专利名称：蛇毒细胞毒素及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛇毒细胞毒素及其制备方法与应用。
技术背景目前，临床上使用的抗癌药物主要以化学药为主，即常说的化疗药。这类药物 共同缺点是副作用严重，普遍能引起患者严重的呕吐和脱发等。因此，副作用较小 的生物抗癌药近年成为研究的热门，主要集中在蛇毒、蜈蚣毒素等的研究。某些蛇种的蛇毒中含有能够破坏肿瘤细胞结构的细胞毒素，此前有过相关的报 导，例如在美国铜斑蛇蛇毒、我国皖南的尖吻蝮蛇蛇毒中都发现了具有抗癌作用的 细胞毒素，这些发现目前还处在学术研究阶段，没有进行药用开发。但是在锯鳞蝰 蛇蛇毒中提取得到具有抗癌作用的细胞毒素此前未见报导。 发明内容本发明的一个目的是提供一种制备蛇毒细胞毒素的方法。本发明所提供的制备蛇毒细胞毒素(蛇毒提取物)的方法，包括如下步骤(1) 将蛇毒溶液进行离子交换层析，所述离子交换层析中所用的离子交换基 团为二乙基氨基乙基，以含有氯化钠的、PH值为8. 2、浓度为0. 05mol/L的Tris-HCl 缓冲液为流动相进行氯化钠线性梯度洗脱，氯化钠浓度梯度为0—0. 5mol/L，收集 洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上的第一吸收峰和第二吸收峰之间的流 出液；(2) 将步骤(1)得到的流出液进行排阻层析，以水作为流动相，所用的层析 介质为聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel-P-60，所用的层析柱子的直径为4.5cm、柱床高度 为120cm，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上第二吸收峰，得到蛇毒 细胞毒素。在所述离子交换层析中，所用的层析介质可以为DEAE-S印hadexA-50;所述流 动相的流速可以为0. 8-1. Oml/min。在所述排阻层析中，所述流动相的流速可以为40ml/h。所述蛇毒溶液在进行离子交换层析前，还可以进行如下处理先用饱和硫酸铵 沉淀，收集上清液，再对所述上清液进行透析。所述蛇毒具体可以为锯鳞蝰蛇的蛇毒。上述任一所述方法制备的蛇毒细胞毒素也属于本发明的保护范围。 以上述蛇毒细胞毒素为活性成分的预防和/或治疗癌症的药物也属于本发明的 保护范围。上述蛇毒细胞毒素在制备抗癌症药物中的应用。 其中，所述癌症具体可为喉癌。本发明通过生化手段从巨鳞蝰蛇蛇毒中得到细胞毒素，该细胞毒素能通过破坏 细胞的基本结构杀死细胞，对某些癌细胞的亲和性远远高于正常细胞。实验结果表明，本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素能够明显诱导人喉癌细胞H印-2凋亡，当蛇毒 细胞毒素浓度为0. 01mg/ml时，其诱导H印-2细胞凋亡的能力强于浓度为10(^g/ml 的平阳霉素；而且异常毒性实验证明该物质对小白鼠没有毒性即该细胞毒素的副作 用轻。本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素可以作为一种抗癌症药物，使生物抗癌药成 为现实。
图1为离子交换层析结果图谱，其中，纵坐标为吸光度值，横坐标为管号。 图2为排阻层析结果图谱，其中，纵坐标为吸光度值，横坐标为管号。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。 实施例1、蛇毒细胞毒素的制备本实施例中以锯鳞蝰蛇蛇毒冻干粉(购于荆市开泰药业有限公司)为原料。提取的实验步骤如下1、 蛇毒溶解将8g锯鳞蝰蛇蛇毒冻干粉溶于100ml Tris-HCl缓冲液(pH8. 2， 0. 05mol/L)中。2、 除杂蛋白向步骤l获得的蛇毒溶液中加入6ml饱和硫酸铵溶液，混合后 在室温条件下放置l小时，3000 rpm离心10分钟，弃去沉淀，保留上清溶液。3、 透析除盐将步骤2获得的全部上清液封闭在截留14000D分子量的透析袋 中，然后将透析袋放入蒸馏水中透析15小时，每3小时换水一次，蒸馏水的体积 1200ml。透析后所得到的透析液大约180 ml。4、 离子交换层析用pH 8. 2、0. 05mol/L的Tris-HCl缓冲液平衡DEAE-S印hadex A-50层析柱15小时，流速为1. 0 ml/min;将步骤3获得的透析得到的透析液移到平衡后的DEAE-S印hadex A-50层析柱，待上清液完全移动到胶面以下后，在胶面 上方加Tris-HC1缓冲液(PH8. 2， 0. 05mol/l) 50ml;以Tris-HC1缓冲液(pH8. 2， 0. 05mol/l)为起始液、以含0. 5mol/L氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH8. 2， 0. 05mol/l) 为终止液进行氯化钠线性梯度洗脱。所用的洗脱液共为4000ml;洗脱液的流速为 0. 8-1. Oml/min (即氯化钠的浓度的变化速度为1 X 10—4mol/L/min -1.25X 10—4mol/L/min)。用自动馏分收集器收集，每管15ml，通过紫外分光光度计检测层析液吸光度， 检测波长为280nm，制作点一吸光度曲线，如图1所示。收集第一吸收峰和第二吸 收峰之间的部分(第16—29管流出液)，收集的流出液约210 ml。5、 排阻层析将步骤4获得的210ral流出液进行排阻层析。用BI0-GEL-P-60 凝胶层析分离(按照凝胶说明书处理并灌柱)，层析柱长150cm，直径4.5cm，胶 床高度不低于120cm，以纯化水作为流动相，流速40ml/h;用自动馏分收集器收集 层析液，15ral/管，通过紫外分光光度计监测层析液吸光度，检测波长为280nm; 制作点一吸光度曲线，如图2所示。收集吸光度曲线上的第二吸收峰(第26—34 管流出液)，收集的流出液约135 ml。6、 用Folin-酚试剂法(lowry法)测得收集液蛋白质浓度为0. 08mg/ml。 将收集液稀释成蛋白含量为0. 01mg/ml的溶液，即得锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素原液1080 ml。通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛇毒细胞毒素的分子量，检测结果表明， 所得细胞毒素呈现一条带，分子量为31000D。实施例2、锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素的功能验证 一、锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素的抗癌症功能验证以人喉癌细胞Hep-2细胞株(辽宁医学院头颈外科研究所提供)为靶细胞，观 察本发明蛇毒细胞毒素和平阳霉素诱导癌细胞调亡的效率对比。实验方法参照文献 (邰隽王雪峰平阳霉素诱导人喉癌Hep-2细胞调亡的实验研究《辽宁医学 院学报》2004 Aug. 25(4) 5—7页)，具体如下人喉癌细胞系H印-2细胞株的培养:将细胞接种于RPMI-1640的完全培养液(胎 牛血清10%、青霉素100u/ml、链霉素100ug / ml)，置于37。C、含5%0)2培养箱 内培养。取实施例1制备的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素原液20 ml冷冻干燥后，用20mlRPMI-1640培养液复溶备用，细胞毒素(蛋白质)的浓度为0.01mg/ml。实验分为三个处理含有浓度为0. Olmg/ml上述蛇毒细胞毒素的RPMI-1640培 养液中作为实验组，含有浓度为lOO^g/ml的平阳霉素的RPMI-1640培养液作为阳 性对照组，RPMI-1640培养基作为空白对照组。上述三个处理分别接种上述H印-2 细胞，接种浓度均相同，然后置于37。C、含5%0)2培养箱内培养24小时。每个处 理均重复10次。采用PI单染法，进行流式细胞仪检测，从而计算出细胞凋亡率(细胞凋亡率二 凋亡细胞数目/活细胞数目+凋亡细胞数目)。结果如表l所示，表l中的数值为平均值士标准差。结果表明，本发明所得的 锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素能够明显诱导H印-2细胞凋亡，当蛇毒细胞毒素浓度为 0. Olmg/ml时，其诱导H印-2细胞凋亡的能力强于浓度为lOOPg/ml的平阳霉素。表1、细胞凋亡情况组别凋亡率空白对照组3. 03±0. 14阳性对照组12. 69±0. 24*实验组17. 31 ±0. 27*A*尸< 0. 01同空白对照组比较；A尸〈0. 01同阳性对照组比较二、锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素异常毒性考察选择健康的昆明种一级小白鼠5只，体重18 22g，雌雄不限。将实施例l所 得的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素原液经过0. 2微米孔径的微孔滤膜过滤后，无菌操作给 小白鼠尾静脉注射，每只小白鼠注射lml，正常饮食饲养观察48小时。结果48小 时后5只小白鼠未见任何异常。上述给小白鼠的用量大约是人治疗量的75倍以上， 小白鼠无异常，因此锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素异常毒性合格，安全性可靠。
权利要求
1、一种制备蛇毒细胞毒素的方法，包括如下步骤(1)将蛇毒溶液进行离子交换层析，所述离子交换层析中所用的离子交换基团为二乙基氨基乙基，以含有氯化钠的、pH值为8.2、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液为流动相进行氯化钠线性梯度洗脱，氯化钠浓度梯度为0-0.5mol/L，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上的第一吸收峰和第二吸收峰之间的流出液；(2)将步骤(1)得到的流出液进行排阻层析，以水作为流动相，所用的层析介质为聚丙烯酰胺凝胶Bio-Gel-P-60，所用的层析柱子的直径为4.5cm、柱床高度为120cm，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上第二吸收峰，得到蛇毒细胞毒素。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子交换层析中，所用的 层析介质是DEAE-S印hadex A-50。
3、 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述离子交换层析中，流 动相的流速为0. 8-1. Oml/min。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的方法，其特征在于所述排阻层析中，所述 流动相的流速为40ml/h。
5、 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述蛇毒溶液在进行 离子交换层析前，还进行如下处理先用饱和硫酸铵沉淀，收集上清液，再对所述 上清液进行透析。
6、 根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述蛇毒为锯鳞蝰蛇的蛇毒。
7、 用权利要求l-6中任一所述方法制备的蛇毒细胞毒素。
8、 一种预防和/或治疗癌症的药物，它的活性成分为权利要求7中所述蛇毒细 胞毒素。
9、 权利要求7所述蛇毒细胞毒素在制备抗癌症药物中的应用。
10、 根据权利要求8所述的药物或权利要求9所述的应用，其特征在于所述 癌症为喉癌。
全文摘要
本发明公开了一种蛇毒细胞毒素及其制备方法与应用。本发明所公开的制备蛇毒细胞毒素的方法包括如下步骤(1)将蛇毒溶液进行离子交换层析，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上的第一吸收峰和第二吸收峰之间的流出液；(2)将步骤(1)得到的流出液进行排阻层析，以水作为流动相，收集洗脱液中280nm检测波长的吸光度曲线上第二吸收峰，得到蛇毒细胞毒素。本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素能够明显诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡，当蛇毒细胞毒素浓度为0.01mg/ml时，其诱导Hep-2细胞凋亡的能力强于浓度为100μg/ml的平阳霉素；而且异常毒性实验证明该细胞毒素的副作用轻。本发明的锯鳞蝰蛇蛇毒细胞毒素可以作为一种抗癌症药物，使生物抗癌药成为现实。
文档编号A61K35/58GK101269092SQ20081010625
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者于洪儒 申请人:于洪儒