专利名称：：一种胸腺素alphal(Tal)类似物及生产工艺和医用途的制作方法
技术领域：
：本发明公开一种胸腺素alphal(Tal)类似物及生产工艺和医用途，通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造，得到了具有更强生物学活性的天然蛋白类似物，属于重组蛋白质药物生产领域。
背景技术：
：胸腺素a1(简称Ta1)是一种免疫活性肽，它主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，可增加T细胞表面Thy-l,Thy-2.3和Lyt-1.2.3表达，能促进T淋巴细胞的增殖，提高淋巴细胞产生干扰素和白介素2等细胞因子的能力，提高机体抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素al是一种重要的免疫调节剂和增强剂。临床上主要作为原发性或继发性免疫功能缺陷病，肿瘤和慢性活动性肝炎的免疫调节剂，其安全性和有效性已经超万例临床应用所证实，长期使用，无蓄积性，无抗原性，并得到国内外相关领域专家的公认。文献表明，Tal是通过与其特异性受体结合从而产生特定的生物学效应，如果加强T(U及其相应受体间的结合力，有利于提高Tal的生物学效应，本研究针对Tal和其相应受体的三维结构进行了计算机模拟分析，分析结果表明Ta1的11位氨基酸位点Ile突变为Val，可以使Tal与其受体的结合力增强，从而有可能提高Tal的体内外生物活性。针对上述结果，本发明构建了第11位突变为Val的Ta1类似物表达菌株，通过发酵，纯化得到了该类似物纯品，并对其进行了体内外生物学活性的研究。
发明内容本发明目的在于公开一种胸腺素alphal(Tal)类似物，为新的重组蛋白。本发明还公开胸腺素alphal(Tal)类似物的生产工艺，通过基因工程重组表达的方法获得。本发明另一目的是提供了胸腺素alphal(Tal)类似物医用途。本发明公开的胸腺素alphal(Tal)类似物(SEQIDN0:1)，其氨基酸序列为01-19:Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys20-28:Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。本发明的Ta1类似物是通过基因工程重组表达的方法获得的，包括如下步骤1)表达载体的构建依据Ta1类似物氨基酸序列(SEQIDN0:1)，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tal类似物DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5'端和3'端加上限制性酶切位点，并进行N—末端修饰(加入EK酶酶切位点)，得到编码Tal类似物的核酸序列。再分别将如上述制备的Ta1类似物序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系，经转化、筛选得到正确的重组子；用限制性酶切下重组子的融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的Pharmacia公司质粒pGEX连接，经筛选得到正确的重组子。2)重组Ta1类似物的表达及分离纯化将上述所含pGEX质粒的重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，离心收集目的蛋白高表达的菌体。高压均质破碎菌体并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用EK酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，得Tal类似物，最终目的蛋白纯度大于98%。一、对重组Ta1类似物的体外生物活性测定用E玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2X107ml。各取200ii1细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品Ta1类似物与阳性对照品日达仙(天然Ta1)，37。C水浴90分钟，每支EP管中加入200tU绵羊红细胞(2X107ml)，4'C放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。按以下公式计算激活率。激活率=样品管药结百分比一对照药结百分比x100%对照管百分比经测试，本发明生产的Ta1类似物体外生物活性大于天然Tal。二、重组Tal类似物的体内生物活性测定动物模型的建立取7周大的雌性Balb/C小鼠(每组6只)连续10天腹膜内注射0.2mL含25mg/kg的5-FU生理盐水，同时分组注射30ug/kg的测试样品Ta1类似物、30ug/kg的日达仙以及生理盐水，10天后分离胸腺细胞做流式细胞仪分析CD4+、CD8+细胞数。流式细胞仪分析新分离的胸腺细胞中加入抗CD4、CD8抗体，阴性选择获得的CD4—CD8—细胞中加入羊抗鼠Smo抗体，用FACScan流式细胞仪分析，CellQuest软件。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述试验结果可以得出结论，本发明得到的Tal类似物，在单位剂量的条件下体内外生物活性明显优于天然Tal.因此，本发明Tal类似物与天然的Tal相比具有较强的免疫增强功能，可以制备相应的提高免疫力的药物。本发明的积极效果在于提供的Tal类似物为一种新的重组蛋白，与天然的Tal相比具有更高的生物活性，可以最终取代Tal的化学合成，从而减少由于化学合成生产Tal给自然界带来的污染。图1为免疫后动物的阳转率。图2为抗体消长规律图。具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1.胸腺素al前体蛋白表达质粒的构建与工程菌的获得首先通过全基因和成扩增出Ta1类似物蛋白的全基因序列，设计如下:ggatccI(;at(;a(:(;atga(:.w;"ItcggatgcggccgtgBariHl酶切位点GATACCTCGTCGGAAACCACGAAAGATCTGAAAGAAAAAAAGGAAGTGGTTGAAGAGGCGGAAAATTAATGAGAATTCf:(:()R:i目的片段经BamHI、EcoRI双酶切后分别回收小片段，质粒PGEX经BamHI、EcoRI双酶切后回收大片段，14'C在T4连接酶体系中两段目的基因片段进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PGMT。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LA中培养至OD600为0.6-0.8时加入IPTG0.lmM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15%SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为菌体可溶性蛋白的35%。经胸腺素al的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达胸腺素al前体蛋白的工程菌命名为PGMTal/BL21。2.发酵1).摇瓶表达含胸腺素al前体蛋白基因的PGMTal/BL21，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37°C，200rpm)，再按1:30接种含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37。C培养3小时后，加入O.lmMIPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素al融合蛋白(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体可溶性蛋白的40%。2)发酵工艺a.培养基a)种子液培养基(LA):胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升、氨苄青霉素100微克/毫升。b)培养基(15升):磷酸氢二钠375克、磷酸二氢钾80克、氯化钠10.克、氯化铵45克、胰蛋白胨50克。以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。硫酸镁15克、葡萄糖150克、补料(500克/升)葡萄糖b.发酵过程(a)种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LA中，37度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LA中，36度、200转/分，过夜。(b)发酵过程将培养好的种子液(0D柳产3-4)加入罐中，调好各参数，37度、150转、溶氧100%,开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，加入终浓度0.3mM的IPTG诱导(五小时)。3.层析(l)亲和层析采用GSH-Agrose层析介质(Sigma公司)，平衡液采用25慮Tris-HC1，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上GlutathioneS印harose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。(2)酶解上一步的洗脱液加入EK酶(5NIHU/mL)37。C酶切20小时。(3)阴离子交换层析采用Source30Q层析介质，平衡液为20mMPB，pH7，上一步得到的样品用水稀释l倍进行上样，平衡后采用20mMPB，pH7，O—lMNaCl，20个柱体积的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。4.检测得到的胸腺素al通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，得Tal类似物，纯度均大于95%。胸腺素alphal(Tal)类似物(SEQIDN0:1)，其氨基酸序列为01-19:Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys一Asp—Leu—Lys—Glu—Lys20-28:Lys-Glu-Val-Va:L-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。5.体外活性检测E玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试基础细胞培养液1640基础培养基10.0g，NaHCQ.,2.2g，H印es5.9g，丙酸钠0.llg，0.05M巯基乙醇2.0ml，ddH2O1000ml;细胞培养基基础细胞培养基90ml,小牛血清IOml，双抗(青霉素+链霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml;测活培养基基础培养基95ml小牛血清5.0ml，双抗及谷胱甘肽浓度与上相同。过滤灭菌；裂解液SDS10g,，DMSO25ml,ddH2019ml，调PH=4.7。方法首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2X10Vml。各取200ii1细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品Ta1类似物与日达仙，37。C水浴90分钟，每支EP管中加入200u1，绵羊红细胞(2X107ml)，4。C放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。按以下公式计算激活率。激活率=样品管药结百分比一对照药结百分比X100%对照管百分比样品对E玫瑰花结形成率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>N=5，林P〈0.01,与对照比由上表可知，Tal类似物可显著提高人外周血淋巴细胞E玫瑰花结形成数量，且作用大于日达仙(天然的Tal)。6.免疫增强试验动物模型的建立取7周大的雌性Balb/C小鼠(每组6只)连续10天腹膜内注射0.2mL含25mg/kg的5-FU生理盐水，同时分组注射30ug/kg的测试样品Ta1类似物、30ug/kg的日达仙以及生理盐水，10天后分离胸腺细胞做流式细胞仪分析CD4+、CD8+细胞数。流式细胞仪分析新分离的胸腺细胞中加入抗CD4、CD8抗体，阴性选择获得的CD4—CD8—细胞中加入羊抗鼠Smo抗体，用FACScan流式细胞仪分析，CellQuest软件。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述试验结果可以得出结论，本发明得到的Tal类似物，在单位剂量的条件下体内外生物活性明显优于天然Tal.因此，本发明Tal类似物与天然的Tal相比具有较强的免疫增强功能，可以制备相应的提高免疫力的药物。7.用于制备疫苗佐剂的应用实验-免疫小鼠BALB/c，雌性，4-6周(19-21g)免疫用犬瘟热病毒(CDV)为本室从疫苗中分离并保存的弱毒株。以步骤1制备的纯度为99%的胸腺素a1突变体作为佐剂，免疫小鼠。120只BALB/c小鼠随机分为4组，每组30只。各组的免疫方案如下(1)佐剂对照组胸腺素al类似物组，30ng/只；(2)病毒对照组CDV，20TCID50/只;(3)低剂量佐剂组20TCID50CDV+30ng胸腺素al类似物/只；(4)高剂量佐剂组20TCID50CDV+300ng胸腺素al类似物/只。以戊巴比妥钠麻醉小鼠后，按照上述方案肌肉注射病毒或病毒佐剂混合物免疫动物，程序为2次免疫，即初次免疫后的第14天加强免疫。自初次免疫后，每隔14天采血并分离血清，细胞中和法检测抗CDV中和抗体效价。抗体消长情况如图2所示。结果表明，低剂量胸腺素al突变体起到了明显的佐剂作用，能够显著增加小鼠的CDV抗体效价，与病毒对照组差异显著。高剂量佐剂组亦具有明显的佐剂作用，抗体水平于初免后14天达到了最高点，不过随后即呈下降趋势。以抗CDV抗体效价》1:%时作为抗体阳转的标准，计算不同方案组免疫后动物的阳转率，见图1。结果表明，低剂量佐剂组初次免疫后14天的CDV阳转率为83.3%，加强免疫后14天(即初免后第28天)，CDV阳转率为86.6%;高剂量佐剂组初次免疫后2周的CDV阳转率为83.3。/。，加强免疫后28天，CDV阳转率为73.3%。低剂量佐剂组小鼠的CDV滴度与不加胸腺素佐剂的犬瘟热的相比，差异显著(P《0.05)。说明低剂量胸腺素不仅显著提高犬瘟热免疫小鼠的阳转率，而且增强犬瘟热小鼠的抗体滴度。权利要求1、一种胸腺素alpha1(Ta1)类似物(SEQIDNO1)，其氨基酸序列为01-19Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Val-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys20-28Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。2、权利要求1所述胸腺素alphal类似物的多核苷酸序列。3、权利要求l中的胸腺素alphal类似物制备方法，包括一下步骤1)表达载体的构建依据Ta1类似物氨基酸序列，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Ta1类似物DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序列之5'端和3'端加上限制性酶切位点，并进行N—末端修饰，加入EK酶酶切位点，得到编码Ta1类似物的核酸序列；再分别将如上述制备的Ta1类似物序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系，经转化、筛选得到正确的重组子；用限制性酶切下重组子的融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的Pharmacia公司质粒pGEX连接，经筛选得到正确的重组子；2)重组Td1类似物的表达及分离纯化将上述所含pGEX质粒的重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基因工程菌，然后经发酵，离心收集目的蛋白高表达的菌体；高压均质破碎菌体并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用EK酶酶切后，再将样品通过阴离子柱进一步纯化，得Tdl类似物，最终目的蛋白纯度大于98%。4、权利要求1所述的胸腺素alphal类似物在制备治疗免疫力低下及病毒病药物中的应用。全文摘要本发明公开一种胸腺素alpha1(Ta1)类似物及生产工艺和医用途，通过对天然蛋白的分子设计与基因工程改造，与天然的Ta1相比具有更高的生物活性，可以最终取代Ta1的化学合成，从而减少由于化学合成生产Ta1给自然界带来的污染，用于制备治疗免疫力低下及病毒病药物。文档编号A61K38/32GK101302252SQ20081005044公开日2008年11月12日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者李树民,禹江,赵翠波申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所