专利名称：一种新的抗乙肝病毒药物组合--拉米夫定与原儿茶酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于乙肝病毒治疗的新的药物组合——拉米夫定和原儿茶 酸，包括该药物组合的配方比例及其和实验疗效。通过该药物组合单用与联合 作用于乙肝病毒实验研究，证实该药物组合对乙肝病毒的治疗效果好于拉米夫 定与原儿茶酸的单独使用。
背景技术：
乙型肝炎病毒(HBV)的急性和慢性感染是造成肝细胞坏死，肝细胞炎症， 以及原发性肝细胞癌(HCC)的重要原因。乙型肝炎病毒(HBV)的急性和慢性 感染是造成肝细胞坏死，肝细胞炎症，以及原发性肝细胞癌(HCC)的重要原因。 大约0. 5%急性感染的病例最后将导致致命的急性肝炎。慢性感染同样可以造成 严重的后果其中约L/4的病人最终发展为慢性肝病，包括慢性肝炎、肝纤维 化、肝硬化和肝癌。慢性乙型肝炎是临床常见病，我国现有慢性乙肝病人超过 3000万，每年因肝病死亡人数约30万。全世界每年死于HBV导致的肝癌患者 数量超过100万。根据估计，全世界范围内的HBV携带者数量已达4亿，我国 大约有1亿2千万的HBV携带者。病毒性肝炎每年带给我国的直接经济损失至 少500亿元，对人民健康和国家经济危害严重。乙型肝炎病毒以及其导致的肝 细胞疾病越来越成为中国乃至世界瞩目的问题，对HBV的预防和其引发的肝细 胞疾病的治疗成为当今世界难题之一 。近年来，西医、中医在治疗慢性病毒性乙型肝炎上都取得了重要进展。西 医以抗病毒疗法为主，根本目标是清除或永久抑制乙型肝炎病毒复制，降低其 致病性和传染性，消除或减轻肝脏的炎症和坏死。干扰素(IFN—a)曾是惟一获准用于抗HBV的药物，它的作用机制是增强HBV抗原在肝细胞表面的表达，抑制 病毒RNA前基因组的包装，它还是CD8+细胞的细胞毒作用的重要媒介。但其临床 疗效不令人满意，即使是经过严格选取的患者接受标准疗程后也仅有约30% 40%持续应答。此外，IFN—a的不良反应比较明显，包括感冒样症候、发热、 肌痛、轻微骨髓抑制、情绪改变，如抑郁等。故寻找另外的抗病毒途径显得迫 切和重要。近年来第二代核苷类似物的应用为乙型肝炎(乙肝)治疗开辟了新的 前景，已在世界范围获准治疗慢性乙肝的拉米夫定(lamivudine)就是这类药物 的代表。拉米夫定(2,3-双脱氧-3-硫代胞嘧啶，简称3TC)作为第一个获FDA批准的 口服抗病毒核苷类似物药物，其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程。其作用 机理是药物在细胞内经磷酸化后，与脱氧胞嘧啶核苷竞争，进入合成中的DNA 链、使其不能继续延伸而终止复制。其次，3TC还可竞争性地抑制HBV DNA聚合 酶。3TC对宿主细胞的DNA而言是一种相对较弱的抑制剂，并不使宿主细胞DNA 链终止。1999年国家药品监督管理局(SAD)批准拉米夫定在中国上市，国内肝病 专家遵照SAD批准文件，制定了《2000年拉米夫定临床应用指导意见》及《2001 年拉米夫定临床应用专家共识》用以指导临床医生用药。由此可见国内肝病专 家对拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的重视和认可。作为新一代核苷类抗病毒药物， 拉米夫定以其口服方便、高效而备受欢迎，它可迅速改善临床症状，基本无不 良反应，但停药后症状易复发，长期用药会引起病毒针对该药的耐受。文献报 道持续用该药达9个月即可出现特异性的病毒DNA聚合酶区YMDD基序变异，用药l 年时耐药发生率约14%，变异株对该药敏感性大大降低，使得该药的应用受到 了限制。中药抗乙肝病毒的研究以抗病毒、保肝护肝、提高免疫力和抗纤维化为主， 一直受到国内医学界的重视。经过多年的实践，取得了一定的成果。许多清热 解毒药、清热利湿药等研究证明有抗病毒的作用。多种中药有效成分如五味子素、齐墩果酸等在保护肝细胞、改善肝功能、降低转氨酶等方面有显著的作用。猪苓多糖、冬虫夏草等可提高巨噬细胞吞噬功能，促进T淋巴细胞E玫瑰花结形 成和转化，激发多种与免疫和抗炎反应的生物活性因子的产生，显著诱导干扰 素产生，有利于乙肝病毒的清除。原儿茶酸对于心肌缺血和心肌梗死具有一定 的保护作用，而且还有一定的抗乙型肝炎病毒的作用。据对木瓜的脂溶性部分 中6种三萜类化台物抗HBV效果进行对比，发现原儿茶酸对于HBeAg的抑制率要高 于对HBsAg的抑制率，且其作用机制不同于其他几种化合物和目前广泛使用的核 苷类似物。进一步考察发现，原儿茶酸浓度为70Pg/mL时对H印G2. 2. 15细胞中HBV DNA的抑制率高达46. 54%。且叶下珠、丹参、五味子等抗HBV中药提取物中均含 有原儿茶酸，证明了其用于治疗乙肝的潜在价值。尽管中药制剂在乙肝的辅助 治疗、恢复肝功、调整免疫功能以及抗肝纤维化方面都取得了进展甚至于突破， 但是在解决乙肝的根本问题，即抗病毒治疗方面尚无重大进展。对于乙型肝炎病的治疗，无论西药还是中药，目前尚无一种完全有效的药 物抑制、杀灭病毒。寻找新的药物或药物组合以提高药物疗效，防止停药后复 发，减小给药剂量，克服由于长期用药而带来的药物毒性积累以及减少病毒的 耐药性，是目前慢性乙型肝炎治疗亟待解决的问题。发明内容本发明的目的是提供一种具有显著疗效且安全无毒副作用的抗乙肝病毒的 新的药物组合，以使乙肝患者的抗原转阴率显著提高，治疗效果好。本发明是这样实现的。本发明的中西药配伍组成为拉米夫定和原儿茶酸(1: 50 1: 100, w/fr)，拉米夫定用量0.05 5 Pg，原儿茶酸用量5 500 Pg，最佳中西药配伍组成为，拉米夫定原儿茶酸为l: 70 1: 90 (为质量比)。本发明的药物组合综合了拉米夫定和原儿茶酸在治疗乙型肝炎病的优势， 发挥优势互补，能够提高药物疗效，防止停药后复发，使药物剂量最小化，减 少药物毒性积累以及减少出现病毒耐药危险。本发明的效果是用下列HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的荧光定量PCR检测方法 进行评价的。主要步骤是(1) 细胞培养H印G2. 2. 15细胞用含10%胎牛血清、380 ug/mL G418、 100 ug/mL青霉素、 100 ug/mL链霉素的DMEM液，用5呢NaHC03调PH值至7. 2。将H印G2. 2. 15细胞 消化，配制成lX105个细胞/mL接种细胞培养板，24孔板每孔400uL 37°C， 5 XC02培养24h，弃培养上清液，换用含不同药物浓度的培养液。每2天换用含 同等药物浓度的新鲜培养液；实验共进行8d，第8天末检测药物对细胞的毒性 并收集培养上清液，-2(TC保存；由同一人同批试剂盒进行HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的荧光定量PCR检测。(2) HBsAg检测1. 取包被微孔反应条，固定于塑料框架上，加标本50化/孔，阴、性对照 50叱(或1滴)/孔各两孔，同时留一孔不加作空白对照，随即加入测HBsAg酶结 合物50叱(或一滴)/孔，空白对照不加。2. 置37t:烘箱孵育0.5小时，以保证最大包被量。3. 小心移去孔内液体，拍干；用蒸馏水将洗涤液作l: 20倍稀释，注满各 孔，停留30秒后弃去，如此反复洗涤6次，每次均拍干。避免孔间交叉污染。4. 加底物液50叱(或一滴)/孔，随即加显色液50ML (或一滴)/孔，37 'C显色10分钟。5. 加终止液50ML (或一滴)/孔，终止反应。6. 立即用450nm波长空白校零点，分别测定阴阳性对照及标本的OD值； 当有异常值出现时，应采用双波长测定，参考波长为630 nm。(3) HBeAg检测1.取包被微孔反应条，固定于塑料框架上，加标本50叱/孔，阴、性对照 (或1滴)/孔各两孔，同时留一孔不加作空白对照，随即加入测HBsAg酶结合物50PL (或一滴)/孔，空白对照不加。2. 置37匸烘箱孵育0.5小时，以保证最大包被量。3. 小心移去孔内液体，拍干；用蒸馏水将洗涤液作l: 20倍稀释，注满各 孔，停留30秒后弃去，如此反复洗涤6次，每次均拍干。避免孔间交叉污染。4. 加底物液50叱(或一滴)/孔，随即加显色液50叱(或一滴)/孔，37 "C显色10分钟。5. 加终止液50叱(或一滴)/孔，终止反应。6. 立即用450nm波长空白校零点，分别测定阴阳性对照及标本的OD值； 当有异常值出现时，应采用双波长测定，参考波长为630nm。(4) HBV DNA的荧光定量PCR测定 用深圳市匹基生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增 (PCR)荧光定量检测试剂盒测定HBV的DNA量。1. 培养液样品的处理取培养液100叱，加到0.5mLEP管中，加入IOO叱 DNA提取液1，振荡混匀，13 OOOrpm离心10min，弃上清(离心时注意固定离 心管方向，尽可能弃上清但不碰沉淀)，再加入25PL DNA提取液2，振荡混匀， 2000rpm离心10sec， IO(TC干浴或沸水浴10min， 13， OOOrpm离心10min，保 留上清备用(如样本裂解产物当天不使用，则要保存在一2(TC)。2. 扩增前的准备从试剂盒中取出HBV PCR反应液、Taq酶及UNG，室温 融化并振荡混匀后，2000rpm离心10sec。设所需要的PCR反应管数为(n二样本 数+2管阳性对照+ 1管强阳性对照+ 1管临界阳性对照+4管阳性工作标准 品)，每个测试反应体系的配制是，PCR反应液17. 8叱，Taq酶0. 2uL，UNG 0. 计算好各试剂的用量，加入一适当体积离心管中，充分混匀，2000rpm离心 10sec，向设定的几个PCR管中分别加入上述混合液18叱。3. 加样若样品及对照裂解产物保存在一2(TC，使用前置室温解冻以 13000rpm离心5min。阳性工作标准品使用前置室温解冻，振荡混匀，2000rpm离心10sec。向所设定的n个PCR反应管中分别加入处理过的样品，阳性对照，强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳性工作标准品各2化(其中阴性 对照作2管)，盖紧管盖，将PCR反应管转移到PCR仪，记录样品的排放顺序。4. 反应条件设置在荧光定量PCR仪上设置的扩增条件为37°C， 5min， 94°C， lmin， 95°C， 5sec， 60°C， 30sec, 50个循环，反应体系为加叱。荧光 信号收集设定为Fam荧光素。将阳性工作标准品设为STAN并输入拷贝数，待测 样本和对照品设为UNKN，开机进行扩增。5. 结果分析取3 — 15个循环的荧光信号作为检测仪进行结果分析时基线。 阈值设定设定原则以阈值线刚好超过正常阳性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且"值=40.0为准。本发明基于一种新的抗乙肝病毒药物组合。该药物组合能明显提高拉米夫 定对乙肝病毒抗原的抑制效果，显著降低拉米夫定单一用药时的毒副作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。 实施例一HBsAg检测(按步骤(2)中的操作)原儿茶酸5(￥g/mL时对HBsAg抑制 率为27. 3%;拉米夫定0. 5Pg/mL时对HBsAg抑制率为30. 8%;原儿茶酸50Pg/mL 联合拉米夫定0. 5ixg/rnL时对HBsAg抑制率为50. 4%。实施例二HBeAg检测(按步骤(3)中的操作)原儿茶酸5Pg/mL时对HBeAg抑制率 为17. 6%;拉米夫定0. 05Pg/mL时对HBeAg抑制率为11. 0%;原儿茶酸5Pg/mL 联合拉米夫定0. 05Pg/mL时对HBeAg抑制率为34. 3%。实施例三HBVDNA的荧光定量PCR测定(按步骤(4)中的操作)原儿茶酸5(￥g/mL 时对HBV DNA抑制率为16. 9%;拉米夫定0. 05M<g/mL时对HBV DNA抑制率为53. 5%; 原儿茶酸5(￥g/mL联合拉米夫定0. 05Pg/mL时对HBV DNA抑制率为61. 4%。
权利要求
1、一种新的抗乙肝病毒的药物组合，其特征在于中西药配伍组成拉米夫定/原儿茶酸的质量比为1∶50～1∶100，且通常拉米夫定用量0.05～5μg，原儿茶酸用量5～500μg。
2、 根据权利要求1所述的一种新的抗乙肝病毒的药物组合，其特征在于最佳中西药配伍组成为拉米夫定/原儿茶酸的质量比为1: 70 1: 90。
全文摘要
本发明提供了一种具有更显著疗效且安全无毒副作用的抗乙肝病毒药物组合，以使乙肝患者的抗原转阴率显著提高。以HepG2.2.15细胞为靶细胞，在细胞生长液中加入适当浓度配制的拉米夫定、原儿茶酸以及拉米夫定和原儿茶酸的配伍制剂。常规培养并采用ELISA法检测该细胞分泌的HBsAg和HBeAg，并用荧光定量PCR测定HBV DNA的含量，以计算抑制率的方法判定药物抗HBV的作用，以确定药物组合的抗乙肝病毒的疗效及配比。其配比为拉米夫定/原儿茶酸为1∶50～1∶100(为质量比)，且通常拉米夫定用量0.05～5μg，原儿茶酸用量5～500μg。该药物组合能明显提高拉米夫定对乙肝病毒抗原的抑制效果，显著降低拉米夫定单一用药时的毒副作用。
文档编号A61K31/506GK101224209SQ20081004679
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者吴建国, 张晓雷, 朱文婷, 王恒松, 勇 陈, 韩凤梅 申请人:湖北大学