专利名称：巴马丁在治疗西尼罗病毒感染药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，更具体涉及一种巴马丁在制备治疗或预防抗西尼罗病毒感染药物中的应用。
背景技术：
西尼罗病毒(West Nile Virus,丽V)于1937年在非洲的乌干达首次被发现，从西尼罗地区的一位发热的成年妇女血液中分离到，因此得名西尼罗病毒。其广泛分布于非洲，欧洲，澳大利亚，亚洲以及西半球的美国，加拿大，墨西哥，加勒比和中美洲以及南美洲，主要引起西尼罗河热。鸟是该病毒的存贮宿主，是该病毒的主要传染源，蚊子是该病毒的传播媒介。目前，已经从很多鸟类体内检査到该病毒，蚊子叮咬感染鸟类后，病毒在蚊体内经过10-14天的时间便存在于蚊的唾腺中，可以经由叮咬其他动物或人类而传播病毒，病毒进入动物或人的血液后，会透过血脑屏障进入脑内，引发脑炎。目前一般使用对西尼罗病毒敏感的哺乳动物细胞系来分离病毒。目前还没有针对WNV感染的特效治疗药物，同时也没有批准上市的人用西尼罗病毒疫苗。因此，对于抗西尼罗病毒的药物的开发和人用西尼罗病毒疫苗的研究是十分紧急和迫切的任务。中国目前尚未发现WNV感染的临床病例，但是这并不能使我们放松对该病毒的警惕，因为中国的气候、地理环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，同时随着国际交流的日益频繁，WNV传入中国境内的可能性非常大。另外，中国每年都有相当数量病因不明的病毒性脑炎病例，由于国内对WNV的研究还没有深入的研究。因此，也不能完全排除已存在丽V感染病例的可能性，对WNV应提高警惕。
因此，我们应该高度重视这些病原，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种巴马丁在制备治疗或预防西尼罗病毒感染药物中的应用，以WNV编码的丝氨酸蛋白酶为对象进行体外的药物筛选，研究结果显示黄连水提取液对丝氨酸蛋白酶具有较强抑制效果，在5g/L (药物质量/溶液体积)浓度下，其对蛋白酶的抑制率达到99.179L同时，来源于黄连的有效成分巴马丁在100 M浓度下对这些病毒抑制率分别为97. 71%。巴马丁在浓度分别为100 M条件下，Vero细胞的存活率为92. 93%。巴马丁能够有效地抑制西尼罗病毒，但是对细胞没有毒性，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案-
巴马丁来源于中药黄连，是黄连的主要成份之一，目前，巴马丁已经在临床上用于治疗妇科炎症,菌痢，肠炎，呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。
A. NS3蛋白的体外表达
采用原核表达的方式在￡ co7/BL21 (DE3)(美国AMERSHAM)中表达WNV编码的NS3蛋白，对表达的NS3蛋白进行纯化，同时用蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白的浓度，分装后于-7CTC保存。
B. 体外筛选体系
NS3蛋白能特异性的识别底物pERTKR-細C (R&D Systems公司)，同时能对pERTKR-AMC进行切割，因此在激发波长为380 nm和发射波长为460 nm下，通过荧光读取仪读取值。将药物与NS3蛋白作用30分钟，然后加入底物，检测激发波长为380 nm和发射波长为460 nm的值。
C. 巴马丁对Vero细胞的毒性实验
Vero细胞是WNV的易感细胞。因此，本实验首先检测巴马丁对Vero细胞的细胞毒性，以不同浓度的巴马丁作用于Vero细胞，来了解在细胞存活率为90%以上的巴马丁的最大使用浓度，为后续的巴马丁对WNV的抑制作用实验提供参考数据。
D. 巴马丁对WNV的抑制实验以不同浓度的巴马丁作用于已经感染了 WNV的Vero细胞，来获得巴马丁对病
毒的抑制效率。本实验中的巴马丁的使用浓度均在使Vero细胞在90%以上存活率的浓度的范围内，因此，可以排除巴马丁的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。
一种巴马丁在作为制备治疗或预防西尼罗病毒感染药物中的应用，其基本过 程是
A、 NS3蛋白的表达和纯化
将质粒pWNVNS2BNS3 (参考文献Niklaus HM， Changsuek Y， Vannakambadi KG， Padmanabhan R. INT J BIOCHEM CELL B (2007) 39: 606-614.)转入￡ BL21 (DE3)(美国認ERSHAM)，用接种环接种于含30吗/ml Kan (美国AMRESCO)的固 体LB培养基，待长出单菌落后，挑取单菌落接种于含30 pg/ral Kan的液体LB培养 基中，培养12h，置2 8 。C过夜(12-16 h)，次日将2 8i:过夜的菌液按iy。(v/v) 接种于l L新鲜的含30 p g/ml Kan的LB液体培养基中扩大培养至0D6。。为0. 60时， 加终浓度为O. 5咖ol/L的IPTG (美国Sigma)，在16 。C培养16 h;将菌液以8000 r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体，在_70 。C过夜，然后加入20 ml结合缓冲 液[20 mM Tris-HCl (美国AMRESCO) ， 0. 5 M NaCl (国药集团化学试剂有限公 司)，5 mM Imidazole (美国AMRESCO)， pH 7.9)， 4 。C振荡l h后，用超声波充 分破碎。破碎的溶液在4 'C环境下经20，000 g，离心30 niin,收集上清。使用 His-BindKits (美国Novagen公司)来纯化蛋白，对纯化的蛋白进行透析，然后 使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测蛋白的浓度，分装 成小管后置-7(TC保存备用。从而获得纯化的NS3蛋白。
B、 以NS3为靶标的体外筛选体系
以10 mM Tris-HCl, pH 8.0， 20% (v/v) glycerol (国药集团化学试剂 有限公司)为反应的缓冲体系，整个反应的体积为0. 1 mL [蛋白酶的终浓度为5 g/L，底物pERTKR-AMC (腿D Systems公司)的终浓度为50 M ]。称取5 g 黄连，加入10 mL无菌去离子水，煎煮30 min,然后10000 g离心5 min，弃沉 淀，收集上清,于-70 。C保存备用。巴马丁购自于成都曼思特生物科技有限公司， 黄连购自于北京同仁堂武汉大药房。
实验步骤将中药黄连水提取液和巴马丁分别与NS3蛋白混合，于室温 (20-25'C以下相同)作用60min,然后加入底物。对照不加药物，在激发波长 ( " excitation wavelength) 为 380 nm禾口发射波长(柳，emission
5wavelength)为460 nm的条件下使用Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, USA)读取值。
表1黄连水提取液和巴马丁对NS3蛋白的抑制作用
检测内容测量值
黄连水提取液530520521
巴马丁145711475415002
对照631296301163212
C.巴马丁对Vero细胞的毒性实验:
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是WNV的易感细胞。实验中的Vero细胞购买 于中国科学院上海生科院细胞资源中心；MTT试剂盒购于碧云天生物技术研究 所；胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)购买于美国GIBCO公司；细胞培养板购 买于德国Greiner bio one公司；DMEM培养基和MEM培养基购买于美国 GIBCO公司。
实验步骤如下
1:接种Vero细胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个细 胞悬液，以每孔1000—10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100
2:培养Vero细胞在37°C, 5% (v/v) C02培养条件下，培养2天； 3:加入巴马丁吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100pl用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0nM,0.4nM， 1.2^M, 3,7jiM, ll|aM,33pM, 100|aM,300 nM)的巴马丁，对照孔加不加含10% (v/v) 胎牛血清的DMEM培养基100
4-呈色培养48小时后，每孔加MTT溶液10 pi,在37 °C， 5% (v/v) C02 培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37 °C， 5% (v/v) C02 培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现fomiazan全部溶 解；
5.测量在570nm测定吸光值。表2不同浓度的巴马丁对Vero细胞的毒性实验
Concentration(nM)OD570 nm
00.7880.7670.834
0.40.8100.7380.764
1.20.7420.8020.812
3.70.7340.7460.758
110.7540細0,747
330.7390.7630.766
1000.7180.7470.753
3000.6310.6960.674
D、巴马丁对WNV的抑制实验；
以Vero细胞为培养病毒WNV的细胞，MOI为0.1 ，实验步骤如下-在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖 孔底的面积约为80-卯％)，吸出培养基，接入病毒样品200 nl， 37 。C吸附2小 时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。 加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0 0.4 pM， 1.2 3.7 jaM, 11 ^M， 33 ^M, 100 )liM)的巴马丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培 养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。
病毒噬斑实验在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细 胞覆盖孔底的面积约为80-90%),吸弃各孔中的培养基，接入用含3% (v/v)胎 牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200pl, 37°C吸附2小时。吸 附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10% (v/v) FBS的DMEM培养基洗去未 吸附的病毒。加入新鲜的45。C预热的半固定培养基[A成分3% (v/v) FBS， 2xMEM培养基，青霉素(美国AMRESCO)和链霉素(美国AMRESCO)终浓度分 别为100U/ml， 0.1mg/ml; B成分1% (w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。 A成 分B成分-l: 1 (v/v)]，于37。C、 5% (v/v) C02的培养箱中培养48 72小 时。待噬斑形成后用结晶紫(美国AMRESCO)染色(2。/。 (w/v)结晶紫溶于10% 甲酲)，2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的 细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaque formation unit噬斑形成单位)。PFU-病毒稀释度xP/V， (P:空蚀斑数目；V:接种 量)。在2次不同的时间进行实验。表3不同浓度的巴马丁对WNV滴度降低实验
ConcentrationOiM) Viral titer (108 PFU/mL)
03428
0.42824
1.22421
3.71814
11"10
333.42.7
1000.720.69
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
本发明利用体外建立的以WNV的NS3丝氨酸蛋白酶为耙标的药物筛选平 台，筛选具有抑制NS3丝氨酸酶活性的药物。丝氨酸蛋白酶对WNV的成熟具 有十分重要的作用，该酶的生物学活性如果被抑制，病毒将不能存活。因此，以 该酶为靶标进行抗该病毒的药物筛选，具有十分现实的意义，目标明确，能够有 效地节约时间和减少药物筛选的工作量。巴马丁来源于中药黄连，获取十分方便， 由于中药是中国重要的自然资源，具有很强的民族特色，而且一些报道也显示 中药在预防和治疗一些疾病的过程中发挥着重要的作用。中药在一定程度上能有 效地增强机体的免疫力，毒副作用较小甚至无毒副作用，同时，由于巴马丁已经 用于临床治疗妇科炎症,菌痢，肠炎,呼吸道及泌尿道感染,外科感染等。鉴于巴马丁 在临床上已经使用多年，因此，其临床使用很安全性。
黄连的水提取液对NS3丝氨酸酶的抑制率达到99.17%。同时，来源于黄连 的有效成分巴马丁在100 ^M浓度下对这些病毒抑制率分别为97.71%。巴马丁在 浓度分别为100 ^M条件下，Vero细胞的存活率为92.93%。巴马丁能够有效地 抑制西尼罗病毒，但是对细胞没有毒性，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起 的疾病的药物，具有广泛的应用前景。
图l蛋白的表达和纯化
1、蛋白质Marker (Fermentas); 2.纯化后的蛋白，蛋白大小约为36 kDa 图2黄连水提取液和巴马丁对NS3丝氨酸蛋白酶的抑制作用 1、巴马丁；2.黄连水提取液反应体系为100pL,巴马丁，黄连水提取液在反应中的终浓度分别为355 pM， 5 g/L，对丝氨酸蛋白酶的抑制率分别为76.59%, 99.17%。 图3巴马丁对Vero细胞的毒性实验
巴马丁对Vero的细胞毒性实验，在0 kiM， 0.4 1.2 3.7 |iM, 11 pM, 33 ^M, 100 ^M, 300 浓度下，Vero细胞的平均存活率分别为100%, 96.87%, 98.70%, 93.77%, 96.56%,95.04%， 92.93%,83.88%。 图4巴马丁对WNV的抑制作用
巴马丁对WNV的抑制作用，在0iiM, 0.4 iaM， 1.2 pM， 3.7 (aM, 11 ^M， 33 liM，lOO pM浓度下，分别在不同的时间进行实验，病毒的滴度分别为3.4X109 PFU/mL, 2.8 X109 PFU/mL, 2.4 X109 PFU/mL, 1.8 X109 PFU/mL， 1.1 X109 PFU/mL, 3.4X 108 PFU/mL， 7.2X 107 PFU/mL和2.8X 109 PFU/mL, 2.4X 109 PFU/mL, 2.1 X 109PFU/mL， 1.4X109 PFU/mL, 1.0X109 PFU/mL, 2.7X108 PFU/mL， 6.9X107 PFU/mL，其平均抑制率分别为0%, 15.97%, 27.21%, 48.53%, 65.97%, 90.18%, 97.71%。
图5巴马丁的结构和分子式
中文名巴马丁，英文名Palmatine，分子式C21H22N04 ，分子量352.40， CAS 号3486-67-7。
具体实施例方式
本发明中所用的LB培养基的制备方法为配制1L的用量:蛋白胨10g酵母 抽提物5gNaCl 10g调pH值至7.0-7.2.分装后于121。C灭菌15 min。 实施例1:
一种巴马丁在作为制备治疗或预防西尼罗病毒感染药物中的应用，其步骤是 B、 NS3蛋白的表达和纯化
将质粒pET28a-WNV-NS2BCF44NS3 (编码有NS3基因，由美国Wadsworth center的石沛勇博士惠赠，基因和质料必须写明文献的出处，不能写惠赠)转入 co//BL21 (DE3)(美国AMERSHAM)，用接种环接种于含30 pg/ml Kan (美国 AMRESCO)的固体LB培养基，待长出单菌落后，挑取单菌落接种于含30 pg/ml Kan的液体LB培养基中，培养12h,置2 8 。C过夜(12-16h)，次日将2 8X:过 夜的菌液按1% (v/v)接种于l L新鲜的含30ng/mlKan的LB液体培养基中扩大培养至OD6oo为0.60时，加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG (美国Sigma)，在16 。C培养 16 h;将菌液以8000r/min离心10分钟，弃上清，收集菌体，在-70 。C过夜，然后 加入20ml结合缓冲液[20mMTris-HCl (美国AMRESCO) ,0.5MNaCl (国药 集团化学试剂有限公司)，5 mM Imidazole (美国AMRESCO)， pH 7.9)， 4 。C振荡l h后，用超声波充分破碎。破碎的溶液在4 。C环境下经20，000g,离心30min，收 集上清。使用His-BindKits (美国Novagen公司)来纯化蛋白，对纯化的蛋白进 行透析，然后使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)检测蛋白 的浓度，分装成小管后置-7(TC保存备用。从而获得纯化的NS3蛋白。结果见图l。
B、 以NS3为靶标的体外筛选体系
以10 mM Tris-HCl, pH 8.0， 20% (v/v) glycerol (国药集团化学试剂有限公 司)为反应的缓冲体系，整个反应的体积为0.1mL[蛋白酶的终浓度为5iag/L， 底物pERTKR-AMC(R&D Systems公司)的终浓度为50 pM ]。称取5 g黄连，加 入10 mL无菌去离子水，煎煮30 min，然后10000 g离心5 min,弃沉淀，收集上 清，于-70 'C保存备用。巴马丁购自于成都曼思特生物科技有限公司，黄连购自于 北京同仁堂武汉大药房。
实验步骤将中药黄连水提取液和巴马丁分别与NS3蛋白混合，于室温 (20-25°C)作用60 min，然后加入底物。对照不加药物，在激发波长(Xex， excitation wavelength)为380 nm禾卩发射波长(Xem， emission wavelength)为460 nm的条件下使用 Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, USA)读取值。结果见图2。
C. 巴马丁对Vero细胞的毒性实验
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是WNV的易感细胞。 实验步骤如下
1:接种Vero细胞用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基配成单个 细胞悬液，以每孔1000—10000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积
歸pi;
2:培养Vero细胞在37'C,5。/。
(v/v) C02培养条件下，培养2天； 3:加入巴马丁吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100^用 含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(0!iM,0.4ixM, 1.2(xM,
103.7 nM, 11 33 ^M, 100 jiM, 300 |aM)的巴马丁，对照孔加不加含10% (v/v) 胎牛血清的DMEM培养基100
4:呈色培养48小时后，每孔加MTT溶液IO 在37 °C, 5% (v/v) C02 培养条件下继续孵育4小时，然后加入Formazan溶解液，在37 。C, 5% (v/v) C02 培养条件下继续孵育4小时，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶 解；
5. 测量在570nm测定吸光值。
6. 实验结果见图3。
D、巴马丁对WNV的抑制作用
以Vero细胞为培养病毒WNV的细胞，MOI为0.1 ，实验步骤如下 1.在24孔细胞培养板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层(细胞 覆盖孔底的面积约为80-90%)，吸出培养基，接入病毒样品200^d， 37 C吸附2 小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。 加入用含10% (v/v)胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(0 pM, 0.4 ^M, 1.2 ^M， 3.7岸，11 pM， 33 ^M， 100 ^M)的巴马丁，于37 。C、 5% (v/v) C02的培 养箱中培养42小时，收集各个孔中的上清，做病毒噬斑实验。
2. 病毒噬斑实验在24孔板中接入Vero细胞，24小时后细胞长至单层 (细胞覆盖孔底的面积约为80-90%)，吸弃各孔中的培养基，接入用含3% (v/v)
胎牛血清的DMEM培养基10倍系列稀释的病毒样品200pl， 37°C吸附2小时。 吸附完成后将各个孔的上清板吸弃，用10% (v/v) FBS的DMEM培养基洗去 未吸附的病毒。加入新鲜的45'C预热的半固定培养基[A成分3% (v/v) FBS， 2xMEM培养基，青霉素和链霉素终浓度分别为100U/ml， 0.1 mg/ml; B成分 1% (w/v)的琼脂糖(法国Biowest)。 A成分B成分4: 1 (v/v)]，于37°C、 5% (v/v) C02的培养箱中培养48 72小时。待噬斑形成后用结晶紫(美国 AMRESCO)染色(2% (w/v)结晶紫溶于10% (v/v)甲醛)，2小时后用流水冲 去结晶紫和琼脂糖，在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑，根据噬斑数和稀释倍数 计算病毒的滴度(PFU/ml， PFU: plaque formation unit噬斑形成单位)。PFl^病 毒稀释度xP/V， (P:空蚀斑数目；V:接种量)。
3. 实验结果见图4。
1权利要求
1、一种巴马丁在制备治疗或预防西尼罗病毒感染药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种巴马丁在制备治疗或预防西尼罗病毒感染药物中的应用。巴马丁对西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)具有很好抑制作用，巴马丁在100M浓度下对这些病毒抑制率分别为97.71％。而巴马丁在浓度分别为100M条件下，Vero细胞的存活率为92.93％。巴马丁能够有效地抑制西尼罗病毒，但是对细胞没有毒性，可进一步开发为治疗这些病毒感染引起的疾病的药物，具有广泛的应用前景。
文档编号A61K31/4375GK101596194SQ20091006316
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月14日 优先权日2009年7月14日
发明者晶 李, 石沛勇, 蔡全信, 袁志明, 凡 贾, 罡 邹, 郑大胜, 闫建平 申请人:中国科学院武汉病毒研究所