酰胺MasnL-a-曱基天冬氨酸MaspL-a-曱基叔丁基甘氨酸MtbugL-a-曱基半胱氨酸McysL-曱基乙基甘氨酸MetgL-a-甲基谷氨酰胺MglnL-a-甲基谷氨酸酯MgluL-a-甲基组氨酸MhisL-a-曱基高苯丙氨酸MhpheL-a-曱基异亮氨酸MUeN-(2-曱基硫代乙基)甘氨酸NmetL-a-曱基亮氨酸MleuL-a-曱基赖氨酸MlysL-a-甲基蛋氨酸MmetL-a-曱基正亮氨酸MnleL-a-甲基正缬氨酸MnvaL-a-曱基鸟氨酸MornL-a-曱基笨丙氨酸MpheL-a-曱基脯氨酸MproL-a-曱基丝氨酸Ms6rL-a-甲基苏氨酸MthrL-a-曱基色氨酸MtrpL-a-曱基酪氨酸MtyrL-a-甲基缬氨酸MvalL-N-曱基高苯丙氨酸NmhpheN-(N-(2,2-联苯乙基)NnbhmN-(N-(3，3-联苯丙基)Nnbhe氨基曱酰基曱基)甘氨酸氨基曱酰基甲基)甘氨酸1-羧基-1-(2,2-联苯-Nmbc乙基氨基)环丙烷表5添力口齐'jBlastGGMMMeg盐1219714122i3ABT-737(1yM)1614614114之6表6<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>所示的值为平均值±l标准偏差MCV，平均红细胞体积；MPV，平均血小板体积所有的小鼠都是近交BALB/c背景的，除了Ac7-Z，w。以外，其为C57BL/6和BALB/c的混合参考文献Adams,GenesDev.,77:2481-2495，2003.Altschula/.，Nucl.AcidsRes.Z5.'3389,1997.Arkine"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,約7811—7815,1992.Aulte"/.，Exp.Hematol.，"996-1001，1992.Ausubela/.，Ci/rre/7f尸rofocoh/'/7#o/ecw/arA2'0/0^7JohnWiley&SonsInc，1994-1998，Chapter15Ausubel(Ed)Ci/7Te/7f尸ro^co/51//7￥o/ecw/arA/o/og/,5thEdition,JohnWiley&Sons,Inc，NY，2002.Bachers/.，DrugDiscoveryToday,J(6):265-273，1998.Baell，Biochem.Pharmacol.,<^(5-6):851-863，2002.Bakimere"/.,J.Clin.Invest.，"(5):1558，1992.Bergera/.，Blood4446-4452，1998.Bertinoe"/.，Transfusion(Paris),":857-866,2003.Blajchman，Transfusion(Paris),":121-125，1997.Boisee"/.，Cell,74:597-608，1993.Bo腸re"/.，Eur.J.Biochem.，"..83，1974.Booysee"入Biochim.Biophys.Acta.，757:660-663，1968.Bouillete"/.，Science,腐1735-1738，1999.Brechere"/"Transfusion(Paris),":974-978，2003.Browna/.，J.Biol.Chem.，275:5987—5996，2000.Carpinelli"a厶，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,頂6553-6558,2004.Casertae"/.，Apoptosis，《345-352，2003.Chens/.，Mol.Cell.,77:393—403，2005.Chenga人，Mol.Cell.,《705-711,2001.Chiu"a/.,Transfusion(Paris)950-954，1994.CohenWa/.，J.Med.Chem.,1990.Cohenefa/.，Thromb.Res.，387-393，2004.Coliganefa/"CurrentProtocolsinImmunology",JohnWiley&Sons,1991.Connere"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,M;278-282，1983.Cosulich"a/.，CurrentBiology,7:913-920，1997.Culver,Ce/er力era;77;爿尸Ti迈(？rfor户//s/c2'a/2s，2ndEd.，MaryAnnLiebert，1996.Danialeta/.,Cell,77(5":205—219，2004.Dayhoffefa/.,Natl.Biomed.Res.Found,5":345—358，1978.DeBottona/.，BloodJOft1310-1317,2002.Degtereva人，Nat.Cell.Biol.，J:173-182，2001.Delgrave"a厶，ProteinEngineering,6:327-331，1993.DenisWaA,Cell,"2:379-391，2005.Diaze"/.,J.Biol.Chem.，"2:11350-11355，1997.Douillarda/.，BasicFactsaboutHybridomas,inCo/z7;7e/7i//i//zo尸/卿"/3o/og/Vol.II，ed.bySchwartz,1981.Drachman,Blood,390-398，2004.Enyedye"/.，J.Med.Chem.，"4313-4324，2001.Ericksona/.，Science,雄.527-533，1990.Ekert，J.Cell.Biol.，7":835-842,2004.Fesik，Nat.Rev.Cancer,J"(11):876—885，2005.Finkelsteine"入，Genomics,7,167-172,1990.Fodore"/.，Science,投767，1991.Franklin,Biochemistry,"(27):8223-8231，2003.Friedman,In:r力era;7/尸orCe/2e〃cZ/sease，T.Friedman,Ed.，OxfordUniversityPress,pp.105-121,1991.Georgee"7.，Ann.Intern.Med.，徵886-890，1998.Greenefa/.，Science,^7:1309—1311，1998.Greene"7.，Science,逝626—629,2004.GoldefsA，Annu.Rev.Biochem.，6《763—797.1995.Go歸lvese"入，J，Biol.Chem.，，(37):34812，2003.Gonnete"/.，Science,Z5W062):1443-1445，1992.Grillotefa/.，JournalofExperimentalMedicine,磁381-391，1996.Grompea/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《6,5855—5892，1989.Grompe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《6,5855-5892,1993.Hacia"a/.,NatureGenetics,".'441-447，1996.Hodgson,Bio/Technology，义.19-21，1991.Hogana人,#si72'pi//af//7gf力eiiz6r/0..爿L360rafor/#3扁/，ColdSpringHarbourLaboratoryPress,CSHNY，1986.Holingere"/.，J.Biol.Chem.，級13298-13304,1999.Huange"/，EMB0.J.，4628-4638，1997.H訓ga/，Cell,旭839-842，2000.JacobsonWa7.，EMB0.J.，1899—1910，1994.Jayasena，Clin.Chem.，"(9):1628-1650，1999.Kaluzhny，Blood,J^ft1670-1678，2002.Kasai"a/.,DevBiol2":202-216，2003.Kaufmanna/.，JournalofCellBiology,雄53_64，2003.Kaushansky,Blood,《"19-431，1995.Kieffere/a/.，Eur.J.Biochem.，JdV:189-195,1987.Kienasta/.，Blood,75:116-121，1990.Kilee"入，Ma亂Ge讓e，"81_85，2003.Kilea/.，Nat.Rev.Genet.,6557-567,2005.Kinszlera/.，Science,U366-1370,1991.Kitadaa/.，J.Med.Chem.，4沃4259—4264，2003.Knudsone"人，Science,"ft96-99,1995.Kohlera/.,Nature,Z5《'495-499，1975.Kohlerefa/"EuropeanJournalofImmunology,f.'511-519，1976.Kothakota"a/.，Science,"<ft294-298，1997.Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，《2:488-492，1985.Kunkele"人，MethodsinEnzymol.，367-382，1987.Kurrek，Eur.J.Biochem.，"ft1628-1644，2003.Kutere"/.，Blood,3457-3469，2002.Kyte"a/.，J.Mol.Biol"U7,105-132，1982.Leeksmae"/.，Nature,〃5:552-553，1955.LiefaA,Transfusion(Paris),4ft1320—1329，2000.LindstenWa人，Mol.Cell.,<5":1389-1399，2000.Liuefa/.，Immunity,7^341—352，2003.McDonnella/.，Cell,J7:79—88，1989.Mangine"厶，J.Biol.Chem.，i7《(35):32880，2003.Mansoure"人，Nature,，348-352，1988.Mar匿e"/.,J.Mol.Biol"J:109，1962.Marsdene"/.,A醒.Rev.Immunol.,":71-105，2003.Maxwella7.，J.Biol.Chem.，27夕(31):32196，2004.MengaA，J.Comp.Chem.，505—524，1992.Methot，a人，J.Exp.Med.，7夕义199—207，2004.Modrich，Ann.Rev.Genet.，":229-253，1991.Morrisa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,夕J(6):2902-2907，1998.Motoyamaa厶，JournalofExperimentalMedicine,册1691-1698，1999.Motoyama"<s/，Science,鋭1506-1510，1995.Nakashima"a厶，CancerResearch,fft1229-1235，2000.Navia<s/.,CurrentOpinionsinStructuralBiology,2:202-210，1992.Newtownefa厶，Nucl.Acids.Res.J7.'2503—2516，1989.O'Connore"/.，EMBO.J.，":384-395，1998.Ogilvyefa/.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,夕沃14943—14948，1999.OltersdorfWa/.，Nature,^5:677-681，2005.Oost，J.Med.Chem.，47(18):4417-4426，2004.Oritaa人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，《《.2776—2770，1989.OttilieaA，JournalofBiologicalChemistry,277:30866—30872，1997.Petersa/.，Physiol.Genomics.,77:185—193，2002.Pickert，7>s/75^e/7/c爿/7/顶a/rec力/20/c^7..爿6o_rafor//(^/7d600i^AcademicPress,SanDiago，CA，1994.PrintWa/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,夕J:12424—12431，1998.Rathmella/.，NatureImmunology,J:932-939，2002.Rein"".，NucleicAcidsResearch,2"10):2255-2264，1998.Remington'sPharmaceuticalSciences,18thEd.，1990，MackPublishing,Company,Easton，PA，U.S.A.Riedla人，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA,夕&14790-14795，2001.Robergee"/.,Science,雄202，1995.R訓o"a/.,Nucl.Acids.Res.77..8392,1989.Ruckere"/.，Mol.Endocrinol.,":1038-1052，2000.Sadowsky，J.Am.Chem.Soc.，"7(34):11966-11968，2005.Sambrook,lo/ecw/arC7on2./7fJZa6o_r"or/#a/i/a7，3rdEdition,CSHLP，CSH，NY，2001.Sattlere"/.,Science,"J:983-986，1997.Schimmera厶，CellDeathDiffer.,》725-733，2001.Schimmer，Cel1DeathDiffer.，"(2):179—188,2006.Review.Shangary,Biochemistry,^:9485-9495，2002.Strassera人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，《及8661-8665，1991.Sheffielda/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,《《.232-236，1989.Sheffields/.，Am.J.Hum.Genet.，4义699-706，1991.Shoemakera人(NatureGenetics,"..450-456，1996.Summertona/.,AntisenseandNucleicacidDrugDevelopment7:187-195，1997.Tavassoli，Blood,537-545，1980.Thielee"/.，Acta.Ha函tologica.，夕7:137-143，1997.Thornberrye"/.,Science,斑1312-1316，1998.TzungWa人，Nat.Cell.Biol.，J:183—191，2001.vanDelfta/.，CancerCell,Jft389-399，2006.Veis，Cell,7ii229-240，1993.Vucic，Biochem.J.，患(Pt1):11-20，2005.Walenskye"7.，Science,息1466-1470，2004.WangWa人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,夕7:7124-7129，2000a.Wangs人，CancerResearch,6^1498-1502，2000b.Wang,J.Biol.Chem.，2ZP(46):48168—48176，2004.Wartelle"人，Nucl.AcidsRes.，J《,2699-2705，1990.Watson"MolecularBiologyoftheGene",FourthEdition,Benjamin/Cummings，MenloPark,Calif.，1987.Webbe"/.，Leuk.Lymphoma71-84，1999.Wells,MethodsEnzymol.，U699-2705,1991.Weyriche"/.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,5556-5561，1998.Whitea/.，Genomics,7么'301-306，1992.White,CellDeathandDifferentiation,1371-1377，2006.WillisandAdams,Curr.Opin.Cell.Biol.，77:617-625，2005.Willisa/.，GenesDev.,J义1294—1305，2005.Wilson-Annana/.，J.Cell.Biol.，7^:877-888,2003.Yange"人，Science,"5:1129-1132，1997.Yin，J.Am.Chem.Soc.,7"(15):5463-5468，2005.Zonga/.，GenesDev.,JJ:1481—1486，2001.权利要求1.增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用有效量的对细胞凋亡进行负调控的制剂。2.权利要求1所述的方法，其中所述的制剂增大细胞中Bcl-xL:Bak的比例。3.权利要求1所述的方法，其中所述的制剂为Bc卜&介导的细胞凋亡途径的激动剂。4.权利要求1所述的方法，其中所述的制剂为Bcl-x^的激动剂。5.权利要求1所述的方法，的拮抗剂。6.权利要求1所述的方法，活性的下游效应子的拮抗剂。7.权利要求1所述的方法，制剂的吸收或细胞活性。8.权利要求1所述的方法，9.权利要求8所述的方法，板的血液产品。其中所述的制剂为Bak和/或Bax其中所述的制剂为Bak和/或Bax其中所述的制剂抑制细胞凋亡诱导其中离体施用所述的制剂。其中将所述的制剂施用于含有血小10.权利要求9所述的方法，其中所述的血液产品为全血或血、板制备物。11.权利要求l所述的方法，其中体内施用所述的制剂。12.权利要求1所述的方法，其中将所述的制剂施用给患血小板减少的受试对象，或者处于形成血小板减少的危险中的受试对象。13.权利要求12所述的方法，其中所述的受试对象正在接受化疗。14.治疗或预防受试对象血小板减少的方法，该方法包括鉴定患血小板减少的受试对象或者处于血小板减少危险中的受试对象；以及向所鉴定的受试对象施用能够对血小板的细胞凋亡进行负调控的制剂。15.权利要求13所述的方法，其中所述的制剂增大血小板中Bc卜xjBak的比例。16.权利要求14所述的方法，其中所述的制剂为Bel-XL介导的细胞凋亡途径的激动剂。17.权利要求14所述的方法，其中所述的制剂为Bel-xt的激动剂。18.权利要求14所述的方法，其中所述的制剂为Bak和/或Bax的拮抗剂。19.权利要求18所述的方法，其中所述的制剂为Bcl-XL或其变体或其模拟物的Bak结合部分，或者Bel-XL或其变体或其模拟物的Bak结合部分，或者Bcl-xt或其变体或其纟莫拟物的Bak和Bax结合部20.权利要求18所述的方法，其中所述的制剂为基因沉默制剂21.权利要求14所述的方法，其中所述的制剂为Bak和/或Bax活性的下游效应器的拮抗剂。22.权利要求14所述的方法，其中所述的制剂抑制血小板中细胞凋亡诱导制剂的吸收或细胞活性。23.降低血小板存活、寿命期或生存能力的方法，该方法包括施用有效量的增强细胞凋亡的制剂。24.权利要求23所述的方法，其中所述的制剂为Bcl-XL介导的细胞凋亡途径的拮抗剂。25.权利要求23所述的方法，其中所述的制剂为Bcl-xt多肽活性的拮抗剂。26.权利要求23所述的方法，其中所述的制剂为Bak多肽活性的激动剂，或者Bax多肽活性的激动剂，或者Bak和Bax多肽活性的激动剂。27.权利要求23所述的方法，其中所述的制剂为Bak和/或Bax活性的下游效应器的激动剂。28.权利要求23所述的方法，其中所述的制剂为IAP拮抗剂。29.权利要求24所述的方法，其中所述的拮抗剂为BH3结构域模拟物或基因沉默制剂。30.权利要求25所述的方法，其中所述的制剂为小分子、抑制性RNA、抗体、适体、肽、拟肽物质、或者限制性肽。31.权利要求23所述的方法，其中体内施用所述的制剂。32.权利要求23所述的方法，其中离体施用所述的制剂。33.权利要求31或32所述的方法，其中向在施用前经过血小板增多测试的受试对象施用所述制剂。34.权利要求23所述的方法，该方法包括在损献血液或血小板之前，使用血小板细胞凋亡增强制剂来处理血液或血小板捐献者，以减小所捐献的血液或血小板中血小板的平均年龄。35.治疗或预防受试对象中血小板增多的方法，该方法包括鉴定患血小板增多的受试对象或者处于血小板增多危险中的受试对象；以及向所鉴定的受试对象施用能够促进血小板的细胞凋亡的制剂。36.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂为Bcl-x^介导的细胞凋亡途径的拮抗剂。37.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂为Bc1-Xl的拮抗剂。38.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂为Bak和/或Bax的激动剂。39.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂为Bak和/或Bax活性的下游效应器的激动剂。40.权利要求36所述的方法，其中所述的拮抗剂为BH3结构域模拟物。41.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂为小分子、抑制性RNA、抗体、适体、肽、拟肽物质、或者限制性肽。42.权利要求35所述的方法，其中所述的制剂以能够有效诱导无核血小板细胞凋亡、但基本上不诱导有核细胞的细胞凋亡的量和/或时间进行施用。43.权利要求42所述的方法，其中所述的制剂为Bel-xt介导的细胞凋亡途径的拮抗剂。44.用于治疗或预防血小板减少的组合物，该組合物包含有效量的能够抑制血小板细胞凋亡的制剂。45.权利要求44所述的组合物，其中所述的制剂增大血小板中Bcl-xjBak的比例。46.用于增加储存的血小板的半衰期的组合物，该组合物包含有效量的能够抑制所述储存的血小板的细胞凋亡的制剂。47.用于治疗或预防血小板增多的组合物，该组合物包含有效量的能够促进血小板细胞凋亡的制剂。48.用于筛选调控血小板的存活、寿命期或生存能力的制剂的方法，该方法包括(i)使所述的制剂与包含靶标的系统接触，其中所述的靶标选自Bc1-Xl和/或Bak或Bax多肽，以及Ac/i、Aair或^21基因序列；以及(n)测定所述制剂与所述靶标之间的复合体的存在情况，所述耙标的活性的变化情况，或者所述靶标的活性的指示剂活性水平的变化情况。49.用于筛选增强血小板和/或其他哺乳动物细胞的存活、寿命期或生存能力的分子的方法，该方法包括(i)将所述的分子与细胞组合；(ii)使所述的细胞与一种或多种制剂接触，其中所述的制剂拮抗所述的细胞中促存活Bel-2家族分子并且诱导细胞凋亡；(iii)相对于对照，测定在所述分子存在下细胞存活(生存能力、寿命期、半衰期)的变化情况；(iv)选择增强细胞存活(生存能力、半衰期)的分子；以及(v)任选将来自(iv)的所选出的分子与血小板组合，以相对于对照，测定在所述分子存在下血小板的细胞存活(生存能力、半衰期)的变化情况。50.权利要求49所述的方法，其中对所述的细胞进行修饰从而增强其对细胞凋亡诱导制剂的敏感性。51.权利要求50所述的方法，其中通过降低一种或多种促存活Bcl-2家族成员的水平或活性来对所述的细胞进行修饰。52.权利要求50所述的方法，其中通过基因破坏来将所述的细胞修饰成缺少一种或多种促存活Bcl-2家族成员。53.权利要求49所述的方法，其中所述的细胞为得自多细胞有机体的Mcl-1缺陷型细胞，而所述的制剂为Bcl-xj吉抗剂。54.权利要求49所述的方法，其进一步包括鉴定Bcl-2家族蛋白质在所述的细胞中的调控情况。55.—种用于对有需要的受试对象进行施用的经修饰的血小板群，其中所述的血小板包括离体储存并与细胞凋亡拮抗剂接触以便增加血小板半衰期的血小板群。56.权利要求55所述的经修饰的血小板群，其中所述的制剂包括Bc卜x^的激动剂或Bak的拮抗剂。57.—种用于治疗或预防血小板减少的细胞凋亡抑制剂。58.权利要求57所述的细胞凋亡抑制剂，其与癌症的治疗联合使用。59.—种用于治疗或预防血小板减少的细胞凋亡抑制剂，其增大血小板中Bcl-xL:Bak的比例。60.—种用于增加储存的血小板的半衰期的细胞凋亡抑制剂。61.—种用于减小储存的血小板的平均年龄的细胞凋亡促进剂，其中在给血前，使用所述的细胞凋亡促进剂处理血液或血小板供体。62.用于治疗或预防血小板增多的细胞凋亡促进剂。63.包含用于治疗或预防血小板减少的细胞凋亡抑制剂的制剂盒。64.包含用于增加储存的血小板半衰期的细胞凋亡抑制剂的制剂盒。65.权利要求l所述的方法，其中所述的制剂为小分子。66.根据权利要求1至13的任意一项中所述的增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用式1所示的制剂。67.增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用一种制剂，该制剂选自图10所示的制剂(a)至(d)中的一种。68.用于治疗或预防血小板减少的细胞凋亡抑制剂或细胞凋亡延迟剂，所述的制剂包含式1所示的结构。69.用于增强储存的血小板的生存能力或存活的细胞凋亡抑制剂或细胞凋亡延迟剂，所述的制剂包含式l所示的结构。全文摘要本说明书公开了多种增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用对细胞凋亡进行负调控的制剂。本说明书还公开了降低血小板的存活、寿命期或生存能力的方法，该方法包括施用有效量的能够增强细胞凋亡的制剂。文档编号A61P7/00GK101541379SQ200780033800公开日2009年9月23日申请日期2007年8月10日优先权日2006年8月11日发明者A·W·罗伯特,B·T·奇勒,D·C·S·黄,K·D·玛森,M·R·卡皮尼利申请人:沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院