专利名称：组织工程用软骨细胞外基质三维多孔海绵支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学软骨组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程用软骨细 胞外基质三维多孔海绵支架，尤其涉及用于引导软骨组织再生的组织相容性三 维多孔支架及其制备方法。
背景技术：
软骨的自身修复能力极其有限，用组织工程技术构建工程化软骨为修复软 骨缺损提供了一种具有良好应用前景的方法。软骨组织工程的研究内容包括种 子细胞、支架材料、细胞因子以及生物反应器技术等，其中构建理想的支架材 料是成功构建软骨组织工程的关键。细胞支架为软骨细胞的增殖分化提供适宜 的场所，相当于软骨的细胞外基质成分。
目前用于软骨组织工程的支架材料包括天然材料和人工合成材料两种，人 工合成的材料主要有聚乙交酯、聚丙交酯以及两者的共聚物等。人工合成材料 的缺点是疏水性，不利于细胞的粘附，并且降解产物呈酸性，在体内容易引起 炎症反应。而天然材料来源于动物或人体，其网状结构、成分、生物力学环境 适合种子细胞的生长、发育及新陈代谢，材料可降解，因此越来越受到研究者 的重视。
目前常用的天然软骨支架材料有胶原和透明质烷为原料的天然软骨的仿生 支架。天然材料研制的基本原则是仿生，即模拟天然软骨细胞外基质的结构与 生物化学成分，为软骨细胞生长提供适宜环境。但是软骨的细胞外基质生化成 分与结构复杂，仿生材料难于真正模仿软骨组织的复杂的天然结构、生物力学 和生物学特性，很少进入临床应用，尚无理想的支架。
脱细胞基质由于去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，并且保 留了原先的天然结构，已经得到了广泛的应用。目前，异体脱细胞真皮基质
(AlloDerm)已经商品化。国外有人用酒精脱水、冻干和液氮循环冻融等方法对兔 鼻间隔软骨进行灭活，作为细胞生长的支架，但是此种方法会使细胞残片残留，抗原性去除不彻底，并且灭活的大块软骨无多孔网状结构，细胞营养供应以及
代谢废物排出困难(见Kelley TF, Sutton FM， Wallace VP, et al. Chondrocyterepopulation of allograft cartilage: a preliminary investigation and strategy fordeveloping cartilage matrices for reconstruction. Otolaryngol Head Neck Surg,2002,127:265-70 )。国内有将软骨整块进行脱细胞处理的研究报道(见王彦君，孔维佳，毕胜斌等。耳廓软骨天然生物支架材料的制备及初步研究.中华耳科杂志,2005,3:194-199 )，但形成的脱细胞软骨不具备组织工程支架要求得多孔网状结构，营养物质的传送以及代谢物的派出困难；另外国内有将软骨进行粉碎后脱细胞的研究报道，韩雪峰等人将软骨粉碎成100 154pm微粒，与软骨细胞混合培养构建组织工程骨，其缺点是微粒较大、与软骨细胞混合不均匀，并且不具备一定具体的形状，细胞-微粒复合体生物力学强度低，手术植入不易操作等。理想的用于组织工程软骨构建的支架材料应符合以下基本要求①相互连通的三维、多孔网状结构，以有利于细胞生长，细胞营养物质的流通和细胞代谢产物的排除。②良好的生物相容性和生物可吸收性。③适合细胞粘附、增生和分化的表面化学特性。④良好的力学特性，能与组织植入部位的力学要求相匹配。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种天然软骨制成的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，能够复合细胞从而构建组织工程软骨，可用于临床上修复软骨缺损。
本发明的另一目的在于提供上述软骨细胞外基质三维多孔海绵支架的制备方法。
以下对本发明进行详细描述。
本发明的构思在于，通过将软骨加工成软骨微丝，从而提供能充分进行去细胞处理和形成多孔支架基质的条件，然后去细胞处理和固化和/或强化处理进而得到彻底脱细胞的软骨基质三维多孔海绵支架。
本发明提供了一种天然软骨制成的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其通过将天然软骨通过成微丝处理、去细胞处理和固化和/或强化处理得到。
本发明支架中，所用天然软骨来自人或其它哺乳动物，例如猪、牛等。对于来自异体的人的天然软骨而言，可以从组织库选用或来自捐献，对于来自异
6种的哺乳动物的天然软骨而言，可以直接或间接从活体或死亡的动物体取得。而且，所用软骨不要带有软骨下骨。所用软骨，例如关节软骨，需要在无菌条件下处理。
天然软骨很致密，难以直接去细胞，因此本发明中先将天然软骨经成微丝处理，例如在4。C物理打碎，得到较细的软骨微丝，然后再进行化学去细胞。这样的好处在于， 一方面，微丝使得软骨细胞充分暴露，从而能够与化学去细胞
处理液充分接触，从而有效去除细胞，有效去除软骨的抗原性；另一方面，微
丝能够提供形成多孔支架的基质，将软骨微粒固化和/或强化后即可得到具有一定生物强度的多孔支架。
所述成微丝处理，例如物理打碎，优选在蛋白酶抑制剂存在下进行，从而避免作为软骨主要细胞外成分的n型胶原和糖胺多糖的破坏，如降解等，而籙型胶原和糖胺多糖能为软骨细胞生长提供最接近的细胞外微环境，是支架的最理想成分。所述成微丝处理，例如物理打碎，可以在合适的液体环境中通过粉碎
机粉碎进行，合适的液体例如可以使用Tris-HCL、 PBS等緩冲液等。成微丝处理的温度优选在0-10。C,尤其是4。C左右最好。
为了更好地进行去细胞处理，优选将上述经成微丝处理所得的软骨微丝进行离心分离，尤其是差速离心梯度分离，以得到具有理想尺寸的软骨微丝。本发明人通过研究发现，当软骨微丝的直径为500nm-38^m,尤其是5pm-10(am时，所得支架效果好。优选微丝的孔径/孔隙约为60um-500um,这样适合软骨细胞生长。
所述去细胞处理，优选通过化学去细胞处理进行。例如，将以上步骤得到的软骨微丝用以下方法中的一种或多种组合进行脱细胞处理离子去垢剂脱细胞法、非离子去垢剂脱细胞法、双性离子去细胞法、酶脱细胞法、高渗或低渗溶液脱细胞法、酸或碱性溶液脱细胞法、磷酸三(正)丁酯(TBP)脱细胞法、敖合剂脱细胞法。对于非离子去垢剂脱细胞法，优选使用TritonX-100作为脱细胞试剂，作用浓度优选0.1-5%，最优选1-2%,作用时间优选12h-6d,最优选12h-72h。对于离子去垢剂脱细胞法，可以优选使用TritonX-200, SDS以及脱氧胆酸钠进行作为脱细胞试剂；对于双性离子去细胞法，优选采用3-[3-(胆酰胺丙基)二曱氨基]丙磺酸内盐HAPS)作为脱细胞试剂；对于酶脱细胞法，优选使用胰酶作为脱细胞试剂，优选作用浓度0.05-0.1%,优选作用条件为37°C， pH为8;至于高渗或低渗溶液脱细胞法、酸或^ 成性溶液脱细胞法、磷酸三(正)丁酯(TBP)脱胞法、敖合剂脱细胞法，它们都是已知技术，例如(Gilbert TW，SellaroTL,BadylakSF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 2006 M;27(19):3675-3683 )。以上脱细胞方法优选在震荡、搅拌等条件下进行。
去细胞处理的一个优选实施方式为，在4。C下将软骨孩i丝加入0.5 2% TritonX-100Tris-HCL緩沖液(pH7.5)，緩冲液内含有蛋白酶抑制剂，例如PMSF,持续振荡24 72h去除细胞。
在去细胞处理后，软骨微丝已经基本去除了抗原性，可以作为良好的支架基质使用。
所述固化和/或强化处理，通过将去细胞的软骨微丝经固定成型化成为具有一定强度的三维多孔状结构的支架，经强化处理得到具有更高生物强度的三维多孔海绵支架，可以直接用于临床，例如软骨修复。
固定成型化可以通过冷冻冻干、电纺丝等技术进行。冷冻冻干法，通过将软骨微丝配置成悬浮液后置于模具中在冻干机中冻干进行。悬浮液的浓度优选为(按重量比)0.5 % ~ 5 % ,冷冻温度优选为-10°C ~ - 50°C。模具形状可以根据需要而调整。采用冷冻一冻干法可以通过调节冷冻温度、降温速率、脱细胞微丝悬液的浓度等因素可控制多孔支架的微结构，制备出具有适宜孔径和孔隙率的三维多孔支架，这些都是本领域技术人员能力范围内的，或者经过有限的试验获得。电纺丝是已知技术，例如(Barnes CP, Pemble CW, Brand DD, SimpsonDG, Bowlin GL. Cross-linking electrospun type II collagen tissue engineeringscaffolds with carbodiimide in ethanol. Tissue engineering 2007Jul;13(7):1593-1605 ),通过电纺丝技术可以得到具有所希望的特定结构的多孔结构支架。所得三维多孔结构支架，能够充分有效地容纳种子软骨细胞，并且为其增殖提供了良好的空间环境，而且软骨已经彻底去除抗原性，不会引发炎症反应，而软骨中保留的II型胶原和糖胺多糖，为软骨细胞生长提供了最接近的细胞外环境。
为了使得支架强度更高，便于临床直接操作，优选将经固化处理后的多孔结构支架再进行强化处理。所述强化处理可以通过物理强化方法或化学强化方法或其组合进行，优选强化处理通过物理强化方法和化学强化方法的组合进行。
所述物理强化方法可以通过真空干热物理方法(重度脱氬法)交联进行，交联温皮优选为80°C ~ 130°C ，交联时间为1 ~ 72h;或使用紫外线交联方法，对于紫外线交联，优选使用波长为258nm的紫外光照射，距离光源优选5- 10cm，
8交联时间优选15min ~ 8h,最优选2-5h。
所述化学强化方法可以通过化学交联进行，优选使用醛类化合物、碳化二亚胺类化合物和碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物的交联剂进行交联。当使用醛类化合物，例如曱醛或戊二醛作为交联剂时，其水溶液浓度优选为0.01% ~ 2.5%,更优选为0.05 - 0.25%。当使用^/f匕二亚胺类化合物，例如l-乙基-3,3-二甲基胺丙基-碳化二亚胺作为交联剂时，其水溶液或者是乙醇溶液浓度优选为0.001 ~ 1M，更优选浓度为0.01 ~0.3M。当使用碳化二亚胺类化合物与N-幾基琥珀酰亚胺的混合物作为交联剂时，其水溶液或乙醇溶液中碳化二亚胺浓度优选为0.001 ~ 1M，更优选浓度为0.01 -0.3M; N-羟基琥珀酰亚胺的浓度优选为0.001 ~ 1M,更优选浓度为0.005 ~ 0.2M。
经过强化所得的支架，其生物力学强度很高，在临床使用中不会破损。
通过本发明制备得多孔支架结合组织工程的方法可以应用于软骨缺损的治疗，以有效促进软骨的体外构建或体内再生。
本发明提供的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架及其制备方法，从天然软骨去除抗原性和细胞成分，保留了软骨的细胞外基质成分，得到具有合适的孔径和孔隙率、适宜降解速率和良好生物相容性以及一定的生物力学强度的支架，材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。
本发明的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架具备以下优点
(1) 制备流程简单易行，制备出的支架产品易长期保存；
(2) 经脱细胞处理后仍然保留了fl型胶原和糖胺多糖，为软骨细胞生长提供了最接近的细胞外微环境；
(3) 经物理、化学交联进行的强化后，支架具备很高的生物力学强度；
(4) 支架具有高的孔隙率和均勻一致、特定大小的孔径，相互贯通的三维多孔网状结构增加了细胞的接触面积，并且有利于营养物质的交换和代谢产物的排出；
(5) 材料具备低抗原性，以及良好的生物相容性；
(6) 经过严格筛选，无疾病传播风险。优选的实施方式
本发明提供以下制备本发明支架的优选实施方式，包括以下步骤
1 )将新鲜关节软骨在4。C下放入浸泡于50mmol/L的Tris-HCL緩冲液
9(pH7.5)中,緩冲液内含有蛋白酶抑制剂PMSF (0.035 mmol/L)，经粉碎机粉碎， 采用差速离心法取5pm左右的软骨微丝。
2 ) 4。C下加入0.5~2% Triton X-100 Tris - HCL緩冲液(pH7.5),緩冲液内同 样含有蛋白酶抑制剂PMSF(0.035 mmol/L)，持续振荡24 ~ 72h去除细胞成分， 10000rpm离心后用蒸馏水反复沖洗。
3 )离心，7000rpm, 5 min。将沉淀配成(按重量比)0.5 % ~ 5 %的白色乳 状悬液。
4 )将溶液注入预冷的模具中，采用冷冻-冻干法，在-l(TC ~ - 50。C温度 下冷冻0.05 ~ 24h后，于冻干机中冻干，得到软骨细胞外基质三维多孔海绵支架。
5) 将步骤4)所得软骨细胞外基质三维多孔海绵支架用真空干热物理方法 (重度脱氢法)交联，交联温度为80°C ~ 130°C,时间为l-48h;然后采用紫
外线交联，或在选自醛类化合物、碳化二亚胺类化合物以及碳化二亚胺类化合 物与N-羟基琥珀酰亚胺的混合物的交联剂的水溶液中交联lh 48h。
6) 清洗，再次冷冻一冻干。
其中，所用的紫外线交联为258nm波长，距离光源5 10cm, 15min-8h; 所用的醛类化合物为曱醛或者戊二醛，浓度为0.01% ~ 2.5%，优选浓度为 0.05 ~ 0.25%;
所用的碳化二亚胺类化合物为l-乙基-3,3-二曱基胺丙基-碳化二亚胺，浓度 为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.01 ~ 0.3M;
所用的碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合水溶液，碳 化二亚胺浓度为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.01 -0.3M; N-羟基琥珀酰亚胺的浓 度为0.001 ~ 1M，优选浓度为0.005 ~ 0.2M。
图l是实施例1中显微镜下成微丝处理后所得的软骨微丝(xi00);
图2是实施例1中3%软骨微丝悬液；
图3是实施例1中显微镜下所得软骨支架(x20);
图4是实施例1中支架结构显微镜图(x20);
图5是实施例1中脱细胞软骨支架结构扫描电镜图(xl00);
图6是实施例1中显微镜下所得软骨支架蕃红O染色图(x20);
图7是实施例1中显微镜下所得软骨支架曱苯胺蓝染色图(x20);图8是实施例1中显微镜下所得软骨支架II型胶原免疫组织化学染色图
(x20);
图9是实施例1中显微镜下所得软骨支架II型胶原免疫焚光染色图(x20);
图IO显示实施例1中MTT法;险测支架的浸提液对细胞无毒性；
图11显示实施例1中BMSCs接种后呈球形粘附在多孔支架孔隙中(x20);
图12显示实施例1中支架孔隙逐渐被细胞以及分泌的基质填满，细胞-支架 复合体轮廓逐渐明显(x20);
图13表示实施例1中多孔支架种植成软骨诱导的BMSCs后48h的扫描电 镜图象，支架孔隙逐渐被细胞以及分泌的基质填满，细胞在支架的孔隙中分布均 匀(x800);
图14表示实施例1中异位构建软骨样组织大体观；
图15表示实施例1中棵鼠体内生成的软骨样组织蕃红O染色阳性，有"陷 窝"生成(x20);
图16表示实施例1中棵鼠体内生成的软骨样组织曱苯胺兰染色阳性，有"陷 窝"生成(x20);
图17表示实施例1中棵鼠体内生成的软骨样组织II型胶原染色阳性，有"陷 窝"生成(x20);
图18表示实施例1中向软骨方向诱导的BMSCs复合软骨支架植入修复兔 膝关节软骨缺损的6个月后大体观；
图19表示实施例1中向软骨方向诱导的BMSCs复合软骨支架植入修复兔 膝关节软骨缺损的6个月后修复组织为透明软骨，细胞排列规则(HE染色) (x20);
图20表示实施例1中向软骨方向诱导的BMSCs复合软骨支架植入修复兔 膝关节软骨缺损的6个月后修复组织为透明软骨，II型胶原染色阳性，细胞排 列规则(x20);
图21是实施例2中1。/。浓度的显微镜图片(x40);
图22是实施例2中2。/。浓度的显微镜图片(x40)。
具体实施例方式
以下通过范例性的实施例来进一步描述本发明，本发明的特点和优点将会 随着这些描述更为清楚。但是，这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该了解的是，在不违背本发明精神和范 围的情况下，本发明有多种不同的实施方式，并且对这些实施方式的具体细节 可以进行多种替换/修改，这些均应落入本发明的范围内。 实施例1:
4 。C下将人关节软骨浸泡于PBS緩冲液(pH7.5)，緩沖液含0.035。/。PMSF(w/v) 和0.1。/oEDTA,立刻用粉碎机粉碎，采用梯度离心法取直径100 nm ~ 5 fxm软 骨微丝(图1 ) 。 4。C下加入含1% Triton X-100的10 mmol/L Tris-HCl緩冲液 (pH7.5)，緩冲液中PMSF含量同上。持续振荡24h，去除细胞成分。7 000r/min 离心5min后用PBS沖洗。37。C下加入50 U/mLDNA酶和1 U/mL RNA酶消 化6 ~ 48 h。同上法离心后用三蒸水冲洗，将沉淀配成质量体积比为3%的白 色乳状悬液(图2)。将悬液置入模具，一2(TC保存24 h， 一8(TC保存1 h，置 入冷冻干燥机中冻干48 h,制成三维多孔支架材料。将所得软骨细胞外基质三 维多孔海绵支架通过真空干热物理方法(重度脱氬法)交联，交联温度优选为 80°C ~ 130°C,交联时间为0~72h;然后采用254 nm紫外线距离10 cm,照射 60 min后，浸入14 mmol/L碳化二亚胺及5.5 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶液交 联2h， PBS冲洗3遍，冷冻冻干，形成软骨支架(图3)。
所得支架的性能检测
理化性能检测光镜下可见支架孔径均勻一致，孔隙相互贯通(见图4)。 扫描电镜观察，可见支架孔径大小及分布较均匀，并且孔隙相互贯通，孔径为 (155±34) pm，(图5)。支架孔隙率为91.3%±2.0% ( 89% ~ 93% ),吸水性 为2 451 % ±155 % ( 1900% ~ 2 700% )。 组织化学染色观察
蕃红O染色可见细胞外基质微丝相互连接，形成均匀一致的网状结构，细胞外基 质微丝上软骨细胞消失，支架均呈红染(图6)。曱苯胺蓝染色呈阳性，网状结构均呈 蓝色(图7) 。 II型胶原免疫组织化学染色阳性，网状支架呈棕色(图8) 。 II型胶原 免疫荧光染色阳性，支架呈绿色荧光(图9) 支架的生物相容性
浸提液毒性分析采用MTT法检测支架浸提液对细胞的毒性。结果，BMSCs 在不同浓度的支架浸提液及对照DMEM培养液中生长良好，A值比较差异无 统计学意义(P <0.05 )(图IO)(软骨细胞外基质多孔支架浸提液对细胞无毒 性作用)。倒置显微镜观察BMSCs接种后呈球形，祐附于多孔支架孔隙中(图
1211 )，培养液中可见少量悬浮细胞，1 ~ 4h后细胞大部分贴壁，呈短梭形，3 ~
5 d后可见支架孔隙逐渐被细胞以及分泌的基质填满，细胞-支架复合体轮廓逐 渐明显(图12)。扫描电镜观察培养后48h细胞在支架孔隙中分布均匀，呈 椭圓形或类圆形软骨样细胞，可见大量基质分泌(图13) 棵鼠体内试验
无菌条件下将体外培养1周的软骨细胞/CACM多孔支架复合体植入到棵鼠 背部皮袋，4周后取材观察结果，生成的复合体为光滑色白类软骨样组织,有一定 的弹性(图14)。组织学结果4周后类软骨样组织切片番红0,曱苯胺蓝，II型 胶原染色阳性(图15,16， 17)。
修复兔膝关节软骨缺损的实验
将向软骨方向诱导的BMSCs复合软骨支架植入修复兔膝关节软骨缺损，6 个月后大体观察可见完全修复，边缘整合良好，呈半透明外观(图18)。修复 组织为透明软骨，细胞呈柱状排列，可见潮线生成，II型胶原染色阳性(x20)(图19, 20)。
实施例2:脱细胞软骨微丝的含量对软骨细胞外基质三维多孔海绵支架的微 结构的影响
将新鲜关节软骨在粉碎机将之粉碎，用密度梯度离心方法1500rpm离心 5min,取呈牛奶状的上清，用1% Triton X-100在4。C持续振荡48h去除细胞成 分，7000rpm离心后用蒸馏水反复冲洗。将沉淀分别配成(按重量比)1%和2 %的悬液，溶液注入预冷的模具中，采用冷冻-冻干法，在-20。C温度下冷冻 24h后，于冻干机中冻干，得到不同孔径和微结构的软骨细胞外基质三维多孔海 绵支架。参见图21和22。在相同的冷冻温度以及冷冻速率的情况下，所形成支 架的孔径的大小与脱细胞软骨微丝的浓度成反比。
实施例3: 软骨细胞外基质三维多孔海绵支架的交联
将新鲜关节软骨在粉碎机将之粉碎，用差速离心的方法1500rpm离心5min, 取呈牛奶状的上清，用1% Triton X-100在4。C持续振荡48h去除细胞成分， 7000rpm离心后用蒸馏水反复沖洗。将沉淀分别配成(按重量比)2 %的悬液， 溶液注入预冷的模具中，采用冷冻-冻干法，在-2(TC温度下冷冻24h后，于冻 干机中冻干，得到软骨细胞外基质三维多孔海绵支架。(1) 将支架用真空干热物理方法110 °C交联5h，然后浸入14mM EDAC及5.5mM NHS溶液交联2h,PBS冲洗3遍，三蒸水沖洗2遍后将支架冷冻冻干。
(2) 将支架用真空干热物理方法110°C交联5h,然后浸入2.5 %的戊二醛水溶液 交联24h，然后用三蒸水反复冲洗。
(3) 将支架用真空千热物理方法110。C交联5h，然后紫外线交联(258nm波长， 距离光源10cm) 8h。
与未交联的支架相比，三种方法交联后的支架其力学性能都有了一定的提高。
1权利要求
1、一种天然软骨制成的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，通过将天然软骨通过成微丝处理、去细胞处理和固化和/或强化处理得到。
2、 如权利要求1所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所用天然 软骨来自人或其它哺乳动物。
3、 如权利要求l或2所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述 成微丝处理，例如物理打碎，在蛋白酶抑制剂存在下进行；和/或其中所述成微丝处理的温度在0-10。C,尤其是4。C左右； 和/或其中所述去细胞处理，还包括将经成微丝处理所得的软骨微丝进行离心分 离，尤其是差速离心梯度分离，以得到具有理想尺寸的软骨微丝。
4、 如权利要求1所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述去细 胞处理通过化学去细胞处理进行，所述化学去细胞处理优选使用以下方法中的 一种或多种组合进行离子去垢剂脱细胞法、非离子去垢剂脱细胞法、双性离 子去细胞法、酶脱细胞法、高渗或低渗溶液脱细胞法、酸或;威性溶液脱细胞法、 磷酸三(正)丁酯(TBP)脱细胞法、敖合剂脱细胞法。
5、 如权利要求4所述的的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述去 细胞处理为，在4。C下将软骨微丝加入0.5 2% Triton X-100 Tris - HCL緩冲液 (pH7.5),緩冲液内含有蛋白酶抑制剂，例如PMSF，持续振荡24 72h去除细 胞。
6、 如权利要求1所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述固化 处理通过冷冻冻干或电纺丝技术进行。
7、 如权利要求1所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述强化 处理通过物理强化方法或化学强化方法或其组合进行，优选通过物理强化方法 和化学强化方法的组合进行。
8、 如权利要求7所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，其中所述的物 理强化方法使用真空干热物理方法交联或使用紫外线交联方法；和/或其中所迷化学强化方法通过化学交联进行，优选使用醛类化合物、碳化二亚胺类化合物和碳化二亚胺类化合物与N-轻基琥珀酰亚胺的混合物的交联剂进 行交联，其中当使用醛类化合物，例如曱醛或戊二醛作为交联剂时，其水溶液浓度为0.01% ~ 2.5%，优选为0.05 - 0.25%;当使用碳化二亚胺类化合物，例如 1-乙基-3，3-二曱基胺丙基-碳化二亚胺作为交联剂时，其水溶液或者是乙醇溶液 浓度为0.001 ~ 1M，优选浓度为0.01 ~ 0.3M;当使用碳化二亚胺类化合物与N-幾基琥珀酰亚胺的混合物作为交联剂时，其水溶液或乙醇溶液中碳化二亚胺 浓度为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.01 ~ 0.3M;N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001 ~ 1M，优选浓度为0.005 ~ 0.2M。
9、如权利要求1所述的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，通过包括以下 步骤的方法制备1)将新鲜关节软骨在4。C下放入浸泡于5Ommol/L的Tris - HCL緩冲液 (pH7.5)中，緩冲液内含有蛋白酶抑制剂PMSF (0.035 mmol/L),经粉碎机粉碎， 釆用差速离心法取5|im左右的软骨微丝；2) 4。C下加入0.5~2% Triton X-100 Tris - HCL緩冲液(pH7.5),緩冲液内同 样含有蛋白酶抑制剂PMSF(0.035 mmol/L),持续振荡24 ~ 72h去除细胞成分，1 OOOOrpm离心后用蒸镏水反复沖洗；3)离心，7000rpm, 5 min。将沉淀配成(按重量比)0.5%~5%的白色乳 状悬液；4)将溶液注入预冷的才莫具中，采用冷冻-冻干法，在-10°C ~ - 50。C温度 下冷冻0.05 ~ 24h后，于冻干机中冻干，得到软骨细胞外基质三维多孔海绵支架；5) 将步骤4)所得软骨细胞外基质三维多孔海绵支架用真空干热物理方法 交联，交联温度为80°C ~ 130°C,时间为l-48h;然后采用紫外线交联，或在 选自醛类化合物、碳化二亚胺类化合物以及碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀 酰亚胺的混合物的交联剂的水溶液中交联lh ~ 48h;6) 清洗，再次冷冻一冻干；其中，所用的紫外线交联为258nm波长，距离光源5 10cm， 15min-8h; 所用的醛类化合物为曱醛或者戊二醛，浓度为0.01% ~ 2.5%，优选浓度为 0.05 ~ 0.25%;所用的碳化二亚胺类化合物为l-乙基-3,3-二曱基胺丙基-碳化二亚胺，浓度 为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.01 ~ 0.3M;所用的碳化二亚胺类化合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合水溶液，碳化二亚胺浓度为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.01 -0.3M; N-羟基琥珀酰亚胺的浓 度为0.001 ~ 1M,优选浓度为0.005 ~ 0.2M。
10、制备软骨细胞外基质三维多孔海绵支架的方法，该方法如权利要求l -9中任一项所述。
全文摘要
本发明公开了一种天然软骨制成的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架，能够复合细胞从而构建组织工程软骨，可用于临床上修复软骨缺损。本发明中，通过将软骨加工成软骨微丝，从而提供能充分进行去细胞处理和形成多孔支架基质的条件，然后去细胞处理和固化和/或强化处理进而得到彻底脱细胞的软骨细胞外基质三维多孔海绵支架。从天然软骨去除抗原性和细胞成分，保留了软骨的细胞外基质成分，得到具有合适的孔径和孔隙率、适宜降解速率和良好生物相容性以及一定的生物力学强度的支架，材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。
文档编号A61L27/56GK101496913SQ20081005737
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者卢世璧, 军 姚, 孙明学, 莉 张, 江 彭, 强 杨, 汪爱媛, 玥 田, 翔 眭, 许文静, 斌 赵, 郭全义, 黄靖香 申请人:中国人民解放军总医院