专利名称：用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗和诊断方法。
背景技术：
2002年，美国因癌症引起的死亡人数占总死亡人数的22.8%，位 居主要死因第二位。导致死亡最普遍的四种癌症类型是肺或支气管 癌、乳腺癌、结肠或直肠癌和前列腺癌。对2005年的推算表明，肺 癌将占男性癌症死亡人数的31%,将占女性癌症死亡人数的27%。预 计女性主要癌症死因第二位的乳腺癌，将占女性癌症死亡人数的15% ， 而前列腺癌很可能占男性癌症死亡人数的10%。预计男女性结肠直肠 癌将占癌症相关死亡人ft的10%。
癌症诊断
上述每一种致命的癌症只要在转移发生之前被检查出来，就都是 可医治的。在适当的情况下，手术切除术加上可能的放射疗法或辅助 性化学疗法仍然是主要的治疗方法。早期检查有时通过对风险适当升 高的患者群体进行常规筛查来实现。筛查方法包括分别用于结肠癌和 乳腺癌早期检查的结肠镜检查和乳房X线摄影术。乳房X线摄影术仍
是有缺点的检查法，因为难以检查出乳房致密女性中的损害。前列腺
癌筛查包括直肠指4企(DRE)和血液前列腺特异性抗原(PSA)水平的测 定。单DRE的灵敏度仅约为50%;结合DRE和PSA水平评价的结果 较好，但是前列腺癌的早期检查是否能挽救生命则仍然存在着争议。 最终并未证实筛查肺癌的常规X线胸片是有效的。现行研究关注的焦 点在于胸部CT扫描能否用作肺癌早期检查的有效筛查工具，但是偶然发现的频率相对较高，紧随其后必需进行后续检查，这是对费用效
益的考验。然而只有当乳腺损害大小超过2 cm，肺中超过lcm时， 2-[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)和正电子发射断层成像(positron emission tomography, PET)扫描(FDG-PET)扫描对于4企查肺和乳I^原 发性恶性肿瘤才是灵敏的。用于检查原发性前列腺癌的灵敏度和特异 性较差。因为结肠中FDG活性通常都升高，所以PET不是筛查原发 性结肠癌的理想选择。在诊断检查的现有限制条件下，患者病史检查 和身体检查仍然是癌症诊断最重要的方面。
癌症一经确诊，就必须确定癌症的病期。这由测量肺瘤的大小和 程度组成，不论它是否已侵袭到附近结构，也不论它是否已扩散到淋 巴结或体内更远的部位。给定的治疗方法是否有效取决于诊断时癌症 的病期。如果癌症检查发生在相对较早期，则患者就可按治愈目的进 行治疗，而且手术切除通常是必要的。对于较晚期的癌症，便实施使 患者生命质量最优化的治疗，手术则常常会引起生病而不会治愈。
已充分证明闪烁显像研究是癌症分期的有效诊断工具。采用99m-锝标记的二膦酸盐化合物的骨扫描传统上被用来检查肺癌、乳腺癌、 前列腺癌、结肠直肠癌和多种其它癌症的骨转移。在这种情况下， 80-90%以上的骨扫描灵敏度一般是可接受的，但是这些比例在很大程 度上是从局限于一种癌症类型的少量研究中推断出来的。仅骨扫描的 特异性相对较差，必须由临床信息和补充射线照相法予以提高。 FDG-PET扫描已经成为有价值的癌症分期工具。其检查骨转移的灵敏 度几乎等于骨扫描的灵敏度，但是其特异性要高得多。另外，PET扫 描可检查软组织中的转移，包括淋巴结、肝、肾上腺、肺和胸壁上的 转移。遗憾的是，在美国PET扫描并不是普遍可使用得到的。与拥有 和运作PET成像中心有关的花费要求这些中心存在于较高人口密度 的地区。美国许多地区依赖移动PET设备，其中将PET扫描仪放在 卡车的后车箱，定时运到社区。 一些农村地区的患者为了接受PET扫 描，不得不旅行数小时并支付住宿费。较为传统的具有单光子发射型计算机断层成像(Single-Photon Emission Computed Tomography, spect)性能的y照相机比pet扫描仪便宜并易于拥有和操作，因此 可更为广泛地使用。能够检查癌症和进行癌症分期、灵敏度和特异性 与fdg相似的单光子发射型放射性示踪物可以用spect y照相机拍 照，对于负担不起PET中心的社区会有很多好处。显然，这不^f又仅有 益于美国农村和半农村社区，而且还有益于全球没有pet中心的地 区。这可采用以相对高的亲和力特异性结合癌细胞的分子来实现，该 分子可用单光子发射体(例如99m-锝)标记；目前仍然存在对这类分子 的需求。
癌症治疗
癌症的现有治疗包括》t射疗法、化学疗法和生物疗法。可在"^断 之后，根据癌症类型、病期、部位和患者健康状况，采用这些癌症疗 法类型的一种或多种。生物疗法在癌症治疗中的作用或许是癌症治疗 研究中发展得最快的领域。用于癌症治疗的另 一条正在研发中的治疗 药路线包括抑制癌生长和转移的合成小分子药物。下面将论述用于治 疗癌症的生物疗法和小分子药物疗法两者的优缺点。
癌症的生物疗法通常包括在癌症患者体内诱导抗癌免疫应答。这 是一个困难的问题，因为虽然患有增殖性疾病，但是患者免疫系统在 很大程度上仍把癌细胞识别为"自身"的。在最近20多年来，已经 开发出若干种利用生物药物对抗癌症的策略。细胞因子(例如白介素2 (IL-2)和干扰素a (IFN-a))大多是通过刺激患者的免疫系统，而被用来 对抗多种癌症。这些疗法可能引起严重的副作用，几乎没有聚焦在特 异性针对癌细胞的免疫应答上。或者，单克隆抗体(例如阿仑珠单抗 (alemtuzumab)(肯巴斯(Campath))和利妥昔单抗(rituximab)(美罗华 (Rituxan))),当用于针对某些类型的癌症(例如B细胞淋巴细胞白血病) 时，被证明是放射疗法和化学疗法有效的辅助疗法，尽管这些单克隆 抗体和其它单克隆抗体靶向与癌症有关的细胞类型，但不仅仅只是癌细胞。整个细胞群体或谱系的部分或完全丧失(例如当给予患者阿仑珠 单抗时所有淋巴细胞丧失)是许多这类治疗药令人困扰和使用受限制
的副作用。只有最新获得的通过肿瘤特异性抗原(TSA;例如曲妥珠单 抗(trastuzumab)、赫赛汀(Herceptin))特异性靶向癌细胞的单克隆抗体， 才成为临床工作人员的对抗癌症药物库的组成部分。生物疗法，包括 可以区分健康细胞与癌细胞的肽、多肽和抗体将提供重要的治疗益 处。
结合和抑制癌细胞的小分子药物是另 一个新兴的用于癌症治疗 的治疗选择。埃罗替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)(治疗非小细胞 肺癌所必需的EGFR酪氨酸激酶抑制剂)等药物是特异性靶向和抑制 癌细胞的第一代小分子药物的成员。最近十年来，应用计算机建模设 计最佳结合和抑制特性，极大地加快了抗癌小分子药物的研究和开 发，市场上也涌现出许多新产品。鉴定和合成小分子药物未来的努力 为有效的癌症靶向疗法提供了希望。
发明简述
本发明的特征是用于癌症诊断和分期、用于监测患者对癌症疗法 的反应以及用于治疗癌症患者的组合物和方法。本发明是基于发现了 以比正常细胞高的亲和力结合癌细胞的肽、多肽、抗体和小分子(即本 发明的药物)。本发明的组合物和方法的特征是如SEQ ID NO:l-14所 示的一组结合序列的诊断和治疗用途，所述序列促进标记或未标记的 本发明药物与癌细胞特异性结合。在本发明另一个实施方案中，本发 明的药物与得自热激蛋白70 (HSP70)的表位结合，其序列如SEQ ID NO:15所示。在具体实施方案中，本发明所^^开的肽、多肽、抗体和
小分子与下列癌细胞结合的亲和力比与非癌组织结合的亲和力高肺 癌、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌细胞。
一方面，本发明的特征是与天然非变性构象的热激蛋白70 (HSP70)蛋白家族成员(例如HSP70、 HSC71、 GRP78和致死蛋白(mortalin))结合的药物(例如肽、多肽、抗体和小分子)。在一个实施方 案中，该药物能够与癌细胞(例如人肺瘤细胞)结合。在一个优选的实 施方案中，该药物与癌细胞结合的亲和力比与正常细胞(例如非癌细胞) 结合的亲和力大。在另一个实施方案中，该药物含有结合结构域，其 包括与一个或多个如SEQ ID NO:l-14所示的序列有至少90%序列同 一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明的药物是抗体 (例如双链抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')2分子、单链Fv (scFv) 分子、串联scFv分子、单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和抗体融合蛋 白)。在又一个实施方案中，抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、重组 抗体、合成抗体或天然书f生的抗体，并可具有一种选自IgG、 IgA、 IgM、 IgD或IgE的同种型。在其它实施方案中，本发明的药物通过共价键 与以下成分偶联(例如直接(例如含或不含接头部分)，或者通过电荷相 互作用(例如通过离子键、疏水键、氢键或范德华力)与以下成分间接 偶联可检测标记(例如放射性标记(例如锝-99m、硖-123、碘-131或 铟-lll)、焚光标记(例如荧光团)、酶标记、重金属(例如relaxivity金 属)、比色标记或磁共振成像标记))、治疗药、细胞毒药物或螯合剂。 在一个优选的实施方案中，本发明的药物含有与一个或多个如SEQ ID NO:l-14所示的氨基酸序列有至少80%、优选90%、更优选95%、最 优选99%或100%序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中， 本发明的药物包括含有氨基酸序列DYWDTSWPLLLF (SEQ ID NO:ll)的结合结构域。优选本发明的药物靶向癌组织(例如乳腺癌、前 列腺癌、结肠癌或肺癌)。另一个实施方案包括通过聚乙二醇化、交联 或其它化学修饰法修饰的本发明药物。在一个优选的实施方案中，本 发明的药物与药学上可接受的载体或赋形剂 一起配制。
本发明第二个方面的特征是使用本发明第 一方面的药物(例如 肽、多肽、抗体和小分子yf吏癌症成^f象或"^断癌症的方法。在本发明的 一个实施方案中，体内或体外使用该药物使人患者或其样品的赘生物 (neoplasm,亦称肺瘤)或含有肿瘤细胞(neoplastic cell)的区域成像。在另一个实施方案中，采用该方法检测哺乳动物体内的肿瘤，或者在体
外方法中检测得自患者的生物样品中的胂瘤。优选这些方法包括(a) 提供本发明的可检测标记的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)，该 药物具有一个或多个结合结构域，该结合结构域含有一个或多个如 SEQ ID NO:l-14所示的序列(或者与如SEQ ID NO:l-14所示的氨基酸 序列有至少80%、优选90%、更优选95°/。、最优选99%或100%序列 同一性的分子)；(b)给予患者(例如通过静脉内注射)该药物，或者使该 药物与取自患者的生物样品接触；和(c)使该药物与癌组织结合，并将 未结合的药物从身体或样品中清除；和(d)得到胂瘤或含有肿瘤细胞的 区域的成像，或者对胂瘤或含有胂瘤细胞的区域进行^r测，或者通过 对标记药物与癌细胞结合进行检测来诊断患者的癌症。在本发明 一个 优选的实施方案中，如此获得的成像可包括整个身体以显示身体内原 发性癌症的部位，或者^f全测整个身体内癌转移的存在或分布。或者， 成像可只包括身体某一部位(例如头颈部、胸廓(thorax/chest)或腹部)， 以更好地确定身体某一区域内肿瘤组织的大小或程度。优选成像采用 Y闪烁法获得。
第三个方面，本发明的特征是使用本发明的药物(例如肽、多肽、 抗体和小分子)治疗哺乳动物体内癌症(例如肿瘤)的方法。 一个优选的 实施方案包括(a)给予诊断有效量的可检测标记的分子，其中所述分 子是一种具有如SEQ ID NO:l-14所示序列的肽(或者与如SEQ ID NO:l-14所示的肽序列有至少80%、优选90%、更优选95%、最优选 99%或100%序列同一性的分子)；和(b^企测结合哺乳动物组织的分子 的可检测标记的存在，其中标记的量超过本底水平可表示哺乳动物体 内存在肿瘤。在优选的实施方案中，该方法涉及怀疑患有乳腺癌的人 患者，所述组织是乳腺组织。在其它优选的实施方案中，该方法涉及 怀疑患有前列腺癌的人患者，所述组织是前列腺组织。在其它优选的 实施方案中，该方法涉及怀疑患有结肠癌的人患者，所述組织是结肠 组织。在其它优选的实施方案中，该方法涉及怀疑患有肺癌或支气管癌的人患者，所述组织是肺或支气管组织。优选可检测标记的肽与放
射性核素(例如锝-99m)连接，检测步骤通过放射性成像(例如Y闪烁法) 实现。
第四个方面，本发明的特征是本发明第 一 方面的肽(例如一 个或 多个与SEQ ID NO:l-14有至少80%、优选85%、 90%或95%、更优 选99%或100%序列同一性的肽)在制备与癌细胞具有亲和力的抗体的 方法中的用途。抗体可以通过重组产生，并可配制以分别用于4企测或 治疗哺乳动物体内癌(例如肿瘤)的诊断或治疗用途。本发明的抗体具 有 一个或多个能够与天然非变性构象的热激蛋白70 (HSP70)蛋白家族 成员(例如HSP70、 HSC71、 GRP78和致死蛋白)结合的结合结构域。 在优选的实施方案中，本发明的抗体具有一个或多个能够与HSP70蛋 白的表位结合的结合结构域，所述表位与如SEQ ID NO:15所示的序 列(GIPPAPRGVPQIEVTF; HSP70的氨基酸463-478)有至少90%序列 同一性、优选95°/0、最优选99%或100%序列同一性。在优选的实施 方案中，本发明抗体的至少一个结合结构域具有选自一个或多个如 SEQ ID NO:l-14所示序列的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案 中，本发明抗体的结合结构域包括氨基酸序列DYWDTSWPLLLF (SEQIDNO:ll)。在优选的实施方案中，本发明的抗体是重組抗体、 嵌合抗体、人源化抗体、合成抗体或天然衍生的抗体。在其它优选的 实施方案中，本发明的抗体可以是双链抗体、双特异性抗体、Fab片 段、F(ab')2分子、单链Fv (scFv)分子、串联scFv分子、单克隆抗体 (mAb)、多克隆抗体和抗体融合蛋白。本发明的抗体还可以是选自IgG、 IgA、 IgM、 IgD或IgE的任一种同种型。
法，例如治疗、稳定、抑制癌细胞或者减少癌细胞数或降低癌细胞恶 性程度，或者治疗、稳定、抑制肿瘤或减小肿瘤大小。在一个优选的 实施方案中，该方法包括给予治疗有效量的本发明抗体，其中所述抗 体含有至少一个具有如SEQ ID NO:l-14所示氨基酸序列的结合结构域(或者与如SEQ ID NO: 1 -14所示氨基酸序列有至少80%、优选90% 、 更优选95%、最优选99%或100%序列同一性的抗体)。该方法还包括 给予治疗有效量的抗体，所述抗体含有与如SEQ ID NO:15所示的序 列有至少90°/。序列同一性、优选95%、更优选99%或100%序列同一 性的氨基酸序列特异性结合的結合结构域。在优选的实施方案中，该 方法涉及患有乳腺癌、前列腺癌、结肠癌或者肺癌或支气管癌的人患 者。优选该抗体与可检测标记、细胞毒药物、治疗药或螯合剂直接连 接(例如通过共价键或接头部分)，或者通过电荷相互作用间接连接。
本发明第六个方面的特征是测定小分子能否以高亲和力与如 SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或与同SEQ ID NO: 15有至少90%同 一性的氨基酸序列结合的方法。该方法还包括筛选可优先结合癌细胞 但不结合非癌细胞的候选小分子。
第七个方面，提供用于本发明诊断或治疗实施方案的药盒。该药 盒包括本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)和可^r测标记、 治疗药、螯合剂或接头部分，所述药物具有如SEQ ID NO:l-14所示 的序列(或者与如SEQ ID NO:l-14所示的肽序列有至少80%、优选 90%、更优选95%、最优选99%或100%序列同一性的序列)。在一个 优选的实施方案中，药盒的每种组分(肽、多肽或抗体和可检测标记、 治疗药、螯合剂或接头部分)单独包装在药盒中。在另一个优选的实施 方案中，药盒包括预定量的本发明药物和可检测标记、治疗药、螯合 剂或接头部分(例如足以诊断或治疗受治疗者的癌症的量)。可将本发 明药物和可检测标记、治疗药、螯合剂或接头部分冻干以便能够长期 保存。可将肽、多肽或抗体和可检测标记、治疗药、螯合剂或接头部 分密封装在无菌容器中。药盒优选包括使用药盒及其内容物的说明 书。例如使用之前，可用无菌等渗盐水将Tc-99m-高锝酸盐从普遍存 在于核医学设备和医院用》文射性药物(hospital radi叩harmacies)中的 Tc/Mo发生器中洗脱出来，在还原选定量的Tc-99m高锝酸盐的还原 剂存在下，将药盒中所提供的肽与Tc-99m-高锝酸盐结合，从而得到所需的Tc-99m-肽缀合物。还原剂的实例包括但不限于氯化亚锡和连 二亚硫酸钠。金属螯合剂的实例包括但不限于亚氨基羧酸反应基 (ininocarboxylic reactive group)和聚氨基聚羧酸反应基、二亚乙基三胺 五乙酸(DTPA)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)。
本文所用术语"大约"是指所列数值±10°/。的数值。
术语"给药"或"给予"'是指将一定剂量的本发明组合物(例如 肽、多肽、抗体或小分子)给予哺乳动物(例如人)的方法，其中所述方 法是例如局部、口服、静脉内、腹膜内或肌内给药。优选的给药方法 可随不同因素而变化，例如药物组合物的组分、潜在或实际疾病的部 位(例如肺癌、乳腺癌、结肠癌或前列腺癌的位置)和疾病的严重程度。
术语"类似物"是指不同于参比分子但在结构上、功能上和/或化 学上与参比分子有关的分子。类似物可保留参比分子的基本性质、功 能或结构。类似物最优选地保留参比分子的至少一种生物功能。 一般 而言，差异是有限的，从而使得参比分子的结构或序列与类似物的结 构或序列在总体上是相似的。肽或多肽类似物及其参比肽或参比多肽 可在氨基酸序列上因一个或多个取代、添加和/或缺失(以任何组合)而 有所不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或者可以不是天然存在的 氨基酸。肽或多肽的类似物可以是天然存在的，例如等位基因变体， 或者可以是已知不会天然存在的变体。肽或多肽的非天然存在的类似 物可通过直接合成、通过修饰或通过诱变技术来制备。
术语"抗体"是指重组抗体、合成抗体或天然抗体的全部或一部 分，其包含一个或多个如SEQ ID NO:l-14所示的氨基酸序歹'J(或者与 SEQIDNO:l-14中的一个或多个有至少90%、 95%或99%序列同一性 的序列(即至少一个如SEQ ID NO:l-14中任一个所示的氨基酸残基可 被任何其它氨基酸取代或者可缺失))，它存在于互补决定区中。术译 "抗体，，包括能够与HSP70蛋白特异性结合的任何多肽，包括例如完 整的完全抗体、嵌合抗体、双链抗体、双特异性抗体、Fab片段、F(ab')2 分子、单链Fv(scFv)分子、串联scFv分子以及包括如SEQIDN0:1-14所示结合序列的融合蛋白。完整的完全抗体包括单克隆抗体(例如鼠单
克隆抗体)(mAb)、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。可
对本发明的抗体进行工程改造以包括得自两种或更多种哺乳动物种 类或者得自 一种哺乳动物种类的多肽序列。抗体还可包括经合成获得 的序列。 一般而言，本发明的抗体包括得自人抗体的结构区序列。本 发明抗体还可以是"人源化的"，即它在一个或多个区(例如可变区的
一个或多个CDR)中包括非人类的残基。本发明的抗体对于HSP70蛋 白而言，表位的特异性和亲和力提高，体内半寿期延长。
一般而言，本发明的嵌合抗体由非人类哺乳动物(例如小鼠、兔 或山羊)与得自人抗体的恒定区序列经过重组衍生的结合序列构成。
抗体的产生及完整的完全抗体和抗体片段(例如Fab片段、scFv 片段和F(ab)2片段)的蛋白质结构及编码这类分子的遗传序列的组构 是众所周知的，参见例如Harlow等，ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)和Harlow等，USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, 1999，所述文献通过引用全部结 合到本文中。
术语"螯合剂"是指与单一金属原子形成多个化学键的分子。在 形成化学键之前，螯合剂具有一对以上的未共用电子。通过与金属原 子共用电子对从而形成化学键。螯合剂包括例如亚氨基二羧酸或聚氨 基聚羧酸。可釆用一般在以下文献中所描述的方法，使螯合剂与本发 明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)连接Liu等，5/oco"ywgafe C/z亂12(4):653， 2001; Alter等，U.S.P.N. 5,753,627和PCT公布号 WO 91/01144;所述各文献通过引用结合到本文中。本发明的药物可 通过其连接的螯合剂与可^r测标记络合，从而产生间接标记的药物。 同样，细胞毒药物或治疗药也可通过螯合基团与本发明的药物连接。
术语"互补决定区"或"CDR"是指作为超变区能够使抗体与特 定表位结合的抗体的氨基酸序列或该氨基酸序列的编码核酸序列(例
18^口 Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4片反,美 国卫生及公共服务部(U.S. Department of Health and Human Services), 美国国立卫生研究院(National Institutes of Health) (1987))。在完全抗体 中，在抗体可变区中有3个重链CDR (或者CDR区)和3个轻链CDR (或者CDR区)。形成抗体结合部位的可变区，通过连接可变区的相对 保守的构架区(FR)而排列在一起。按照Kabat等人的标准序列定义 (Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (美国国立卫 生研究院，Bethesda, Md. (1987)和(1991))，对CDR和FR残基进行 描述。
术语"偶联"是指第一分子与第二分子由共价键或通过非共价分 子间引力连接的特征。
术语"细胞毒药物"是指对肿瘤细胞有毒的任何天然存在的、修 饰的或合成的化合物。这类药物可用于治疗肿瘤，并可用于治疗以细 胞增殖或细胞群体过度活化为特征的其它症状或疾病。细胞毒药物包 括但不限于烷化剂、抗生素、抗代谢药、微管蛋白抑制剂、拓朴异构 酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、激素激动剂、激素拮抗剂或免疫 调节剂。细胞毒药物当被光线或红外线激活时可具有细胞毒性 (Photofrin， IR dyes; 5/otec/2"o/ 19(4):327画331 (2001))，可通过其它 机理途径起作用，或者可以是补充增效剂。
术语"可检测标记"是指当与本发明的药物(例如肽、多肽、抗 体或小分子)连接时使药物可被检测出的任何类型的标记。可检测标记 可以是有毒或无毒的，并且可具有不限于以下的一个或多个特性荧 光性(Kiefer等，WO9740055)、颜色、毒性(例如放射性，例如y发射 放射性核素、俄歇发射放射性核素(Auger-emitting radionuclide)、卩发 射放射性核素、a发射放射性核素或正电子发射放射性核素)、放射敏 感性或光敏感性。可检测标记可与本发明的药物直接连接(例如与肽、 多肽或抗体的残基连接，或通过化学键与小分子连接)，或者可与本发 明的药物间接连接，例如通过与连接(例如通过共价4建或间接连接)药物的螯合基团络合。可检测标记可通过由第二分子特异性结合标记的 能力而与本发明的药物间接连接。这种间接连接标记的类型的 一个实 例是可被第二分子(即链霉抗生物素)特异性结合的生物素标记。第二
分子还可与允许中子俘获的部分连接(例如硼笼(boron cage),参见例如 Kahl等，Ato"c"d5W 87:7265-7269 (1990))。
可检测标记还可以是得自重元素或稀土离子的金属离子，例如 Gd3+、 Fe3+、癒3+或Cr2+(例如/"ve^ 33(10):752-761, 1998)。
优选的放射性可检测标记包括能够与本发明类似物中存在的D-Tyr、 L-Tyr、 D-4-氨基-Phe或L-4-氨基-Phe残基每一个偶联的放射性碘标 记(例如1221、 1231、 1241、 1251或1311)。优选的非放射性可检测标记包括 能够与NH2-末端氨基酸残基偶联的多种已知的染料。
可检测标记的优选的实例可以是对细胞有毒的可检测标记，包括 蓖麻毒蛋白、白喉毒素和放射性可检测标记(例如1221、 1231、 1241、 1251、 131I、 177Lu、 64Cu、 67Cu、 153Sm、 166Ho、 186Re、 188Re、 211At、 212Bi、 225Ac、 67Ga、 68Ga、 75Br、 76Br、 77Br、 117mSn、 47Sc、 109Pd、 89Sr、 159Gd、 149Pm、 l42Pr、川Ag、 165Dy、 213Bi、川In、 114mIn、 201Ti、 195mPt、 193Pt、 86Y和
肽、多肽、抗体或小分子)或其类似物直接或间接连接。有毒的可检测 标记还可以是化疗药物(例如喜树碱类(camptothecins)、高喜树碱类 (homocamptothecins) 、 5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)或阿霉素 (adriamycin)),或者可以是辐射旁文4匕剂(radiosensitizing agent)(例i口泰 素(Taxol)、吉西他滨(gemcitabine)、氟嘧咬、metronitozil或脱氧胞苦 类似物2',2'-二氟-2'-脱氧胞苷(dFdCyd)。
可检测标记当与本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)偶 联时，发射出可用信号转换机检测的信号。在某些情况下，可检测标 记可自发地发射信号，例如当可^^测标记是》文射性核素时。在其它情 况下，可4企测标记由于被外源场刺激而发射信号，例如当可4企测标记 是relaxivity金属时。信号的实例包括但不限于y射线、X射线、可见光、红外能和无线电波。信号转换机的实例包括但不限于包括
SPECT/CT装置在内的y照相机、PET扫描仪、荧光计和核磁共振成 像(MRI)机。
术语"诊断有效量"是指本发明的可检测标记药物(例如肽、多 肽、抗体或小分子)当给予哺乳动物内部时，在量上足以被哺乳动物外 部的信号转换机(例如用于y闪烁法的y照相机);险测到但通常在量上 不足以产生药理作用的剂量。
术语"表位"是指抗原分子上与抗体或其部分特异性结合的区域。 表位可以由蛋白质抗原分子不同区域的残基所形成的三维序列产生， 该序列在天然状态下由于蛋白质折叠而紧密地并列在一起，或者可由 变性构象中蛋白质或肽的线性序列产生。本文所用"表位"还可指由 HSC70蛋白家族成员(例如HSP70、 GRP78、 HSC71)的肽或半抗原部 分产生的但不是三维表位的表位。优选的表位是其中当与免疫原(抗 体、抗体片段或免疫原性融合蛋白)结合时导致癌增殖或转移被抑制或 阻断的表位。
"热激蛋白(heat shock protein)"或"HSP"是指暴露于细胞应激 或环境应激(例如突然温度升高或葡萄糖剥夺)中在细胞内表达的蛋白 质。热激蛋白家族包括参与蛋白质跨膜转运的HSP70蛋白。在癌细胞 中，HSP70蛋白一般会增加。HSP70和HSP家族成员的实例参见例 如美国专利第5,627,039号和美国专利申请公布号20030211102和 20060270622,所述专利通过引用结合到本文中。
术语"人源化抗体，，是指包含人构架区和一个或多个得自非人类 (通常为小鼠或大鼠)抗体的CDR的嵌合抗体类型。提供CDR的非人 类抗体称为"供体，，，提供构架的人抗体称为"接纳体"。恒定区不 一定存在，但是如果存在，则与人抗体恒定区基本相同，即至少约 85-90%相同，优选约95%或以上相同。因此，人源化抗体的所有组成 部分，可能除CDR以外，都与天然人抗体序列的相应组成部分基本 相同。术语"成像剂(imaging agent,亦称造影剂)"是指当给予有生命的 受治疗者(例如哺乳动物(例如人))时，可使受治疗者的内部结构显现或 者可供测定受治疗者的组织或器官的机能的组合物。成像剂的实例包 括例如可与本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)直接或间接 连接的FDG。
术语"接头部分(linker moiety)"是指使本发明的药物(例如肽、 多肽、抗体或小分子)与螯合剂偶联的氨基酸序列。
术语"赘生物(neoplasm，亦称肿瘤)"是指以因细胞过度分裂而引 起异常生长为特征的任何组织或其细胞。赘生物(胂瘤)可以是良性的 或是恶性的。赘生物(肿瘤)的实例包括但不限于肺癌或支气管癌、结 肠直肠癌、乳腺癌和前列腺癌。
术语"肽"是指包括5个以上氨基酸残基的氨基酸序列。"肽" 既指短链(通常称为肽、寡肽或寡聚体)，又指较长链，长度长达约100 个残基，可包括通过肽键或修饰的肽键彼此连接的环状肽或支链肽。 肽可含有20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸(即非天然存在的氨基 酸)和肽键以外的键(例如拟肽的N-取代的甘氨酸键)。"肽"包括通过 天然过程或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。 修饰可发生在肽序列的任何位置上，包括肽主链、氨基酸侧链和C端 或N端。
本文所用的氨基酸残基的符号是本领域常用的缩写。不常用的缩 写Abu、 Ava、卩-Ala、 hSer、 Nle、 Nva、 Pal、 Dab和Dap分别代表 2-氨基-丁酸、氨基戊酸、|3-氨基丙酸、高丝氨酸、正亮氨酸、正缬氨 酸、(2、 3或4) 3-吡啶基-Ala、 1,4-二氨基丁酸和1,3-二氨基丙酸。在 本发明的所有方面，值得注意的是当氨基酸未注明是D-氨基酸还是 L-氨基酸时，氨基酸是L-氨基酸，或者可为D-氨基酸或L-氨基酸。
术语"还原剂"是指用来通过提供电子(从而被氧化)以还原另一 化合物的化合物。还原剂的实例包括但不限于氢化铝锂(LiAlH4)、初 生氢、钠汞齐、硼氢化钠(NaBHO、亚锡离子、亚碌^酸盐化合物、肼(Wolff-Kishner还原)、锌汞齐(Zinc-mercury amalgam) (Zn(Hg))、 二异 丁基氢化铝(DIBAH)、林德拉催化剂(Lindlar catalyst)和草酸(<:211204)。
术语"特异性结合"是指本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或 小分子)识別和结合靶标(例如肿瘤细胞，例如乳腺癌细胞、前列腺癌 细胞、结肠癌细胞或肺癌细胞)，但基本不识别和结合非耙标(例如非 肿瘤细胞)，无论靶标是存在于体内还是存在于体外样品中，例如包括 例如肿瘤细胞在内的生物样品。理想的本发明药物与癌细胞(例如乳腺 癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞或肺癌细胞)特异性结合。本发明 的药物优选结合肿瘤细胞的亲和力比结合非肿瘤细胞的亲和力至少 高2倍、5倍、10倍、20倍、100倍或1000倍。另外，本发明的药 物结合如SEQ ID NO:15所示HSP70表位的解离常数小于1(T6M，更 优选小于10-7M、 10'8M、 1(T9M、 10"。M、 1(T"M或10"2M,最优选小 于10"3M、 1(T"M或1(T15M。
术语"基本序列同一性"或"基本相同"是指肽或多肽(包括但 不限于抗体或抗体片段序列)与参比氨基酸序列有至少50°/。、优选 60%、 70%、 75%或80%、更优选85。/。、 90%或95%、最优选99%同 一性。比较序列的长度一般可为至少5个氨基酸，优选至少10个连 续氨基酸，更优选至少15、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 80、 90、 100、 150、 200、 250、 300或350个连续氨基酸，最优选为全长氨基酸序列。 优选本发明的肽序列与参比序列(例如如SEQ ID NO:l-14所示的一个 或多个肽)至少有40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或99% 同 一性。通常应用BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (基本局 部比对检索工具))或者按其中规定的默认参数应用BLAST 2来测定 序列同一性(例如Altschul等，/M /編215:403-410 (1990);以及 Tatiana等，F￡MS M/craZ /o/174:247-250 (1999))。该寿欠件程序通 过给各个取代、缺失和其它修饰的同源性程度赋值，使相似序列相匹 配。保守取代通常包括下列组别中的氨基酸取代甘氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰
23胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。
术语"治疗药，，是指本领域已知的用于检测、诊断或治疗癌症的 任何化合物。这类化合物可以是天然存在的、修饰的或合成的。治疗 药可以是例如抗肺瘤药，包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒药物。抗胂 瘤药可以是烷化剂、抗生素、抗代谢药、激素激动剂、激素拮抗剂、 微管蛋白抑制剂、拓朴异构酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、抗凋 亡剂、促凋亡剂或免疫调节剂。抗肿瘤药可通过其它机理途径起作用， 或者抗肿瘤药可以是补充增效剂。
术语"治疗有效量"是指本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或 小分子)当给予哺乳动物体内时足以产生药理作用的剂量。例如，在癌 症或肿瘤治疗中，"治疗有效量"是足以在临床上产生重要作用的量， 例如当与未接受这类疗程的对照患者相比，按照本发明的方法接受用 本发明的药物治疗的疗程的患者中，稳定或减小肿瘤的大小，或者稳 定或减緩癌细胞增殖，或者有统计显著性地改善患者存活。
术语"治疗、稳定或抑制癌症"是指引起肿瘤大小减小或癌细胞 数目减少、减緩或防止肿瘤大小增大或癌细胞增殖增加、肿瘤或其它 癌症消失与再次出现之间的无病存活时间延长、防止肿瘤或其它癌症 初次或再次发生、或者减轻与肿瘤或其它癌症有关的不良症状。在一 个理想的实施方案中，正如采用任何标准测定法(例如胱天蛋白酶测定 法、TUNEL和DNA断裂测定法、细胞通透性测定法及膜联蛋白V测 定法)所测定的一样，比起最初的肿瘤或癌细胞数，经过治疗仍存活的 肿瘤或癌细胞的百分比至少降低20%、 40%、 60%、 80%或100%。理 想的是，通过给予本发明的药物诱导的肿瘤或癌细胞数的减少至少是 非肿瘤或非癌细胞数减少的2倍、5倍、10倍、20倍或50倍。理想 的是，正如按标准方法所测定的一样，本发明方法导致肿瘤大小减小 或癌细胞数减少20%、 40%、 60%、 80%或100%。理想的是，至少20%、 40%、 60%、 80%、 90%或95°/。的接受治疗的受治疗者完全免除癌症， 其中肺瘤或癌症的所有迹象全都消失。理想的是，肿瘤或癌症不复发或者至少5年、10年、15年或20年后不复发。
根据本发明优选实施方案的下列描述以及权利要求书，本发明的 其它特征和优势是显而易见的。
附图简述
图l是显示用于针对不同的癌细胞类型和成纤维细胞淘选噬菌体 文库，以选出结合不同类型癌细胞但不结合正常成纤维细胞的噬菌体 克隆的流程(algorithm)示意图。循环流程被重复进行了多次。
图2是显示癌结合噬菌体肽(cancer binding phage p印tide)的共有 序列的表格。在最后一轮针对癌细胞的淘选后，对未扩增的噬菌体库 的共有序列进行分析。从12聚体(12mer)库中选出24个克隆，从7聚 体库中选出13个克隆。
图3A-3C是使用肽制剂PanF的细胞内化研究的显微照片。使癌 细胞(图3A) NCI-H460、(图3B) DU-145和成纤维细月包(图3C) CCD-1070Sk与焚光素标记的肽(绿色)一起孵育。细胞核用DAPI (蓝 色)显色。在癌细胞中观察到明显内化，但在成纤维细胞中未观察到。
图4曲线图显示将细胞与PanL —起孵育所诱导的细胞毒性百分 比。在DYWDTSWPLLLFGGGS (KFAKFAK)3 (PanL; SEQ ID NO: 13) 存在下，将包括前列腺癌细胞、肺癌细胞、非恶性前列腺上皮细胞和 成纤维细胞的细胞培养物进行孵育。在胂瘤细胞的情况下，观察到细 胞死亡呈剂量依赖性增加。非恶性细胞显示较低敏感性。
图5柱形图显示由与蓖麻毒蛋白A亚基缀合的癌结合肽(cancer binding peptide) (PanC)杀死细胞的百分比。蓖麻毒蛋白缀合物的浓度 为1000 nM。
图6是对从亲和力俘获的癌肽结合靶洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳并用考马斯蓝染色的照片。泳道2含有标准分子量的梯条带。泳 道5显示单一明显的相当于质量约70 kD的条带。
图7是表示放射性标记的PanC与候选表位结合的曲线图。这是使表位与20 nM标记的PanC —起温育来测定的。将量递增的未标记 的PanC加到温育混合物中，这阻断了标记的PanC的结合。
图8是显示Hsc71表位干扰肽结合Hsp70的曲线图。在不同浓度 的Hsc71表位(GIPPAPRGVPQIEVTF; SEQ ID NO:15)存在下，将放 射性标记的PanC加到Hsp70包被的孔和BSA包纟皮的孔(作为对照)中。 PanC浓度保持不变。Hsc71表位以浓度依赖性方式干扰PanC与Hsp70 结合，但是在所有浓度下，它抑制PanC与BSA的结合大致相等，这 与该表位与Hsp70之间有特异性结合竟争、但该表位与BSA之间无 特异性结合竟争相符。
发明详述
本发明的特征是用于诊断和治疗癌症的方法和组合物。本发明的 发明人证实癌细胞比非癌细胞表达某些膜结合分子的水平高，例如热 激蛋白70(HSP70)家族的蛋白质，例如HSP70(亦称HSP72)、 HSC70 (亦称HSP73)、 Grp78(亦称BiP)、致死蛋白、HSP60和HSC71。因此， 这些分子是治疗药和诊断药特异性导向癌细胞的有价值的靶标，从而 有利于检测癌细胞和/或使细胞毒药物靶向癌细胞，并消除或降低对周 围非癌细胞和组织的毒性。利用分子在癌细胞上差异展示(differential display)的现有努力无法鉴定可被治疗药或诊断药靶向的有用表位。本 发明的组合物和方法利用针对差异表达HSP70蛋白家族成员的癌细 胞的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)。该药物可用于"^断或^r测 癌细胞，或者可用来通过对药物进行修饰以分别包括可检测标记或治 疗药/细胞毒药物，从而诱导癌细胞凋亡或坏死。本发明的药物与确定 表位GIPPAPRGVPQIEVTF (SEQ ID NO:15)或与该确定表位至少有 90%、 95%或99%序列同一性的表位特异性结合。该表位存在于HSP70 家族蛋白中(例如HSP70的氨基酸463-478)。具体地讲，本发明的药 物单独或在多肽序列存在的情况下(例如在癌细胞上展示的多肽的情 况下)与该HSP70表位结合。优选地，当HSP70表位以其天然构象在癌细胞上的HSP70蛋白中展示时，本发明的药物与该HSP70表位结 合。因此，HSP70蛋白的变性不是本发明药物结合该确定表位所必需 的。总之，本发明的方法和药物提供直接靶向癌的治疗药和诊断药， 这可降低旁观者的细胞毒性。
本发明的药物还为医学癌症成像领域提供益处。成像分子可与本 发明的药物缀合，用来获取确定在给予成像剂的哺乳动物体内存在癌 细胞的图像。或者，可使与本发明药物缀合的成像分子与得自哺乳动 物的生物样品接触，筛选出成像剂与样品中癌细胞的结合。通过本发 明的药物检测从结合癌细胞的成像剂发射出来的信号，来证实哺乳动 物或得自哺乳动物的生物样品中癌细胞的存在。本发明的成像剂当体 内使用时，可用来使整个身体成像。另外，可使用本发明的成像剂确 定患者癌症的病期，这可有利于确定适当的后续处理。此外，可使用 本发明的成像剂在治疗期间和之后检测癌组织的反应。有时，之前的 癌块会保留在放射摄影成像(例如CT扫描)中，尽管已得到成功治疗。 在这种情况下，可使用本文所公开的本发明的成像剂将已成功治疗的 癌块与未成功治疗的癌块中区分开来；在给予本发明所公开的成像剂 之后未从癌块发射出信号，表明癌块已被成功治疗。本发明可采用PET 和SPECT成像技术使肿瘤成像，这更便宜并且被更广泛利用。
本发明的肽或多肽药物的制备
本发明的能够靶向癌细胞的肽或多肽药物可以采用固相肽合成 法(SPPS)通过偶联制备。正如本领域熟知的一样，待用作底物以形成 肽的氨基酸在掺入肽之前是Fmoc保护的(参见例如Chan. W. C.和 White, P. D., FMOC Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach Oxford University Press, New York (2003);该文献通过引用全部结合到 本文中)。用来偶联氨基酸以形成本发明所公开的肽和多肽的标准偶联 技术是本领域众所周知的(参见例如Chan和White,出处同上)。例如， 可采用本领域众所周知的化学方案，将Fmoc-Rink加到聚酰胺树脂上，来制备聚酰胺-Rink树脂(参见例如Chan和White,出处同上)。采用 本领域众所周知的技术，用哌啶从树脂上的N端胺基上脱去Fmoc后， 使肽或多肽序列的第一个氨基酸与树脂偶联。 一旦该偶联完成，便用 哌啶洗涤树脂，从偶联的氨基酸上脱去Fmoc。再次洗涤树脂，采用 本领域众所周知的技术，使所述序列中的下一个氨基酸与之前偶联的 氨基酸偶联。用必需氨基酸重复该步骤直到形成所需要的肽或多肽。 在最后一个氨基酸偶联之后，用哌啶脱去Fmoc基团。末端胺基可留 作游离胺基，或者可采用本领域众所周知的技术使之乙酰化(参见例如 Chan和White,出处同上)。可按照本领域已知的技术，用三氟乙酸 (TFA)、三异丙基硅烷和水将肽或多肽从树脂上裂解下来(参见例如 Chan和White,出处同上)。然后经过滤，将裂解的肽或多肽从残余物 中分离出来。通常使TFA蒸发至干，随后用乙醚使肽或多肽析出。通 常按照本领域众所周知的技术，将最终的肽或多肽产物用HPLC纯化 (参见例如Chan和White,出处同上)。采用质谱法证实获得了所需要 的肽或多肽。采用多种众所周知的市售自动合成仪的任一种(例如 Applied Biosystems ABI 433A肽合成仪)，可容易地通过自动固相合成 法制备本发明所公开的肽和多肽。
还可通过本领域已知的其它技术，从天然来源、重组产物或合成 物中分离出本发明的肽或多肽药物。
本发明的小分子
本发明还以用作诊断或治疗功能的小分子为特征，该功能基于d、 分子通过如SEQ IDNO:15所示表位(或者与该确定表位至少有90%、 95%或99%序列同一性的表位)与展示HSP70家族蛋白的癌细胞特异 性结合的能力。可对本发明的小分子进行标记，或者使之与诊断或治 疗接头、标记、细胞毒药物或本发明其它实施方案融合以协助诊断或 治疗癌症。
28用于结合HSP70蛋白的小分子的筛选方法
技术领域：
本发明的特征是用于高通量篩选(HTS)本发明的候选小分子药物 与HSP70家族蛋白、特别是与如SEQIDNO:15所示序列结合的能力 的方法。还可筛选候选小分子结合癌细胞、抑制生长或改变转移潜力 的能力。 一般而言，出于作为本发明药物的进一步考虑，候选小分子 与靶序列结合的解离常数必须小于1(T6M。
编码如SEQ ID NO: 15所示表位或与SEQ ID NO:15有至少卯0/0 同一性的序列的肽、多肽、噬菌体或融合分子或其文库，将使用HTS 结合测定和方法。 一般而言，基于荧光和发光的测定法(例如ELISA、 比色测定法)，被用来测定与一个或多个靶化合物接触的候选小分子的 结合亲和力，所述靶化合物编码如SEQ ID NO:15所示的表位。得自 第一种筛选方法的候选小分子经鉴定后，有必要通过不同的第二种 HTS测定法进一步细查候选小分子的结合亲和力和能力。这可通过以 下方法实现，例如，使有希望的候选小分子与如SEQIDNO:15所示 表位的变体接触，更精确地测定该分子的结合亲和力。HTS方法的有 关论述参见Verkman， "Drug discovery in academia (学术界的药物发 现)"^肌尸/yw.。/. Ce〃尸/^w.。/. 286, C465-C474 (2004)和Dove,
"Screening for content — the evolution of high throughput (筛选--高
通量方法的进展)"历o&c/z"o/ 21:859-864 (2003)。用于发现有用小 分子药物的HTS筛选方法的实例参见例如美国专利第7,279,286号和 第7,276,346号，所述专利文献通过引用结合到本文中。 可按照下面论述的有关设计考虑，凭经验对已进行HTS筛选的 候选小分子进行进一步修饰以改进结合亲和力或癌细胞生长抑制性 质。
小分子设计
还可根据合理设计原理来产生本发明的小分子。计算机建模技术 能使选定分子和新设计的化合物显现三维原子结构，所述分子和化合物可通过如SEQ ID NO: 15所示表位或者在癌细胞中表达的HSP70蛋 白的其它独特表位与HSP70家族蛋白相互作用。三维构建体通常取决 于选定分子或表位的X射线晶体学分析或NMR成像数据。计算机制 图系统能够预测候选小分子化合物将如何与靶标HSP70家族蛋白或 表位结合，可供对小分子和靶蛋白的结构进行实验性操纵从而改进结 合特异性。当分子一蛋白质中的一个或两个发生较小改变时，可运用 分子力学软件和计算密集型计算机，预测分子一蛋白质间相互作用的 程度。以上概括描述的分子建模系统的实例包括CHARMm和 QUANTA程序(Polygen Corporation, Waltham， Mass.)。 CHARMm执 行能量最小化和分子动态功能，而QUANTA执行构建、图形建模和 分子结构分析。QUANTA供交互构建、修饰、显现和分析彼此相互 作用的分子的作用方式之用。可用来鉴定用于本发明方法的d、分子的 另 一种分子建模程序是DOCK (Kuntz Laboratory, UCSF)。
HSP70家族蛋白的构象和结构性质为本领域技术人员所知(参见 Bork等，"An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins (原才亥纟田刀包周期蛋白、 糖激酶、肌动蛋白和hsp70热激蛋白共同的ATP酶结构域)"，Ato/ 爿cad5W 89(16):7290-4 (1992); Bukau等，"The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines (Hsp70和Hsp60陪4半才几)"，Ce〃 92(3):351-66 (1998); Misselwitz等,"J proteins catalytically activate Hsp70 molecules to trap a wide range of peptide sequences (J蛋白孑崔4b'l"生;敫活Hsp70分子 以俘获多种肽序列)，，，Mo/ Ce〃 2(5):593-603 (1998); Osipiuk等， "Structure of a new crystal form of human Hsp70 ATPase domain (人 Hsp70 ATP酶结构:威的新晶型的结构)"Oysto/Zogr Z)所o/ CV^to〃ogr. (Pt 5): 1105-7 (1999); Sondermann等，"Structure of a Bag/Hsc70 complex: convergent functional evolution of Hsp70 nucleotide exchange factors (Bag/Hsc70复合物的结构Hsp70核苷酸交换因子的 趋同功能进化)，，，5We"ce 291 (5508):1553-7 (2001); Tutar, "Key residuesinvolved in Hsp70 regulatory activity and affect of co-chaperones on mechanism of action (参与Hsp70调节活性的关键残基以及共陪伴分子 对作用机理的影响)，，，尸rafe/"尸e/^丄欲13(7):693-8 (2006)。可应用这一 知识设计能够与HSP70蛋白结合的小分子。
小分子合成
本发明的小分子可以是有机化合物或无机化合物，甚至是核酸。 可通过在小分子上包括有正确空间定位和电荷的化学基团，实现与中 靶HSP70家族蛋白或表位特异性结合。在一个优选的实施方案中，化 合物被设计成具有氢键供体和被处理成与中耙分子或表位互补的接 受位点。当药物呈由结合靶分子或表位而被诱导和稳定的特定构象 时，形成了具有按规定产生正确空间排列的氩键受体和供体的化学侧 基的药物。当合成本发明的小分子时，还可考虑其他结合力，例如离 子键和范德华相互作用。可运用分子计算程序对可能形成的合乎要求 的构象加以改进和/或最优化。
有机化合物可被设计成刚性的，或者在边缘或平面提供可与互补 位点相互作用的氢键结合基团。Rebek, 5We"ce235, 1478-1484(1987) 和Rebek等，J^4w C/zew 5bc 109， 2426-2431 (1987)概括了这些涉及化 合物与蛋白质区域结合的方法和机制。
本领域技术人员还可采用这些合成方法来产生与HSP70家族蛋 白或表位d 、沟(minor groove)中的官能基相互作用的小分子。
本发明抗体组合物的制备
本发明还4是供包括一个或多个如SEQ ID NO:l-14所示序列的抗 体组合物。另外，本发明提供与如SEQ IDNO:15所示表位、优选与 其未变性的天然构象结合的抗体。本发明的抗体可以是重组(例如嵌合 或人源化)抗体、合成抗体或天然抗体。本发明的特征是完全抗体、双 链抗体、双特异性抗体、抗体片段、Fab片段、F(ab')2分子、单链Fv (scFv) 分子、串联scFv分子或抗体融合蛋白。本发明的抗体包括IgG、 IgA、IgM、 IgD和IgE同种型。本发明的抗体含有一个或多个CDR区或结 杏肽，该结合肽与HSP70家族蛋白在如SEQIDNO:15所示表位上结 合，或与该确定表位有90%、 95%或99%序列同一性的序列结合。本 发明的抗体与如SEQ ID NO: 15所示序列或与同SEQ ID NO: 15有至少 90%序列同一性的序列结合，解离常数小于10《M，更优选小于1(T7M、 10—8M、 1(T9M、 10"°M、 1(T"M或1(T12M,最优选小于10"3M、 1(T14M 或1(T15M。
本文所描述的许多抗体或其片段可在可变区和恒定区两区内进 行非必需氨基酸取代、添加或缺失而不失去结合特异性或效应子功 能，或结合亲和力无过度降低(即约l(T7 M以下)。通常掺入这类变化 的抗体与其从中衍生的参比抗体具有基本序列同一性。有时，可以选
突变抗体。噬菌体展示技术为选出这类抗体提供了极其有效的技术。 参见例如Dower等，WO 91/17271; McCafferty等,WO 92/01047; 以及Huse, WO 92/06204，所述专利申请都通过引用结合到本文中。
抗体片段
在本发明另 一个实施方案中，本发明的药物是本文所述的完整抗 体的片段。抗体片段包括单独的可变重链、可变轻链、Fab 、 Fab' 、 F(ab')2 、 Fabc和Fv。可通过对完整免疫球蛋白进行酶分离或化学分离来产生 这些片,殳。例如，可采用标准方法(例如Harlow和Lane， Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs" N. Y. (1988)中所述方 法)，在pH3.0-3.5下用胃蛋白酶进行蛋白水解消化，由IgG分子获得 F(ab')2片段。Fab片段可通过有限还原由F(ab')2片段获得，或者可在 还原剂存在下用木瓜蛋白酶消化由完整抗体获得。片段还可通过重组 DNA技术产生。编码选定片段的核酸区段通过用限制性内切酶消化全 长编码序列产生，或者通过从头合成产生。片段通常以噬菌体外壳融 合蛋白的形式表达。这种表达方式对提高抗体亲和力是有利的。
32人源化抗体
本发明还提供人源化抗体，其中一个或多个CDR得自非人类抗 体序列，且一个或多个、^L优选所有CDR与如SEQ ID NO: 15所示的 HSP70表位或与该表位有90%、 95%或99%序列同一性的表位特异性 结合。
区，以及在某些情况下，得自人抗体的大部分可变区。一个或多个CDR (所有或其部分，以及一个或多个CDR周围的不连续氨基酸)由非人类 抗体(例如小鼠抗体)提供。抗体的恒定区可以存在，或者可以不存在。 在用于人的治疗或诊断的情况下，人源化抗体提供若干优于非人源化 抗体的优势。这些包括
1) 人免疫系统不应识别作为外源的人源化抗体的构架区或恒定 区，因此，抗体针对这类注射抗体的应答应小于针对完全外源小鼠抗 体或部分外源嵌合抗体的应答；
2) 因为人源化抗体的效应子部分是人的，所以它可与人免疫系 统的其它部分更好地互相作用；和
3) 有报道指出，注射小鼠抗体在人体循环中的半寿期比正常人 抗体的半寿期短得多(参见例如Shaw等，J/Awm/"o/ 138:4534-4538 (1987))。注射人源化抗体的半寿期基本上等于天然存在的人抗体的半 寿期，这就便于较少和较低频率的剂量。
如果人可变区构架采取与小鼠可变构架(CDR由其产生)相同或 相似的构象，则将一个或多个小鼠CDR取代人可变区构架很可能使 其正确空间取向受到保护。这可通过由其构架序列具有与鼠可变构架 区(CDR由其产生)具有较高程度的序列同一性的人抗体获得人可变区 来实现。重链和轻链可变构架区可得自相同或不同的人抗体序列。人 抗体序列可以是天然存在的人抗体的序列，或者可以是若干人抗体的 共有序歹'J。 参见例如Kettleborough等，fVo/e/w五"g/"ee"'"g 4:113(1991); Kolbinger等，尸rato'w五"g/"em."g 6:971 (1993)。
通过计算机对小鼠可变区的氨基酸序列与已知人抗体的序列进 行比较来鉴定合适的人抗体序列。分别对重链和轻链进行比较，但是 对每种比较的原理都是同样的。
嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段的制备方法参见美国专利号 4,816,567、 5,530，101、 5,622,701、 5,800,815、 5,874,540、 5,914,110、 5,928,904、 6,210,670、 6,677,436和7,067,313以及美国专利申请号 2002/0031508、 2004/0265311和2005/0226876。抗体或其片段的制备 还可参见美国专利号6,331,415、 6,818,216和7,067,313。
本发明的诊断药或治疗药
可按照本发明所公开的方法，使本发明的药物(例如肽、多肽、 抗体或小分子)与螯合化合物偶联以形成可用来检测、诊断或治疗癌细 胞的诊断药或治疗药。诊断药和治疗药可通过各种方法制备，这取决 于所选择的螯合剂。另外，本发明的药物可用荧光分子标记以有助于 本发明的诊断或治疗应用。
可通过使本发明药物(例如肽、多肽或抗体)N端残基的游离氨基 与螯合剂的合适官能团(例如羧基或活性西旨)反应，从而使本发明的药 物(例如肽、多肽或抗体)偶联形成缀合物。例如，当用亚乙基链上的 羧基取代基官能化时，缀合物可掺入配位化学领域常用的螯合剂乙二 胺四乙酸(EDTA)中。该类.EDTA衍生物的合成参见Arya等 (历oco"乂wg"^ C/7eAwW^， 2:323， 1991)。其中4个配位羧基各自被叔 丁基封闭，而亚乙基链上的羧基取代基是游离的，以便与药物的氨基 反应，乂人而形成缀合物。
缀合物可掺入金属螯合剂组分中，该组分是肽类，即与固相肽合 成一样。在这种情况下，螯合剂可以按与上述EDTA同样的方式与本 发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)偶联，或者更简便的是， 螯合剂和药物完全自该肽的C端残基开始合成，用螯合剂N端残基结束。
缀合物可进一步掺入接头部分，该接头部分用来使本发明的药物 (例如肽、多肽、抗体或小分子)与螯合剂偶联而又不对药物的寻耙功 能或螯合剂的金属结合功能造成不利影响。合适的连接基团包括用于 与药物和螯合剂两者偶联的反应基官能化的氨基酸链和烷基链。当螯 合剂是肽类时，氨基酸链是优选的连接基团，因此可完全通过固相技 术合成缀合物。
可通过使本发明药物(例如肽、多肽或抗体)N端残基的氨基与烷 基链的第 一 官能团(例如羧基或活性酯)反应，将烷基链连接基团掺入 缀合物。随后，通过使烷基链的第二官能团与螯合剂上合适的基团反 应，使螯合剂与烷基链连接，从而完成缀合物的形成。烷基链的第二 官能团选自与螯合剂上的官能团起反应而不与药物的N端残基起反 应的取代基。例如，当螯合剂掺入官能基(例如羧基或活性酯)时，烷 基链连接基团的第二官能团可以是氨基。要了解的是，缀合物的形成 可能需要对存在的官能团予以保护和脱保护，以避免形成不需要的产 物。保护和脱保护可采用有机合成领域常用的保护基、试剂和方案来 实现。特别可采用应用于上述固相肽合成中的保护和脱保护技术。
烷基链上的 一个替代化学连接基团是聚乙二醇(PEG),其按与上 述烷基链的同样方式官能化而掺入缀合物。本发明的药物(例如肽、多 肽、抗体和小分子)可以聚乙二醇化以改善体内半寿期，降低剂量频率。 要了解的是，连接基团或者可先与螯合剂偶联后，再与本发明的药物 偶联。
本发明另一个方面包括使本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或 小分子)交联以改进其药代动力学特性、免疫原性、诊断和/或治疗特 性。交联包括通过在本发明药物的合适位点(例如伯氨基、巯基)上进 行化学反应由共价键将两个分子连接起来。在一个实施方案中，可将 一个或多个本发明的药物交联在一起。或者，本发明交联的药物包括 但不限于半抗原-载体蛋白缀合物、抗体-酶缀合物、抗体-毒素缀合物(免疫毒素)和其它标记的本发明药物。
根据本发明的另一个方面，本发明的药物(例如肽、多肽、抗体 或小分子)-螯合剂缀合物可掺入能够形成络合物的在诊断上或治疗上 有益的金属。合适的金属包括例如放射性核素，诸如其不同形式的锝
和铼(例如"，cO"、 99mTc02+、 ReO"和Re02+)。可通过配位化学领域 的各种通用方法将金属掺入药物-螯合剂缀合物内。当金属是锝-99m 时，可采用下列常用方法形成锝络合物。首先将缀合物溶于水性醇(例
如乙醇)制备药物-螯合剂缀合物溶液。然后，将该溶液脱气除去氧气 后，用合适的试剂(例如用氢氧化钠)脱去巯基保护基，然后用有机酸 (例如乙酸)中和(pH 6.0-6.5)。在标记步骤中，将从钼发生器获得化学 计量过量(stoichiometric excess)的高锝酸钠加到缀合物溶液与足以^吏 锝还原的一定量的还原剂(例如氯化亚锡)中后，加热。可用层析法(例 如用C-18 Sep Pak柱体)将标记的缀合物与污染物""^Tc(V和胶体 "mTc02分离开来。
在 一 个替代方法中，标记可通过转螯合反应(transchelation reaction)来完成。锝源是与不稳定配体络合的锝溶液，这有利于配体 与所选择的螯合剂进行交换。用于转螯合的合适配体包括酒石酸、柠 檬酸和葡庚糖酸(heptagluconate)。在这种情况下，优选的还原剂是连 二亚硫酸钠。要了解的是，缀合物可以采用上述技术进行标记，或者 可对螯合剂本身进行标记，随后与本发明的肽、多肽或抗体偶联形成 缀合物，即称为"预先标记配体"方法的一种方法。
对本发明缀合物进行标记的另 一种方法包括将药物-螯合剂缀合 物通过在金属进行螯合作用时裂解的键固定在固相支持体上。当螯合 剂通过配位原子之一与支持体的官能团偶联时，便可以实现。优选配 位硫原子与被硫保护基(例如马来酰亚胺)官能化的支持体偶联。
当用诊断上或治疗上有益的金属标记时，可通过本领域已确定的 诊断成像方法，使用本发明的药物-螯合剂缀合物检测赘生物(例如肺 癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌)。可通过静脉内注射，或者通过本文所述其它方法，给予哺乳动物溶于药学上可接受的溶液(例如等渗盐溶
液)中的用放射性核素金属(例如锝-99m)标记的缀合物。适于给予的标 记缀合物的量在某种意义上取决于所选缀合物的分布特征，比起清除 不太快的缀合物，快速清除的缀合物可以较高剂量给予。对于70 kg 的个体，可接受的使赘生物成像的单位剂量的范围约为5-40mCi。可 通过本文所述标准技术，在给药后的适当时间跟踪体内分布和定位； 通常介于30分钟和180分钟之间，这取决于与非耙组织清除率相比 时耙部位的积累率。
可采用本领域众所周知的4支术，用荧光团(例如罗丹明或荧光素) 标记药物，从而标记用于焚光性检测的本发明的药物(例如肽、多肽、 抗体或小分子)(参见例如Lohse等，历oco"乂. C7ze肌8:503-509 (1997))。 采用本领域众所周知的技术，还可以将药物与使放射性金属或 relaxivity金属螯合的金属螯合剂偶联，从而用放射性金属或relaxivity 金属标记本发明的癌症靶向药物。螯合剂的实例包括但不限于亚氨基 羧酸反应基、聚氨基聚羧酸反应基、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-l,4,7,10-四乙酸(DOTA)。螯合剂可通过其氨 基酸侧链与癌症靶向药物直接偶联。或者，可使用间插氨基酸序列或 接头部分使癌症靶向药物与螯合剂偶联。
本发明的治疗药或细胞毒性药物
可通过将药物与任何已知的细胞毒药物或治疗部分偶联，来制备 本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)。可与本发明药物偶联 的治疗药或细胞毒药物的实例包括例如抗肿瘤药，例如阿西维辛 (Acivicin)、 阿柔比星(Aclarubicin)、 盐酸阿考达峻(Acodazole Hydrochloride)、阿克罗宁(Acronine)、阿多来新(Adozelesin)、阿霉素、 阿地白介素(Aldesleukin)、 六曱蜜胺(Altretamine)、安波霉素 (Ambomycin)、 醋酸阿美蒽醌(Ametantrone Acetate)、 氨鲁米特 (Aminoglutethimide)、安吖口定(Amsacrine)、卩可刃卩曲p坐(Anastrozole)、安
37曲霉素(Anthramycin)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、曲4木菌素(Asperlin)、 阿扎胞苷(Azacitidine)、阿扎替派(Azetepa)、阿佐霉素(Azotomycin)、 巴马司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、 盐酸比生群(Bisantrene Hydrochloride)、 二曱磺酸双奈法德(Bisnafide Dimesylate)、比折来新(Bizelesin)、疏酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)、 布p奎那钠(Brequinar Sodium)、 溴匹立明(Bropirimine)、 白消安 (Busulfan)、放线菌素(Cactinomycin)、卡鲁睾酮(Calusterone)、喜树碱、 卡醋胺(Caracemide)、卡贝替姆(Carbetimer)、卡钿(Carboplatin)、卡莫 司汀(Carmustine)、盐酸卡柔比星(Cambicin Hydrochloride),卡折来新 (Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西罗 霉素(Cirolemycin)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、康普瑞汀 A画4 (Combretestatin A-4)、甲磺酸克立那托(Crisnatol Mesylate)、环磷 酰胺(Cycl叩hosphamide)、 阿糖胞苷(Cytarabine)、 达卡巴溱 (Dacarbazine)、 DACA (N-[2-(二甲基-氨基)乙基]吖啶-4-曱酰胺)、放线 菌素D (Dactinomycin)、 盐酸柔红霉素(Daunorubicin Hydrochloride)、 道诺霉素(Daunomycin)、 地西他滨(Decitabine)、 右奥马铂 (Dexormaplatin)、地扎呱宁(Dezaguanine)、曱磺酸地扎呱宁、地吖醌 (Diaziquone)、多西他赛(Docetaxel)、多拉司他汀(Dolasatin)、多柔比 星(Doxorubicin)、盐酸多柔比星、屈洛昔芬(Droloxifene)、枸橼酸屈洛 昔芬、丙酉臾屈4也》# 6同(Dromostanolone Propionate)、 达佐霉素 (Duazomycin)、 依达曲沙(Edatrexate)、 盐酸依氟鸟氨酸(Eflornithine Hydrochloride)、玫瑰树》咸(Ellipticine)、依沙,星(Elsamitrucin)、恩洛 柏(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌。定(Epipropidine)、盐酸 表柔比星(EpirubicinHydrochloride)、厄布洛峻(Erbulozole)、盐酸依索 比星(Esorubicin Hydrochloride),雌莫司汀(Estramustine)、雌莫司汀磷 酸钠、依他硝唑(Etanidazole)、乙碘['"I]油(Ethiodized Oil I 131)、依托 泊苷(Etoposide)、磷酸依托泊香、Etoprine、盐酸法倔峻(Fadrozole Hydrochloride 法扎拉滨(Fazarabine)、芬维A胺(Fenretinide)、氟尿苦(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)、 氟尿嘧咬、5-FdUMP、氟西他滨(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲星钠(Fostriecin Sodium)、吉西他滨、盐酸吉西他滨、金[柳Au]、高喜树碱、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride),异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、干扰素a-2a、干扰素a-2b、干扰素a-nl 、干扰素a-n3 、干扰素(3-Ia、干扰素y-Ib、异丙铂(Iproplatin)、盐酸 <尹立3#康(Irinotecan Hydrochloride)、醋酸兰瑞肽(LanreotideAcetate)、来曲峻(Letrozole)、醋酸亮丙立德(Leuprolide Acetate)、盐酸利阿峻(Liarozole Hydrochloride)、》各美曲索钠(Lometrexol Sodium)、洛莫司汀(Lomustine)、盐酸洛索蒽醌(Losoxantrone Hydrochloride)、马索罗酚(Masoprocol)、 美登素(Maytansine)、 盐酸氮芥(MechlorethamineHydrochloride)、醋酸曱地孕酮(Megestrol Acetate)、醋酸美仑孕酮(Melengestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、美i若立尔(Menogaril)、巯基噪呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠、氯苯氨咬(Metoprine)、美妥替哌(Meturedepa)、米丁度胺(Mitindomide)、米托卡星(Mitocarcin)、丝裂红素(Mitocromin)、米托洁林(Mitogillin)、米托马星(Mitomalcin)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托司培(Mitosper)、米托坦(Mitotane)、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone Hydrochloride)、麦考酚酸(Mycophenolic Acid)、 诺考达哇(Nocodazole)、 诺拉霉素(Nogalamycin)、奥马铂(Ormaplatin)、奥昔舒仑(Oxisuran)、紫杉醇(Paclitaxel)、培门冬酶(Pegaspargase)、培利霉素(Peliomycin),奈莫司汀(Pentamustine)、硫酸培洛霉素(Peploycin Sulfate)、培磷酰胺(Perfosfamide)、哌泊溴烷(Pipobroman)、咪泊舒凡(Piposulfan)、盐酸吡罗蒽醌(Piroxantrone Hydrochloride)、普卡霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、 p卜吩姆钠(Porfimer Sodium)、紫菜霉素(Porfiromycin)、;发尼莫司汀(Prednimustine)、 盐酉吏丙卡巴肼(ProcarbazineHydrochloride),，禁罗霉素(Puromycin)、盐酸嘌罗霉素、吡唑呋林(Pyrazofbrin)、利索新(Rhizoxin)、利索新D、利波腺苷(Riboprine)、罗谷亚胺(Rogletimide)、沙芬戈(Safmgol)、盐酸沙芬戈、司莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、磷乙酰天冬氨酸钠(SparfosateSodium)、司帕霉素(Sparsomycin)、 盐酸锗螺胺(SpirogermaniumHydrochloride)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺柏(Spiroplatin)、链黑霉素(Streptonigrin)、链佐星(Streptozocin)、氯化锶[89Sr] (Strontium ChlorideSr89)、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、紫杉烷(Taxane)、紫杉烷类化合物(Taxoid)、替可加兰钠(Tecogalan Sodium)、替加氟(tegaflir)、盐酸替洛蒽醌(Teloxantrone Hydrochloride),替莫泊芬(Temoporfin)、替尼泊苷(Teniposide)、替罗昔隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、 Thiamiprine、硫乌噤呤(Thioguanine)、塞替派(Thiotepa)、Thymitaq、谨:哇吹林(Tiazofbrin)、替拉扎明(Tirapazamine)、拓优得(Tomudex)、 TOP53、盐酸托泊替康(Topotecan Hydrochloride)、枸橼酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)、醋酸曲托龙(Trestolone Acetate)、磷酸曲西立滨(Triciribine Phosphate)、三曱曲沙(Trimetrexate)、葡#唐醛酸三甲曲沙、曲普瑞林(Triptorelin)、盐酸妥布氯唑(TubulozoleHydrochloride),乌拉莫司汀(Uracil Mustard)、乌瑞替派(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、维替泊芬(Verteporfin)、长春i成(Vinblastine)、 >琉酸长春碱、长春新碱(Vincristine)、石克酸长春新碱、长春地辛(Vindesine)、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)、硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)、硫酸长春罗辛(Vinleurosine Sulfate)、酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)、硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)、硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)、伏氯唑(Vorozole)、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁(Zinostatin)、盐酸佐柔比星(Zorubicin Hydrochloride), 2-氯脱氧腺苷、2'-脱氧型霉素(2'-Deoxyformycin) 、 9-氨基喜树碱(9-aminocamptothedn)、雷替曲塞(raltitrexed)、 N-炔丙基-5，8-二去氮杂叶酸(N-propargyl-5,8-dideazafolic acid)、 2-氯-2'-阿糖-氟-2'-脱氧腺苷(2-chloro-2'-arabino-fluoro-2'-deoxyadenosine)、 2陽氣-2'-脱氧A泉普、菌香霉素(anisomycin)、曲古抑菌素A (trichostatin A)、 hPRL-G129R、
40CEP-751、利诺胺(linomide)、硫芥子气(sulftir mustard)、氮芥(nitrogenmustard/mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺(ifosfamide)、白消安、N-曱基-N-亚硝基脲(MNU)、 N,N'-双(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(BCNU)、 N-(2-氯乙基)-N'-环己基-N-亚硝基脲(CCNU) 、 N-(2-氯乙基)-N'-(反式-4-曱基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)、 N-(2-氯乙基)-N'-(二乙基)乙基膦酸酉旨-N-亚硝基脲(福莫司';丁(fotemustine))、《连脲佐菌素(streptozotocin)、 达卡巴p秦(diacarbazine)(DTIC)、米托唑胺(mitozolomide)、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派、丝裂霉素C、 AZQ、阿多来新、顺铂、卡铂、奥马铂、奥沙利铂(Oxaliplatin) 、 C1-973 、 DWA 2114R 、 麓16 、 JM335 、 双柏(Bis(platinum))、拓优得、阿扎胞苷、阿糖胞苷、吉西他滨、6-巯基噤呤、6-硫鸟嘌呤、次黄嘌呤、替尼泊苷、9-氨基喜树碱、托泊替康(Topotecan)、 CPT-ll、多柔比星、道诺霉素、表柔比星(Epirubicin)、darubicin、 米4乇蒽醌(mitoxantrone)、 洛索蒽醌(losoxantrone)、方欠线菌素D(Dactinomycin/ActinomycinD)、安吖咬、吡唑并吖卩定、全反式维生素A (all-trans retinol)、 14-羟基-逆-维生素A、全返式4见黄酸、N-(4-羟基苯基)视黄酰胺、13-顺式视黄酸、3-曱基TTNEB、 9-顺式视黄酸、氟达拉滨(fludarabine) (2-F-ara-AMP)或2-氯脱氧腺苷(2-Cda)。
其它抗胂瘤化合物包括但不限于20-7i-l，25-二羟基维生素D3、 5-乙炔基尿嘧啶、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星、酰夫文(acylflilvene)、adecypenol、阿多来新、阿地白介素、ALL-TK拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀(ambamustine) 、 amidox 、氨石粦汀(amifostine) 、 5-氛基酮戊酸(aminolevulinic acid)、氨柔比星(ammbicin)、安吖咬、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲哇、穿心莲内酉旨(andrographolide)、血管生成抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、 antarelix、抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)、 抗力,激素药(antiandrogen)、前列腺癌、抗雌激素药(antiestrogen)、抗瘤酮(antineoplaston)、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、细胞凋亡基因调节剂、细胞凋亡调节剂、脱噤呤核酸(apurinic acid)、 ara-CDP-DL-PTBA、4青氨酸脱氨酶、asulacrine 、 阿他美坦(atamestane)、 阿莫司汀(atrimustine) 、 axinastatin 1、 axinastatin 2、 axinastatin 3、卩可4Li司玉京(azasetron)、阿扎毒素(azatoxin)、重氮酪氨酸(azatyrosine)、巴卡丁 III书f生物(baccatin III derivative), balanol、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、benzochlorins、 苯曱酰基星孑包素(benzoylstaurosporine)、卩内酰胺书亍生物、beta-alethine、亚阿克4立霉素B (betaclamycin B)、才华木酉臾(betulinicacid)、 bFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群(bisantrene)、双氮杂环丙烷基精胺(bisaziridinylspermine)、 双奈法德(bisnafide)、 bistratene A、 比折来新、breflate、博来霉素A2 (bleomycin A2)、博来霉素B2、溴匹立明、布度钛(budotitane) 、 S-。-氨基-3-羧丙基)-S- 丁基硫氧亚氨(buthionine sulfoximine)、 卡泊三醇(calcipotriol) 、 UCN-1028 C(calphostin C)、喜树碱衍生物(例如10-羟基-喜树碱)、canarypox IL-2 、卡培他滨(capecitabine)、曱酰胺-氨基-三唑、羧基酰胺基三唑、CaRestM3、 CARN700、软骨衍生的抑制剂(cartilage derived inhibitor),卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)、粟精胺(castanospermine)、天蚕素B(cecropinB)、西曲瑞克(cetrorelix)、 二氢卟酚类(chlorins)、氯p奎喔^^酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)、西卡前歹。素(cicaprost)、)顿式吟啉(cis-porphyrin)、 克拉屈滨、氯米芬类似物(clomifene analogue)、 克霉峻(clotrimazole)、 collismycin A、 collismycin B、康普瑞汀A4、康普瑞、;丁类孑以4勿、conagenin、 crambescidin 816 、克立刃卩对乇(crisnatol)、念珠'藻环肽8 (cryptophycin 8)、念珠藻环肽A衍生物、库拉素A (curacin A)、玉不戊蒽、酉昆类(cyclopentanthraquinones) 、 cycloplatam 、 cypemycin 、cytarabine ocfosfate、细胞溶解因子、细胞生长抑素(cytostatin)、达昔单抗(dacliximab)、地西他滨、脱氢膜海鞘素B (dehydrodidemnin B)、2'-脱氧考福霉素(2'-deoxycoformycin) (DCF)、地洛瑞林(deslorelin)、右异环磷酰胺(dexifosfamide)、右雷佐生(dexrazoxane)、右维拉帕米(dexverapamil)、地吖醌、膜海鞘素B (did emnin B) 、 didox 、diethylnorspermine、 二氬-5-氮杂胞*、 二氬泰素(dihydrotaxol) 9-、 二 草霉素(dioxamycin)、 二苯基螺莫司汀(diphenyl spiromustine)、淅皮海 纟帛内酉旨(discodermolide)、 二十二烷醇(docosanol)、多4立司琼(dolasetron)、 去氧氟尿苷(doxifluridine)、 屈洛昔芬、屈大麻酚(dronabinol)、 duocarmycin SA、依布石西(ebselen)、依考莫司汀(ecomustine)、依;也福 新(edelfosine)、依决洛单抗(edrecolomab)、依氟鸟氨酸(eflornithine)、 榄香烯(elemene)、乙嘧替氟(emitefur)、表柔比星、埃坡霉素类 (epothilones) (A: R = H; B: R = Me)、 epithilones、依立雄胺(epristeride)、 雌莫司汀类似物、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、依他硝唑、依托泊 苷、4'-磷酸依托泊苷(etoposide 4'-phosphate)(凡毕复(etopofos))、依西 美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、法扎拉滨、芬维A胺、非格司 亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黄酮吡多(flavopiridol)、氟草斯 汀(flezelastine) 、 fluasterone 、氟达拉滨、 fluorodaunorunicin hydrochloride 、福酚美克(forfenimex) 、 4畐美坦(formestane)、福司曲星 (fostriecin) 、 3畐莫司汀、^L替沙4木(gadolinium texaphyrin)、》肖酉吏4家、力口 洛他滨(galocitabine)、加尼瑞克(ganirelix)、明月交酶抑制剂、吉西他滨、 谷胱甘肽抑制剂、庚二醇二氨基磺酸酯(hepsulfam)、调蛋白(heregulin)、 六亚曱基二乙酰胺(hexamethylene bisacetamide)、 高三尖杉酉旨石威 (homoharringtonine) (HHT)、金丝才兆素(hypericin)、寸尹班膦酸(ibandronic acid)、伊达比星(idarubicin)、艾多昔芬(idoxifene)、伊决孟酮 (idramantone)、伊莫福新(ilmofosine)、伊洛马司他(ilomastat)、咪哇并 吖，定酮类(imidazoacridones)、卩米p奎莫德(imiquimod)、免疫刺;敫肽类 (immunostimulantpeptides),胰岛素样生长因子-1受体抑制剂、干扰素 ;敫动齐寸、干4尤素类、白介素类、石典千胍(iobenguane)、 iododoxorubicin、 4-依波米醇(ipomeano1， 4-)、 j尹立替康(irinotecan)、 4尹罗普拉(iroplact)、 伊索拉定(irsogladine) 、 isobengazole 、 异高软海纟帛素 B (isohomohalicondrin B)、伊他司琼(itasetron)、 jasplakinolide 、海虫舌蝓提 取物(kahalalide F)、三醋酸层状素N (lamellarin-N triacetate)、兰瑞肽(lanreotide)、 leinamycin、来格司亭(lenograstim)、石克酸香恭多糖(lentinan sulfate)、 leptolstatin、来曲唑、白血病抑制因子、白细胞a干扰素、亮 丙立德+雌激素+黄体酮、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、 利阿唑(liarozole)、直链多胺类似物、亲脂性二糖肽、亲脂性4自化合物、 lissoclinamide 7、洛斷lobaplatin)、虫丘虫引磷月旨(lombricine)、洛美曲索 (lometrexol)、氯尼达明(lonidamine)、洛索蒽酉昆、洛伐他汀(lovastatin)、 洛索立宾(loxoribine)、 勒托替康(lurtotecan) 、 lutetium texaphyrin 、 lysofylline、裂解肽(lyticpeptides)、美登素、mannostatinA、马立马司 他(marimastat)、马索罗酚(masoprocoh)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、 matrilysin抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、rnerbarone、 美替瑞林(meterelin)、曱硫氨酸酶(methioninase)、曱氧氯普胺 (metoclopramide)、 MIF抑制剂、米非司酮(ifepristone)、米4齐福新 (miltefosine)、米立司亭(mirimostim)、错配双链RNA 、光辉霉素 (mithracin)、米托胍腙(mitoguazone)、 二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉 素类似物、米托萘胺(mitonafide)、分裂毒素(mitotoxin)成纤维细胞生 长因子-皂草毒蛋白(saporin)、米托蒽醌、莫法罗汀(mofarotene)、莫拉 司亭(molgramostim)、 单克隆才元体、人纟戎促性素(human chorionic gonadotrophin)、单磷酰脂质A +分枝杆菌细胞壁sk (myobacterium cell wallsk)、莫哌达醇(mopidamol)、多药抗药性基因抑制剂、基于多肿瘤 抑制剂1的疗法、芥子气(mustard)抗癌药物、印度洋海绵B (mycaperoxide B)、分枝杆菌细胞壁提取物、myriaporone、 N-乙酰地那 林(N-acetyldinaline)、 N-取代的苯曱酰胺、那法瑞林(nafarelin)、 nagrestip、纟内^各嗣(naloxone) +喷j也佐辛(pentazocine)、 napavin、 那5岛 替喷(naphterpin)、那才乇司亭(nartograstim)、奈达柏(nedaplatin)、奈莫 柔比星(nemombicin)、奈立膦酸(neridromc acid)、中性内肽酶、尼鲁米 特(nilutamide) 、 nisamycin 、 一氧化氮调节剂、硝基氧抗氧化剂、 nitrullyn 、 06-千基鸟卩票 令(06-benzylguanine)、奥曲肽(octreotide)、 okicenone 、 寡核苷酸类、奥那司酮(onapristone)、昂丹司琼(ondansetron)、昂丹司琼、oracin、 口服细胞因子诱导物、奥马柏、奥 沙特隆(osaterone)、奥沙利柏、oxaunomycin、紫杉醇类似物、紫杉醇 衍生物、palauamine、棕榈酰利索新(palmitoylrhizoxin)、巾白米膦酸 (pamidronic acid)、 人参三醇(panaxytriol)、巾白诺米芬(panomifene)、 parabactin、帕4斤普汀(pazelliptine)、 J咅门冬酶、培4寻星(peldesine)、戊 聚石危钠(pentosan polysulfate sodium)、喷司4也丁(pentostatin)、pentrozole、 全氟溴烷(perflubron)、培磷酰胺、紫苏子醇(perillyl alcohol)、 phenazinomycin、 苯乙酸盐(phenylacetate)、石辟酸酶抑制剂、溶血性链 球菌制剂(picibanil)、盐酸毛果芸香石咸(pilocarpine hydrochloride)、吡柔 比星(pirambicin)、 p比曲克辛(piritrexim)、 placetin A、 placetinB、纟千'溶 酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor)、柏络合物、柏化合 物、铂-三胺络合物、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、外吩姆钠、紫菜霉 素、丙基二吖咬酮(propyl bis隱acridone)、前列腺素J2 (prostaglandin J2)、 蛋白酶体抑制剂、基于A蛋白的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制剂、蛋 白激酶C抑制剂、microalgal、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂、噪呤核苷磷 酸化酶抑制剂、红紫素类(purpurins)、吡唑并吖啶、吡，定氧基化血红 蛋白聚氧乙火希纟褒合物(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate)、 raf拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼(mmosetron)、 ras法尼基 蛋白转移酶抑制剂、ms抑制剂、ras-GAP抑制剂、脱曱基瑞替普汀 (retelliptine demethylated)、依替膦酸铼[Re186] (rhenium Re 186 etidronate)、利索新、核酶、RII视黄酰胺(RII retinamide)、罗谷亚胺、 rohitukine、 罗莫月太(romurtide)、 罗唾美克(roquinimex)、 rubiginone B1 、 ruboxyl、 沙芬戈、saintopin、 SarCNU、 sarcophytol A、 沙格司亭 (sargramostim)、 Sdi 1才莫拟物、司莫司汀、衰老衍生抑制剂1 (senescence derived inhibitor 1)、有义寡核苷酸类、信号转导抑制剂、信号转导调 节剂、单链抗原结合蛋白、西佐喃(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、 硼卡钠(sodium borocaptate)、苯乙酉交钠、solverol、生长调节素结合蛋 白(somatomedin binding protein)、索纟内明(sonermin)、膦门冬酸(sparfosicacid)、 spicamycinD、螺莫司汀、splenopentin、'海纟帛素1 (spongistatin 1)、 司夸胺(squalamine)、干细胞抑制剂、干细胞分裂抑制剂、stipiamide、 基质溶素抑制剂(stromelysin inhibitor)、 sulfmosine、活性过度的血管活 'f生肠肽4吉4元剂、suradista、 苏4立明(suramin)、苦马豆素(swainsonine)、 合成糖胺聚糖类(glycosaminoglycans)、他莫司汀(tallimustine)、甲石爽化 他莫昔芬(tamoxifen methiodide)、牛磺莫司汀(tauromustine)、他扎罗汀 (tazarotene)、替可力口兰#)、 *#力口氟、tellurapyrylium、端斗立酵(telomerase) 抑制剂、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、tetrachlorodecaoxide、 tetrazomine 、 thaliblastine 、 沙利度胺(thalidomide) 、 p塞可拉林 (thiocoraline)、血小才反生成素(thrombopoietin)、血小才反生成素冲莫拟物、 胸腺法新(thymalfasin)、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南 (thymotrinan)、促曱状腺激素、乙基锡初红紫素(tin ethyl etiopurpurin)、 替拉扎明、二氯二茂4太、托泊替康、topsentin、托瑞米芬(toremifene)、 全能干细胞因子、翻译抑制剂、维A酸(tretinoin)、三乙酰尿苷、曲西 立滨(triciribine)、三曱曲沙、曲普瑞林、托烷司琼(tropisetron)、妥罗 雄脲(turosteride)、酪氨酸激酶抑制剂、tyrphostins、 UBC抑制剂、乌 苯美司(ubenimex)、泌尿生殖窦衍生的生长抑制因子、尿激酶受体拮 抗剂、伐普肽、variolin B、载体系统，红细胞基因疗法、维拉雷瑣 (velaresol)、 藜芦胺(veramine)、 verdins、 维替泊芬(verteporfin)、 长春 瑞滨(vinorelbine)、 vinxaltine、 aV卩3人源化抗单抗(vitaxin)、伏氯唑、 扎诺特隆(zanoterone)、折尼铂、亚千维(zilascorb)和净司他丁斯酯 (zinostatin stimalamer)。
本发明的组合物还可通过使本发明的药物与抗增殖药物(例如异 硫代硫酸吡曲克辛(piritrexim isothionate))偶联来制备。或者，本发明 的药物还可与抗前列腺增生药物(例如西托糖苷(sitogluside))、良性前 列腺增生疗法药物(例如盐酸坦洛新(tamsulosin hydrochloride))或前列 腺生长抑制剂(例如喷托孟(pentomone))偶联。
本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)也可与放射性药物偶联，包括但不限于碘[1251]血纤蛋白原、氟["F]脱氧葡萄糖 (Fludeoxyglucose 18F)、氟['V]多巴(Fluorodopa 18F)、碘[1251]胰岛素 (Insulin 1251)、碘[1311]胰岛素、碘['23l]苄胍(lobenguane |231)、胆影钠[1311〗 (Iodipamide Sodium 1311)、碘['"I]安替比林(Iodoantipyrine 1311)、捵[1311] 胆甾醇(Iodocholesterol 1311)、碘['23l]马尿酸钠(lodohippurate Sodium 1231)、碘[1251]马尿酸钠、碘["'I]马尿酸钠、石典奥酮[1251] (Iodopyracet 1251)、 碘奥酮[1311]、盐酸碘['23l]非他胺(lofetamine Hydrochloride1231)、碘[1251] 美丁(Iomethin 1251)、碘[1311]美丁(1。methin 1311)、碘[1251]他拉酸钠 (Iothalamate Sodium 1251)、硤[1311]他拉酸钠、酪氨酸[1311]、碘[1251]塞罗 宁(Liothyronine 1251)、碘[1311]塞罗宁、醋酸汞[^Hg]丙醇(Merisopro1 Acetate l97Hg)、醋酸汞，3Hg]丙醇、汞[^Hg]丙醇、硒[75Se]蛋氨酸 (Selenomethionine 75Se)、三硫化锑锝["，c]胶体(Technetium 99mTc Antimony Trisulfide Colloid)、比西酸锝["m丁c] (Technetium 99mTc Bicisate)、地索苯宁锝["mTc] (Technetium 99mTc Disofenin)、依替膦酸 锝[99mTc] (Technetium 99mTc Etidronate)、依沙美肝锝[99mTc] (Technetium 99mTc Exametazime)、锝[99mTc]吹膦(Technetium 99mTc Furifosmin)、葡庚糖酸锝[99，0] (Technetium99mTc Gluceptate)、利多苯 宁锝[99mTc] (Technetium 99mTc Lidofenin)、曱溴苯宁锝[99mTc] (Technetium 99mTc Mebrofenin)、亚曱膦酸锝["mTc] (Technetium 99mTc Medronate)、锝[99mTc]亚曱膦酸二钠(Technetium 99mTc Medronate Disodium)、锝["mTc]巯替肽(Technetium 99mTc Mertiatide)、奥昔膦酸锝 [99mTc] (Technetium 99mTc Oxidronate)、喷替酸锝["，c] (Technetium 99mTc Pentetate)、锝["mTc]喷替酸辆三钠(Technetium 99mTc Pentetate Calcium Trisodium)、司他比锝["mTc] (Technetium 99mTc Sestamibi)、西 硼將锝["，c] (Technetium 99mTc Siboroxime)、 二巯丁二酸锝[""^Tc] (Technetium 99mTc Succimer)、锝[9加Tc]胶体硫(Technetium 99mTc Sulfbr Colloid)、替肟锝["mTc] (Technetium 99mTc Teboroxime)、替曲膦锝 [99mTc] (Technetium 99mTc Tetrofosmin)、 Technetium 9mTc Tiatide、曱状
47腺素-碘[1251]、甲状腺素-碘[1311]、碘['"I]托泊酮(Tolpovidone 1311)、三 油酸甘油酯硤[1251] (Triolein 1251)或三油酸甘油酯碘[1311]。
本发明的治疗药或细胞毒性药物还可包括本发明的肽、多肽、抗 体或小分子与例如抗癌补充增效剂偶联，包括但不限于三环类抗抑 郁药(例如丙米。秦(imipramine)、地昔帕明(desipramine)、 阿米替林 (amitryptyline)、氯米帕明(clomipramine)、曲米巾自明(trimipramine)、多 塞平(dox印in)、去甲替林(nortriptyline)、普罗替林(protriptyline)、阿莫 沙平(amoxapine)和马普替林(maprotiline));非三环类抗抑郁药(例如舍 曲林(sertraline)、曲峻酮(trazodone)和西酞普兰(citalopram)); Ca+十拮 抗剂(例如维拉帕米(verapamil)、硝苯地平(nifedipine)、尼群地平 (nhrendipine)和卡罗维林(caroverine));钙调蛋白抑制剂(例如普尼拉明 (prenylamine)、三IU立口秦(trifluoroperazine)和氯米巾白明)；两寸生霉素B (Amphotericin B); 曲帕拉醇(Triparanol)类似物(例如4也莫昔芬 (tamoxifen));抗心律失常药(例如奎尼丁(quinidine));抗高血压药(例
如利血平(reserpine));巯基清除剂(Thiol depleter)(例如S-(3-氨基-3-羧 丙基)-S-丁基硫氧亚氨)和多药耐药性还原剂例如聚氧乙烯醚(35)蓖麻 油(Cremaphor EL)。
还可与细胞因子(例如粒细胞集落刺激因子)一起给予本发明的药 物(例如肽、多肽、抗体或小分子)。
还可以抗癌鸡尾酒合剂(cocktail)给予本发明的药物(例如肽、多 肽、抗体和小分子)，该鸡尾酒合剂包括(有些在圓括号内标出其MTD): 吉西他滨(1000 mg/m2);曱氨蝶呤(15 gm/m2静脉内+ leuco. < 500 mg/ m2静脉内w/o leuco); 5-FU (500 mg/m2/天x5天)；FUDR (对于小鼠100 mg/kgx5，尤其对于人0.6 mg/kg/天)；FdUMP;羟基脲(对于人35 mg/kg/ 天)；多西他赛(60-100 mg/m2);淅皮海绵内酯；埃坡霉素类；长春新 碱(1.4mg/m2);长春碱(渐增3.3-11.1 mg/m2或罕有至18.5 mg/m2); 长春瑞滨(30mg/m2/周);meta-pac;伊立替康(50-150 mg/m2， lx/周, 取决于患者反应)；SN-38 (比伊立替康有效-100倍)；10-OHcampto;托泊替康(对于人1.5 mg/mV天，lx静脉内LDIO小鼠=75 mg/m2);依 托泊苷(对于人100 mg/m2);,阿霉素；黄酮吡多；Cis-Pt (对于人 100mg/m2); carbo-Pt (对于人360 mg/m2);博来霉素(20 mg/m2);丝裂 霉素C (20 mg/m2);普卡霉素(mithramycin) (30 sug/kg);卡培他滨(2.5 g/m2口服)；阿糖胞苷(100mg/mV天)；2-Cl-2'-脱氧腺普；氟达拉滨-P04 (25 mg/m2/天，x5天)；米托蒽醌(12-14 mg/m2);米托唑胺(> 400 mg/m2); 喷司他丁或拓优得。
本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)还可与抗代谢药物 (例如曱氨蝶呤)偶联。抗代谢药包括但不限于下列化合物及其衍生物 硫唑噪呤(azathi叩rine)、克拉屈滨、阿糖胞苷、达卡巴嚷、磷酸氟达 拉滨、氟尿嘧啶(fluorouracil)、盐酸吉西他滨、巯基噪呤、曱氨蝶呤、 二溴甘露醇(mitobronitol)、米托坦、盐酸氯胍(proguanil chlorohydrate)、 乙胺嘧啶(pyrimethamine)、雷替曲塞、葡糖醛酸三甲曲沙、乌4立坦 (urethane)、硫酸长春》威、硫酸长春新碱等，更优选X可为叶酸型抗代 谢药，是包括例如以下药物的一类药物曱氨蝶呤、盐酸氯胍、乙胺 嘧咬(pyrimethanime)、曱氧千咬(trimethoprime)或葡糖醛酸三曱曲沙或 这些化合物的衍生物。
在另一个实施方案中，本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小 分子)可与肿瘤药物蒽环类家族的成员偶联，包括但不限于盐酸阿柔比 星、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、 盐酸吡柔比星或盐酸佐柔比星(zorubicine chlorhydrate)、喜杉t碱类或其 衍生物或相关化合物，例如10,11-亚曱二氧基喜树碱 (10,1 l-methylenedioxycamptothecin);或美坦生类化合物(maytansinoid) 家族的化合物的成员，包括各种在结构上相关的化合物，例如安丝菌 素 P3 (ansamitocin P3)、 美登素、2，-N-去曱美坦布亭 (2'-N-demethylmaytanbutine)和maytanbicyclinol。
可对本发明的药物(例肽、多肽、抗体或小分子)进行^f'务饰或标记 以利于诊断或治疗用途。可一全测标记例如》文射性标记、荧光标记、重金属或可与发明的肽、多肽、抗体或本小分子结合的其它药物。药物 的单个标记、双重标记或多标记可能是有利的。例如，用一个或多个 残基的放射性碘化，结合例如通过螯合基团使WY另与含胺基侧基或 反应基偶联，这样双重标记可供组合标记之用。这可用于专门的诊断 需要，例如鉴定广泛分布的小肿瘤细胞块。
还可以对本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)或其类似 物进行修饰，例如使肽组分酪氨酸残基卣化。卣素包括氟、氯、溴、 碘和砹。这类本发明的卣化剂可以是可检测标记的，例如，如果卣素
是放射性同位素，例如"F、 75Br、 77Br、 122I、 123I、 124I、 125I、 129I、 131I、 或"、t。本发明的卣化剂含有与至少一个氨基酸、优选与本发明的药 物中存在的D-Tyr残基共价结合的卣素。其它合适的可检测修饰包括 其它化合物(例如荧光染料例如荧光素)与类似物的赖氨酸残基、特别 与具有接头(包括赖氨酸)的类似物结合。
用于对本发明的药物(例如本发明的肽、多肽、抗体或小分子)进 行放射标记的放射性同位素包括可与本发明药物或其类似物的氨基 酸残基或合适的反应基共价结合的任何放射性同位素。放射性同位素 可选自发射P辐射或Y辐射的放射性同位素，或者，可对药物进行修 饰从而含有可与该药物内的赖氨酸残基共价结合的螯合基团。然后， 再对该螯合基团进行修饰以含有多种放射性同位素中的任一种，例如 镓、铟、锝、镱、铼或铊(例如1251、 67Ga、 "1111、 99mTc、 169Yb、 186Re)。
如果本发明的药物是通过连接放射性同位素而进行修饰的，则优 选放射性同位素是放射性半衰期相当于所用药物的生物半衰期或比 所用药物生物半衰期长的放射性同位素。放射性同位素更优选是卣原 子的放射性同位素(例如氟、氯、溴、碘和砹的放射性同位素)，甚至 更优选为"Br、 77Br、 76Br、 122I、 123I、 124I、 125I、 129I、"I或川At。
包括放射性金属的本发明药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)可 用于放射摄影成像或放射疗法。优选的放射性同位素还包括99mTc、 51Cr、 67Ga、 68Ga、山ln、 168Yb、 14°La、 90Y、 88Y、 153Sm、 156Ho、 165Dy、64Cu、 97Ru、 103Ru、 186Re、 188Re、 2°3Pb、 211Bi、 212Bi、 213Bi和214Bi。 根据所需要的治疗或诊断用途来确定金属的选择。包括金属组分的本发明药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)可用 作诊断药和/或治疗药。可检测标记可以是得自重元素或稀土离子的金 属离子，例如Gd"、 Fe3+、 Mn"或C一+。包括顺磁性金属或超顺磁性 金属的缀合物可在MRI成像应用中用作诊断药。可用于肽药物的顺磁 性金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(n)、镨(ni)、钕(m)、杉(m)、礼(ni)、铽(ni)、镝(ni)、钬(m)、铒(III)和镱(ni)。优选金属的relaxivity为至少10、 12、 15或20mM"秒 "Z"。其中Z为顺磁性金属的浓度。可使用螯合基团与可检测标记或 本发明药物的其它分子间接偶联。螯合基团可利用例如双官能稳定螯 合剂连接本发明的药物与放射性标记，或者它们可与 一个或多个本发 明药物内的末端氨基酸反应基或内部氨基酸反应基连接。它们还可以 通过异硫氰酸(3-Ala或防止Edman降解的合适的非a-氨基酸接头连 接。本领域已知的螯合剂的实例包括例如亚氨基羧酸反应基和聚氨基 聚羧酸反应基、亚氨基羧酸反应基、聚氨基聚羧酸反应基、二亚乙基 三胺五乙酸(DTPA)和1,4,7，10-四氮杂环十二烷-1，4,7,10-四乙酸 (DOTA)。有关通用方法可参见例如Liu等，历occ^'wgate C/zew. 12(4):653,2001; Cheng等，WO 89/12631; Kieffer等，WO 93/12112; Albert等，U.S.P.N. 5,753,627;以及WO 91/01144 (所述各文献都通过 引用结合到本文中)。本发明的药物组合物可以配制本发明的药物(例如肽、多肽、抗体或小分子)给予患者 用于治疗或诊断用途，或用于体外诊断用途。当与治疗药或细胞毒药 物偶联时，通过本发明药物的特异性寻靶可供选择性地破坏肿瘤。例 如，本发明的药物可用来靶向和破坏肺、乳腺、前列腺和结肠的赘生 物(肿瘤)。可将本发明的药物直接或者与本领域已知的任何药学上可接受的载体或盐组合给予哺乳动物受治疗者(例如人)。药学上可接受 的盐可包括常规用于制药业的无毒的酸加成盐或金属络合物。酸加成 盐的实例包括有机酸，例如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、 苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯曱酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、曱磺酸、曱苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸类，例如单宁酸、羧 曱基纤维素等；以及无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。 一个示例性的药学上可接受的载体是生理盐 水。其它生理上可接受的载体及其制剂为本领域技术人员所掌握，可参见i列^口 Remington's Pharmaceutical Sciences.(第18片反)，A. Gennaro 主编，1990, Mack Publishing Company, Eastern, PA。可通过以下途径给予治疗有效量的本发明药物(例如肽、多肽、 抗体或小分子)或其药学上可接受的盐的药物制剂口服、胃肠外(例 如肌内、腹膜内、静脉内或皮下注射、吸入、真皮内、滴眼药或植入)、 经鼻、阴道、直肠、舌下或局部，或者与适于所述给药途径的药学上 可接受的载体混合。本领域众所周知的用于制备剂型的方法可参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版)，A. Gennaro主编，1990, Mack Publishing Company, Easton， PA。可按照本领域已知的用于制备药物 组合物的任何方法，将用于口服用途的含有本发明药物的组合物制成 固体或液体形式。含有本发明药物的组合物可任选含有甜味剂、矫味 剂、着色剂、芳香剂和/或防腐剂以便提供更加适口的制剂。用于口服 给药的固体剂型包括胶嚢剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这类固 体剂型中，药物可与至少 一种药学上可接受的惰性载体或赋形剂相混 合。这些可包括例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、蔗糖、 淀粉、磷酸钙、磷酸钠或高岭土。还可使用粘合剂、緩沖剂和/或润滑 剂(例如硬脂酸4美)。片剂和丸剂另还可用肠溶包衣制备。用于口服给药的含有本发明药物的组合物的液体剂型包括药学 上可接受的乳液剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和软明胶胶嚢剂。这些油性介质。除这类惰性 稀释剂以外，含有本发明药物的组合物还可包括辅助剂，例如润湿剂、 乳化剂和悬浮剂。用于胃肠外给药的含有本发明药物的组合物的剂型包括无菌水 性或非水性溶液剂、混悬剂或乳液剂。合适的溶媒的实例包括丙二醇、 聚乙二醇、植物油、明胶、氢化萘和可注射有机酯，例如油酸乙酯。 这类剂型还可含有辅助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。 可使用生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚 物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物控制化合物的释放。含有本发明药物的 组合物的其它潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚 物颗粒、渗透泵、植入输注系统和脂质体。液体剂型可以通过以下方法灭菌例如经滤菌器过滤、将杀菌剂 4参入组合物中、或者通过辐射或加热组合物。或者，它们还可以无菌 固体组合物的形式制备，可在临用前溶于无菌水或其它一些无菌可注 射介质中。用于直肠或阴道给药的含有本发明药物的组合物优选为栓剂，该 栓剂除含有活性物质以外，还含有赋形剂，例如可可油或栓剂蜡。用 于经鼻或舌下给药的组合物还用本领域已知的标准赋形剂制备。用于 吸入的剂型还含有赋形剂(例如乳糖)，或者可以是含有例如聚氧乙晞-9-月桂醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂或喷雾剂的形式或作为凝胶剂给药的油性溶液剂。本发明组合物中活性成分的量可以发生变化。本领域技术人员应 了解的是，可在某种程度上根据各种因素来调节确切的个别剂量，有 关因素包括待给予的肽、给药时间、给药途径、制剂性质、排泄率、 受治疗者疾病的性质以及患者的年龄、体重、健康状况和性别。另夕卜， 药物所靶向疾病的严重程度也会对剂量水平产生影响。每日给予的剂量水平一般介于0.1 )ig/kg体重至100 mg/kg体重之间，以单剂或分成 多剂给予。 一般的剂量范围优选介于250吗/kg体重/天至5.0 mg/kg体重/天之间。鉴于不同给药途径的效率不同，因此预期所需剂量有较 大范围的变化。例如， 一般预期比起通过静脉内注射给药，口服给药 需要较高的剂量水平。这些剂量水平的变化可用本领域众所周知的标 准的经验方法调整以使之最优化。 一般而言，确切的治疗有效剂量将 由主治医师在考虑上述给定因素后加以确定。可以缓释组合物给予本发明的药物(例如肽、多肽、抗体和小分子)，例如参见U.S.P.N. 5,672,659和U.S.P.N. 5,595,760。即释或緩释 组合物的使用取决于待治疗疾病的类型。如果该病包括急性疾病或超 急性疾病，则优选用优于緩释组合物的即释形式治疗。或者，对于预 防性治疗或长期治疗，则一般可优选緩释组合物。可通过下列实施例对本发明进行说明，所述实施例不以任〗可方式 限制本发明。实施例实施例1:用p发射体标记的肿瘤结合肽的治疗效果可制备钇标记的肽以测试其在携带异种移植物胂瘤的大鼠中的 潜在治疗价值。使该肽通过短接头序列(gly-gly-gly-ser)在C端与螯合 剂基团(例如DOTA)连接。从销售商获取90-YC13 。可使90-Y在乙酸 铵緩沖液(pH 4.5)中与肽-DOTA的溶液反应以对肽复合物进行标记。 可在大鼠两胁皮下各注射1.0 ml 2 mg/ml肺癌细胞的细胞悬液，以产 生荷瘤大鼠。肿瘤生长大约两周。将荷瘤动物随机分成实验組和对照 组。经尾部静脉给每只动物注射所述肽。5只动物将接受单剂5 mCi/kg 的90-Y-肽。5只动物将接受单剂10 mCi/kg的90-Y-肽，5只对照动 物将接受单剂等摩尔剂量的未标记肽(8 nmol/kg)。用测径器测量3个 最大的直径dl 、d2和d3，按照用于椭圆体的公式V=(兀/6) (dlxd2xd3)， 计算得到每个肿瘤的体积。确定每只动物的肿瘤体积，为每只动物各 胂瘤体积之和。每3-4天对肿瘤体积进行测定。将归一化至最初肿瘤 体积的肺瘤体积作为时间的函lt绘图。一旦对照动物组的肿瘤体积达2cc或者坏死时便处死；预计肽注 射后这段时间约为10天。接受5 mCi/kg的组中，预计1只动物在注 射后3周显示肿瘤完全消除，而其它4只与对照相比，则显示肿瘤生 长延迟大约1周。接受10 mCi/kg的动物组中，预计4只在注射后7 周肿瘤完全消除，观察 8个月的时间未继续生长。l只动物显示肿瘤 生长延迟，但是一旦胂瘤达到2cc体积或坏死时便需要处死。实施例2:测试y发射体标记的肿瘤结合肽的诊断用途的人体研究招募诊断为3b期或4期肺癌的15名患者。18岁以下患者或怀孕 患者不包括在内。研究对象的预计平均年龄为60岁。可按照标准临 床方案对每位研究对象进行PET/CT成像，该方案通常包括给予10-13 mCi 18-FDG后，从卢贞底到大腿近端进行PET和非强反差CT成像 (non-contrast CT imaging)。在PET成像后 一周和两周之间，用》文射性 标记的肽作为放射性药物，可获得闪烁成像。可通过使肽 -gly-gly-gly-ser-DTPA与111-In氯化物反应来制备放射性药物。每位 研究对象将接受静脉内给予剂量为5mCi的lll-In标记肽。可在给予 放射性标记的肽之后24小时和48小时，获取受治疗者全身前部和背 部平面图像。在给予放射性标记的肽之后24小时和48小时，还可获 得胸部和腹部的SPECT成像。采用中能准直仪(medium energy collimator),可用SPECT/CT照相机获得闪烁成像。两位放射学研究 人员将读取每位受治疗者的PET/CT研究结果，另外两位放射学研究 人员将读取每位受治疗者的SPECT/CT研究结果；每組放射学研究人 员对其它研究结果并不知情。可将由PET成像的放射示踪物摄取的每 个异常病灶的部位、大小和程度与SPECT成像的部位、大小和程度 进行比较。可采用科恩k检验(Cohen's kappa testing)来确定PET与 SPECT成像之间的一致性水平。15名研究对象中，我们预期通过PET和SPECT成像可观察到访文 射示踪物摄取(radiotmceruptake)的40个异常病灶。根据每个成4象特征(imaging modality),大约9名患者为3b期。将48小时获得的SPECT 图像与PET图像进行比较，计算得到科恩k比为0.85。将24小时 SPECT图像与PET进行比较，所得到的科恩k比为0.8。根据解剖区 域、部位的器官或损害的大小， 一致性没有显著变化。在进行癌症总 体分期比较时，对于两种成像特征，计算得到科恩k比为0.95。实施例3:癌结合肽和表位的鉴定 癌结合肽的筛选在最后一轮针对癌细胞的淘选之后，对得自未扩增的12聚体噬 菌体库的24个克隆和得自未扩增的7聚体噬菌体库的13个克隆进行 了测序。图2显示获得的具有最高共有程度的序列。癌结合肽的细胞内化结合癌细胞的12聚体用荧光素标记(PanF),并与生长在培养物中 的肺癌细胞(NCI-H460)、前列腺癌细胞(DU-145)和成纤维细胞 (CCD-1070Sk)—起孵育。用荧光显微镜观察表明，肺癌细胞和前列腺 癌细胞的细胞摄取明显，但是在成纤维细胞的情况下未观察到明显的 摄取。与裂解肽序列缀合的癌结合肽的细胞毒性合成了通过4个残基接头与裂解肽序列缀合的癌结合12聚体 (PanL)，并测定了在肺癌、前列腺癌、非恶性前列腺上皮细胞和成纤 维细胞中的差异性细胞毒活性。在每种癌细胞类型的情况下，观察到 细胞死亡呈剂量依赖性增力口，肽浓度高达2.5 pM。在非恶性细胞系中， 观察到较低程度的细胞死亡。体外细胞毒性与蓖麻毒蛋白-A缀合每种细胞类型被杀死的百分比见图5。比起成纤维细胞(16%),在 肺癌(50%)和前列腺癌(32%)的情况下，观察到杀死的细胞较多。还将56未缀合的蓖麻毒蛋白A亚基与每种细胞类型一起孵育，未观察到细胞;故杀死。 肽靶标的鉴定将与生物素缀合的癌结合肽(DYWDTSWPLLLFGGGSK; SEQ ID NO:12; PanB)用于亲和力俘获技术以分离和鉴定选择癌的肽 (cancer-selecting peptide)与之结合的分子靶标。将由亲和层析法4孚获的 组分(species)洗脱出来，洗脱液进一步用SDS PAGE纯化。用考马斯 蓝染色时，出现单一明显的相当于70kD的条带(图6)。切取该条带， 进行质谱分析，分析显示多个相关组分。已鉴定出的靶标中有热激蛋 白HSP70家族的数个成员。包括HSPA5、应激-70蛋白、线粒体前体、 热激关联71 kDa蛋白同等型1和热激70 kDa蛋白1。另外还鉴定出 蛋白质二硫4定异构酶A4前体。这些蛋白质中的多个涉及已知在癌细 胞中发生的解折叠蛋白应答。肽与Hsc71选定表位的结合观察到较高水平的放射性标记肽PanC与生物素缀合的表位 (GIPPAPRGVPQIEVTF; SEQ ID N0:15)结合，因为放射性标记的PanC 与未标记的PanC的比率增加(图8)。标记的PanC浓度保持恒定，为 20 nM,而将量递增的未标记的PanC加到混合物中以阻断标记肽的结 合。热PanC (hotPanC)与候选表位结合的饱和度出现在标记/未标记比 0.1%以上。Hsc71的表位干扰肽与Hsp70结合将不同浓度的Hsc71的合成表位(GIPPAPRGVPQIEVTF; SEQ ID:15)与恒量的PanC加到Hsp70包被的孔中以测定表位是否与Hsp70 竟争结合PanC。 Hsc71表位以浓度依赖性方式抑制PanC与Hsp70结 合，与该表位和Hsp70对PanC结合的特异性结合竟争相符(图8)。比较起来，该表位抑制PanC与白蛋白的结合在所有浓度下都大致相等， 这就表明在该表位与白蛋白之间缺乏特异性结合竟争。总之，这些结 果表示PanC与Hsp70的结合是通过与选定表位特异性结合而介导的。
材料与方法 细胞培养
所有细胞均获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas， VA)。每种细月包培养物都在37°C 、 5% C02 下生长。使COLO 320DM (结肠癌)和NCI-H460 (肺癌)在RPMI 1640 培养基与2mML-谷氨酰胺中生长，调整该培养基以含有1.5 g/L碳酸 氢钠、4.5 g/L葡萄糖、10 mM HEPES和1.0 mM丙酮酸钠，并补充 10%的胎牛血清。使DU-145 (前列腺癌)和CCD-l(T70Sk (成纤维细胞) 在极限必需培养基(Eagle)与2mML-谷氨酰胺中生长，调整EarleBSS 以含有1.5 g/L碳酸氢钠、0.1 mM非必需氨基酸和1.0 mM丙酮酸钠， 并补充10。/。的胎牛血清。使Hs 578T (乳腺癌)在Dulbecco改进的Eagle 培养基与4mML-谷氨酰胺中生长，调整该培养基以含有1.5 g/L碳酸 氢钠和4.5 g/L葡萄糖，并补充0.01 mg/ml的牛胰岛素和10%的胎牛 血清。使RWPE-1 (非癌前列腺上皮细胞)在补充了 5 ng/ml人重组EGF 和0.05 g/ml牛垂体提取物的角质形成细胞-无血清培养基中生长。
癌细胞结合肽的筛选
将喧菌体展示文库(Ph.D.-12和Ph.D,7, New England Biolabs， Ipswich. MA)针对多种癌细胞类型进行连续淘选。在针对每种癌细胞 类型进行淘选后，收集结合癌细胞的克隆后扩增；使用扩增的克隆针 对正常成纤维细胞进行淘选。在针对正常成纤维细胞进行淘选后，收 集非结合克隆，用于针对下一种癌细胞类型进行淘选(参见
图1)。按这 种方式，选出能够结合多种癌细胞类型而不结合正常成纤维细胞的克 隆。对于12聚体文库，用来淘选的细胞类型的顺序为l)结肠癌之后为成纤维细胞，2)前列腺癌之后为成纤维细胞，3)肺癌之后为成纤维 细胞，4)乳腺癌之后为成纤维细胞，5)结肠癌之后为成纤维细胞，和 6)前列腺癌之后为成纤维细胞。对于7聚体文库淘选顺序为l)乳腺 癌之后为成纤维细胞，2)肺癌之后为成纤维细胞，3)前列腺癌之后为 成纤维细胞，和4)结肠癌。该方法的更多详细描述见下文。
将肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后悬浮于PBS (pH 7.4)中。将细胞悬 液稀释成106个细胞/1111。将等分量(IO pl)的噬菌体文库加到1.5 ml微 量离心管中的细胞悬液中，在23。C下振荡孵育60分钟。孵育之后， 将细胞悬液在18K rpm下离心10分钟。如果细胞沉淀得自癌细胞， 则弃去上清液；该沉淀用PBS洗涤3次，并在细胞裂解溶液(tris 25 mM (pH7.5)、 0.5。/。曲通(triton)X-100)中孵育。将裂解混合物加到LB培养 基内处于早期对数期的20 ml大肠杆菌(E. coli) (ER2738)培养物中，按 照Ph.D.文库试剂盒(New EnglandBiolabs)生产商说明书进行噬菌体扩 增。如果该沉淀得自正常的成纤维细胞，则保留上清液(含有非结合噬 菌体)，并连续地用于针对下一种癌细胞培养物的后续淘选。
在针对癌细胞的最后一轮淘选之后，使细胞沉淀，用PBS洗涤3 次后裂解。按照生产商说明书，将含有噬菌体的裂解混合物滴定到琼 脂板上。在Ph.D.-12文库的情况下，选出用于DNA测序的24个噬菌 斑。在Ph.D.-7文库的情况下，选出15个噬菌斑。共有结合序列见图 2。
肽合成
采用标准FMOC保护化学法来合成肽。对于体外研究，在C端 接有4个残基接头序列的结合癌细胞的12个残基肽序列用荧光团或 细胞毒药物标记。序列DYWDTSWPLLLFGGGSK (SEQ ID NO:12; PanF)(荧光素)-酰胺用于进行体外细胞内化研究。对于体外杀死细胞 的研究，肽用 C端的下述细胞裂解序列合成 DYWDTSWPLLLFGGGS(KFAKFAK)3 (PanL; SEQIDNO:13)。合成了肽序列DYWDTSWPLLLFGGGC (PanC; SEQ ID NO:14),用于随 后与蓖麻毒蛋白-A亚基缀合，并用于用99m-锝进行放射性标记。合 成了肽DYWDTSWPLLLFGGGSK-生物素(SEQ ID NO:12: PanB)用于
癌抗原分离。
细胞内化
按上文详述方法，使NCI-H640、 DU-145和CCD-1070Sk在培养 物中生长。细胞在6孔板的盖玻片上生长。在改进的Eagle培养基中 制备25 )iM肽DYWDTSWPLLLGGGSK-荧光素(PanF; SEQ IDNO:12) 的溶液。细胞培养基用1.6ml含肽培养基更换，使细胞与肽在37。C下 孵育1小时。弃去培养基后，细胞用PBS洗涤3次。将2ml2。/。曱醛 的PBS溶液加到各孔中，将板保持在冰上达15分钟。细胞用冷的PBS 洗涤3次，并用蒸馏水漂洗。盖玻片用含DAPI培养基封片，然后用 Olympus BX51焚光显微镜和DP70数码照相机观察拍照，激发波长和 发射波长分别为490 nm和520 nm。
与裂解肽序列缀合的癌结合肽的细胞毒性
按上文详述方法，使NCI-H640、 DU-145和CCD-1070Sk在培养 物中生长。细胞用胰蛋白酶消化后悬浮于含有10。/。FBS的培养基中。 将细胞在1，000rpm下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重新悬浮于1 ml不含FBS的培养基中。将细胞悬液稀释成2乂104个细胞/75 pl。将 25微升适当稀释的肽溶液(PanL)加到细胞样品中，得到以下不同的药 物浓度0jiM、 0.1 fxM、 0.5 |iM、 l.O(iM、 2.5 ^M、 5.0 jiM或10 jaM。 每个样品按一式三份准备。将细胞悬液转移到96孔板中，在不同浓 度的PanL存在下于37。C孵育2小时。每种细胞类型的6个样品不含 肽。从培养箱中取出测定板，将2 |nl裂解溶液(Tris 25mM (pH 7.5)、 0.5。/。曲通X-100)加到每种细胞类型不含肽的3个样品中，得到阳性对 照最大LDH释放。将100 |il CytoTox-ONE试剂(Roche Applied Science)加到各孔中，在板振荡器混合30秒钟后，测定每个样品的LDH释放。 将样品在22。C下孵育10分钟。将50 (al终止溶液(每100 pi CytoTox-ONETM试剂加入的量)加到各孔中来终止反应。采用530 nm 的激发波长和620 nm的发射波长，测定各孔中的焚光强度(Cytofluor 4000)。 CytoTox-ONE测定法显示，产生了与杀死的细胞数成线性'比 例的一些荧光产物(相关系数=0.99,数据未显示)。运用下列公式计 算已杀死细胞的百分比
,"t, 100%x(p-c)
%细胞毒性=(M_C)
其中P =细胞与肽孵育各孔中的LDH释放；C =细胞未与肽孵育各 孔中的LDH释放；M=裂解溶液孵育各孔中的LDH释放。该公式基 于这样的假设，即CytoTox-ONE产物产生与已杀死细胞数之间呈线性 关系。C为y截距，M是由于100%细胞杀死所产生的。
体外细胞毒性与蓖麻毒蛋白-A缀合
使肽PanC (DYWDTSWPLLLFGGGC; SEQ ID NO:14)与荒麻毒 蛋白A亚基(Sigma-Aldrich)缀合。蓖麻毒蛋白A溶液获自生产商。緩 沖液交换用0.1 M PBS/20。/。甘油进行。将蓖麻毒蛋白A与NHS-PE04 马来酰亚胺交联剂(Pierce， Rockford, IL)按1:10摩尔比在室温下缀合 30分钟。衍生化蓖麻毒蛋白A用P4柱纯化(采用0.1 MPBS/20。/。甘油 为洗脱緩沖液)。使衍生化蓖麻毒蛋白A与P12S按1:1摩尔比混合， 并在室温下反应2小时。
按上文详述方法，使NCI-H640、 DU-145和CCD-1070Sk在培养 物中生长。细胞用胰蛋白酶消化后悬浮于含有10。/。FBS的培养基中。 将细胞在1,000 rpm下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重新悬浮于1 ml不含FBS的培养基中。将细胞悬液稀释成2><104个细胞/75 )al。将 25微升适当稀释的肽-蓖麻毒蛋白A缀合物加到各细胞样品中，得到 1 pM的药物浓度。每个样品按一式三份准备。将细胞悬液转移到96 孔板中，在肽-蓖麻毒蛋白A缀合物存在下于37。C孵育2小时。按照上文4既述方法测定杀死细^;的百分比(图5)。 癌细胞抗原的鉴定
如上培养NCI-H460细胞以得到109个细胞。使用CNM蛋白质提 取试剂盒(BioChain, Hayward， CA)来提取细胞膜蛋白质。对生产商 说明书进行修改以将线粒体保留在胞质组分中；其它方面则按照生产 商说明书进行提取。合并含有细胞膜蛋白质的组分并保存在-80。C下。 通过将固定化Neutravidin微珠悬浮于TBS (pH 7.2)中，用移液管将200 |il所得凝月交浆液移至Nanosep 3K 44转^主(Pa11 Corporation, East Hills. NY)上，以制备固定化Neutravidin柱。将各柱放在收集管中，将500 |il TBS加到各旋转柱上后，以l，250xg离心30-60秒钟，各柱不盖盖子。 然后把底塞插入各柱。
将生物素化肽(PanB)制成100吗/ml溶液；将500 |il溶液加到旋 转柱上。将各柱在室温下轻轻摇动温育30分钟。收集管中的各柱以 l，250xg离心60秒钟，除去未结合的PanB。然后将旋转柱转移到单 独的收集管中进行生物素封闭。将250 nl生物素封闭溶液(100 fig/ml) 加到各旋转柱上。各柱盖上盖子，倒转3-5次后，在室温下温育5分 钟。取下各柱的螺旋顶盖，将柱放置到收集管中以l,250xg离心30-60 秒钟。将TBS (pH 2.2) 500 jxl加到各旋转杯中。将螺旋顶盖再盖到各 柱上，将各柱倒转3-5次。取下螺旋顶盖。将各柱放到收集管中，以 l，250xg离心30-60秒钟。各柱再用500 fxl TBS洗涤2次后，插入底 塞。
使细胞膜蛋白质混合物融化到室温后，加到旋转柱上，在4。C下 轻轻摇动温育4小时。温育后，从各柱取下顶盖和底塞。将各柱放到 收集管中，以1,250xg离心60秒钟。将各柱转移到单独的收集管中洗 涤。将各柱在TBS中洗涤4次。每次洗涤后，收集各柱以1，250xg离 心30-60秒钟后，收集管中的洗涤緩冲液为废物。将旋转柱转移到新 的收集管中，以洗脱俘获的膜蛋白。使各柱在洗脱緩沖液(0.2M甘氨酸-HCl， pH 2.2)中在室温下温育3-5分钟后，以1,250xg离心30-60秒钟，洗脱出蛋白质。中和洗脱液pH，进行緩冲液交换，得到蛋白质洗脱液的tris緩冲盐溶液(pH 7.2)。蛋白质洗脱液再用ID SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步纯化，随后用考马斯蓝染色。切取出现在70 kD位置的单条明显条带(图6)，送到美国马萨诸塞州大学医学院(University of Massachusetts Medical School)蛋白质测序中心。采用质谱法对蛋白质进行鉴定。
肽PanC的放射性标记
将2 |il等分量的PanC (3 M)与40 |il 0.25M乙酸铵、15 pi酒石酸緩沖液(pH 8.7)、4 ^氯化亚锡的100 mM酒石酸钠溶液和30(xl 99m-Tc高锝酸盐混合。将混合物在95。C下加热25分钟。用Sep-Pak进行QC，且QC总是为90%以上。将少量的等分量注射入Waters 600 HPLC以检查放射性特征。收集流分，用丫计数器(Perkin-ElmerWallac Wizard1470)读数。
肽与Hsc71选定表位的结合
为了预测合成肽PanC与之结合的癌细胞抗原的特定表位，应用商用软件对4个HSP70家族成员(通过上述抗原俘获鉴定)的氨基@1^列进行比对，鉴定出保守区。在4种蛋白质中是保守的最长区域出现在Hsc71的氨基酸463-478 (GIPPAPRGVPQIEVTF; SEQ ID NO:15)上。该区比鉴定出的下一个最长的保守区长78%，因此确定为PanC结合的合理的候选表位。该候选表位用标准FMOC化学法合成，具有缀合到N端的生物素。
为了测定放射性标记的PanC与候选表位的结合，将100 pM生物素化表位与可变比率的放射性标记与未标记的肽PanC在体积为150 pi的PBS (pH 7.2)中温育2小时。2小时温育后，将混合物与Neutravidin农l珠(Pierce, Rockford IL)混合以4吏生物素缀合的表位和任
63何可与之结合的肽PanC固定化。微珠用PBS洗涤3次，除去未结合的肽。随后统计微珠上结合的放射性肽。
Hsc71表位与Hsp70表位之间的结合竟争
为了证实PanC与各种HSP70家族成员的结合由PanC与表位GIPPAPRGVPQIEVTF (SEQ ID NO: 15)的结合介导，进行了竟争结合研究。通过向各孔加入0.5 pg/孑L Hsp70 (BioVision， Mountain View,CA)或BSA (对照)的100 pl PBS溶液，在4°C下温育过夜，从而用Hsp70或BSA包被各孔来制备96孔板。次日，各孔用PBS洗涤3次。将体积为150 pi的PBS (pH 7.4)中的99m-Tc标记的PanC (0.1 ^Ci)和不同浓度的合成表位加到各孔中，在室温下温育l小时。温育结束时，各孔用PBS洗涤3次。将结合的PanC用甘氨酸tris HC1缓冲液(pH 2.8)从各孔洗脱出来，用Y计数器进^亍统计以确定流分结合。
实施例4:嵌合抗体在癌症治疗中的应用
抗表位GIPPAPRGVPQIEVTF (SEQ ID NO:15)的抗体可采用本文所述方法或本领域已知方法制备。其它详细方案可参见例如Ausubel等,幼oW户ratoco/s Mo/ecw/ar BZo/ogy,第5版,或者Harlow和Lane，爿w^ c^'es.'爿丄a6ora/wj Afawwa/。还可只十本发明的抗体估文进一步〈奮饰以包括一种或多种本文所述的治疗药或细胞毒药物，并可如下测定其在有需要的患者中治疗癌症的能力。
在I期临床试验中，招募15位患有IIIB期或VI期非小细胞肺癌的患者。患者接受每周一次静脉内输注125mg/m2、 250mg/m2或375mg/n^的抗体共4周。监测患者与输注相关的副作用。每周监测完全血细胞计数、肝功能测试和代谢特征共6个月。在0、 1、 2、 3和6个月研究招募时间内，用PET和CT成像对肿瘤大小和代谢进行比较，从而对肺瘤反应进行评价。对用Kaplan-Meier分析对生存者进行监测达12个月。其它实施方案
本说明书中提及的所有出版物和专利申请都通过引用结合到本文中，其程度与每个独立的出版物或专利申请具体而单独指明通过引用结合到本文一样。
虽然本发明结合其具体实施方案进行了描述，但要了解的是能够对本发明进行进一步修改，并且本申请涵盖在本发明的总体原则下的任何修改、用法或改编，其中包括偏离本发明公开内容但属于本发明
所属领域已知惯例范围内的这类修改、用法或改编，并且可适用于上文中所述的必要特征。
权利要求
1.一种肽或多肽，包含如SEQ ID NO1-14中任一个所示的氨基酸序列。
2. 权利要求1的肽或多肽，其中所述肽与同SEQIDNO:15所示 序列有至少卯％序列同一性的氨基酸表位结合。
3. 权利要求1的肽或多肽，其中所述肽与热激蛋白70 (HSP70) 蛋白结合。
4. 权利要求3的肽或多肽，其中所述肽与天然非变性构象的所述 HSP70结合。
5. 权利要求3的肽或多肽，其中所述HSP70蛋白选自GRP78、 致死蛋白和HSC71。
6. 权利要求l的肽或多肽，还包含可检测标记、治疗药、螯合剂 或接头部分中的一个或多个。
7. 权利要求6的肽或多肽，其中所述肽与所述可检测标记间接连接。
8. 权利要求6的肽或多肽，其中所述肽与所述可检测标记直接连接。
9. 权利要求6的肽或多肽，其中所述可^f企测标记是;^射性药物、 荧光剂或重金属。
10. 权利要求9的肽或多肽，其中所述放射性药物是与所述肽的 氨基酸连接的碘、砹或澳标记。
11. 权利要求9的肽或多肽，其中所述放射性药物是锝-99m。
12. 权利要求6的肽或多肽，其中所述治疗药是细胞毒药物。
13. 权利要求12的肽或多肽，其中所述细胞毒药物是烷化剂、抗 生素、抗肿瘤药、抗代谢药、抗增殖药、微管蛋白抑制剂、拓朴异构 酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、生长因子、激素激动剂、激素拮 抗剂、细胞凋亡剂、免疫调节剂或放射性药物。
14. 权利要求12的肽或多肽，其中所述细胞毒药物选自下列化合 物及其衍生物多柔比星、曱氨蝶呤、喜树碱、高喜树碱、硫代秋水 仙素、秋水仙素、康普瑞汀、combretastin A-4、鬼臼毒素、利索新、 利索新-d、多拉司他汀、泰素、紫杉醇、CC1065、安丝菌素p3和美 坦生类化合物。
15. 权利要求6的肽或多肽，其中所述螯合剂是亚氨基羧酸反应 基、聚氨基聚羧酸反应基、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或1,4,7,10-四 氮杂环十二烷-1，4,7，10-四乙酸(DOTA)。
16. 权利要求1的肽或多肽，其中所述肽还包含药学上可接受的 载体。
17. 权利要求1的肽或多肽，其中所述肽与肿瘤细胞特异性结合。
18. 权利要求17的肽或多肽，其中所述肽与由所述肿瘤细胞表达 的热激蛋白70(HSP70)蛋白特异性结合。
19. 权利要求17的肽或多肽，其中所述肿瘤细胞包括肺肿瘤细 胞、乳腺肿瘤细胞、结肠肿瘤细胞或前列腺肿瘤细胞。
20. —种使人体内含有肿瘴细胞的区域成像的方法，所述方法包括(a) 给予所述人包含如SEQ ID N0:l-14中任一个所示的氨基酸 序列和可^r测标记的肽或多肽药物；(b) 使所述肽或多肽药物结合，并从患者体内清除未结合的所述 肽或多肽药物；和(c) 获得含有所述肿瘤细胞的区域的图像。
21. 权利要求20的方法，其中所述区域是乳腺。
22. 权利要求20的方法，其中所述区域是前列腺。
23. 权利要求20的方法，其中所述区域是胃肠道。
24. 权利要求20的方法，其中所述区域是肝脏。
25. 权利要求20的方法，其中所述区域是肺。
26. 权利要求20的方法，'其中所述区域是整个身体，成像的目的是检测癌转移。
27. 权利要求20的方法，其中所述图像用闪烁法获得。
28. 权利要求20的方法，其中所述可检测标记是放射性核素。
29. 权利要求28的方法，其中所述放射性核素是锝-99m。
30. —种"^断人的癌症的方法，所述方法包括(a) 给予所述人肽或多肽药物，或者使得自所述人的生物样品与 肽或多肽药物接触，所述肽或多肽药物包含如SEQ ID NO:l-14中任 一个所示的氨基酸序列和可检测标记；(b) 通过检测所述肽或多肽药物与所述人的细胞的结合，来诊断 所述人的癌症。
31. 权利要求30的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳&泉癌。
32. —种治疗人的癌症的方法，所述方法包括给予所述人权利要 求6的肽或多肽，其中所述肽或多肽包含治疗药。
33. 权利要求32的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳腺癌。
34. —种治疗人的癌症的方法，所述方法包括给予所述人编码细 胞毒药物和权利要求1的肽或'多肽的核酸分子。
35. 权利要求34的方法，其中所述细胞毒药物和所述肽或多肽被 表达成一条多肽链。
36. 权利要求34的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳腺癌。
37 —种抗体，所述抗体包含可变区，所述可变区包含选自SEQID NO: 1-14的序列。
38. 权利要求37的抗体，其中所述抗体与HSP70、HSP71 、GRP78、 致死蛋白或HSC71结合，其解离常数小于1(T7M。
39. 权利要求37的抗体，其中所述可变区存在于免疫球蛋白重链中。
40. 权利要求37的抗体，其中所述可变区存在于免疫球蛋白轻链中。
41. 权利要求37的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
42. 权利要求37的抗体，其中所述抗体是重组抗体。
43. 权利要求37的抗体，其中所述抗体与同SEQIDNO:15所示 序列有至少90%序列同一性的氨基酸表位结合。
44. 权利要求37的抗体，其中所述抗体与天然非变性构象的所述 HSP70蛋白结合。
45. 权利要求37的抗体，其中所述序列是连续的。
46. 权利要求39的抗体，其中所述重链选自同种型IgG、 IgA、 IgM、 IgD和IgE。
47. 权利要求37或39的抗体，其中所述抗体在所述可变区以外 的结合部位与氨基酸表位结合，所述氨基酸表位与如SEQ ID NO:15 所示序列有至少90%序列同 一性。
48. 权利要求37的抗体，所述抗体还包含可检测标记、治疗药、 螯合剂或接头部分中的一个或多个。
49. 权利要求48的抗体，其中所述抗体与所述可4企测标记间接连接。
50. 权利要求48的抗体，其中所述抗体与所述可检测标记直接连接。
51. 权利要求48的抗体，其中所述可检测标记是放射性药物、荧 光剂或重金属。
52. 权利要求51的抗体，其中所述放射性药物是与所述抗体的氨 基酸连接的碘、砹或溴标记。
53. 权利要求51的抗体，其中所述放射性药物是锝-99m。
54. 权利要求48的抗体，其中所述治疗药是细胞毒药物。
55. 权利要求54的抗体，其中所述细胞毒药物是烷化剂、抗生素、 抗肺瘤药、抗代谢药、抗增殖药物、微管蛋白抑制剂、拓朴异构酶I抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、生长因子、激素激动剂、激素拮抗剂、 细胞凋亡药、免疫调节剂或放射性药物。
56. 权利要求54的抗体，其中所述细胞毒药物选自下列化合物及 其衍生物多柔比星、曱氨蝶呤、喜树碱、高喜树碱、硫代秋水仙素、 秋水仙素、康普瑞汀、combretastin A-4、鬼臼毒素、利索新、利索新 -d、多拉司他汀、泰素、紫杉醇、CC1065、安丝菌素p3和美坦生类 化合物。
57. 权利要求48的抗体，其中所述螯合剂是亚氨基羧酸反应基、 聚氨基聚羧酸反应基、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或1，4,7，10-四氮杂 环十二烷-l，4,7,10-四乙酸(DOTA)。
58. 权利要求37的抗体，其中所述抗体还包含药学上可接受的载体。
59. 权利要求37的抗体，其中所述抗体与肿瘤细胞特异性结合。
60. 权利要求59的抗体，其中所述抗体与由所述肿瘤细胞表达的 热激蛋白70(HSP70)蛋白特异性结合。
61. 权利要求59的抗体，其中所述肿瘤细胞包括肺肿瘤细胞、乳 腺肿瘤细胞、结肠肿瘤细胞或前列腺肿瘤细胞。
62. 权利要求37的抗体，其中所述抗体是双链抗体、双特异性抗 体、Fab片段、F(ab')2分子、单链Fv (scFv)分子、串联scFv分子或抗 体融合蛋白。
63. —种使人体内含有肿瘤细胞的区域成像的方法，所述方法包括(a) 给予所述人包含如SEQ ID NO:l-14中任一个所示的氨基酸 序列和可4企测标记的抗体；(b) 使所述抗体结合，并从患者体内清除未结合的所述抗体；和(c) 获得含有所述肿瘤细胞的区域的图像。
64. 权利要求63的方法，其中所述区域是乳腺。
65. 权利要求63的方法，其中所述区域是前列腺。
66. 权利要求63的方法，其中所述区域是胃肠道。
67. 权利要求63的方法，其中所述区域是肝脏。
68. 权利要求63的方法，其中所述区域是肺。
69. 权利要求63的方法，其中所述区域是整个身体，成像的目的 是检测癌转移。
70. 权利要求63的方法，其中所述图像用闪烁法获得。
71. 权利要求63的方法，其中所述可检测标记是放射性核素。
72. 权利要求71的方法，其中所述放射性核素是锝-99m。
73. —种"^断人的癌症的方法，所述方法包括(a) 给予所述人抗体，或者使得自所述人的生物样品与抗体接触， 所述抗体包含如SEQ ID NO:l-14中任一个所示的氨基酸序列和可检 须寸才示i己；(b) 通过检测所述抗体与所述人的细胞的结合，来诊断所述人的 癌症。
74. 权利要求73的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳腺癌。
75. —种治疗人的癌症的方法，所述方法包括给予所述人权利要 求48的抗体，其中所述抗体包含治疗药。
76. 权利要求75的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳腺癌。
77. —种治疗人的癌症的方法，所述方法包括给予所述人编码细 胞毒药物和权利要求37或39的抗体的核酸分子。
78. 权利要求77的方法，其中所述细胞毒药物和所述多肽被表达 成一条多肽链。
79. 权利要求77的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺 癌或乳腺癌。
80. —种制备抗体的方法，该方法包括4吏编码包含SEQ ID NO:l-14中的一个或多个的氨基I1^列的核酸序列进行重组表达，其中所述氨基酸序列与同SEQ ID NO:15所示序列有至少90%序列同一 性的表位特异性结合。
81. —种制备抗体的方法，该方法包括(a) 给哺乳动物注射肽，所述肽包含与如SEQIDNO:15所示的序 列有至少90%序列同 一性的氨基酸序列；(b) 采集所述哺乳动物的腹水；和(c) 由所述腹水纯化出所述抗体，其中所述抗体与所述肽特异性 结合。
82. 权利要求81的方法，其中所述抗体与天然非变性构象的热激 蛋白70(HSP70)蛋白特异性结合。
83. 权利要求81的方法，该方法还包括将所述肽序贯注射到所述 哺乳动物内。
84. —种测定小分子是否能够特异性结合癌细胞的方法，该方法 包括(a) 使所述小分子与包含与如SEQ ID NO:15所示的序列有至少 卯°/。序列同一性的氨基酸序列的肽、多肽、噬菌体或融合分子接触；和(b) 测定所述小分子与所述肽、多肽、噬菌体或融合分子的结合 亲和力，其中测出所述小分子与所述肽、多肽、噬菌体或融合分子结 合的解离常数为1(T M以下时，表明所述小分子能够特异性结合所述 癌细月包。
85. —种测定小分子是否能够特异性结合癌细胞的方法，该方法 包括使通过权利要求84的方法鉴定出的小分子与癌细胞接触，如果 所述小分子与所述癌细胞结合但不与非癌细胞结合，则表明所述小分 子能够与所述癌细胞特异性结合。
86. —种药盒，所述药盒包含(a) 肽、多肽或抗体，所述肽、多肽或抗体包含与一个或多个如 SEQ ID NO: 1 -14所示的序列有至少90%序列同 一性的氨基酸序列；和(b) 可检测标记、治疗药、螯合剂或接头部分中的一个或多个。
全文摘要
本发明公开了用于使肿瘤成像和用于治疗哺乳动物癌症的肽、多肽、抗体、小分子和它们的使用方法。所述方法包括给予哺乳动物(例如人)一种或多种本发明的药物；与肿瘤细胞特异性结合的肽、多肽、抗体和小分子可以用放射性标记或治疗性标记(例如细胞毒药物)进行标记。
文档编号A61K38/08GK101646449SQ200780044650
公开日2010年2月10日 申请日期2007年10月10日 优先权日2006年10月10日
发明者S·斯夸尔斯 申请人:斯奎科公司