有机-氧化砷化合物及其用途的制作方法

专利名称：有机-氧化砷化合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机-氧化砷化合物及用于合成它们的方法。本发明还 涉及包含这些化合物的药物组合物及它们在疾病和障碍的治疗中的用 途，所述疾病和障碍包括增殖性疾病和障碍。
背景技术：
在过去，含砷化合物已经被用作治疗疾病的治疗剂。然而，含砷化 合物的固有毒性以及它们的通常不利的治疗指数已经基本上使它们不 可能被用作药物试剂。
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已经公开了有机-氧化砷化合物。这类化合物被描 述为具有可用于治疗增殖性疾病的抗增殖性质。WO 04/042079 〃>开了 有机-氧化砷化合物用于诱导线粒体通透性转运(MPT)的用途以及有 才几-氧化砷化合物用于i秀发凋亡的用途，特别是在内皮细胞中。WO
团连接到氧化砷基团之上的基本上不能渗透细胞膜的侧基。WO
物。 、 '、,、
患有急性早幼粒细胞白血病(APL)的患者在接受现有疗法(全國 反式视黄酸)的治疗之后会遭受疾病复发。在这类情况下，考虑选择用 三氧化二砷来进行治疗(Reiter et al.， 2004 )。三氧化二砷为一种选择性 杀死APL细胞的三价砷化物。三氧化二砷还表现出有用于治疗骨髓增
生异常综合征---种目前尚没有用于其的标准治疗方法的疾病——
的前景(Vey，2004)。
然而，人们一直认为当无机砷化物例如三氧化二砷在体内存在的水 平超过身体解毒这种两性金属的能力时，它是毒药和致癌物并且与许多 有害副作用有关。
需要用于治疗增殖性疾病的替代疗法，所述增殖性疾病例如癌症 (包括实体瘤的治疗)和相关病症。具体而言，需要用于治疗APL——包括急性粒细胞白血病(AML)——的替代疗法。还需要用于骨髓增生 异常综合征的治疗方法。
本发明涉及一组氧化砷化合物，所述氧化砷化合物含有经由连接基 团连接到苯基氧化砷基团之上的任选取代的氨基酸残基。本发明的化合 物具有一种或多种优于已知含砷化合物例如三氧化二砷以及WO 01/21628或WO 04/042079中所〃>开的氧化砷化合物包括化合物 4-(N-(S-谷胱甘肽乙酰基)氨基)苯基氧化砷 (4-(N-(S國glutathionylacetyl)amino)phenylarsenoxide ) (GSAO)在内的 优点，特别是用于治疗增殖性疾病例如癌症(例如实体瘤)时。

发明内容
在第一方面中，本发明涉及一种具有通式(I)的化合物及其盐和水合
物<formula>formula see original document page 7</formula>
其中
所述As(OH)2基团可位于该苯环上N原子的邻位、间位或对位； R1选自氢和d.3烷基；
112和113可相同或不同，并且独立地选自氬、任选取代的Cw烷基、 任选取代的环丙基、任选取代的Cw烯基和任选取代的d.3烷氧基；
114和115可相同或不同，并且独立地选自氢、任选取代的Cw烷基、 任选取代的环丙基、任选取代的(:2-3烯基和任选取代的d.3烷氧基；
n为选自1、 2和3的整数；
n为选自1、 2和3的整数；
*表示手性碳原子。
在第二方面中，本发明涉及一种药物组合物，包含至少一种本发明第 一方面的具有式(I)的化合物，以及一种可药用赋形剂、稀释剂或佐剂。 在另一方面中，本发明涉及一种治疗脊推动物中增殖性疾病的方
法，所述方法包括给予所述脊推动物治疗有效量的一种本发明第一方面
的具有式(I)的化合物或者一种本发明第二方面的组合物。所述增殖性疾
病可为癌症，例如实体瘤。
在另一方面中，本发明涉及一种抑制脊堆动物中血管发生的方法，
包括给予所述脊推动物有效量的一种本发明第一方面的具有式(I)的化
合物或者一种本发明第二方面的组合物。
在另 一方面中，本发明涉及一种诱导脊推动物发生线粒体通透性转
变(MPT)的方法，包括给予所述脊推动物治疗有效量的一种本发明第一 方面的具有式(I)的化合物或者一种本发明第二方面的组合物。
在另一方面中，本发明涉及一种诱导增殖的哺乳动物细胞发生凋亡 的方法，包括给予所述哺乳动物可诱发凋亡量的一种本发明第一方面的 具有式(I)的化合物或者一种本发明第二方面的组合物。
在另一方面中， 一种治疗脊推动物中白血病或骨髓增殖异常综合征 的方法，包括给予所述脊推动物治疗有效量的一种本发明第一方面的具 有式(I)的化合物或者一种本发明第二方面的组合物。
在另一方面中，本发明涉及本发明第一方面的具有式(I)的至少一种 化合物在制备一种用于治疗脊堆动物中增殖性疾病的药剂中的用途。所 述增殖性疾病可为癌症，例如实体瘤。
在另一方面中，本发明涉及本发明第一方面的具有式(I)的至少一种 化合物在制备一种用于抑制脊推动物中血管发生的药剂中的用途。
在又一方面中，本发明涉及本发明第一方面的具有式(I)的至少一种 化合物在制备一种用于在脊推动物中诱发MPT的药剂中的用途。
在另一方面中，本发明涉及本发明第一方面的具有式(I)的至少一种 化合物在制备一种用于诱导增殖的哺乳动物细胞发生凋亡的药剂中的 用途。
在另一方面中，本发明涉及本发明第一方面的具有式(I)的至少一种 化合物在制备一种用于治疗脊推动物中白血病的药剂中的用途。
定义
以下为一些可有助于理解本发明说明书的定义。这些定义意在作为一般性定义且不应将本发明的范围仅仅限定于这些术语，而是用于更高 的理解下述说明。
除非上下文另外要求或者明确说明相反，否则本文中所列举单数形 式的整数、步骤或元件的本发明的整数、步骤或元件均明确地包括单数 和复数两种形式的所列举的整数、步骤或元件。
本说明书通篇中，除非上下文中另外要求，否则术语"包括"或其变 化形式如"包含"或"含有"均应被理解为是指包括所说明的步骤或元件 或整数或者步骤或元件或整数的群，但不排除任何其他的步骤或元件或 整数或者步骤或元件或整数的群。因此，在本说明书的上下文中，术语 "含有"是指"主要但不必唯一包括"。
本领域技术人员将会认识到本发明可以很容易进行变化和修改，而 并不局限于本文所具体描述的这些实施方案。应理解本发明包括所有这 些变化和修改。本发明还单独地或共同地包括本说明书中所涉及或指出 的所有步骤、特性、组合物和化合物，以及所述步骤或特性的任何及所 有组合或者任何两种或多种。
在本发明的上下文中，BRAO是指4-(2-溴乙酖基氨基)-笨胂酸 (4-(2-bromoacetylamino)-benzenearsonic acid ) ; CAO是指4-(N-(S-半胱氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸(4-(N-(S-cysteinylacetyl)amino) 國phenylarsinous acid ); GSAO是指4誦(N-(S-谷胱甘肽乙酰基)氨基)苯基 卑胂酸(4-(N-(S-glutathionylacetyl)amino)phenylarsinous acid ); 和 PENAO是指4-(N-(S-青霉氨基乙酰基)氨基)苯基卑胂酸["(S)-青霉胺-氧 化碎"
(4-(N-(S-penicillaminylacetyl)amino)phenylarsinous acid ["(S)曙Penicillamine-arsenoxide")。
本文所用的术语"d.3烷基基团"的含义中包括具有l-3个碳原子 的单价("烷基")和二价("亚烷基，，)直链或支链饱和脂肪族基团。因
此，例如，术语d—3烷基包括甲基、乙基、1-丙基和异丙基。
术语"C2-3烯基基团"的含义包括具有2-3个碳原子并且在链中任
意位置具有至少一个双键的单价("烯基")和二价("亚烯基，，)直链或 支链不饱和脂肪烃基团。除非另外说明，否则关于每个双键的立体化学
均可独立地为顺式或反式，或者适当时为E或Z。烯基基团的实例包括 次乙基、乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、l-丙烯基和2-丙烯基。
本文所用的术语"<:2_3炔基基团"的含义包括具有2-3碳原子并且具有至少一个三键的单价("炔基")和二价("亚炔基")不饱和脂肪烃 基团。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、l-丙炔基。
本文所用的术语"烷氧基"是指直链或支链烷基氧(即o-烷基) 基团，其中烷基为上文所定义的那些。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧 基、正丙氧基和异丙氧基。
本文所用的术语"氨基"是指NRaRb形式的基团，其中Ra和Rb 均单独地选自氢、任选取代的(Cw)烷基、任选取代的(C2-4)烯基、任选 取代的(Cw)炔基、任选取代的(C6-K))芳基和任选取代的芳烷基基团例如 苯曱基。所述氨基基团可为伯、仲或叔氨基基团。
在本说明的上下文中，术语"氧化砷"与"卑胂酸"为同义词，是
指基团As(OH)2，它还可以表示为As=0。
本文所用的术语"氨基酸"包括天然和非天然存在的氨基酸，以及
它们的取代变体。因此，(L)和(D)形式的氨基酸均包括在术语"氨基酸" 范围之内。术语"氨基酸"的范围包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨 酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖 氨酸、精氨酸和组氨酸。氨基酸残基的主链可以被一个或多个独立地选 自以下的基团所取代(Cw)烷基、卤素、羟基、羟基(Cw)烷基、芳基
例如苯基、苯基(CL3)烷基例如苯曱基，以及(C^6)环烷基。
本文所用的术语"(:6_1()芳基"或其变化形式例如"亚芳基"是指具
有6-10个碳原子的芳族烃的单价("芳基")和二价("亚芳基")的单 环、多环、轭合和稠合的残基。芳族基团的实例包括苯基和萘基。
本文所用的术语"芳基烷基"或其变化形式例如"芳烷基"的含义 包括与二价的饱和的直链或支链烯基原子团连接的单价("芳基")和二
价("亚芳基，，)的单环、多环、轭合和稠合的芳族烃原子团。芳基烷基 基团的实例包括苯曱基。
本文所用的术语"C3-8杂环烷基"的含义包括具有3-8个环原子的单 价("杂环烷基")和二价("杂环亚烷基")的饱和的单环、双环、多环 或稠合的烃原子团，其中l-5或l-3个环原子为独立地选自O、 N、 NH
或S的杂原子。所述杂环烷基基团可为C3—6杂环烷基。所述杂环烷基基
团可为(:3.5杂环烷基。杂环烷基基团的实例包括氮丙定基、吡咯烷基、 哌咬基、哌嗪基、奎宁环基、氮杂环丁烷基、吗啉基、四氢噻呤基、四氢呋喃基、四氢P比喃基等。
本文所用的术语"Cwo杂芳族基团"及其变化形式例如"杂芳基"或
"杂亚芳基"的含义包括具有5-20个原子的单价("杂芳基")和二价("杂 亚芳基")的单环、多环、轭合和稠合的芳族原子团，其中1-6个原子 或l-4个或l-2个环原子为独立地选自O、 N、 NH和S的杂原子。所述 杂芳族基团可为C^o杂芳族基团。所述杂芳族基团可为Cs-8杂芳族基 团。杂芳族基团的实例包括吡啶基、嘧啶基、歧溱基、吡嗪基、2，2，-二 吡咬基、菲咯啉基、喹啉基、异喹啉基、咪唑啉基、噻唑啉基、吡咯基、 呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基等。
本文所用的术语"卣素"或其变化形式例如"卤化物"或"卣"是 指氟、氯、澳和碘。
本文所用的术语"杂原子，，或其变化形式例如"杂-"是指O、 N、 NH和S。
本文所用的术语"任选取代的"是指本术语所指的基团可以是未被 取代的或者可以是被一种或多种独立地选自以下的基团所取代烷基、 烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卣素、卤代烷基、卣代炔基、 羟基、羟烷基、烷氧基、硫代烷氧基、烯氧基、囟代烷氧基、面代烯氧 基、N02、 NRaRb、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷 氨基、二烷氨基、烯基胺基、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰氨 基、二酰胺基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卣代杂 环烷基、烷基亚磺酰基、烷基羰氧基、烷硫基、乙酰硫基、含磷基团例 如膦酰基和氧膦基、芳基、杂芳基、烷基芳基、芳烷基、烷基杂芳基、 氰基、氰酸基、异氰酸基、C02H、 C02烷基、C(0)NH2、 -C(O)NH(烷
基)和-C(0)N(烷基)2。优选的取代基包括d.3烷基、Cw烷氧基、
-CHHd.3)烷氧基、C6.1()芳基例如苯基和-CH2-苯基、囟素、羟基、羟 基(Cw)烷基，以及卣代(Cw)烷基例如CF3和CH2CF3。特别优选的取 代基包括Cw烷基、Cw烷氧基、卣素、羟基、羟基(Cw)烷基例如CH2OH, 以及卣代(d-3)烷基例如CF3、 CH2CF3。
在本说明书的上下文中，术语"给予"及其变化形式包括"给药" 和"投药"，包括通过任何适宜的手段将本发明的化合物或组合物接触、 施加、递送或提供给生物体或表面。
在本说明书的上下文中，术语"脊推动物"包括人以及任何具有社会、经济或研究价值的物种的个体，包括但不限于羊类、牛类、马类、 猪类、猫类、犬类、灵长类(包括人和非人灵长类)、啮齿类、鼠类、 羊类、鼠类和鸟类的成员。在一个优选的实施方案中，所述脊推动物为 人。
在本发明的上下文中，术语"治疗"是指无论以任何方式治疗疾病 状态或症状、预防疾病的建立，又或者预防、妨碍、延緩或逆转疾病或 其它令人不快症状的进展的任何和所有用法。
在本说明书的上下文中，术语"有效量"的含义包括本发明的化合 物或组合物的足以提供所需效果但无毒的量。因此，术语"治疗有效量，， 的含义包括本发明的化合物或组合物的足以提供所需治疗效果但无毒
的量。所需的准确量将会根据受试者而变化，取决于以下因子例如正 在治疗的物种，受试者的性别、年龄和一般身体状况，正在治疗的病症 的严重程度、正在给予的具体试剂、给药模式等。因此，不可能规定准 确的"有效量"。然而，对于任何给定情况，适宜的"有效量"可以由 本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。


图1. (S)-音霉胺-氧化砷("PENAO")的结构。 图2. (S)-青霉胺-氧化砷的iH-NMR镨。
图3. (SV青霉胺-氧化砷的二维iH-"C多键相关数据。观察到4-(2-溴乙酰基氨基)-苯胂酸("BRAO")的酰基氢(8 3.55)和青霉胺季碳(8 46.75)之间的远程偶合。所述NMR语是在300 MHz Bruker (双通道探 针NMR光镨仪)上以D20记录的。
图4.质谱在413.011678处观察到的钠质谱峰(计算得到8 1.5 ppm)。快速烷基酯形成的发生取决于所使用的醇溶剂，例如如果使用 曱醇上样所述样品，则所观察到的主峰为+15或+30个质量单位。
图5. (S)-青霉胺-氧化砷以0.4 urn的IC^抑制BAE细胞的增殖。五 价含砷化合物(S)-青霉胺-砷酸((S)-Penicillarnine-arsenonic acid)对增殖 没有作用。数据点为进行三次重复的三次实验的平均值士SD。
图6. (S)-青霉胺-氧化砷对BAE增殖和生存力的作用的比较。数据点 为进行三次重复的三次实验的平均值士SD。
图7. (S)-青霉胺-氧化砷是与三氧化二砷一样有效的APL细胞增殖抑
12制剂。在于浓度不断增加的三氧化二砷、青霉胺-氧化砷或GSAO孵育 72小时后的仍然存活的NB4细胞的数目。数据点为三次重复测定的平 均值士SD。
图8. (S)-音霉胺-氣化砷在诱导线粒体通透性转变方面比GSAO更 有效。由100 pM GSAO或(S)-青霉胺-氧化砷诱导的线粒体膨胀通过30 分钟内520 nm处光散射的下降测得。迹线代表对两个不同线粒体制品 重复进行两次的两个实验。
图9. (S)-音霉胺-氧化砷在BAE细胞中的积累速率比GSAO快约70 倍。将BAE细胞在存在50 nM GSAO或(S)-青霉胺-氧化砷的情况下孵 育最长达4小时，并且通过诱导性偶联的电感偶合等离子体光镨测量胞 内的砷。数据点和误差棒是三次重复测定的平均值± SD并且代表两次实 验。
图10.细胞表面OATP的抑制减弱(S)-音霉胺-氧化砷的细胞积累和 抗增殖活性。A.利用OATP抑制剂DIDS抑制(S)-青霉胺-氧化砷在内 皮细胞中的积累。将细胞使用或未使用500 pMDIDS预处理30分钟， 然后用20 jiM (S)-青霉胺-氧化砷孵育2小时。砷含量为利用ICPMS测 定的。值为三次测定的平均值士SD。结果代表两次实验。**: p<0.01。 B. DIDS减弱GSAO在内皮细胞中的抗增殖活性。将BAE细胞^(吏用或 未使用300 jiM DIDS预处理30分钟，然后用1.5 (S)-青霉胺-氧化 砷孵育24小时。细胞生存力是使用MTT测定的。结果表达为对照的百 分数。值为三次重复测定的平均值士SD。结果代表两次实验。**: p<0.01。 图11. (S)-青霉胺-氧化砷是由MRPl/2从细胞中泵出来的。在不存 在或存在4H10 ( 5 jiM)或MK-571 ( 25 fiM )的情况下，将BAE细胞 用50 nM (S)-青霉胺-氧化砷孵育最长达2小时，并且通过诱导性偶联的 电感耦合等离子体光谱测量胞内的砷。数据点和误差棒是四次重复测定 的平均值并且代表两次实验。B. MRPl/2抑制剂4H10(2 nM )和MK-571 (25 nM)对于BAE细胞增殖的青霉胺-氧化砷(0.3 pM)抑制的影响。 将MRP抑制剂与所述细胞孵育30分钟，然后将所述细胞用(S)-青霉胺 -氧化砷孵育72小时。数据点和误差棒为三次重复测定的平均值土SD。 ***为/ <0.001, **为/7<0.01。
图12.细胞谷胱甘肽的消耗增加了 (S)-青霉胺-氧化砷的抗增殖活 性。将BAE细胞用(S)-青霉胺-氧化砷和所示浓度的BSO共同处理72小时，并且计算增殖抑制的IC50。数据点和误差棒为进行三次重复的两 次实验的平均值士SD。
图13.通过持续皮下给予(S)-青霉胺-氣化砷来抑制人胰腺癌肿瘤生 长。BxPC画3肿瘤是在7-9周龄雌性Balbc棵鼠的近中线处形成的。在 带有 50 mmS肺瘤的小鼠的胁腹皮下植入28天alzet微型渗透压泵。所 述泵递送剂量为0.25、 0.5或1 mg/kg/天的溶于100 mM甘氨酸(载体) 的(S)-青霉胺-氧化砷。
图14.通过酶切割GSAO来生产CAO。
图15. GASO和CAO的HPLC分析。将5 nmole的GSAO ( A部 分)或CAO ( B部分)用C18反相柱解析，并且监测256 nm处的吸光 度。
图16.与GSAO相比，CAO在细胞中积累得更快并且抗增殖活性 更高。A. CAO在细胞中的积累速率比GSAO快得多。将BAE细胞与 50 jiM GSAO或CAO孵育4小时。细胞砷水平是通过ICPMS测定的。 GSAO和CAO的积累速率分别为0.03和0.20 nmol As原子/106细胞。 数据点为三次测定的平均值士SD。结果代表两次实验。B. CAO是由多 药耐药相关蛋白l从细胞中输出的。将用10 nM的MRP-l抑制剂4H10 预处理30 min的BAE细胞与50 jiM GSAO或CAO孵育2小时。细胞 砷水平是通过ICPMS测定的。数据点为三次测定的平均值士SD。结果 代表两次实验。C.内皮细胞的增殖抑制的GSAO和CAO ICso值。将 BAE细胞与0.8-100 nM GSAO或CAO孵育24、 48或72小时。细胞 生存力是使用MTT测定的。结杲表达为对照的百分数。值为三次重复 测定的平均值士SD。结果代表三次实验。
图17. CAO触发线粒体通透性转变。将线粒体与nil("、150 jiM Ca2+ 和6 mM Pi(o)或200 jiM CAO(A)—起孵育，并且利用60分钟内520 nm 处光散射的下降来监测膨胀。迹线代表两次实验。
具体实施例方式
本发明涉及有机-氧化砷化合物，含有经由连接基团连接到苯基氧 化砷基团之上的任选取代的氨基酸基团。
本发明的有机-氧化砷化合物具有取代的或未取代的氨基酸基团。 氨基酸基团的实例包括半胱氨酰基、取代的半胱氨酰基例如青霉胺基(也称为p，p-二甲基半胱氨酰基或3-巯基缬氨酰基)、任选取代的丙氨 酰基、任选取代的巯基丙氨酰基、任选取代的缬氨酰基、任选取代的4-巯基缬氨酰基、任选取代的亮氨酰基、任选取代的3-或4-或5-巯基亮氨 酰基、任选取代的异亮氨酰基，或者任选取代的3-、 4-或5-异亮氨酰基。 在本发明的一个优选实施方案中，所述氨基酸基团为P，P-二曱基半胱氨 酰基("青霉胺基")。在本发明的另一个实施方案中，所述氨基酸基团为 (S)-青霉胺基。在本发明的另一个实施方案中，所述氨基酸基团为半胱 氨酰基。所述氨基酸基团可具有(L)、 (D)、 (R)或(S)构型。任选的取代 基包括Cw烷基、环丙基、Cw烷氧基、-CH2-(cl3)烷氧基、<:6_1()芳基、 -CH;r苯基、卣素、羟基、羟基(Cw)烷基，以及卣代-(Cw)烷基例如CF3、 CH2CF3。在优选的实施方案中，任选的取代基独立地选自羟基、甲氧 基、卤素、曱基、乙基、丙基、环丙基、CH20H和CF3。
本发明的有机氧化砷化合物的连接基团为取代的或未取代的乙酰 胺基基团。在一个实施方案中，所述连接基团为未取代的乙酰胺基基团。
具体而言，本发明涉及具有通式(I)的化合物以及其盐和水合物
co2e
H3N ((pR4R5)n
其中
所述As(OH)2基团位于该苯环上N原子的邻位、间位或对位； Rt选自氢和Cw烷基；
112和113可相同或不同，并且独立地选自氬、任选取代的Cw烷基、 任选取代的环丙基、任选取代的Cw烯基和任选取代的Cw烷氧基；
R"和rs可相同或不同，并且独立地选自氢、任选取代的Cw烷基、 任选取代的环丙基、任选取代的(:2-3烯基；和任选取代的Cw烷氧基；
m为选自1、 2和3的整数；
n为选自1、 2和3的整数；*表示手性碳原子。具有通式(I)的化合物的优选实施方案如下文所述。应该理解的是， 本文所公开的实施方案的一个或多个可与任何其他一个或多个实施方 案(包括一个或多个优选的实施方案)结合。
任选的取代基可相同或不同，并且独立地选自Cw烷基、环丙基、 Cw烷氧基、-CH:r(d-3)烷氧基、C"o芳基、-CHr苯基、卤素、羟基、 羟基(Cw)烷基，以及卣代-(Cw)烷基例如CF3、 CH2CF3。在一个实施 方案中，任选的取代基独立地选自羟基、甲氧基、卤素、甲基、乙基、 丙基、环丙基、CH20H和CF3。在一个实施方案中，没有任选的取代 基。
所述As(OH)2基团可位于该苯环上N原子的邻位或对位。在一个实 施方案中，所述As(OH)2基团位于该苯环上N原子的对位。在一个实施 方案中，所述As(OH)2基团位于该苯环上N原子的邻位。 W可为氢、曱基或乙基。在一个实施方案中，W为氢。 112和113可相同或不同。112和RS可独立地选自氢、Cw烷基、C2_3 烯基、d—3烷氧基、卣代(d-3)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卣代(Cw)烷 基。在一个优选的实施方案中，R"和RS可独立地选自氢、甲基、乙基、 曱氧基、乙烯基、CH2OH、 CF3和OCFs。在另一个优选的实施方案中， 112和113可独立地选自氢、曱基和乙基。在另一个实施方案中，W为甲 基且W为氢。在另一个实施方案中，112和113均为氢。
R"和rS可相同或不同。114和rs可独立地选自氢、Cw烷基、Cw 烯基、Cw烷氧基、卣代(Cw)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卣代-(Cw)烷 基。在一个优选的实施方案中，！^和rs可独立地选自氢、甲基、乙基、 曱氧基、乙烯基、羟基(Cw)烷基、CFs和OCF3。在另一个优选的实施 方案中，！^和R5可独立地选自氢、曱基、乙基和CH20H。在另一个实 施方案中，W为曱基或乙基，并且rs为氢或曱基。在另一个实施方案 中，W为甲基且r5为氢。在另一个实施方案中，！^和R5均为氢。在 另一个实施方案中，W和rs均为甲基。
在一个实施方案中，m为l或2。在另一个实施方案中，n为l或 2。在另一个实施方案中，m和n均为l。
在具有通式(I)的化合物的一个实施方案中，所述As(OH)2基团位于 该苯环上N原子的邻位或对位；W为氢或甲基；112和113均独立地选自 氢、Cw烷基、C2-3烯基、Cw烷氧基、卤代-(Cw)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卣代(Cw)烷基；114和115均独立地选自氢、Cw烷基、<:2.3烯基、 Cw烷氧基、卤代(Cw)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卤代(Cw)烷基；m为 1或2;并且n为1或2。
在具有通式(I)的化合物的另一个实施方案中，所述As(OH)2基团位 于该苯环上n原子的邻位或对位；W为氢或甲基；！^和RS均独立地选 自氢、甲基、乙基、曱氧基、乙烯基、CH2OH、 CF3和OCF3; R4和 RS均独立地选自氢、甲基、乙基、CH2OH、甲氧基、乙烯基、CFs和 OCF3; m为1;并且n为1。
在具有通式(I)的化合物的另一个实施方案中，所述As(OH)2基团 位于该苯环上n原子的邻位或对位；W为氢或甲基；rz和rS均独立地 选自氢、甲基和乙基；R"和RS均独立地选自氢、甲基和乙基；m为l; 并且n为1。
在具有通式(I)的化合物的另一个实施方案中，所述As(OH)2基团 位于该苯环上n原子的邻位或对位；W为氢或曱基；W为氢或曱基； W为氢或甲基；114为氢、甲基或乙基；R5为氢或甲基；m为1;并且n 为1。
在具有通式(I)的化合物的另一个实施方案中，所述As(OH)2基团 位于该苯环上n原子的对位；W为氢；R2为氢或曱基；R3为氢；R4 为氢或曱基；Rs为氢或曱基；m为l;并且n为l。
在本发明的一个具体实施方案中，具有式(I)的化合物为
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该化合物在本文中被称为"青霉胺-氧化砷"。 在本发明的另一个实施方案中，具有式(I)的化合物为
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该化合物在本文中被称为"半胱氨酰基-苯基氧化砷", 具有式(I)的化合物的合成具有式(I)的化合物可以很容易地由本领域技术人员使用本领域中 已知的方法和材料并且参考标准教科书来制备，所迷标准教科书例如
"Advanced Organic Chemistry" by Jerry March (third edition, 1985, John Wiley and Sons)或"Comprehensive Organic Transformations" by Richard C. Larock (1989， VCH Publishers),
用于制备具有式(I)的化合物的代表性方案如下文所示
方案1
其中X为离去集团，并且^和pz为氢或保护基团。
在方案1中，X为能够在亲核反应中被亲核基团置换的离去基团。 适合的离去基团包括囟素例如碘、溴和氯。其他适合的离去基团是本领 域技术人员已知的。根据本发明，所述亲核基团可以为巯基。-SH可被 碱去质子化，所述碱例如氬氧化钠、氬氧化钾、碳酸氬钠、碳酸钠等。 氨基基团和/或羧酸基团可能会被保护。适合的保护基团是本领域技术 人员已知的，并且可以参考"Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora Greene and Peter Wuts (third edition, 1999， John Wiley and Sons)。
在一个备选的合成方法中，本发明的具有式(I)的化合物可以通过对 有机-氧化砷化合物的肽基残基进行酶法切割来制备。可以根据所述肽 基残基組分来选择一种或多种适合的酶。因此，例如，当一种有机-氧 化砷起始化合物包括一个三肽残基例如谷胱甘肽，具有式(I)的化合物可 以通过下述方法来制备用"谷氨酰转肽酶(例如羊肾Y-谷氨酰转肽酶 I型)对末端，谷氨酰残基进行酶法切割，然后使用氨肽酶(例如猪肾 氨肽酶)对甘胺酰基残基进行切割以使半胱氨酰基氨基酸残基离去。
式(I)中由A表示的手性碳原子处的立体化学可以为(R)或(S)。本发明 包括对映异构体纯级形式的具有式(I)的化合物、以任何比率的对映异构体的混合物，以及外消旋化合物。在本发明的一个实施方案中，通式
(1)中由A表示的手性碳原子处的立体化学为(R)。在本发明的另一个实施
方案中，式(I)中由A表示的手性碳原子处的立体化学为(S)。
在本发明的另一个优选实施方案中，具有式(I)的化合物为(S)-青霉
胺-氧化砷。在本发明的另一个优选实施方案中，具有式(I)的化合物为
(R)-青霉胺-氧化砷。在另一个实施方案中，具有式(I)的化合物包括青霉 胺-氧化砷的(R)和(S)对映异构体的混合物。在另一个实施方案中，所述 青霉胺-氧化砷的(R)和(S)对映异构体的混合物为外消旋混合物。
在本发明的一个优选实施方案中，具有式(I)的化合物为(S)-半胱氨 酰基-苯基氧化砷。在本发明的另一个优选实施方案中，具有式(I)的化 合物为(R)-半胱氨酰基-苯基氧化砷。在另一个实施方案中，具有式(I) 的化合物包括半胱氨酰基-苯基氧化砷的(R)和(S)对映异构体的混合物。 在另一个实施方案中，所述半胱氨酰基-苯基氧化砷的(R)和(S)对映异构 体的混合物为外消旋混合物。
还包括在本发明的范围之内的是具有式(I)的化合物的所有立体异 构体、几何异构体和互变异构形式(包括表现出多种类型异构现象的化 合物)，以及其一种或多种的混合物。还包括的是其中反荷离子是有旋 光活性的酸加成盐或碱加成盐例如d-乳酸盐或/-赖氨酸，或者外消旋体 例如W-酒石酸盐或W-精氨酸。
技术来^离，-例如色^"法和分级J晶。' ''"、'
用于制备/分离各对映异构体的常规技术包括用适合的旋光纯前体 的手性合成或者使用例如手性高压液相色镨(HPLC)解析外消旋化合 物(或者盐或衍生物的外消旋化合物)。
或者，外消旋化合物(或者外消旋前体)可以与适合的具有旋光活 性的化合物例如醇反应，或者在式(I)的化合物含有酸性或碱性基团的 情况下与碱或酸例如1 -苯乙胺或酒石酸反应。所得的非对映混合物可通 过色谱法和/或分级结晶来分离，并且所述非对映体的之一或两者均可 通过技术人员公知的手段转化为相应的纯对映异构体。
本发明手性化合物(以及其手性前体)可以通过色镨法(通常为 HPLC)用由以下物质组成的流动相在不对称树脂上来获得(富含对映 异构体的形式)，所述物质为含有0-50体积％的异丙醇(通常2%-20%)、
190-5体积％的烷基胺(通常0.1。/。的二乙胺)的烃，通常为庚烷或己烷。 对洗脱物的浓缩可以提供得到丰富的混合物。
治疗应用
本发明的具有式(I)的化合物以及其可药用盐和水合物均能够结合 增殖性内皮细胞中线粒体腺噤呤核苷酸转运体(ANT )的半胱氨酸残基， 从而诱导线粒体通透性转变(MPT)。因此，本发明的具有式(I)的化合 物可用于诱发增殖抑制和细胞死亡。有利的是，与其他细胞(例如肿瘤 细胞)相比，具有式(I)的化合物可以在增殖性内皮细胞中有选择地诱发 MPT。因此，具有式(I)的化合物可以用于治疗增殖性疾病。
有利的是，具有式(I)的化合物(例如青霉胺-氧化砷和半胱氨酰基 -苯基氧化砷)可以比已知的氧化砷化合物更有效地抑制细胞增殖(特 别是内皮细胞的增殖)和/或降低内皮细胞的生存力，所述已知的氧化 砷化合物包括WO 01/21628中7>开的有机-氧化砷化合物例如化合物 4一(N-(S-谷胱甘肽乙酰基)氨基)苯基氧化砷("GSAO，，)。在本发明的上 下文中，"降低内皮细胞的生存力"可以包括细胞死亡或向细胞死亡的 进展。例如，具有式(I)的化合物在抑制内皮细胞的增殖和/或降低内皮 细胞的生存力方面比GSAO更有效约5倍、约10倍、约15倍、约20 倍、约25倍、约30倍、约40倍、约50倍、约75倍或约100倍。在 一个具体的实施方案中，具有式(I)的化合物在抑制内皮细胞的增殖和/ 或降低内皮细胞的生存力方面比GSAO更有效约5-50倍。在另一个实 施方案中，具有式(I)的化合物在抑制内皮细胞的增殖和/或降低内皮细 胞的生存力方面比GSAO更有效约10-30倍。在另一个实施方案中，具 有式(I)的化合物在抑制内皮细胞的增殖和/或降低内皮细胞的生存力方 面比GSAO更有效约20-25倍。
有利的是，具有式(I)的化合物(例如青霉胺-氧化砷和半胱氨酰基-苯基氧化砷)在诱导线粒体通透性转变(MPT )方面比已知氧化砷化合 物例如GSAO更有效。例如，与其他氧化砷化合物例如GSAO相比， 具有式(I)的化合物使分离的线粒体发生半最大膨胀的时间可以更快约 2-约20倍、约2-约15倍、约2-约10倍、约2-约8倍、约2-约6倍或 约2-约4倍。在本发明的一个具体实施方案中，具有式(I)的化合物在诱 发MPT方面比其他氧化砷化合物例如GSAO更快约2-约10倍。在另一个实施方案中，具有式(I)的化合物在诱发MPT方面比其他氧化砷化 合物例如GSAO更快约2-约6倍。在另一个实施方案中，具有式(I)的 化合物在诱发MPT方面比其他氧化砷化合物例如GSAO更快约4倍。
本发明的具有式(I)的化合物抑制增殖内皮细胞效率的增加可能是 由于在细胞内的积累增加。例如，具有式(I)的化合物在内皮细胞中的积 累速率比其他氧化砷化合物例如GSAO快。因此，具有式(I)的化合物 可能是比其他有机-氧化砷化合物例如GSAO更有效的细胞增殖抑制 剂。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种治疗脊推动物中细胞增殖 性疾病的方法，所述方法包括给予所述脊推动物治疗有效量的至少一种 具有式(I)的化合物或者其盐或水合物或者其药物組合物。所述细胞可以 是内皮细胞。具有式(I)的化合物对增殖性内皮细胞有选择性。与化合物 GSAO相比，具有式(I)的化合物可对增殖性细胞表现出更高的选择性。 所述增殖性疾病可为癌症，例如实体瘤。因此，本发明的一个具体的实 施方案涉及一种治疗实体瘤的方法，所述方法包括给予所述脊推动物治 疗有效量的至少一种具有式(I)的化合物或者其盐或水合物或者其药物 组合物。在优选的实施方案中，具有式(I)的化合物可为青霉胺-氧化砷 或半胱氨酰基-苯基氧化砷。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种抑制脊推动物中血管发生的 方法，包括给予所述脊推动物有效量的至少一种具有通式(I)的化合物或 者其盐或水合物或者其药物组合物。
本发明的另一个实施方案涉及一种选择性诱导脊推动物增殖细胞 发生MPT的方法，包括给予所述脊推动物治疗有效量的至少一种具有 式(I)的化合物或者其盐或水合物或者其药物组合物。本发明的具有式(I) 的化合物可通过结合到线粒体腺噤呤核苷酸转运体的半胱氨酸残基之 上来诱发MPT。具有式(I)的化合物在诱导增殖性细胞发生MPT方面比 化合物GSAO更有效约2-约20倍、约2-约10倍、约2-约5倍例如约 4倍。
本发明的另 一个实施方案涉及一种诱导哺乳动物中的增殖细胞发 生凋亡的方法，包括给予所述哺乳动物可诱发凋亡量的至少一种具有式 (I)的化合物或者其盐或水合物或者其药物组合物。与正常细胞相比，具 有式(I)的化合物可选择性地在增殖性细胞诱发凋亡。具有通式(I)的化合物在诱发增殖细胞中凋亡方面比化合物GSAO更有效。
本发明的具有式(I)的化合物还具有用于治疗急性早幼粒细胞白血 病(APL)的潜力。APL的现有治疗方法为靶向基本的分子损伤并且使 白血病原始细胞分化为成熟的粒细胞的全反式视黄酸(ATRA)疗法 (Reiter et al.， 2004 )。然而，使用ATRA的疗法会产生导致死亡的视黄 酸综合征。疾病复发也是一个问题。在疾病复发的患者中，考虑选择用 三氧化二砷来进行治疗(Reitereta1.，2004)。然而，当无机砷化物例如 三氧化二砷用于治疗时，具有数种缺点。例如，人们一直认为当无机砷 化物例如三氧化二砷在体内存在的水平超过身体解毒这种两性金属的 能力时，它是毒药和致癌物。三氧化二砷在2小时内通过静脉输注给予， 以使副作用最小，所述副作用包括QTc间期延长、APL分化综合征、 外周神经病、肝功能障碍和肠胃反应(Evens et al.， 2004 )。需要更安全 的砷化物来治疗APL (包括AML)和骨髓增生异常综合征。
因此，本发明的另一个实施方案涉及一种治疗脊推动物中白血病或 骨髓增生异常综合征的方法，方法包括给予所述脊稚动物治疗有效量的 至少一种具有式(I)的化合物或者其盐或水合物或者其药物组合物。在一 个实施方案中，所述白血病为急性早幼粒细胞白血病(APL)。在另一 个实施方案中，所述白血病为急性粒细胞白血病(AML)。才艮据本发明， 具有式(I)的化合物在抑制APL细胞方面至少与三氧化二砷一样有效。在 一个实施方案中，具有式(I)的化合物在治疗APL方面比三氧化二砷更 有效。有利的是，具有式(I)的化合物可表现出低于三氧化二砷的副作用。 具有式(I)的化合物在治疗APL、 AML和/或骨髓增生异常综合征方面比 其他有机氧化砷化合物例如GSAO更有效。
本发明的具有式(I)的化合物另 一特征为它们与例如三氧化二砷相 比可具有降低的脂溶性。具有式(I)的化合物的水溶性使得它们穿透组织 的能力下降并且极有可能被限制在血管内区室中。因此，有利的是，具 有式(I)的化合物可导致比其他砷化物例如三氧化二砷更低的副作用。
治疗优势可以通过组合方案来实现。在组合疗法中，可以同时或以 任何顺序序贯给予各个试剂。因此，本发明的治疗方法可包括给予一种 或多种具有式(I)的化合物。 一种或多种具有式(I)的化合物可以与常规疗 法例如放射疗法、化学疗法、外科手术或其他形式的医疗干预结合给予。 化疗试剂的实例包括阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、美法仑、顺铂、奥沙利铂、a干扰素、长春新碱、长春碱、angioinhibin、 TNP-470、戊聚糖 聚硫酸盐、血小板因子4、血管他丁、 LM-609、 SU-lOl、 CM-lOl、 Techgalan、沙利度胺、SP-PG等。其他化疗试剂包括烷化剂，例如氮 芥(nitrogen mustard )包括氮芥(mechloethamine )、马法兰、苯丁酸 氮芥、环磷酰胺和异环磷酰胺，亚硝基脲包括卡莫司汀、洛莫司汀、司 莫司汀和链佐星；烷基磺酸酯包括白消安；三溱包括氮烯眯胺；氮丙啶 包括塞替派和六曱密胺；叶酸类似物包括曱氨蝶呤；嘧啶类似物包括5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷；噤呤类似物包括6-巯基噤呤和6-硫代鸟嘌呤；抗 肿瘤抗生素包括放线菌素D;蒽环类包括多柔比星、博来霉素、丝裂霉 素C和光辉霉素(methramycin);激素和激素拮抗剂包括他莫昔芬和 皮质类固醇，以及其他药剂(miscellaneous agent)包括顺钿和布会那， 以及治疗方案例如COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨蝶呤和泼尼 f^)、 依托泊苷、mBACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长 春新碱和地塞米松)和PROMACE/MOPP (泼尼松、曱氨蝶呤(w/麦清蛋 白拯救(leucovin rescue))、多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、依托泊苷 /氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)。
药物和/或治疗制剂
通常，对于医学用途来说，本发明的化合物的盐是可药用盐；但是 其他盐可用于制备本发明的化合物或者制备其可药用盐。可药用盐是指 这些盐在正确的医学判断的范围内，适合用于与人和低等动物的组织 接触而无过度毒性、刺激、变态反应等，并且与合理的效益/风险比相 称。可药用盐在本领域中是公知的。
具有式(I)的化合物的可药用盐可以通过本领域技术人员已知的方 法制备，包括例如，(i)通过使具有式(I)的化合物与所需的酸或碱反应； (ii)通过从具有式(I)的化合物的适合前体上移除酸或碱不稳定的保护基 团或者通过使用所需酸或碱使适合的环状前体(例如内酯或内酰胺)开 环；或(iii)通过与适宜的酸或碱反应或者通过适合的离子交换柱将一种 具有式(I)的化合物的盐转化为另一种具有式(I)的化合物的盐。
所有三种反应通常是在溶液中进行的。所得的盐可沉淀析出，并且 通过过滤来收集或者可以通过蒸发所述溶剂来回收。所得的盐中离子化 的程度可在完全离子化至几乎未离子化之间有所变化。
23因此，例如，本发明化合物的适合的可药用盐可以通过使可药用酸 与本发明的化合物混合来制备，所述可药用酸例如盐酸、硫酸、甲磺酸、 琥珀酸、延胡索酸、马来酸、苯甲酸、正磷酸、乙酸、草酸、碳酸、酒 石酸或柠檬酸。因此，本发明化合物的适合的可药用盐包括酸加成盐。
S. M. Berge等人在/ 尸/^nMacew,/ca/ 5Wewces, 1977， 66:1-19.中详
细描述了可药用盐。所述盐可以在本发明化合物的最终分离和纯化过程 中原位制备，或者通过使所述游离碱性官能团与适合的有机酸反应单独 制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、 天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑 酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡萄糖酸盐、环戊丙酸盐、十二烷基 硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、 庚酸盐、己酸盐、氩溴酸盐、盐酸盐、碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖 醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙 二酸盐、曱磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、 棕榈酸盐、朴酸盐、果冻酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦 味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、 硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱或碱土金属 盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒铵盐、季铵盐和胺 阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、 三乙胺、乙胺、三乙醇胺等。
方便的给药模式包括注射(皮下、静脉内等)、口服给药、吸入、 经皮肤施加、外用乳膏或凝胶或粉末或者直肠给药。在一个实施方案中， 给药模式为肠胃外给药。在另一个实施方案中，给药模式为口服给药。 根据给药途径，所述制剂和/或化合物可以用某种材料来包被以保护所 述化合物免遭酶、酸和其他可以使所述化合物的治疗活性失活的天然条 件的作用。所述化合物还可以为肠胃外给药或腹膜内给药。
还可以使用甘油、液体聚乙二醇和它们的混合物以及油来制备本发 明化合物的分散液。在通常的贮藏和使用条件下，药物制品可含有防腐 剂以防止微生物的生长。
适合用于注射的药物组合物包括无菌水溶液(当可溶于水时)或分 散液，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。理想地， 所述组合物在制备和贮藏条件下是稳定的，并且可包括防腐剂以稳定所述组合物免遭微生物例如细菌和真菌的污染作用。
一种或多种本发明的化合物可以——例如与惰性稀释剂或可消化 的食用载体一起——通过口服给药。 一种或多种所述组合物及其他成分 还可以被包封在硬壳明胶胶嚢或软壳明胶胶嚢中、压成片剂或者直接掺 入到个体的饮食中。对于口服治疗给药，可以将一种或多种所述化合物 与赋形剂混合，并且以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶嚢、酏剂、 悬液、糖浆、薄片形式使用。适合地，这类组合物和制品可含有至少1 重量％的活性化合物。 一种或多种具有式(I〗的化合物在药物組合物及制 品中的百分数当然可有所变化，并且例如变化范围可方便地为所述单位
剂量重量的约2%-约卯％、约5%-约80%、约10%-约75%、约15%-约65%;约20%-约60%、约25%-约50%、约30%-约45%或者约35%-约45%。化合物在可用于治疗的组合物中的量使得可获得适合的剂量。 语言"可药用载体"意在包括溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和 抗真菌剂、等渗剂和吸收延緩剂等。这类介质和试剂用于药物活性物质 的用途在本领域中是公知的。只要常规介质或药剂与所述化合物相容， 就考虑到其在治疗用组合物以及治疗和预防方法中的应用。还可在本发 明的组合物中掺入补充的活性化合物。将肠胃外組合物配制成单位剂量 以便于给药和使剂量均匀是特别有利的。本文所用的"单位剂量形式" 是指适合于对待治疗个体单式给药的在物理学层面的离散单位；计算每 个含有预定量的一种或多种化合物的单位以便与所需药物栽体一起产 生希望的疗效。可以将有效量的一种或多种所述化合物与适合的可药用 载体配制为可用的单位剂量以便方便且有效的给药。对于含有补充的活 性成分的组合物的情况，可以参考通常剂量以及所述成分的给药方式来 确定剂量。
在一个实施方案中，所述载体为一种经口服给药的载体。 药物组合物的另 一种形式为被配制成适合于口服给药的肠包衣颗 粒、片剂或胶嚢的剂型。
本发明的范围内还包括緩释制剂。
本发明的具有式(I)的化合物还可以"前药"形式来给药。前药是 可在体内转化为活性形式的无活性形式的化合物。适合的前药包括所述
活性形式的化合物的酯、磷酸酯等。
在一个实施方案中，具有式(I)的化合物可通过注射来给药。对于可注射溶液的情况，所述栽体可以为溶剂或分散介质，包含例如水、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物 和植物油。例如通过使用包衣如卵磷脂、可以通过维持所需的粒度(在 使用分散液的情况下)以及通过使用表面活性剂来维持适合的流动性。
对孩i:生物作用的防止可以通过包含各种抗细菌剂和/或抗真菌剂来实 现。适合的试剂是本领域技术人员所公知的，并且包括例如对羟苯曱酸 酯、氯丁醇、苯酚、苯甲醇、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，所 述组合物中优选地包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨糖 醇)、氯化钠。所述可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中 包含可延緩吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌的可注射溶液可以通过以下方法来制备，将所需量的所述类似 物掺入具有上文所列举的一种成分或一组合成分(根据需要)的适宜的 溶剂中，然后进行无菌过滤。通常，分散液通过下述方法来制备，即将 所述类似物掺入含有基本分散介质和所需其他上文所列举的成分的无 菌载体中。
片剂、锭剂、丸剂、胶嚢等还可以含有以下物质粘合剂，例如黄 蓍胶、阿卡胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉 米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例 如蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂例如薄荷、冬青油或樱桃香精。当所 述单位剂型为胶嚢时，除上述类型的物质外，它还可以含有液体载体。
理形式。例如:片剂:丸剂或胶i可二被虫胶和/或糖所包:。:浆或
酏剂可以包含所述类似物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯 甲酸甲酯和对羟基苯曱酸丙酯、染料以及例如樱桃或甜橙香精的调味 剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何物质均应是药物纯级的并且以 所用量应用时基本无毒。此外，所述类似物可以被掺入到持续释放的制 品和制剂中。
优选地，所述药物组合物可进一步包括用于使酸水解最小化的适合 的緩冲剂。适合緩冲剂是本领域技术人员所公知的，并且包括但不限于 磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐及它们的混合物。
可以对本发明的化合物和/或药物组合物进行单次或多次给药。本 领域技术人员能够利用常规实验来确定本发明的化合物和/或组合物的
26有效且无毒的剂量水平，以及适合用于治疗所迷化合物和组合物适用的 疾病和/或感染的给药模式。
此外，对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，可以使用疗法 确定试验的常规疗程来确定疗法的最佳疗程，例如在确定天数内每天给 予的本发明的化合物或组合物的剂量数。
通常，每24小时的有效剂量范围可为约0.0001 mg-约1000 mg/kg 体重；例如，约0.001 mg-约750 mg/kg体重；约0.01 mg-约500 mg/kg 体重；约0.1 mg-约500 mg/kg体重；约0.1 mg-约250 mg/kg体重；或 者约l.Omg-约250mg/kg体重。更适合地，每24小时的有效剂量范围 可为约1.0 mg-约200 mg/kg体重；例如，约1.0 mg-约100 mg/kg体重； 约1.0 mg-约50 mg/kg体重；约1.0 mg-约25 mg/kg体重；约5.0 mg-约50 mg/kg体重；约5.0 mg-约20 mg/kg体重；或者约5.0 mg-约15 mg/kg体重。
或者，有效剂量最高可到约500 mg/m2。例如，预期的有效剂量范 围通常为约25-约500 mg/m2、约25-约350 mg/m2、约25-约300 mg/m2、 约25-约250 mg/m2、约50-约250 mg/m2和约75-约150 mg/m2。
在另一个实施方案中，具有式(I)的化合物可以下述剂量范围给药， 即约100-约1000 ing/天，例如约200-约750 mg/天、约250-约500 mg/ 天、约250-约300 mg/天或者约270-约280 mg/天。
本发明的化合物可作为治疗方案的一部分与其他药物一起给药。合 乎需要的是给予活性化合物的结合物来例如治疗具体的疾病或病症。因 此，在本发明的范围之内的是，可将两种或多种药物组合物一一其中至 少一种含有本发明的具有式(I)的化合物一一联合成为适合用于共同给
予所述组合物的试剂盒形式。
发明。所述实施例意^^用于举例说明本发明，并且^不应被理解为限制本 说明书通篇中所描述的公开内容的一般性。
实施例
实施例1——(S)-青霉胺-氧化砷("PENAO")的制备及效力 材料和方法
(S)-青霉胺-氧化砷的合成及纯化将对氨基苯胂酸(10 g， 46.07 mmol)溶于1.18 M Na2C03溶液中， 所述N"C03溶液是通过将Na2C03 (15 g， 141.5 mmol)溶于盛于500 mL圆底烧瓶中的H20 (120 mL )中制备的。将所述溶液在4 °C水箱 中冷却2小时，然后置于磁力搅拌器上的冰浴中。将溶于CH2C12(14 mL) 中的溴乙酰溴(9 mL， 101.4 mmol)溶液分4等份加入到所述烧瓶中， 同时剧烈搅拌所述混合物。加入耗时l分钟，同时伴有C02释放。将所 述混合物在水浴中搅拌5分钟，然后在室温下搅拌30分钟直至C02释 放停止。将所述混合物倾注至250 mL分液漏斗中。额外加入CH2Cl2(10 mL)，并且使层分离约10分钟。分离所述CH2Cl2层并且将所述水层置 入400 mL烧杯中。搅拌所述溶液并且用98% H2S04(2.8 mL)将其酸化 至pH4。通过过滤收集所获得的白色沉淀(14.83 g,产率95%)。将所 得的4-(2-溴乙酰基氨基)-苯胂酸("BRAO") ( 14.83g， 43.88 mmol)溶 于盛于500 mL三口圃底烧瓶内的1:1 HBr/MeOH(210 mL)中。加入 Nal(5 mg)并且搅拌所述混合物。以约2个气泡/秒的速率冒泡通入S02， 10分钟后开始形成白色沉淀。再冒泡通入S02 20小时，并且以中等速 度搅拌所述混合物。通过过滤收集所述固体，将其用所述滤液冲洗，然 后用水冲洗(30 mLx3)，并且将其置于50。C的旋转蒸发器上5小时以 产生4-(2-溴乙酰基氨基)-苯亚胂酸(6.04 g，产率38,8% )。将一部分4-(2-溴乙酰基氨基)-苯亚胂酸(500 mg， 1.553 mmol)溶于通入氮气的 DMSO(10 mL)中，并且将其在约1分钟内逐滴加入至溶于NaHC03( 840 mg， 10 mmol)水溶液的S-青霉胺(265 mg， 1.77 mmol)溶液中，所述 NaHC03水溶液使用氮气饱和的H20 ( 20 mL )。所述加入是在100 mL 圆底烧瓶中进行的，并且在氩气气氛下，将所述澄清溶液以低速搅拌4 小时。将所述溶液用98% H2S04(约0.2 mL)酸化至pH 5。对丙酮(500 mL) 进行剧烈搅拌，并且在约5分钟的时间内逐滴加入所述酸>[匕的溶液以产 生白色沉淀。离心并倒出上清液，将所得白色固体用丙酮(20 mLx2) 进一步清洗并且再次离心，用丙酮(40 mL)转移至100 mL梨形烧瓶中并 且在25 。C下在旋转蒸发器上干燥2小时。利用内标tH-NMR发现青霉 胺-氧化砷粗产品的纯度为约30%。
将(S)-青霉胺-氧化砷粗产品(100.2 mg， 0.077 mmol,纯度为30%) 溶于氮气饱和的H2(D(2.5mL)中，并且用低压液相色^普系统加以纯化。 所使用的条件为内径为1.25 cm的30cm柱、以氮气饱和的1120作为运
28行緩冲液、Biogel P-2树脂且速率为0.25 mL/分钟。将第二个峰收集到 50mLFalcon管中，用液氮冷冻，冷冻干燥3天，并且置入干燥器中1 天以产生干燥的纯(S)-青霉胺-氧化砷(20.3 mg， 0.052 mmol)。使用更多 的青霉胺-氧化砷粗产品(总计696 mg)重复进行该过程，并且这样产 生纯化的(S)-青霉胺-氧化砷(114mg，产率为26.5。/。)。通过MS^H-NMR 和2D NMR确认(S)-青霉胺-氧化砷的结构(图1)。利用砷活性测定测 得所获得纯度为卯％。主要杂质为水，因为终产物极其吸湿。(S)-青霉 胺-氧化砷的分子量为3卯.28 g/摩尔。
!H-NMR (300 MHz, D20):S 1.32(s, 3H)、 1.53(s， 3H)、3.55(d， J=3.4Hz， 2H)、 3.63 (s， 1H)、 7.52(d， J=8.3Hz， 2H)、 7.68(d, J=8.3Hz, 2H)。质子 NMR i普(图2 )是使用Bruker双通道探针NMR波镨仪记录的。快速 酮-烯醇互变异构以及随后的氖置换导致1小时后出现在8 3.5518处的 双峰丢失。这可以使用时间依赖性的NMR来监测。
13C-NMR (D20): 8 23.15、 26.83、 33.12、 46.75、 61.36、 121.62、 130.04、 139、 144、 170。
(S)-青霉胺-氧化砷的结构也可以通过HMBC实验(2DiH-"C多键 偶合，参见图3)来确认。
MS:附々413.011678 (M+Na)+(C13H19S05N2AsNa要求413.012285)。 (图4)
青霉胺-胂酸的合成
将对氨基苯胂酸(10 g， 46.07 mmol)溶于1.18 M Na2C03溶液中， 所述Na2C03溶液是通过将Na2C03 (15 g, 141.5 mmol)溶于盛于500 mL圆底烧瓶内的H20 (120 mL)中制备的。将所述溶液在4 °C冰箱 中冷却2小时，然后置于磁力搅拌器上的冰浴中。将溶于CH2C12(14 mL) 中的溴乙酰溴(9 mL， 101.4 mmol)溶液分4等份加入到所述烧瓶中， 同时剧烈搅拌所述混合物。加入耗时l分钟，同时伴有C02释放。将所 述混合物在冰浴中搅拌5分钟，然后在室温下搅拌30分钟直至C02释 放停止。将所述混合物倾注至250 mL分液漏斗中。额外加入CH2C12(10 mL)，并且使层分离约10分钟。分离所述CH2Cl2层并且将所述水层置 入400 mL烧杯中。搅拌所述溶液并且用98% H2S04(2.8 mL)将其酸化 至pH 4。通过过滤收集所得的白色沉淀4-(2-溴乙酰基氨基)-苯胂酸("BRAO" ) (14.83g，产率95% )。
将一部分4-(2-溴乙酰基氨基)-苯胂酸(500 mg， 1.479 mmol)溶于 NaHC03水溶液(420 mg， 4.999 mmol，溶于10 mL水中)中，并且将其 在约1分钟内逐滴加入至溶于NaHC03水溶液(640 mg、 7.618 mmol， 溶于15mL水中)的(S)-青霉胺(265 mg， 1.77 mmol)溶液中。所述加 入是在100 mL圓底烧瓶中进行的，并且将所述澄清溶液以低速搅拌4 小时。将所述溶液用98% H:jS04(约0.25 mL)酸化至pH 5。对i:l的丙 酮乙醇溶液(500 mL)进行剧烈搅拌，并且在约5分钟的时间内逐滴加入 所述酸化的溶液以产生白色沉淀。离心并倒出上清液，将所得白色固体 用1:1的丙酮乙醇(25mLx2)进一步清洗并且再次离心，用l:l的丙酮 乙醇(50 mL)转移至100 mL梨形烧瓶中并且在25 。C下在旋转蒸发器上 干燥2小时。利用内标^-NMR分光术发现所得的(S)-青霉胺-胂酸的 纯度为约44%,并且直接使用而未进行进一步纯化(1.022 g，产率为 75%)。通过MS、 111- ]\111和20 NMR确i人(S)-青霉胺-胂酸的结构。 主要杂质为水，因为终产物极其吸湿。分子量为406.28 g/mole。
GSAO的制备如前文所述(Don et al., 2003 )。
通过将三氧化二砷固体(Sigma, St. Louis, MO )溶于去氧水制备的 3M NaOH中来制备1M的三氧化二砷溶液。将所述溶液用去氧7JC稀释 10倍，使用HCl将pH调整至7.0并且于4 。C下贮藏在气密容器中直 至使用。
砷测定
将(S)-青霉胺-氧化砷溶于滴定緩冲液中，无菌过滤，并且通过用二 巯基丙醇滴定和用5，5，-二硫双(2-硝基苯曱酸)计算残余的游离巯基来 测定浓度。将所述溶液在4 。C下避光保存直至使用。当在这些条件下 贮藏时，所述砷化物储液的活性浓度至少在一个月内没有明显损失。
线粒体膨胀测定
线粒体是按照前文所述(Dilda et al.， 2005a; Don et al.， 2003)使用差 速离心从约250 g雄性Wister大鼠的肝脏中分离的。将最终的线粒体沉 淀重悬于pH 7.0的含有213 mM甘露醇、71 mM蔗糖和10 mM琥珀酸 钠的3 mM HEPES-KOH緩冲液中，浓度为30 mg蛋白/mL。通过在25 。C下将所述肝脏线粒体以0.5 mg蛋白/mL的浓度悬浮于pH 7.0的含有 75 mM甘露醇、250 mM蔗糖、10 mM琥珀酸钠和2 nM鱼藤酮的3 mMHEPES-KOH緩冲液中来通过分光光度法评估线粒体通透性转变诱导。 通过使用SpectraMax Plus酶标仪(Molecular Devices, Palo Alto， CA) 监测520 nm处的相关光散射的降低来测量膨胀。 细胞培养
BAE细胞来自Cell Applications, San Diego， CA， BxPC誦3、HT1080、 LLC、 PANC國l、 MCF-7、 HCT116和K562细胞来自ATCC， Bethesda， MD。NB4和MDCK2细胞来自Shane Supple (Kanematsu Laboratories, Royal Prince Alfred Hospital, Sydney, Australia)和 P. Borst (The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, The Netherlands)。将BAE、 HT1080、 Panc-l、 MCF國7、 HCT116、 MDCK2和LLC细胞在DMEM 中培养。将NB4、 K562和BxPC-3细胞在RPMI培养基中培养。给所 述细胞补加10%胎牛血清(FBS )、 2 mM L-谷氨酰胺和1 U/mL-l青霉 素/链霉素。细胞培养的塑料器具来自Techno Plastic Products (Trasadingen， Switzerland)。所有其他细胞培养试剂均来自 Gibco (Gaithersburg， MD)。
细胞增殖和生存力测定
将BAE、 NB4、 K562、 MDCK2、 HT1080、 LLC、 HCT116、 Panc-l、 MCF-7和BxPC隱3细胞分别以1.5x103、 3xl03、 4xl03、 5xl02、 2xl03、 5xl02、 5xl02、 6xl03、 6xl()3和lxl04细胞/孔的密度接种到96孔板中。 使粘附细胞粘附过夜。然后将它们在含有10。/。胎牛血清和(S)-青霉胺-氧化砷的培养基中培养72小时。活细胞是通过用四唑盐MTT (Sigma, St. Louis, MO)孵育细胞来测定的，所述四唑盐MTT会被活细胞代谢形成 不可溶的紫色甲晶体。加入DMSO以溶解细胞，将孔中的内含物匀 浆并且测量550 nm处的吸光度。将未处理的对照中的细胞数目标准化 为100%，并且将所有处理的活细胞数目表达为对照的百分数。(S)-青 霉胺-氧化砷的细胞毒性作用是通过使用碘化丙啶的流式细胞术测定 的。将BAE细胞以5xl04细胞/孔的密度接种到12孔板中，使其粘附 过夜，然后使用GSAO处理48小时。将粘附细胞用胰蛋白酶/EDTA脱 附，并且与含有已经在处理过程中脱附的细胞的生长培养基合并。使合 并的细胞沉淀，重悬于0.5 mL含有1叫.mL-1碘化丙咬(Molecular Probes, Eugene, OR)的无血清培养基中，并且利用流式细胞术进行分析。
(s)-音霉胺-氣化砷流
将BAE细胞以1.5xl(^个细胞的密度接种到培养皿中，并且使其粘 附过夜。将细胞在37。C下用50 nM (S)-青霉胺-氧化砷分别孵育不同时 间(最长为2小时)，然后用冰冷的PBS沖洗三次。将经冲洗的细胞用 1 mL 70% w/w硝酸裂解。然后将培养皿用1 mL的PBS冲洗两次并且 保持在4。C下直至使用。将样品稀释10倍，并且使用Elan 6100电感偶 合等离子体光镨仪(Perkin Elmer Sciex Instruments, Shelton， CT)分析 砷原子。
有机阴离子转运多肽(OATP)研究。将75,0000个BAE细胞接种 到含有DMEM和10%胎牛血清的6孔板中并且使其粘附过夜。将细胞 使用或未使用500 nM 4，4，-二异硫氰基苯-2，2，-二磺酸(DIDS )预处理 30分钟，然后将其用20 fiM (S)-青霉胺-氧化砷在37。C下在5%C02中 孵育2小时。然后将细胞用冰冷的PBS冲洗两次，并且用70%硝酸裂 解。细胞砷水平通过ICPMS测定。
将5000个BAE细胞接种到含有DMEM和10%胎牛血清的96孑L 板中并且使其粘附过夜。将该细胞使用或未使用300 nM DIDS预处理 30分钟，然后将其用1.5 nM (S)-青霉胺-氧化砷在37。C下在5%C02中 孵育24小时。细胞生存力4吏用MTT测定。
药物转运蛋白转染子。已经描述了 Madin-Darby犬肾II( MDCKII) 极化上皮细胞系的转染子——过表达多药耐药相关蛋白(MRP)l、 2或3 (Evers et al， 2000; Kool et al" 1999 )，以及过表达人MDR1或BCRP 的MEF/MDR1克隆H4 ( Dilda et al.， 2005b )。使细胞在含有10%小牛 血清(CosmicTM， Hyclone, Tauranga， New Zealand )、 100 jig/mL青霉素 和60 pg/mL链霉素的DMEM生长并且保持粘附单层形式。按照前人 所述(Allen et al" 1999 )进行细胞毒性测定。
原发性肿瘤生长测定。使用7-9周龄的雌性Balb C棵鼠(UNSW Biological Resource Centre )。将小鼠分组铜养，每组3-5只小鼠，饲养 条件为12小时昼夜循环、不限量给予动物食物和水。将溶于0.2 mL PBS 的2xl(^个BxPC-3细胞的悬液经皮下注射到近中线处。j吏肿瘤形成并 且生长到大小为约50 mm3，之后将它们随机分为4组。 -使用关系式长 x高x宽x 0.523来计算肿瘤体积。使用公式Td-0.693/1ii(Vf/Vj)由指
32数生长过程中的肿瘤生长速率曲线计算肺瘤体积倍增时间(TD)，其中 VF为最终的胂瘤体积而为V!为初始时肿瘤体积(Wolff et al., 2004)。 给动物的胁腹中皮下植入28天alzet型1004樣t型渗透压泵(ALZA Corporation, Palo Alto, CA)。所述泵递送剂量为0.25、 0.5或1 mg/kg/ 天的溶于100 mM甘氨酸的(S)-青霉胺-氧化砷。每2或3天测量肿瘤体 积和动物体重。 统计学分析
结果表示为平均值士SD。所有具有统计学显著性的检验均为双侧的， 并且认为P值《.05为具有统计学显著性。
结果和讨论
(S)-青霉胺-氧化砷抑制哺乳动物细胞的增殖
报道的GSAO诱导的对牛主动脉内皮细胞(BAE)的增殖抑制和生 存力丧失的ICso值分别为10 jiM和75 jiM (Dilda et al， 2005a; Don et al.， 2003)。与GSAO对BAE细胞增殖抑制的ICso为10 jiM相比，(S)-青霉 胺-氧化砷的BAE细胞增殖抑制的ICso为0.4 jiM (图5),而生存力丧 失的ICso值为3.5 jiM (图6)。因此，(S)-青霉胺-氧化砷在阻断内皮细 胞的增殖和降低其生存力方面比GSAO更有效约25倍。
(S)-青霉胺-氧化砷是内皮细胞而非肿瘤细胞的选择性抑制剂。对内 皮细胞和上皮细胞与八种不同肿瘤细胞系相比的增殖抑制的ICSo的比 较示出于表l中。与内皮细胞相比，所有测试的肿瘤细胞对(S)-青霉胺-氧化砷的抗性均高1.6-30倍。BAE细胞对(S)-青霉胺-氧化砷的敏感度还 比肾上皮细胞高5.6倍。(S)-青霉胺-氧化砷在作用于APL细胞时与三氧 化二砷等价，而GSAO的活性低约10倍(图7 )。
表l.(SV音霉胺-氧化砷对各种细胞系增殖抑制的IC^
细胞类型_细胞系 IC50，pM
牛主动脉内皮细胞 BAEC 0.43
人急性早幼粒细胞白血病 NB4 0.70
人慢性粒细胞白血病 K562 1.4
狗肾上皮细胞 MDCK2 2.4
人纤维肉瘤 HT1080 4.0
人肺癌 LLC 5.0人结肠直肠癌
HCT1116
人胰腺癌 人乳腺癌 人胰腺癌
PANC-1
MCF-7
BxPC-3
(S)-青霉胺-氧化砷在诱导线粒体通透性转变方面也比GSAO更有 效。与GSAO类似，(S)-青霉胺-氧化砷以时间和浓度依赖性方式触发分 离的大鼠肝脏线粒体的膨胀(图8)。与GSAO相比，(S)-青霉胺-氧化 砷使分离的线粒体发生半最大膨胀的时间快约4倍。
不希望受限于任何特定理论，(S)-青霉胺-氧化砷与GSAO相比抗增 殖活性增加的 一种可能机制是在细胞中的积累增加。该理论可以通过下 述方法来测试，即通过测量砷的细胞积累来比较内皮细胞对这两种化合 物的摄取。(S)-青霉胺-氧化砷在BAE细胞中的积累速率比GSAO快大 约70倍(图9)。 GSAO和(S)-青霉胺-氧化砷的初始积累速率分别为1 和69 pmo1/106细胞/分钟。
OATP参与跨质膜的O-青霉胺转运
DIDS是质膜有机阴离子转运多肽(OATP )的 一种抑制剂 (Kobayashi et al.， 2003)。该化合物抑制BAE细胞中的(S)-青霉胺-氧化 砷摄取(图10A)并且降低其抗增殖活性(图10B),这一发现意味着 该转运蛋白参与这些细胞对(S)-青霉胺-氧化砷的摄取。
(S)-青霉胺-氧化砷由MRP1和2输出细胞
MRP1/2介导GSAO从BAE细胞中输出(Dilda et al.， 2005b )。青 霉胺-氧化砷也是MRP1/2的底物。在存在MRP1/2抑制剂4H10和 MK-571的情况下，有更多的(S)-青霉胺-氧化砷积累到BAE细胞中(图 IIA)，这与更加有力的抗增殖作用相关(图IIB)。所述抑制剂单独时 对BAE细胞增殖没有影响(数据未示出)。
测试了过表达MRP 1、 2、 3或6或者MDR1或BCRP的哺乳动物 细胞对(S)-青霉胺-氧化砷的抗性。MRP1、 MRP2或MRP3均在犬肾 上皮细胞MDCKII细胞系中过表达，而MRP6、 MDR1或BCRP均在 鼠类胚胎成纤维细胞MEF3.8系中过表达。使细胞与所示浓度的(S)-青 霉胺-氧化砷接触96小时，测量活细胞数并以未处理细胞数的相对值进 行表示。以(S)-青霉胺-氧化砷对未转染母体细胞的增殖抑制的ICso的相对值计算抗性因子。
表2.过表达不同药物转运蛋白的哺乳动物细胞对(S)-音霉胺-氧化砷 的抗性
转运蛋白_抗性因子_
MD/MRP1 3.7 MD/MRP2 4.6 MD/MRP3 0.8 MEF/MRP6 1.3 MEF/MDR1 1.2 MEF/BCRP 1.1
这些结果表明GSAO和(S)-青霉胺-氧化砷均由MRP1/2从BAE细
胞中输出。
使用谷胱甘肽处理BAE细胞降低了 GSAO对BAE细胞增殖的抑 制，而使用丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO )( —种y-谷氨酰半胱氨酸合酶的 抑制剂)阻断谷胱甘肽从头合成可增强增殖抑制达几乎100倍(Dilda et al., 2005b)。这些结果表明MRPl/2需要细胞谷胱甘肽来从细胞中有效 转运GSAO。与所述使用GSAO的发现类似，使用BSO处理BAE细 胞增强了(S)-青霉胺-氧化砷对增殖抑制的ICso达到约25倍(图12)。
这些结果表明(S)-青霉胺-氧化砷是一种更为有效的内皮细胞抑制 剂，因为它在所述细胞中的积累速率比GSAO快得多。
(S)-青霉胺-氧化砷的抗肿瘤活性
给在近中线处携带有皮下人BxPC-3胰腺癌肿瘤的BalbC棵鼠的胁 腹中皮下移植28天微型渗透压alzet泵。所述泵递送剂量为0.25、 0.5 或1 mg/kg/天的(S)-青霉胺-氧化砷。BxPC-3肿瘤的生长在接受(S)-青霉 胺-氧化砷的小鼠中明显受到抑制(图13)。对于以载体(100mM甘氨 酸)或者0.25、 0.5和l mg/kg/天的(S)-青霉胺-氧化砷处理的组，肺瘤 倍增时间分别为9.2、 8.3、 13.9和16.2天。
与(S)-青霉胺-氧化砷处理的动物相比，载体处理的动物的体重没有 变化(未示出)。在给予最高剂量的动物中，在所述泵递送部位有某种 程度的皮肤毒性。在10只小鼠中有3只小鼠在所述递送部位有皮肤坏死，而在l只小鼠中存在结締组织的积累。在给予较低剂量(s)-青霉胺國
氧化砷的偶见小鼠的所述递送部位处，存在某些结締组织积累的证据。
实施例2 - 4-(N-(S-半胱氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸("CAO")的 制备和效力
材料和方法 细胞增殖测定
牛主动脉内皮(BAE)细胞来自Cell Application (San Diego， CA)。 将BAE细胞在补加有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和5个单位/mL 青霉素和链霉素的DMEM (Gibco， Gaithersburg， MD)中培养。将细胞 在37""C下在5%C02、 95%空气的气氛中培养。将BAE细胞接种到96 孔板中(5，000个细胞每孔)的0.2ml培养基中。生长24小时后，将所 述培养基更换为补加有GSAO、 CAO或4H10的新鲜培养基，并且将细 胞再培养24、 48或72小时。使用四唑盐MTT (Sigma, St. Louis, MO) 按照生产商的说明书测定活的粘附细胞。结果表达为未处理对照的百分 数。
CAO的制备
按照前人所述(WO 01/21628 )利用HPLC生产GSAO，纯度>94%。 50 mM GSAO溶液是通过将GSAO固体溶解于pH 7.0的含有0.14 M NaCl、20 mM甘氨酸和ImM EDTA的20 mM Hepes緩冲液中制备的。 4-(N-(S-半胱氨酰甘氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸是通过用羊肾，谷氨 酰转肽酶I型(Sigma,产品号G8040 )从GSAO上切割y-谷氨酰基团 来产生的(图14 )。将10 mM GSAO溶液与溶于pH 7.4的含有40 mM 双甘氨肽的緩冲液中的0.55个单位/ml yGT在30。c下孵育1小时。通 过使用YM3 Microcon膜(Millipore， Billerica， MA)过滤来从反应体系 中移除yGT。
4-(N-(S-半胱氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸("CAO")是通过使用 猪肾氨肽酶N (IV-S型，Sigma,产品号L5006)从4-(N-(S-半胱氨酰甘 氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸上切割甘氨酸来产生的(图14)。将所述 滤液与2个单位/ml氨肽酶N在37。C下孵育1小时。通过使用YM3 Microcon膜(Millipore)过滤来从反应体系中移除氨肽酶N。 CAO的 浓度可以通过以下方法来测量，即4吏用二巯基丙醇滴定并且使用5，5'-二硫双(2-硝基苯曱酸)计算残余的游离巯基(Don etal.， 2003)。对经滴定的溶液进行无菌过滤并且在4t:下避光贮藏直至使用。
HPLC分析
GSAO和CAO可通过HPLC来表征(1200系列Agilent Technologies, Santa Clara, CA )。将样本在使用乙腈-水(25:75 vol/vol) 流动相的Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4.6x150 mm, 5拜；Agilent Technologies )解析，流速为0.5 ml/分钟，并且监测256 rnn处的吸光度 (图15)。
GSAO和CAO在BAE细胞中的积累
根据实验类型，1.6xl(^或7.5xl()5个BAE细胞分别接种到培养亚 或6孔板中，并且粘附过夜。更换培养基，并且在不存在或存在阿西维 辛或4H10的情况下将所述细胞孵育30分钟。然后，将所述细胞用50 或100 nM GSAO或CAO赙育30分钟或4小时。然后将细胞用水冷的 PBS冲洗两次，并且用1 ml 70% w/w硝酸裂解。将裂解产物稀释30倍， 并且使用Elan 6100电感偶合等离子体光谱仪(Perkin Elmer Sciex Instruments, Shelton， CT)分析砷原子。
线粒体膨胀测定
线粒体是按照前人所述(Dilda et al.， 2005a)使用差速离心从约20 g 雌性BalbC棵鼠的肝脏中分离的。将最终的线粒体沉淀重悬于pH 7.0 的含有213 mM甘露醇、71 mM蔗糖和10 mM琥珀酸钠的3 mM Hepes-KOH緩冲液中，浓度为30 mg蛋白/mL。通过在37。C下将所述 肝脏线粒体以1 mg蛋白/ml的浓度悬浮于pH 7.0的含有75 mM甘露醇、 250 mM蔗糖、10 mM琥珀酸钠和2 mM鱼藤酮的3 mM H印es-KOH 緩冲液中来通过分光光度法评估线粒体通透性转变诱导(Dilda et al., 2005a)。通过使用分子设备M2酶标仪(Palo Alto, CA)监测520 nm处 的相关光散射减少来测量膨胀。
结果和讨论
与GSAO相比，CAO在细胞中积累得更快并且抗增殖活性更高。 4-(N-(S-半胱氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸(CAO )是通过对GSAO 进行酶法切割来产生的，并且测量其在内皮细胞中的积累以及对细胞增 殖的作用。4-(N-(S-半胱氨酰甘氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸是通过使 用羊肾？谷氨酰转肽酶从GSAO上切割y-谷氨酰基团来产生的，并且4一(N-(S-半胱氨酰乙酰基)氨基)-苯基卑胂酸(CAO)是通过使用猪肾氨 肽酶N从该中间产物上切割氨基酸甘氨酸来产生的(图14)。利用分子 筛过滤将所述反应体系中移除所述酶。
CAO在内皮细胞中积累的速率比GSAO快约8倍(图16A)。这些 代谢产物的细胞积累是细胞摄取速率和输出速率之间的平衡。GSAO在 细胞中的积累受到多药耐药相关蛋白(MRP)l和2的输出速率的控制 (Dilda et al.， 2005b )。为了测试CAO是否也是由MRP输出的，测试 MRP-1抑制剂4H10对内皮细胞中积累的影响。当MRP-1受到抑制时， CAO的细胞积累分别增加了约3倍(图16)。这一发现意味着CAO在 内皮细胞中积累的增加主要是由于摄取速率增加。
预期CAO在内皮细胞中的较快积累速率会导致抗增殖活性增加。 GSAO和CAO在24、 48和72小时测定时的内皮细胞增殖抑制的IC50 在图16C中示出。由该结果显而易见的是，GSAO的ICso随孵育时间 而显著降低，而CAO的ICso随孵育时间的降低要小得多。例如，72小 时的GSAO的ICs。与24小时的CAO的ICsc相似。
CAO触发线粒体通透性转变。
已经证明GSAO会使线粒体内膜转运蛋白腺噤呤核苷酸移位酶 (ANT )失活，这会导致增殖抑制和细胞死亡(Don et al.， 2003 )。 CAO 还会诱导线粒体通透性转变(图17)。参考文献
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权利要求
1.一种具有通式(I)的化合物及其盐和水合物、其对映异构体和外消旋化合物其中所述As(OH)2基团位于该苯环上N原子的邻位、间位或对位；R1选自氢和C1-3烷基；R2和R3可相同或不同，并且独立地选自氢、任选取代的C1-3烷基、任选取代的环丙基、任选取代的C2-3烯基和任选取代的C1-3烷氧基；R4和R5可相同或不同，并且独立地选自氢、任选取代的C1-3烷基、任选取代的环丙基、任选取代的C2-3烯基和任选取代的C1-3烷氧基；m为选自1、2和3的整数；n为选自1、2和3的整数；＊表示手性碳原子。
2. 根据权利要求1的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环上N 原子的邻位或对位。
3. 根据权利要求1或2的化合物，其中Ri选自氢、曱基和乙基。
4. 根据权利要求l-3任一项的化合物，其中W为氢。
5. 根据权利要求1-4任一项的化合物，其中112和113均独立地选自氢、d—3烷基、C2-3烯基、Cw烷氧基、卣代-(Cw)烷氧基、羟基(Cw)烷 基和卤代(Cw)烷基。
6. 根据权利要求l-5任一项的化合物，其中112和113独立地选自氢、 曱基、乙基、曱氧基、乙烯基、羟甲基、CFs和OCF3。
7. 根据权利要求l-6任一项的化合物，其中112和113独立地选自氢、甲基和乙基。
8. 根据权利要求l-7任一项的化合物，其中W为曱基且RS为氢。
9. 根据权利要求l-8任一项的化合物，其中！^和RS均为氢。
10. 根据权利要求l-9任一项的化合物，其中114和115均独立地选自 氢、Cw烷基、Cw烯基、Cw烷氧基、卣代-(Cw)烷氧基、羟基-(Cw)烷 基和囟代(Cw)烷基。
11. 根据权利要求1-10任一项的化合物，其中W和R5独立地选自 氢、曱基、乙基、甲氧基、乙烯基、羟基-(Cw)烷基、CF3和OCF3。
12. 根据权利要求1-11任一项的化合物，其中议4和R5独立地选自 氢、甲基、乙基和羟甲基。
13. 根据权利要求l-12任一项的化合物，其中W为氢、曱基或乙 基，并且R5为氢。
14. 根据权利要求1-13任一项的化合物，其中R4为曱基且R5为氢。
15. 根据权利要求1-12任一项的化合物，其中R"和R5均为氢。
16. 根据权利要求1-12任一项的化合物，其中R"和W均为曱基。
17. 根据权利要求l的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环 上N原子的邻位或对位；W为氢或曱基；议2和R"均独立地选自氢、d-3烷基、Q-3烯基、Cw烷氧基、面代-(d-3)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卤代(d—3)烷基；R4和R5均独立地选自氢、Cw烷基、Cw烯基、Cw烷氧基、 卤代(Cw)烷氧基、羟基(Cw)烷基和卤代(Cw)烷基；m为l或2;并且n 为l或2。
18. 根据权利要求1的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环 上N原子的邻位或对位；W为氢或甲基；W和113均独立地选自氢、曱 基、乙基、甲氧基、乙烯基、CH2OH、 CF3和OCF3; 114和115均独立地 选自氢、曱基、乙基、CH2OH、曱氧基、乙烯基、CF3和OCF3; m为1; 并且n为1。
19. 根据权利要求1的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环 上N原子的对位；W为氢或曱基；W和R3均独立地选自氢、甲基和乙 基；！^和R5均独立地选自氢、甲基和乙基；m为l;并且n为l。
20. 根据权利要求1的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环 上N原子的对位；W为氢或曱基；议2为氢或曱基；113为氢或甲基；R4 为氢、甲基或乙基；Rs为氢或曱基；m为l;并且n为l。
21. 根据权利要求l的化合物，其中所述As(OH)2基团位于该苯环 上N原子的对位；W为氢；W为氢或曱基；W为氢；R"为氢或甲基； R5为氢或曱基；m为l;并且n为l。
22. 根据权利要求l的具有下述结构式的化合物及其盐、水合物、对 映异构体和外消旋化合物H3C、 ,CH3e02C、As(OH)2。
23. 根据权利要求1的具有下述结构式的化合物及其盐、7jc合物、 对映异构体和外消旋化合物、As(OH)2
24. 根据权利要求22或23的化合物及其盐和水合物，其中标有* 的手性碳处的立体化学为(S)。
25. —种药物组合物，包括至少一种根据权利要求1-24任一项的具 有式(I)的化合物或者其盐或水合物，以及一种可药用赋形剂、稀释剂或 佐剂。
26. —种治疗脊推动物中细胞增殖性疾病的方法，所述方法包括给 予所述脊椎动物治疗有效量的一种才艮据权利要求1-24任一项的具有式(I) 的化合物或者一种根据权利要求25的组合物。
27. 根据权利要求26的方法，其中所述增殖性疾病为实体瘤。
28. —种抑制脊推动物中血管发生的方法，包括给予所述脊推动物 有效量的一种根据权利要求1-24任一项的具有式(I)的化合物或者一种才艮 据权利要求25的组合物。
29. —种选择性诱导脊推动物增殖细胞发生MPT的方法，包括给 予所述脊推动物治疗有效量的一种根据权利要求1-24任一项的具有式(I) 的化合物或者一种根据权利要求25的组合物。
30. —种诱导增殖的哺乳动物细胞发生凋亡的方法，包括给予所述 哺乳动物可诱发凋亡量的一种根据权利要求1-24任一项的具有式(I)的化合物或者一种根据权利要求25的組合物。
31. 根据权利要求26-28或30任一项的方法，其中所述细胞为内皮 细胞。
32. —种治疗脊推动物中白血病或骨髓增殖异常综合征的方法，包 括给予所述脊推动物治疗有效量的一种根据权利要求1-24任一项的具有 式(I)的化合物或者一种根据权利要求25的组合物。
33. 根据权利要求32的方法，其中所述白血病为急性早幼粒细胞白 血病(APL)或急性粒细胞白血病(AML)。
全文摘要
本发明涉及有机-氧化砷化合物及用于合成它们的方法。本发明包含还涉及包括这些化合物的药物组合物及它们在疾病和障碍特别是增殖性疾病和障碍的治疗中的用途，所述疾病和障碍包括实体瘤和白血病的治疗。
文档编号A61P35/02GK101595115SQ200780043989
公开日2009年12月2日 申请日期2007年11月1日 优先权日2006年11月1日
发明者P·J·霍格, P·迪尔达 申请人:新南部创新有限公司