专利名称：一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗生素制药领域，涉及一种直接产生妥布霉素的工程菌及 其应用，具体地说，本发明是利用分子生物学操作技术，阻断黑暗链霉菌
(iYrep,CM7/c" ^/ e6i^r/^)生物合成基因""，获得直接产生妥布霉 素的基因工程菌株，可以在抗生素制药中应用。
背景技术：
黑暗链霉菌(^re/^咖/c" "/7e^rar/M)是1967年美国礼莱公司的 研究人员从土壤中分离得到的，该菌株能产生一组抗生素，其中2、 4、 5， 为主组分。组分2为安普霉素(Apramycin， Am)，组分4为6" -O-氨甲酰 卡那霉素B (6" -O-Carbamoylkanamycin B, CKB),组分5，为6" -O-氨 甲酰i+霉素(6" -0-Carbamoyltobramycin， CTB )。组分4、 5，经高温 水解后分别形成卡那霉素B和妥布霉素。
妥布霉素是一种广谱高效的抗生素，在体外对多种细菌有抗菌活性， 特别是某些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效，而且妥布霉素的耳、肾 毒性相对较低，是临床上广泛应用的抗菌药。
多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和 优化生产工艺等方面取得一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因 工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合 抗生素生产等方面取得长足的进步。在分子水平，李天伯等克隆到一段 50Kb区域，证明其中含有参与妥布霉素合成的dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶。 Madan Kumar Kharel等利用同源杂交的方法克隆到一段13. 8Kb氨甲酰妥 布霉素生物合成基因簇，证明了其中Am丄/Zw^的基因功能，推断出氨 甲酰妥布霉素的生物合成途径。
目前，妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中分离得到氨甲酰 妥布霉素，再经碱性条件下高温水解获取妥布霉素。该方法的缺点是杂质 多，产品收率低，生产成本高。
随着分子生物学技术的发展，使得利用基因工程的方法改造抗生素组 分成为可能。Madan Kumar Kharel等克隆到黑暗链霉菌中妥布霉素部分合 成基因簇，Blastn发现其中基因TacA为氨甲酰基转移酶，可能与6"位氨 甲酰基合成有关。
发明内容
本发明的目的是通过对tod失活的方法，获得能直接产生妥布霉素的 工程菌，该菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.2409。
本发明通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中to"基因，主要 包括以下几个步骤
A、 to"基因阻断质粒的构建；
B、 阻断质粒转化黑暗链霉菌；
C、 转化子的筛选；
D、 新组分妥布霉素的鉴定。
框架内删除失活的方法为PCR分别获得m"基因上下游分子量不低 于500bp两个片段，将两者同时连接到pIJ2925中，再往片段的一端连入 在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因利用 5g/II酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。
其中转化是以A co//ET12657 (pUZ8002 )介导的结合转移方法。筛选 为先筛选红霉素抗性(wmR)菌株，无药传代后再从中筛选到红霉素敏感 Un/)菌株，从中筛选到产新组分的转化子。鉴定为发酵滤液釆用薄层 层析TLC、新组分釆用MS分析和HPLC-ELSD。
本发明既简化了生产工艺、又降低了生产成本，同时也更便于进行产 品的质量控制。
本发明所述菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(北京巿朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)登 记保藏，其分类命名为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)，保藏编 号为CGMCC No. 2409。
图l是/"d基因双交换原理及酶切位点示意图 图2是基因工程菌发酵产物组分TLC分析
l为妥布霉素标准品，2为黑暗链霉菌H6(pSPU303-3), 3为野生型菌 株黑暗链霉菌H6。 A为氨甲酰妥布霉素，B为妥布霉素，C为安普霉素。
图3是妥布霉素标准品和新组分的HPLC-ELSD图谱
A为妥布霉素标准品，B为新组分
图4是新组分的质谱分析图谱具体实施方式
实施例1:
本发明主要包括以下主要步骤
1.构建似d基因阻断质粒
根据Madan Kumar Kharel等发表的妥布霉素生物合成基因簇序列 (GenBank Accession Number AJ579650),分别在tod基因上下游i反计两 对引物，以黑暗链霉菌总DM为模板进行PCR扩增获得两个片段PCR1-2 和PCR3-4。将两片段连接产物命名为^tod，其删除了 to"基因5'端111 个碱基、内部260个碱i和3，端88个碱基。将"""连到载体pIJ2925 中获得pSPU301。再往pSPU301中的位点连入红霉素抗性基因 (pXZl经^7"I酶切回收约1.6Kb大小片段)获得重组质粒pSPU302,最 后利用5g/TI酶切将Atoc^+m^连接到载体pHZl"中釦mffl位点，获得
阻断质粒pSP詣3。
2. 阻断质粒pSPU303转化黑暗链霉菌H6
将阻断质粒pSPU303转入￡ co/y ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌 & co// ET12567 (pUZ8002， pSPU303)。然后通过结合转移的方法转化黑暗 链霉菌H6孢子，28t:培养20h后用红霉素和吡啶酸(终浓度分别为100y g/mL和50Mg/mL)水溶液覆盖，28。C继续培养5-6天长出转化子，将所获 得的ermR转化子在含有红霉素(200 pg/mL)和PPA (5 0 ja g/mL)的R2YE培 养基上42。C分区划线培养，48h长出菌落，因为阻断质粒不能在42i:复制， 只能通过同源交换整合到染色体上之后结合子才能生长，表现出对红霉素 抗性。证明结合子发生了单交换整合。随机挑起一株命名为黑暗链霉菌 H6(pSP詣3)。
3. 筛选双交换菌株与发酵产物检测
将ermR转化子在无药合V平板上连续传三代后，挑取单菌落分别点种 到无药合V平板和含药合V (红霉素100 m g/mL)平板，从544株中筛选获得 32个ermS菌株。分别命名为黑暗链霉菌H6 (pSPU303-1)至H6 (pSPU303-32). 对该32个菌株进行发酵，过滤收集发酵液，滤液通过硅胶GFw薄层层析、 生物显影发现，所有菌株均能正常产生安普霉素，但黑暗链霉菌 H6(pSPU303-3)不再产生6"-0-氨甲酰妥布霉素，而产生一个Rf值与妥布 霉素的Rf值相近的新组分。
4. 新组分鉴定
提取发酵液中新组分有如下几个步骤
A、 粗提
发酵液稀释后分别酸化、碱化除蛋白后，用732树脂静态吸附6~8 小时。而后用6倍量的3%氨水进行解吸，当流出液达pH 9. 0以上时，串 联到相当732树脂1/5体积的711树脂柱上，收集树脱液，浓缩为原体积 的1/8~1/10。
B、 分离
浓缩液(pH7. 0~7.5)上D151树脂进行动态吸附。洗涤后分别用 0. 15mol/L和0. 3mol/L的氨水进行洗脱，洗脱流速1/100 ~ l/150/分，以 磷钨酸控制终点，收集0. 3mol/L的氨水洗脱液。硫酸调pH至7. 0-7.5， D152动态吸附，无盐水洗涤后分别用0. lmol/L和0. 15mol/L的氨水进行 洗脱，洗脱流速1/100 ~1/150/分，以磷钨酸控制终点，收集0. 15mol/L 的氨水洗脱液。
C、 精制、结晶
把0. 15mol/L的氨水洗脱液进行浓缩，用硫酸调至pH5.5 6.0,然后 上已处理好的732树脂柱动态吸附，无盐水洗涤。再用3%氨水进行洗脱， 收集解吸液2-3倍量。之后浓缩至10万单位/亳升，加入O. 5。/。(w/v)活 性炭，50 6(TC搅拌脱色1小时，抽滤得脱色液。脱色液浓缩至20万单位
/毫升，得到浓缩液。
在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入io倍量的乙醇进行结晶，此过程需
要3~4小时，之后用离心机分离，85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。
将得到的湿成品真空干燥，真空度500mmHg以上，温度6(TC,干燥6 小时，即得成品。
成品用于HPLC-ELSD分析(图3)和质谱(图4 )。液相条件流动相 0. 2mol/L三氟乙酸溶液甲醇(95: 5 ),流速为1. OmL/min,检测器为SofTA 200sELSD,漂移管温度为105°C,雾化管温度为4(TC,色谱柱Dikma C18 (5 jam, 200 x 4. 6mm)。
实施例2:利用妥布霉素基因工程菌生产妥布霉素
本发明提供的妥布霉素基因工程菌可直接用于生产，菌种经发酵后提 取妥布霉素，作为抗菌药物。、
1. 妥布霉素基因工程菌的摇瓶发酵
种子培养基生黄豆粉10g，葡萄糖10g,蛋白胨3g,酵母粉lg, 玉米粉5g， CaC03(轻质)lg，加自来水至1L。
发酵培养基可溶性淀粉20，生黄豆粉20g,葡萄糖10g, NH,C15g, CaC03(轻质)5g, MgS04 4g， FeS04 0. 05g, ZnS04 0. 03g, MnCl2 0. 3g, 豆油0. 6mL/40mL，加自来水至1L。
将实例1中步骤3获得的基因工程菌黑暗链霉菌H6(pSPU303-3)进行
摇瓶发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于合成v 号斜面，37。C培养7天，挖块接种于种子培养基(装量为20mL/250mL三角 瓶)，37。C摇床培养18h(转速为180rpm，偏心距4.0cm)。按10%接种量转 种于发酵培养基(装量为40mL/250mL三角瓶)，3rC摇床培养UQ h(转速 为180rpm,偏心距4. Ocm)。
2. 囊II产物的HPLC-ELSD分析
l)样品提取纯化按实甸1中步骤4中离子交换法提取发酵液中的妥 布霉素齦分，省略了传统工艺中高温碱性水解步骤，提高了回收率，降低 了生产威本。
2) HPLC-ELSD分析条件:Dikma Cw反向柱(5 m m, 200 x 4. 6mm),柱温 25°C，流动相为0. 2mol/L三氟乙酸溶液甲醇(95: 5 )，流速为1. OmL/min, 进体积20yl，检测器为SofTA 200s ELSD,漂移管温度为10VC,雾化管 温度为40°C。
3)标准品妥布霉素标准品购自中国药品生物制品检定所。
HPLC-ELSD分析结果如图3所示，表明基因工程菌直接产生妥布霉素。
权利要求
1、一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征是通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因，主要包括以下步骤A、tacA基因阻断质粒的构建；B、阻断质粒转化黑暗链霉菌；C、转化子的筛选；D、新组分妥布霉素的鉴定。
2、 根据权利要求l所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的框架内删除失活的方法为，PCR分别获得""基因上下游分子 量不低于500bp两个片段，将两者同时连接到pIJ2925中，再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因 er;z必利用5WI1酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。一
3、根据权利要求1所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的转化是以A "/yET12657 (pUZ8002 )介导的结合转移方法。
4、根据权利要求l所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的筛选为先筛选红霉素抗性菌株，无药传代后再从中筛选到红霉 素敏感菌株，从中筛选到产新组分的转化子。-
5、根据权利要求l所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征 是所述的鉴定为发酵滤液釆用薄层层析TLC、新组分采用HPLC-ELSD分 析和MS分析。
6、 一种直接产生妥布霉素的工程菌在制备抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用，主要是对妥布霉素产生菌中氨甲酰转移酶基因实施了破坏，菌种不再产生氨甲酰妥布霉素，而是产生妥布霉素。本发明通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因，包括构建tacA基因阻断质粒、阻断质粒pSPU303转化黑暗链霉菌H6、筛选双交换菌株与发酵产物检测、新组分鉴定。框架内删除失活的方法为PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段，将两者同时连接到pIJ2925中，再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因ermE，利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。本发明可以简化生产工艺、降低生产成本，便于进行产品的质量控制。
文档编号A61K31/702GK101392229SQ20081001147
公开日2009年3月25日 申请日期2008年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者余永红, 侯曦凡, 夏焕章, 鑫 隋 申请人:沈阳药科大学