专利名称：：一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物，属药物领域。
背景技术：
：龋病是人类最常见的感染性疾病之一，而粘附于牙面的菌斑则是致病菌生存代谢、致病的主要环境。变形链球菌为牙菌斑中的优势菌，具有很强的产酸、耐酸能力，是主要的致龋菌，也是口腔内的正常菌群[1,2]。目前用于预防或/和治疗龋齿的药物主要有氟化物和醋酸氯己定。氟化物机理为抑制釉质、牙本质脱矿，促进其再矿化；抑制致龋菌生长代谢。氟化物主要通过影响牙菌斑内微生物的代谢，作用于细菌本身从而降低其致龋性[3]，比如抑制细菌的糖酵解，干扰致龋菌对糖的摄入，作用于H十/ATPase破坏细胞内环境的稳定等，是目前公认的一种有效防龋剂。研究发现15(^g/ml的NaF能降低变形链球菌的活性，而9500pg/ml的NaF能在5min内杀死变形链球菌，约300600(xg/ml的NaF在18h内都有抑菌活性[4]。氟还可以同时作用于牙齿硬组织促进再矿化[5-6]，广泛应用于口腔预防领域以减少龋病的发生，但氟化物应用时其浓度往往较高，适宜和安全总摄入量0.05…0.07mg/公斤体重，抑制细菌的生长为100-250mg/L，杀死细菌的浓度为1000mg/L，平均致死剂量为4-5g,婴儿的致死剂量为0.25g,成人致死剂量为5-10g，在临床使用中，NaF的浓度低于10(Hig/ml时，没有药效，临床使用没有意义，但过多摄入会导致其并发证如氟牙症、氟中毒等的发生[7]，可导致耐氟菌株产生，因此在临床应用中，除了考虑其药效外，还必须考虑其安全问题。醋酸氯己定为广谱抗菌剂，有抗菌斑作用。其副作用味苦及长时间使用可使牙齿及舌背黏膜着色，可引起口腔菌群失调。牙菌斑是一种典型的生物膜，后者是自然界绝大部分细菌的存在形式，主要由细菌和其分泌的胞外基质组成。胞外多糖是生物膜胞外基质的主要组成成分，具有多种生物学功能使细菌易于黏附于固体表面；促进生物膜的形成和发展；与生物膜内细菌的耐药性密切相关；在疾病的发生和细菌共生聚集形成中起重要的作用[8-12];等等。因此胞外多糖被认为是一种重要的致病因子。口腔链球菌族合成的胞外多糖主要是葡聚糖，根据胞外多糖对水的溶解性可分为以a-l，6糖苷键为主的水溶性多糖(water-solubleglucan，WSG)和以a-l，33糖苷键为主的碱溶性多糖，即水不溶性多糖(water-insolubleglucan,WIG)[13-14]。有学者根据各自的特性将去除生物膜的方法分为以下几大类l.机械去除；2.抗菌剂的使用；3.清除生物膜生长的必需物质；4.抑制微生物的黏附；5.促进脱黏附[15]。其中机械去除和抗菌剂的使用是目前最常用的方法。机械的方法对于一些不能达到的部位该方法就难以实施且无法完全清除生物膜。抗菌剂的使用可能导致菌群失调和细菌耐药性的产生，从而效果不理想。去除微生物生长物质的办法是不可能实现的。从粘附的角度控制生物膜则被认为是很有前景的方法。比如减少多糖的合成，抑制细菌的粘附与集聚。01ofsson[16]等报道，N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)能减少.细菌的粘附使细菌从钢丝表面脱落，该制剂作用于与多糖合成和分泌相关的酶从而减少EPS的合成，导致细菌黏附减少；一种酸果蔓果实的提取物NDM则能抑制GTF和FTF的活性从而影响细菌黏附[17]。而促进脱粘附的的研究目前很少，但已有一些文献报道如放线伴放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)dspB基因的产物DspB蛋白，能水解N-乙酰葡萄糖胺的卩-1,4糖苷键，使细菌从已形成的生物膜菌落上脱落并致使菌落之间的解聚[18];又如增强粘液型铜绿假单胞菌8830藻酸盐裂解酶(alginatelyase)的表达能导致藻酸盐的降解和促进细菌的脱离[19]。研究发现自然界中一部分微生物包括真菌和细菌能够合成一种葡聚糖酶-右旋糖苷酶(Dextranase，Dex)，该酶能够切断a-l,6糖苷键，降解a-l,6葡聚糖。该酶应用比较广泛，比如在制糖工业中被用于降低多糖的分子量从而降低糖的粘性；在血液替代品制造中用于控制右旋糖酐的水解；并且该酶能够增强某些抗菌药物的疗效[20]。而在控制口腔菌斑生物膜方面研究发现Dex不仅能够使水溶性多糖合成减少，也能使水不溶性多糖的合成减少[21];Dex能有效的阻止葡聚糖的聚集，使水不溶性多糖对玻璃表面的黏附性下降，加入Dex降解掉a-l，6葡聚糖后，只有很少量的远缘链球菌(S.sobrinus)会黏附于固体表面，但降解掉a-l，3葡聚糖，远缘链球菌对固体表面的黏附没有改变[22];由穗霉菌(Spicariaviolacea)合成的DextranaseAD17作用于变形链球菌生物膜，轻轻振荡后生物膜极易脱落[23]。变形链球菌本身也能合成Dex，研究认为该酶对于变形链球菌本身的作用在于一方面，分解葡聚糖，为细菌提供能源；另一方面，在细菌多糖合成的过程中，修饰葡聚糖的结构和控制多糖的量，通过改变a-l,6和a-l，3糖苷键的比例从而调节多糖的水溶性和黏性[25~27]。那么在多糖合成的过程中，加入外源性的Dex，必将改变细菌合成的多糖的性质，使生物膜的结构发生改变。Hamada等[23]用扫描电镜观察Dex作用下，变形链球菌周围无定形的荚膜状物质消失。MghirAS[35]等的研究中认为，Dex能增强替马沙星(Temafloxacin)对实验性链球菌性心内膜炎的疗效的原因在于Dex降解掉胞外多糖使其赘生物变小利于抗菌药物的渗透，致病菌暴露；埋于生物膜内的细菌代谢活性较低，而胞外多糖的减少即营养的缺乏使细菌代谢率发生改变，对抗菌药物的敏感性提高。目前尚无将Dex与氟化物联合使用，用于预防或/和治疗龋齿。
发明内容本发明的技术方案是提供了一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物，它是由右旋糖酐酶和氟化钠为活性成分组合制备而成。本发明还提供了该药物组合物的制备方法。本发明提供了一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物，它是由右旋糖酐酶和氟化钠为活性成分制备而成，其中每毫升中含有NaF10-80pg，含右旋糖酐酶1-4U。超过此NaF浓度，药物将单独发挥作用，且药物剂量偏大，具有了明显的毒副作用。其中，每毫升中含有NaF10-80pg，右旋糖酐酶1-2U。进一步优选地，每毫升中含有NaF80pg，右旋糖酐酶1U。本发明药物组合物是由每毫升中含有NaF、右旋糖酐酶为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分制备成口腔常用的固体制剂或液体制剂。其中，所述的制剂为糊剂或含漱剂。本发明还提供了一种制备该药物组合物的方法，它包括如下步骤a、称取活性成分NaF、右旋糖酐酶；b、将右旋糖酐酶溶于20mM磷酸盐缓冲液中，pH6.0，制成存储液，其.中含右旋糖酐酶100U/ml;c、配成混合溶液，使NaF的终浓度为10-80pg/ml，右旋糖酐酶的终浓度为l-4U/ml，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分。通过试验证明，右旋糖酐酶能抑制变形链球菌单菌种生物膜的初期形成，且能降解成熟的生物膜的胞外多糖，破坏其结构；低浓度的氟化钠对生物膜的初期形成以及成熟生物膜的作用不大；右旋糖酐酶与氟化钠联合应用效果优于二者单独作用，具有协同增效的作用。其中，所述的低浓度的氟化钠是低于临床使用剂量的氟化钠，如10-80pg/ml。本发明药物是将低于临床剂量的氟化钠与Dex联合应用，减少了氟化钠的用量，在其亚抑菌浓度即可起到抑制菌斑生物膜的作用，有效增强了氟化物防龋效果，减少了氟化物的毒副作用，从控制胞外多糖的角度控制生物膜以及在降低氟化物毒性的同时提高其作用效果方面提供了实验依据和临床选择。5图1:空白对照组CLSM观察变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大).图2:空白对照组CLSM观察变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图3:CLSM观察Dex(lU/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图4:CLSM观察Dex(1U/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图5:CLSM观察Dex(2U/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图6:CLSM观察Dex(1U/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图7:CLSM观察Dex(4U/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图8:CLSM观察Dex(4U/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图9:CLSM观察NaK80(ig/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图10:CLSM观察NaF(80pg/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图11:CLSM观察NaF(160pg/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图12:CLSM观察NaF(160pg/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图13:CLSM观察NaF(320pg/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图14:CLSM观察NaF(320ng/ml)作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图15:CLSM观察NaF80|ig/ml+DexlU/ml作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图16:CLSM观察NaF80pg/ml+DexlU/ml作用下变形链球菌早期生物膜的结构(2520倍放大)图17:CLSM观察NaF40pg/ml+DexlU/ml作用下变形链球菌早期生物膜的结构(200倍放大)图18:空白对照组CLSM观察成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图19:空白对照组CLSM观察成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图20:CLSM观察Dex(lU/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图21:CLSM观察Dex(1U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图22:CLSM观察Dex(2U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图23:CLSM观察Dex(2U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图24:CLSM观察Dex(4U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图25:CLSM观察Dex(4U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物.膜的结构(2520倍放大)图26:CLSM观察NaF(80pg/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图27:CLSM观察NaF(80pg/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图28:CLSM观察NaF(160pg/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图29:CLSM观察NaF(160pg/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图30:CLSM观察NaF(320|ig/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图31:CLSM观察NaF(320pg/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图32:CLSM观察NaF80jig/ml+Dex(1U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(200倍放大)图33:CLSM观察NaF80^ig/ml+Dex(1U/ml)作用下成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构(2520倍放大)图34:NaF对Dex酶活性的影响具体实施例方式实施例1本发明药物的制备a、原料按下述表格配伍b、将右旋糖酐酶溶于20mM磷酸盐缓冲液中，pH6.0，制成存储液，其中含右旋糖酐酶100U/ml;c、配成混合溶液，使NaF、右旋糖酐酶的终浓度如下表所示，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分，制备成糊剂或含漱剂。NaF(叫/ml)Dex(U/ml)801401201以下通过体外实验证明本发明的有益效果。试验例1Dex与NaF协同作用试验材料与方法1、菌种与主要试剂和仪器变形链球菌(Streptococcusmutans25175)国际标准株，由口腔医学国家重点实验室微生物室提供右旋糖酐酶(dextranase，Dex，美国Sigma)溶于20mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中制成存储液(100U/mL)，4"C冰箱保存氟化钠(NaF，分析纯，成都天华科技股份有限公司)右旋糖酐T40(dextranT40，瑞典Phamacia公司)TSB(TrypticaseSoyBroth)液体培养基(英国Oxoid公司)BOBOTM-3(美国MolecularProbes公司)1:300(V/V)溶于PBS缓冲溶液(pH7.2)Calcofluor(美国Sigma公司)与10mM磷酸钠溶液(pH7.5)配制成10pg/ml的溶液同位素3H-胸腺嘧徒核苷(3H-TdR，中国科学院上海原子核研究所)HTS7000Plus多孔板高效分析仪(美国PE公司)激光共聚焦显微镜(CLSM，德国Leica,型号TSPSP2)2、菌液制备保存的菌种复苏、传代后，选用次代接种于TSB液体培养基中，80%N2、20。/。C02和37"C下厌氧培养18h，涂片检査为纯培养后，将菌液在4'C下以离心力750Xg离心15min，收集细菌，无菌生理盐水洗菌两次，用比浊仪将细菌浓度调整为1.0McFarland的标准菌液(相当于3X108个/ml)。3、NaF对Dex活性的影响采用DNS法检测酶活性[24]。排管5管，其中一管为空白管(不加NaF),加入NaF使其终浓度为80、40、20、10|ig/ml与Dex以及酶底物右旋糖酐T408在37i:共同孵育30min后，于540nm波长读数。4、Dex与NaF对变形链球菌生物膜初期形成的作用4.1激光共聚焦显微镜观察对生物膜初期形成的作用配制含1%蔗糖的TSB培养液，取4mL培养液于12孔无菌细胞培养板中，将标准的载玻片切割成l.Ocmxl.Ocm大小，置于含有各处理因素的培养液中，高压蒸汽灭菌。Dex酶为过滤消毒后加入灭菌后的培养液中。将准备好的菌液按1:9(V/V)接种于培养液中，80%N2，20%CO2，37。C下厌氧培养6h。取出玻片，用蒸馏水轻轻冲洗，BOBOTM-3与CalcofluorTM室温下混合孵育lh，再用蒸馏水冲洗，CLSM分别在红光(570602nrn)和紫外光(400490nm)条件下观察，连续断层扫描。利用CLSM图像软件分析系统分析图片，得到生物膜的断层扫描图像。4.2对生物膜初期形成时粘附的影响菌种复苏、传代，选用次代接种于含有5pCi/ml3H-TdR的无菌TSB液体培养基中，80%N2、20。/。C02和37。C下厌氧培养18h，细菌浓度调整如前。另取lmL无菌TSB培养液于(含有5pCi/ml3H-TdR)于无菌24孔细胞培养板中，每孔中置有高温消毒后的直径8mm的玻片。每组三个平行。按1:9(V/V)加入菌液。同样条件下厌氧培养6h，弃去培养基，取出玻片，蒸馏水冲洗两次后，闪烁计数。5、Dex与NaF对成熟变形链球菌生物膜的作用5.1CLSM观察对成熟生物膜的作用按1:9(V/V)加入准备好的菌液至灭菌后的含1%蔗糖的TSB培养液，80%N2、20。/。C02和37t:下厌氧培养24h待玻片上形成生物膜，更换含各处理因素的TSB培养基。同样条件下厌氧培养过夜(约12h)。染色及观察同上。5.2检测胞外多糖培养完毕后取出玻片，仔细反复刮取黏附于玻片上的生物膜，振荡溶于培养基中形成悬液。4。C下750xg离心30min，沉淀物加入2ml蒸馏水洗涤、离心2次，合并上清，即为水溶性多糖(简称WSG)。水洗后的细菌加入0.4mol/LNaOH溶液2ml洗涤、离心3次，合并上清即为水不溶性多糖(简称WIG)。每组6个平行。蒽酮法测定多糖含量。6、统计分析实验数据以釆用SPSS13.0软件包分析表示，选用单因素方差分析的LSD双侧检验在a=0.05的情况下比较各组之间的差异有无统计学意义。结果1、NaF对Dex酶活性的影响见图34。在NaF浓度在80pg/mll(^g/ml范围内，与空白对照(即NaF浓度为0ng/ml)相比较，加入NaF对Dex酶活性没有影响(p>0.05)。2、CLSM观察Dex和NaF作用下变形链球菌早期生物膜的结构见图1~图17。图1，图2:红光(570—602nm)和紫外光(400—490nm)激发下细菌呈为照片中的浅灰色部分，胞外多糖呈为灰色部分。6h变形链球菌生物膜多糖与生物膜相互包裹，呈团块状，菌落相互交联形成树枝状，有通道间于菌落团块之间。63倍油镜，4倍电子放大即2520倍放大进一步显示细菌相互黏附形成微菌落，也有单个散在的细菌，并与多糖相互包裹，呈一种以多糖为核心细菌镶嵌于其中的形式。图3，图4:与空白对照组相比，Dex(1U/ml)作用下6h变形链球菌生物膜结构有一定的破坏，较多散在的菌落，菌落之间的交联变少，仍有较大的团块存在，进一步放大观察见微菌落变小，有一部分细菌散在于多糖之外。图5，图6:Dex(2U/ml)作用效果与Dex(1U/ml)相似。图7，图8:Dex(4U/ml)作用下，生物膜结构破坏较前两个浓度更厉害，完全失去其树枝装结构，菌落之间没有交连，进一步放大显示更多细菌散落于多糖之外。图9，图10:在有NaF(8(Hig/ml)存在情况下，菌落仍呈团块和树枝交联状态，与空白组生物膜结构相似，2520倍放大显示，与空白对照组比较，细菌仍形成微菌落，且与块状的多糖几乎完全重叠，散在细菌较少。图11，图12:NaF(160^ig/ml)细菌不能形成典型的生物膜结构，与Dex(4U/ml)作用效果相似。油镜放大显示细菌仍与多糖相互包裹。图13，图14:NaF(320pg/ml)时几乎不见细菌以及多糖的图象，局部有微小团块，进一步放大显示在多糖团块周围有少量的细菌。图15图17:NaF8(Hig/ml+DexlU/ml组见，生物膜结构破坏明显，完全被崩解，典型的树枝状结构消失，呈一种"荒凉"的景象，较单用NaF(160pg/ml)及单用Dex(2U/ml)效果更明显。3、CLSM观察Dex和NaF作用于成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构见图18~图33。图18，图19:成熟生物呈现典型的网络状结构，细菌与多糖相互包裹。较大的菌落团块相互交联，有明显的通道、孔隙分布其间。2520倍放大进一步显示菌落呈典型的"蘑薛"状，菌落内部有仍有细小通道和孔隙存在(箭头)。图20，图21:成熟变形链球菌生物膜在酶的作用下，生物膜典型的网格状结构被部分破坏，团块较空白对照变小，但仍然有菌落之间的交联(箭头)。放大显示有散在的细菌，且有多糖网络结构的破坏(箭头)。10图22图25:与Dex(lU/ml)相比，Dex(2U/ml)及Dex(4U/ml)对成熟生物膜作用后，生物膜结构破坏更加明显，细菌菌落变小，菌落之间的交联断裂，进一步放大2520倍显示出现多糖与细菌不重叠的区域，更多细菌散在于多糖之外。图26，图27:低浓度的NaF(8(Hig/mi)对成熟的变形链球菌生物膜的作'用不明显，生物膜结构变化不大，照片中灰色表示的多糖部分仍交联形成网格状结构，并与照片中浅灰色表示的细菌部分重叠，细微结构与对照组相似。图28~图31:与低浓度的NaF(8(Hig/mi)相比，NaF160pg/mi及NaF320pg/ml作用于成熟生物膜后菌落呈较大团块，但进一步放大显示细菌微菌落变小，呈一种散在菌落小块的形式。多糖网络基本存在，但孔隙通道变小。图32、图33:NaF8(Hig/ml+Dex(lU/ml)作用下，已形成的变形链球菌单菌种生物膜结构被破坏，多糖网络之间的连接交联断裂、减少，菌落团块变小，进一步放大显示更多细菌散落于多糖之外。对成熟生物膜的破坏作用较单用NaFi60pg/ml强。4、对生物膜形成初期细菌粘附的影响见表l。表1Dex与NaF对变形链球菌单菌种生物膜形成早期黏附的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>—*注a-Dex1U/ml，b-Dex2U/ml，c-Dex4U/mi,NaF中加酶量均为1U/mlDex(1U/ml、2U/ml)作用下变形链球菌生物膜初期形成时细菌黏附减少(p<0.05),而4U/mi时作用则不明显，各NaF+Dex组的细菌黏附明显减少(p<0.05)。NaF80、4(Hig/ml+DexlU/ml组对减少细菌黏附的效果优于单用1U/ml酶和单用40pg/ml及80pg/mlNaF(p<0.05)。NaF80ng/ml+DexlU/mi效果优于单用Dex2U/ml(p<0.05)，与单用NaF16(Hig/ml效果无明显差异(p>0.05)。抑制细菌黏附和聚集是控制生物膜的重要手段，Dex对细菌黏附的抑制作用并非呈简单量效关系，证明了生物膜结构的降解是多种因素综合作用的结果，要达到良好的预防和/或治疗龋齿的效果，同时又避免破坏口腔正常菌群，提高药物安全性，并非单一使用Dex或氟化物能够做到的，提示本发明的药物组合物在临床上极具应用前景。5、对成熟生物膜作用后多糖的含量见表2。表2Dex与NaF对成熟变形链球菌生物膜作用后胞外多糖的量(Xb)NaF(pg/mL)WIG(丄g/mL)WSG(ng/mL)WithoutDexWithDexWithoutDexWithDexa194.355±15.075112.560±8.538101.023±8.553073.329±1U330b—21.410±0.4329—47.362±0.9227c_17.493±1.7320—33.438±0.836510213.886±15.415107.916±4.069138.733±2.72235.811±1.34520217.791±14.50995.036±20.677121.980±14.99636.942il4.17440221.321±11.70296.934±19.004131.079±12.93143.572±4.83180199.450±10.94760.167±24.721124.195±27.12031.040±7.98816057.148±3.784—47.991±9.259一32027.4I8±2.264—122.540±8.765一*注a-Dex1U/ml，b-Dex2U/ml，c-Dex4U/ml，NaF中加酶量均为lU/ml通过上表数据，结合CLSM观察成熟变形链球菌生物膜后生物膜的结构图进行补充说明，结论如下低浓度NaF(10、20、40、80ng/ml)对已经形成的变链生物膜胞外水不溶性、水溶性多糖作用不大(p〉0.05)，而NaF浓度为160pg/ml、320|_ig/ml时胞外多糖含量明显减少(除了32(Hig/ml时的WSG);Dex能使生物膜胞外.多糖减少(p<0.05)。NaF80pg/ml+DexlU/ml对水不溶性多糖的作用强于单用lU/ml酶和80|iig/mlNaF(p<0.05);对水溶性多糖的作用甚至强于单用Dex2U/ml和单用NaF160pg/ml(p<0.05)。讨论上述实验的结果显示-与空白对照6h生物膜典型树枝状结构相比，Dex作用下生物膜结构有一定的破坏，较多散在的菌落，菌落之间的交联变少，但仍有较大的团块存在；NaF(80~10^ig/ml)单独作用情况下，菌落仍呈团块和树枝状，变化不大；而NaF浓度达到160pg/ml和32(^g/ml时有明显的抑菌性，菌液呈清亮状，细菌难以形成生物膜，活菌较少；各个浓度的NaF(80~10^ig/ml)+Dex(lU/ml)组生物膜结构都明显破坏，优于单用80~10pg/ml的NaF,菌落团块大部分呈.单个散在的形式，菌落之间几乎没有交联或连接很少，以80^ig/ml+Dex(lU/ml)组作用最明显，比单用NaF(160pg/ml)及单用Dex(2U/ml)效果更明显，与NaF320pg/ml时相似生物膜完全被崩解，典型的树枝状结构消失，局部散在微小的团块。对生物膜初期形成过程中细菌的黏附研究结果也表明，Dex(lU/ml、122U/ml)作用下变形链球菌生物膜初期形成时细菌黏附减少(p〈0.05)，而4U/m1.时作用则不明显，Dex作用于变形链球菌生物膜初期形成时细菌黏附并非呈简单的量效关系。各NaF+Dex组的细菌黏附明显减少(p<0.05)。NaF80、40pg/ml+DexlU/ml组对减少细菌黏附的效果优于单用1U/ml酶和单用40pg/ml及80ng/mlNaF(p<0.05)。NaF80pg/ml+DexlU/ml效果优于单用Dex2U/ml(p<0.05)，与单用NaF160pg/ml效果无明显差异(p〉0.05)。对成熟生物膜的观察显示空白对照组36h成熟生物膜呈现典型的网络状结构，有明显的通道、孔隙分布其间；Dex处理后的生物膜被部分破坏，团块变小，但仍然有菌落之间的交联；而NaF对己形成的变形链球菌生物膜的作用不明显，生物膜结构变化不大；NaF+Dex(1U/ml)作用下，已形成的变链生物膜结构被破坏，多糖"骨架"之间的连接交联断裂、减少，照片中浅灰色部分表示的细菌团块更为细小，其中NaF80^ig/ml+Dex(1U/ml)组效果最明显，菌落散在，菌落间的交联完全被破坏，对成熟生物膜的破坏作用较单用'NaF160|ig/ml强。对胞外多糖的检测结果显示，低浓度NaF(10、20、40、80pg/ml)对已经形成的变链生物膜胞外水不溶性、水溶性多糖作用不大(p>0.05)，而NaF浓度为160ng/ml、320pg/ml时胞外多糖含量明显减少(除了320pg/ml时的WSG);Dex能使生物膜胞外多糖减少(p<0.05)。NaF80^ig/ml+DexlU/ml对水不溶性多糖的作用强于单用1U/ml酶和80ng/mlNaF(p<0.05)，对水溶性多糖的作用甚至强于单用Dex2U/ml和单用NaF160ng/ml(p<0.05)。综上可知，预防或/和治疗龋齿需要考虑多方面的指标因素，NaF与Dex分别对变形链球菌早期生物膜、成熟变形链球菌生物膜、生物膜形成初期细菌粘附、成熟生物膜中多糖的含量的影响，并非简单推知具有量效关系，将NaF与Dex配伍使用，是否有协同作用或者发挥协同作用的用量，也非通过简单的临床剂量使用报道就可以推知配比用量。通过上述试验证明，本发明药物是将低于临床使用的有效剂量NaF(80~10^ig/ml)与Dex联合作用于形成的变形链球菌生物膜，对变形链球菌单菌种生物膜初期形成及形成过程中细菌的黏附和已经形成的成熟生物膜、胞外多糖的协同作用，效果明显优于单用低浓度NaF(80~10ng/ml)和单用Dex，与高浓度(160，320|ig/ml)NaF相似。本发明药物组合物预防或/和治疗龋齿的疗效与高浓度NaF相似，但是由于本发明药物组合物中NaF浓度很低(低于临床有效剂量)，避免了高浓度NaF所导致的毒副作用，保证了本发明药物组合物高效低毒，为控制口腔菌斑生物膜提供了一种新的药物制剂。参考文献(1)Loesche，WJ.RoleofStreptococcusmutansinhumandentaldecay.MicrobiolRev，1986，50(4):353-380.(2)BalakrishnanM，SimmondsRS，TaggJR.Dentalcariesisapreventableinfectiousdisease.AustralianDentJ,2000,45(4):235-245.(3)MaquisRE，ClockSA,Mota-Meira.Fluorideandorganicweakacidsasmodulatorsofmicrobialphysiology.FEMSMicrobiolRev,2003，26:493-510.(4)BrownLR,HandlerSF，HortonIM，etal.EffectofsodiumfluorideontheviabilityandgrowthofStreptococcusmutans.JDentRes,1980，59(2》159-167.(5)TenCateJM，FeatherstoneJDB.Mechanisticaspectsoftheinteractionsbetweenfluorideanddetalenamel.CritRevOralBiolMed，1991,2:283-296.(6)TenCateJM,BujisDamenJJM.PH-cyclingofenamelanddentinlesionsinthepresenceoflowconcentrationsoffluoride.EurJOralSci,1995,103:362-367.(7)WhitfordGM.Intakeandmetabolismoffluoride.AdvDentRes,1994,8(1):5-14.(8)DanesePN,PrattLA，andKolterR.ExopolysaccharideproductionisrequiredfordevelopmentofEscherichiacoliK-12biofilmarchitecture.JBacteriol,2000,182(12):3593-3596.(9)TsunedaS，AikawaH，HayashiH，etal.Extracellularpolymericsubstanceresponsible'forbacterialadhesionontosolidsurface.FEMSMicrobiolLett,2003,223(2):287-292.(10)SunNW，YoshimitsuM,AkemiT,etal.Vibriocholerae01strainTSI-4producestheexopolysaccharidematerialsthatdeterminecolonymorphology,stressresistance,andbiofilmformation.ApplEnvironMicrobiol,1998,64(10):3648-3655.(11)WangX，PrestonIIIJF，andRomeoT.ThepgaABCDlocusofEscherichiacolipromotesthesynthesisofapolysaccharideadhesionrequiredforbiofilmformation.JBacteriol,2004，186(9):2724-2734.(12)HentzerM，TeitzelGM，BalzerGJ，etal.AlginateoverproductionaffectsPseudomonasaeruginosabiofilmstructureandfUnction.Jbacterial,2001，183(18):5395-5401.(13)CuiyJA,RebeloMA，etal.Biochemicalcompositionandcariogenicityofdentalplaqueformedinthepresenceofsucroseorglucoseandfructose.CariesRes,2000,34(6):491-497.(14)HanadaN，andKuramitsuHK.IsolationandcharacterizationoftheStreptococcusmutansgtfDgene,codingforprimer-dependentsolubleglucansynthesis.InfectImmun，1989,57(7):2079-2085.(15)XavierJB,PicioreanuC，RaniSA，etal.Biofilm-controlstrategiesbasedonenzymicdisruptionoftheextracellularpolymericsubstancematrix-amodelingstudy.Microbiol,2005，151(Ptl2):3717画3832.(16)OlofssonAC，HermanssonM,andElwingH.N-acetyl國L-cysteineaffectsgrowth,extracellularpolysaccharideproductionandbacterialbiofilmformationonsolidsurfaces.ApplEnvironMicrobiol,2003,69(8):4814-4822.(17)SteinbergD,FeldmanM,OfekI,etal.CranberryhighmolecularweightconstituentpromoteStreptococcussobrinusdesorptionfromartificialbiofilm.IntJAntimicrobialAgent,2005，25(3):247-251.(18)KaplanJB,RagunathC,RamasubbuN,etal.DetachmentofActinobacillusactinomycetemcomitansbiofimcellsbyanendogenousP画hexosaminidaseactivity.JBacteriol，2003,185(16):4693匿4698.(19)BoydA,ChakrabartyAM.RoleofalginatelyaseincelldetachmentofPseudomonasaeruginosa.ApplEnvironMicrobiol,1994，60(7):2355-2359.(20)KhalikovaE,SusiP,UsanovN，etal.PurificationandpropertiesofextracellulardextranasefromaBacillussp.JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci，2003,796(2):315-326.(21)SchaehteleCF,StaatRH，HarlanderS.Dextranasefromoralbacteria:inhibitionofwater-insolubleglucanproductionandadherencetosmoothsurfacebyStreptococcusmutans.InfectImmun，1975，12(2):309-317.(22)HayacibaraMF,KooH,VaccaSmithAM,etal.Theinfluenceofmutanaseanddextranaseontheproductionandstructureofgluncanssynthesizedbystreptococcalglucosyltransferases.CarbohydRes,2004,339(12):2127國2137.(23)HamadaS，MizunoJ,MurayamaY，etal.EffectofdextranaseontheextracellularpolysaccharidesynthesisofStreptococcusmutans:chemicalandscanningelectronmicroscopystudies.InfectandImmun,1975，12(6):1415-1425.(24)JansonJC,andPorathJ.Abacterialdextranase.MethEnzymol,1966,8:615-621.(25)ColbySM，WhitingGC，TaoL,etal.InsertionalinactiviationoftheStreptococcusmutansdexA(Dextranase)generesultsinalteredadhereneceanddextranmetabolism.Microbiol,1995,141(Ptll):2929画2936.(26)ColbySMandRussellRR.SugarmetabolismbymutansStreptococci.JApplMicrobiol.SympSuppl，1997,26:80S-88S.(27)KhalikovaE,SusiP，KorpelaT.Microbialdetran-hydrolyzingenzymes:fundamentalsandapplications.MicrobiolMolBiolRes,2005,69(2):306-325.15(28)MorisakiH，IgarashiT,YamamotoA，etal.Analysisofadextran-bindingdomainofdextranaseofStreptococcusmutans.LettApplMicrobiol,2002,35(3):223-227.(29)KogaT，andInoueM.Effectofdextranaseoncelladherence,glucan-filmformationandglucansynthesisbyStreptococcusmutansglucosyltransferase.ArchoralBiol，1979,24(3):191-198.(30)EbisuS，MisakiA，KatoK，etal.Thestructureofwater-insolubleglucansofcariogenicStreptococcusmutans,formedintheabsenceandpresenceofdextranase.CarbohydrRes,1974,38:374-381.(31)KooH，ShengJY,NguyenPTM,etal.Co-operativeinhibitionbyfluorideandzincofglucosyltrasferaseproductionandpolysaccharidesynthesisbymutansStreptococciinsuspensionculturesandbiofilms.FEMSMicrobiolLett,2006,254(1):134-140.(32)SutherlandIW.Biofilmexopolysaccharide:astrongandstickyframework.Microbiol,2001，147(Ptl):3-9,(33)PatelR.Biofilmsandantimicrobialresistance.ClinOrthopRelatRes,2005,437:41-47.(34)JohansenC,FalholtP,GramL.Enzymaticremovalanddisinfectionofbacterialbiofilms.ApplEnvironMicrobiol,1997,63(9):3724-3728.(35)MghirAS,CremieuxAC，JambouR,etal.DextranaseenhancesantibioticefficacyinexperimentalviridansStreptococcalendocarditis.AntimicrobAgentsChemother,1994,38(5):953-958.权利要求1、一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于它是由右旋糖酐酶和氟化钠为活性成分制备而成，其中每毫升中含有NaF10-80μg、右旋糖酐酶1-4U。2、根据权利要求1所述的预防或/和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于:每毫升中含有NaF10-80吗，右旋糖酐酶1-2U。3、根据权利要求2所述的预防或/和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于:每毫升中含有NaF80吗，右旋糖酐酶1U。4、根据权利要求1-3任一项所述的预防或/和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于它是由每毫升中含有NaF、右旋糖酐酶为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成口腔常用的固体制剂或液体制剂。5、根据权利要求4所述的预防或/和治疗龋齿的药物组合物，其特征在于所述的制剂为糊剂或含漱剂。6、一种制备权利要求1所述的预防或/和治疗龋齿的药物组合物的方法，它包括如下步骤a、称取活性成分NaF、右旋糖酐酶；b、将右旋糖酐酶溶于20mM磷酸盐缓冲液中，pH6.0,制成存储液，其中含右旋糖酐酶100U/ml;c、配成混合溶液，使NaF的终浓度为10-8(^g/ml，右旋糖酐酶的终浓度为l-4U/ml，加入药学上可接受的辅料或辅料性成分。全文摘要本发明提供了一种预防或/和治疗龋齿的药物组合物，它是由右旋糖酐酶和氟化钠为活性成分制备而成，其中每毫升中含有NaF10-80μg、右旋糖酐酶1-4U。本发明还提供了该药物组合物的制备方法。本发明药物是将低于临床剂量的氟化钠与Dex联合应用，减少了氟化钠的用量，在其亚抑菌浓度即可起到抑制菌斑生物膜的作用，有效增强了氟化物防龋效果，减少了氟化物的毒副作用，从控制胞外多糖的角度控制生物膜以及在降低氟化物毒性的同时提高其作用效果方面提供了实验依据和临床选择。文档编号A61P1/02GK101502647SQ20081005767公开日2009年8月12日申请日期2008年2月4日优先权日2008年2月4日发明者仇元新,宁美芝,瑜应,然程,涛胡,丹蒋申请人:四川大学