专利名称：：连翘酯苷在制备抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及连翘酯苷的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
：化疗是目前治疗癌症的一个重要手段，化疗药物在杀死癌细胞的同时，对机体正常细胞也存在毒性。近年来，随着抗癌新药的不断涌现，联合化疗方案的合理应用，化疗的疗效有了较大的提高，但这些药物同时对正常组织器官有损害或毒性作用，从而降低机体免疫功能，出现骨髓抑制等一系列毒副反应，影响化疗的疗效，甚至迫使化疗终止。临床研究表明，在化疗时根据患者的体质、癌症分期以及出现的毒副反应症状，辅以中药治疗，可有效地增强化疗的效果，又能在一定程度上避免或减轻放化疗的毒副反应，延长患者的生存期和生存质量。而中药作为我国得天独厚的资源，在对肿瘤化疗增效减毒方面具有独特的优势，它既能促进造血功能恢复；又提高机体免疫功能；还能防治胃肠道反应；有些药物还具有明显的抗肿瘤作用，因此从我国传统的天然药物中筛选具有对化疗减毒增效的药物具有十分重要的意义。当今，艾滋病(AIDS)已成为人类十大主要死因之一。AIDS的防治是世界范围内的研究热点。自齐多夫定(AZT)——第一个治疗HIV感染/AIDS药物于1987年被美国FDA批准上市后，抗AIDS药物的研究发展突飞猛进，而蛋白酶抑制剂(PI)引入临床后，迅速降低血浆HIV病毒载量和疗效突出，延缓了AIDS的进展。但仍无法解决艾滋病所致的各种并发症，其中包括动脉粥样硬化等严重影响病人生存质量的疾病，同时长期的临床观察也发现PI类药物可引起诸多严重的副作用，包括引起胆固醇含量增高，动脉粥样硬化形成等，因此，建立新的有效防治方法，寻找新的有效防治艾滋病并发症、降低抗艾滋病药物副作用的新药，成为未来艾滋病防治中的新焦点。由于目前常用的降脂药，存在包括横纹肌溶解等副作用，不适用于艾滋病患者用于调节血脂和预防动脉粥样硬化形成，国内外尚无有效方法应对。我国几千味传统的天然药物历经数千年临床，为寻找有效预防药物提供了丰富的药源，因此从天然传统药物中筛选治疗或辅助治疗艾滋病的药物不仅是可行的，而且是经济的。连翘为木犀科连翘属植物连翘的干燥果实，味苦，无毒，性微寒，具有清热止吐、清肝利胆、除湿退黄、通调三焦、畅达血脉、保肝护心等作用，临床应用广泛。连翘酯苷目前己有研究人员将其制备成冻干粉针，用于抗流感病毒、合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒等，但未见关于连翘酯苷用于抗艾滋病病毒的研究，也未见报到连翘酯苷可以改善抗艾滋病药物所导致的副作用。此外关于连翘酯苷与化疗药合用，增加化疗药疗效，降低化疗药毒性的研究均未见有关报道。本发明提供连翘酯苷作为一种新的化疗药及抗艾滋病药的增敏减毒剂，用于抗肿瘤、抗艾滋病的辅助治疗。
发明内容本发明针对上述问题提供连翘酯苷在制备抗肿瘤及抗艾滋病的辅助治疗药物中的用途，用连翘酯苷制备的药物对化疗药的抗肿瘤及抗艾滋病作用具有明显的协同增效作用，且可降低化疗药引起的血细胞下降、肝、肾损伤等副作用。本发明提供的技术方案是连翘酯苷在制备抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物中的应用。上述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病敏减毒药物为有效剂量的连翘酯苷与药用载体和/或赋形剂的组合物。上述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病敏减毒药物为口服制剂。上述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病敏减毒药物为注射剂。本发明可将连翘酯苷与药用载体和/或赋形剂制得药用组合物。所制得的药用组合物用于抗肿瘤或抗艾滋病的辅助治疗，具有疗效好，副作用少等优点。建议临床用量一天两次口服，每次1-100mg连翘酯苷，注射用连翘酯苷一天一次，每次1-100mg。图1为连翘酯苷对抗艾滋病蛋白酶抑制剂引起泡沫细胞形成的保护作用(油红0染色图)；图l说明A:空白对照组；B:利托拉韦组；C:利托拉韦+连翘酯苷10txg/ml组；D:利托拉韦+连翘酯苷2"g/ml组；E:利托拉韦+连翘酯苷0.4yg/ml组具体实施例方式本发明通过以下实施例作进一步说明实施例l:组合物由连翘酯苷(购自上海医药工业研究院，下同)1100克、纤维素400499克制成1000粒。其制备方法为将连翘酯苷与纤维素制粒，然后压片或灌装胶囊，每粒(片)含连翘酯苷1-100mg。实施例2:1100克连翘酯苷加注射用水至1升，分装成1000支制得。其制法为将连翘酯苷溶于注射用水中，加至1升，灭菌，分装。每支含l-100mg连翘酯苷。连翘酯苷抗肿瘤增效减毒作用研究一、连翘酯苷与化疗药联用协同抗肿瘤作用研究(一)实验方法将实验组分为两大组化疗药顺铂处理组(1)正常对照组；(2)顺铂模型组(10Ug/ml);(3)顺铂+连翘酯苷1组(顺铀10ixg/ml+连翘酯苷10ug/ml);(4)顺铂+连翘酯苷2组(顺柏10ug/ml+连翘酯苷2ug/ml);(5)顺铂+连翘酯苷3组(顺铂10ug/ml+连翘酯苷0.4ug/ml);(6)顺铂+连翘酯苷4组(顺铂10ug/ml+连翘酯苷0.08ug/ml);所有药物浓度均为终浓度。未经化疗药顺铂处理组(1)正常对照组；(2)连翘酯苷高剂量组(连翘酯苷10ug/ml);(3)连翘酯苷高剂量组(连翘酯苷2iig/ml);(4)连翘酯苷高剂量组(连翘酯苷0.4yg/ml);(5)连翘酯苷高剂量组(连翘酯苷0.08ug/ml);所有药物浓度均为终浓度。MTT法测定药物对S180细胞生长的抑制作用，计算协同指数收集对数生长期的S180细胞，种于96孔培养板每孔1X105个细胞，置5%0)2培养箱24h后，加入药物经48h后，除去培养液，每孔加入lOOngMTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazoliumbromide]，37'C温育4h，去上清液，加入150u1DMSO溶解，振荡10min混匀，测定波长490nm的吸光值(A)，计算抑制率。药物联合作用评价两药相互作用指数(coefficientofdruginteractionCDI)的计算公式为CDI=AB/(AXB)。体外试验是根据活细胞数(吸光值)进行计算。体内治疗试验是根据瘤重进行计算。AB为两药联用组与对照组吸光值的比值；A或B是各药物单独使用组与对照组吸光值的比值。当CDK1时两药有协同作用；当CDI〈0.7时，协同作用非常显著；如CDP1，则两药作用性质为相加；如CDIM，则两药作用性质为拮抗。数据以x土S表示，均数比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，数据分析采用SPSS10.0统计软件。(二)实验结果实验结果表明，单独使用顺铂对S180细胞的抑制率为59.9%，而与连翘酯苷联合作用时，抑制率明显提高，CDI均小于1，有协同作用。表l连翘酯苷与顺铂协同对S180细胞增殖的影响(>±S，<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、连翘酯苷对化疗药减毒作用研究(一)实验方法取本室自行传代57d，生长良好的乳白色腹水，以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液，细胞数为5乂106个，以0.2ml/只接种。小鼠接种72h以后随机分成5组，每组8只。分为(O空白对照组(ig/ipbid生理盐水)；荷瘤组(ig/ipbid生理盐水)；荷瘤鼠+顺铂组(ip顺铂4mg/kg)联合给药组(2)连翘酯苷高剂量组(ip4mg/kg顺铂，igbid10mg/kg连翘酯苷)；(3)连翘低剂量组(ip4mg/kg顺铂，igbid2mg/kg连翘酯苷)；阳性组(ip4mg/kg顺铂，igbid5mg/kg香菇多糖)。7天后处死动物，摘眼球采血，分两管，其中一管EDTA-2K抗凝，分别用于生化功能检测与全血细胞分析。抽取小鼠腹水并称重；取肝脏、肾脏、胸腺并称重。实验数据用均数士标准差(》士S)表示，两样本均数的比较用t检验，多组间比较采用方差分析，数据分析采用SPSS10.0统计软件。(二)实验结果1.对化疗药致S180荷瘤小鼠死亡率的影响由表2-1、2-2可见，腹腔注射化疗药顺铂对荷瘤小鼠的机体有重大的损伤，表现为各组生存率的不同，荷瘤鼠+顺铂组的生存率只有50%，而连翘酯苷高剂量组的生存率达到100%，其低剂量组的生存率亦有87.5%，可以看出连翘酯苷可以在整体上提高化疗小鼠的存活率。表2-1口服连翘酯苷对化疗药致S180荷瘤小鼠死亡率的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2-2注射连翘酯苷对化疗药致S180荷瘤小鼠死亡率的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.对腹水瘤小鼠腹水生成量的影响由表3-1、3-2可见，与荷瘤组相比，连翘酯苷各剂量组与阳性组腹水生成量均呈显著下降(P〈0.01)，其中连翘酯苷高、低剂量联合用药组对化疗药的药效没有拮抗作用。表3-1口服连翘酯苷对S180腹水瘤小鼠腹水生成量的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3-2注射连翘酯苷对S180腹水瘤小鼠腹水生成量的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与荷瘤鼠组相比*<0.05，*叩<0.013.对化疗药致S180荷瘤小鼠全血细胞变化的影响由表4-1，4-2可见，荷瘤鼠+顺铂组全血wbc(白细胞)、lym(淋巴细胞、)rgb(红细胞)、hgb(血红蛋白)、rtg(网织红比例)水平与对照组相比明显降低，连翘酯苷高、中剂量组、阳性组全血中白细胞水平与模型组相比明显升高，高剂量组的rbc(红细胞)、hgb(血红蛋白)与荷瘤鼠+顺铂组相比有极显著明显差异。表4-1口服连翘酯苷对化疗药致S180荷瘤小鼠全血细胞变化的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>与荷瘤鼠+顺铂组相比fP〈0.05,**P<0.01;与正常组相比AP〈0.05，"P<0.01表4-2注射连翘脂苷对化疗药致S180荷瘤小鼠全血细胞变化的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>与荷瘤鼠+顺铂组相比伞P〈0.05，**P<0.01;与正常组相比"〈0.05，"P<0.014.对化疗药致S180荷瘤小鼠肝、肾功能的影响由表5-l、5-2可见，荷瘤鼠+顺铂组血浆alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)、bun(尿素氮)、CREA(肌苷清除率)水平与对照组相比显著升高(P〈0.01);与荷瘤鼠+顺铂组相比，连翘酯苷高剂量组及阳性组ALT、BUN、CREA、BUN水平明显降低(P〈0.01)，其中低剂量组血清ALT、BUN较荷瘤鼠+顺铂组相比明显降低(P<0.05)。表5-1口服连翘酯苷对化疗药致S180荷瘤小鼠肝肾功能的影响组别ALTASTCREABUN正常鼠37.5±3.5128±106.22±0.7022.4±1.2荷瘤鼠257±20"253士19.3"5.06士0.20"21.3±2.7荷瘤鼠+顺铂378±23"328±6.4"14.1士2.9"40.2士9.0"荷瘤鼠+顺铂+连翘酯苷高152±20**153±16"8.60±1.8**19.1±3.8**荷瘤鼠+顺铂+连翘酯苷低244±21*271±30*10.4±1.729.6±2.9*荷瘤鼠+顺铂+香菇多糖177±21.8**181士16.7"7.68±1.4*20.2±3.5**与荷瘤鼠+顺铂组相比承P〈0.05，**P<0.01;与正常组相比Ap〈0.05,"P〈0.01表5-2注射连翘酯苷对化疗药致S180荷瘤小鼠肝肾功能的影响组别ALTASTCREABUN正常鼠35.8±1.3123±146.02±0.2021.4±3.9荷瘤鼠297士10.1"250±29"5扉0.10"20.3±2.6血荷瘤鼠+顺铂590士7.1"394±32"13.7士2.8"39.8±9.9A荷瘤鼠+顺铂+连翘酯苷高58.3±1.1**174±23**8.23±1.4**18.9±3.2**荷瘤鼠+顺铂+连翘酯苷低142±8.1*196±20**10.3±1.6*19.3±2.8**荷瘤鼠+顺铂+香菇多糖162±19**207±10*6.45+0.70**19.1士3.1"与荷瘤鼠+顺铂组相比承P〈0.05,**P<0.01;与正常组相比AP〈0.05，"P〈0.01三、结论综上所述，通过体内、体外研究可见，连翘酯苷与化疗药物合用具有协同抗肿瘤作用，并能明显降低化疗药引起的死亡率，改善化疗药所致的肝肾功能损伤和骨髓抑制，提示连翘酯苷具有化疗治疗过程中的减毒增效之功效。连翘酯苷抗HIV病毒及减轻抗HIV病毒药物副作用研究一、连翘酯苷抗HIV病毒作用研究(一)实验方法细胞融合每孔加入50ul处于对数生长期的MT-2细胞(细胞浓度2X107ml)，同时设单独的MT-2细胞对照(正常细胞对照)。37'C孵育2h。在倒置荧光显微镜下观察细胞的融合。细胞死亡的保护作用上述融合细胞计数后37'C再培养5d，离心96孔细胞培养板,细胞沉淀做MTT检测，计算保护率。保护率二(实验组OD值-病毒对照组OD值)/(MT2细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)X100%(二)实验结果可见连翘酯苷可保护HIV致感染细胞的死亡。结果见表6。表6.连翘酯苷对HIV致感染细胞死亡的保护作用组别浓度(叱/ml)OD保护率％HIV病毒空白组一0.841±0.2110.00MT/R细胞空白组-1.218±0.135一顺铂+连翘酯苷1组101.114±0.23172.4顺铂+连翘酯苷2组21扁±0.16763.4顺铂+连翘酯苷3组0.40.928±0.19123.1顺铂+连翘酯苷3组0.080.895±0.14914.4二、连翘酯苷抗利托拉维致巨噬细胞泡沫化作用研究动脉粥样硬化形成中巨噬细胞的作用单核细胞迁入内皮下间一激活一分化成巨噬细胞；OX-LDL、OX-Lp(a)与巨噬细胞表面的清道夫受体结合而被摄取一形成泡沫细胞(foamcell)—泡沫细胞聚集一形成脂纹，内皮隆起及变形一SMC大量增生，穿插于巨噬细胞源性泡沫细胞之间，产生胶原、弹性纤维及蛋白多糖一成为纤维斑块一纤维斑块逐渐演变为粥样斑块。由此可见巨噬细胞泡沫化是形成动脉粥样硬化的关键歩骤，有效抑制这一过程的物质，将有望成为抗动脉粥样硬化新药。(一)实验方法实验分组空白对照组；利托拉韦组(10Ug/ml);利托拉韦+连翘酯苷高浓度组(10Ug/ml);利托拉韦+连翘酯苷中浓度组(2"g/ml);利托拉韦+连翘酯苷低浓度组(0.4ug/ml)。取小鼠腹腔巨噬细胞，接种于96孔培养板每孔1X1()5个细胞，置5%)2培养箱24h后，空白对照组加入相应体积的培养基，给药组加入相应浓度的药物，经24h后，除去培养液，乙醇固定，油红0染色，光镜观察。(二)实验结果由实验结果可见，抗HIV药物利托拉韦，可明显引起巨噬细胞的泡沫化，连翘酯苷能明显抑制这一过程，结果见附图l。(三)结论连翘酯苷对HIV致细胞感染死亡有明显的保护作用；对抗HIV药物利托拉韦引起的巨噬细胞泡沫化有明显的抑制作用，表明连翘酯苷可用于抗艾滋病的辅助治疗。权利要求1.连翘酯苷在制备抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物中的应用。2.根据权利要求l所述的应用，其特征是所述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物为有效剂量的连翘酯苷与药用载体和/或赋形剂的组合物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物为口服制剂。4.根据权利要求2所述的应用，其特征是所述抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物为注射剂。全文摘要本发明涉及连翘酯苷在制备抗肿瘤化疗增敏减毒药物或抗艾滋病增敏减毒药物中的应用。本发明可将连翘酯苷与药用载体和/或赋形剂制得药用组合物。所制得的药用组合物用于抗肿瘤化疗增敏减毒或抗艾滋病增敏减毒，具有疗效好，副作用少，提高患者生存质量等优点。文档编号A61K31/7028GK101342185SQ20081004877公开日2009年1月14日申请日期2008年8月12日优先权日2008年8月12日发明者虹丁,谢燕莺,陆伟根申请人:武汉大学