专利名称：一种多拷贝多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过人为的设计方式将两种具有不同生物学功能的多肽或寡肽片段连接并应用人工合成的方式制备出具有高生物活性作用的多肽产物。以本方式制备的多肽产物可作为多肽药物、肽类免疫增强剂或多肽疫苗应用于对疾病的治疗和预防。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
生物体的遗传基因被存储在多聚核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，般超过10个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个以上的功能小肽。
由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”等，有在天然肽链的基础上进行人工改构制备成为用于治疗消化道出血和肢端肥大症的多肽药物“奥曲肽”和抗凝血作用的“水蛭肽”等。蛋白质中的功能片段常常能筛选到含有几十个或小到只有二个氨基酸组成的多肽片段，它们为人工合成多肽功能片段并将它们投入应用奠定了基础。
外源性的致病体，包括各种细菌、病毒、支原体、衣原体、各种动物或植物产生的毒素、植物花粉等进入人体会引发机体产生免疫排斥反应。人类机体内的发生变异的肿瘤细胞同样携带正常细胞不具备的肿瘤特异蛋白或异常产生的肿瘤相关蛋白。这些异类蛋白分子是激发机体免疫系统识别和排斥外源致病体和内源变异体的分子基础。
随着生物技术的发展，许多致病体及肿瘤细胞表面的特异蛋白分子已被鉴定出来，这些分子中的活性位点、功能结构域、抗原性片段等特性已被逐步发现。根据这些特性和现有技术可以利用多肽人工合成的方法把它们合成制备出来。按照人为的预先设计将具备特定生物学功能的多肽或寡肽连接在一起，经过人为加工改造而产生的新的或高活性的功能性多肽产物的技术被称之为“多肽工程”，它是继“基因工程”之后而得以拓展的新生物技术领域。随着人类基因组计划的完成和“多肽工程”的深入发展，将会有越来越多的多肽药物进入人民生活。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种新的多肽药物的结构设计方式，所要解决的技术问题是使两种具有不同生物学功能，但具相关性的多肽或寡肽片段的其中一个以多拷贝的形式相互连接起来，利用两种不同生物学功能片段的产生的协同作用从而能更好地发挥功能片段的作用，使合成的多肽产物提高相应的生物活性作用，更加适于实用，且具有产业上的利用价值。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明的理念将两种不同的但具相关性的多肽功能片段设计成为Xn-Linker-Y的结构方式，其中，X为“第一功能片段”，为具有生物学作用或功能的多肽或寡肽片段；n代表X的拷贝数；Y为“第二功能片段”，为与上述“第一功能片段”不同但具相关性的生物活性多肽或者寡肽片段；Linker为由具有两个可缩合氨基酸的活化氨基的赖氨酸(Lys，或K)组成并用＞K-表示，将上述的具n个拷贝的X片段通过其羧基端的羧基与赖氨酸构成的Linker链的氨基端的氨基做缩合连接，Linker的羧基端上的羧基与单拷贝Y的氨基端相缩合连接形成Xn-Linker-T的结构。本发明的目的是为解决将两种不同功能但具相关性的多肽片段通过多拷贝的连接方式制备出高活性的多肽产物的设计方式，它可应用到生物医药领域中，其技术问题可采用以下技术措施进一步实现。
发明所述的Xn-Linker-Y多肽结构，其中所述的由赖氨酸(Lys或K)构成的Linker结构可为＞K-、＞K2＞K-或＞K4＞K2＞K-，＞K-代表具有两个可供缩合氨基酸的活化氨基的赖氨酸。可利用Y所代表的“第二功能片段”中N端固有的赖氨酸启始做多拷贝的连接。
发明所述的Xn-Linker-Y结构的多肽产物，其中所述的“第一功能片段”X的拷贝数n可为2、4、或8个。在Xn-Linker-Y结构的多肽产物中的氨基酸侧链基团上、产物的氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、添加氨基酸或其他任意化学元素得到的产物。在多拷贝多肽中，在由赖氨酸组成的Linker中插入任意氨基酸或其他任意化学元素得到的产物。按照本发明的设计方式制备的多肽产物可以是多肽药物、免疫增强剂或多肽疫苗。
以多肽分子在人体免疫系统中的应用为具体例子，对本发明所涉及的多肽产物的设计方式和应用加以说明。人体的免疫系统主要有T淋巴细胞承担的细胞免疫和B淋巴细胞承担的体液免疫两大部分组成。它们对维护机体的健康，抵御外来致病体的侵犯起到重要的作用。
法氏囊是鸟类动物所特有的免疫器官，是B淋巴细胞最早发生的场所，对B细胞的发育、成熟和迁移具有重要作用。1986年人们首次从鸡法氏囊抽提液中纯化出一种由3个氨基酸组成的三肽物质，赖氨酸-组氨酸-甘氨酰胺(Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH2)，被命名为囊素(Bursin)。囊素主要是由法氏囊滤泡的上皮细胞合成和分泌的。囊素不仅存在于鸟类动物的法氏囊中、胸腺Hassall小体中、腔上囊中，而且还广泛存在于哺乳类动物(包括人)的骨髓和肝胆上皮细胞中，它对鸟类动物及哺乳动物的体液免疫和细胞免疫具有重要的促进作用，具有促进包括人和禽类动物的B淋巴前体的分化、增殖、提高巨噬细胞的吞噬能力，显著提高B淋巴细胞应答和提高免疫功能的作用(江倩等“囊素的研究进展”，中国畜牧兽医文摘2007年，第3期36页)。
人体脾脏产生的4肽生物活性分子“促吞噬素”(Tuftsin)是由苏氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg，或简写TKPR)组成，实验证明它具有促进T淋巴细胞的分化、增殖和杀伤能力，具有显著提高机体细胞免疫功能的作用(Nishioka K et al“Tuftsinan immunomodulating peptide hormone and itsclinical potential as a natural biological response modifier”.Cancer Invest(1984)39～49)。
为了能够有效地提高机体针对抗原产生免疫应答反应、提高机体的免疫抵抗水平，达到增强免疫抗病能力的目的，将两种不同的免疫增强短肽连接在一起，发挥它们促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性作用。按照本发明的设计方式将促吞噬素TKPR做为X“第一功能片段”，将囊素KHG-NH2作为Y“第二功能片段”，通过赖氨酸(＞K-)构成的Linker将多拷贝的TKPR与单拷贝的KHG-NH2做连接，如(TKPR)4＞K2＞KHG-NH2或(TKPR)8＞K4＞K2＞KHG-NH2充分利用促吞噬素TKPR与KHG-NH2各自所具备的提高免疫功能的作用和它们产生的协调作用综合提高机体的免疫能力，使合成产物的生物活性作用比单独任一片功能段TKPR或KHG-NH2的活性予以显著提高，产物可以制备成免疫增强剂。
本发明对两种生物活性不同但具相关性的多肽或寡肽功能片段采取的设计方式为X代表的“第一功能片段”可以是任意一类具有免疫增强功能的多肽或寡肽片段，如囊素、促吞噬素以及它们的衍生物等等；也可以是一类能够激发B淋巴细胞或T淋巴细胞产生免疫应答作用的多肽或寡肽片段，如多肽抗原片段(可以是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原或其它来源于致病微生物或致病特异蛋白的相关多肽抗原片段)；也可以是可发挥其它作用的多肽或寡肽功能片段，不局限于此。
Y代表的“第二功能片段”可以是任意一类具有免疫增强功能的多肽或寡肽片段，如囊素、促吞噬素等等；可以是任意一类能与细胞表面受体相结合的配体片段；可以是任意一类能与细胞表面分子发生生物学反应的多肽或寡肽片段；可以是任意一类能与细胞内部分子发生生物学反应的多肽或寡肽片段，如内质网滞留片段KDEL或RDEL等，也可以是任意一类可发挥其它生物学作用的多肽或寡肽片段。
本发明将两种功能不同但具生物学相关的多肽或寡肽片段以Xn-Linker-Y的形式连接可设计形成如(多肽抗原片段)8＞K4＞K2＞K-(免疫增强片段)，或(多肽抗原片段)8＞K4＞K2＞K-(细胞表面受体的配体片段)，或(免疫增强片段)8＞K4＞K2＞K-(另一种免疫增强片段)，设计方式不局限于此的多肽活性产物。产物中的免疫增强片段具有与淋巴细胞表面分子结合的能力，能够刺激机体免疫细胞活化，促进产物中的多拷贝多肽抗原片段与淋巴细胞的接近和发生反应，如此设计的优点是在免疫增强片段的帮助下机体免疫系统提高了对多肽抗原的免疫应答反应，产生的协同效应利于制备出效果更好的多肽抗原用于疫苗的制备。
按照本发明的设计方式可以采用任意2种生物学功能不同但具生物学相关性的多肽或寡肽片段制备成分子形式为Xn-Linker-Y的产物，利用产物的相关多肽或寡肽片段的活性激发机体相关的生物学活性，按照此方式制备的产物可制备成生物学功能或活性能够超越其中单拷贝功能片段的产物。如此产生的产物可制备成为药物、免疫增强剂(免疫佐剂)或多肽疫苗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的实施例详做细说明。
具体实施例方式 为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的对多肽产物的设计方式和具体应用实施方式、特征及其功效做以下说明。
1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的羧基端氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。多肽合成的顺序是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合连接向肽段的氨基端(N端)方向逐个延伸。当进行氨基酸的羧基接合反应时要将其氨基和侧链基团保护起来避免发生反应，目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次以结合在固相载体上的氨基酸作为氨基的脱保护基并同过量的下一个有待连接的氨基酸的活化羧基发生缩合反应延长肽链。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即达到缩合-＞洗涤-＞去保护-＞中和和洗涤-＞下一轮缩合(再接上一个氨基酸)，直至达到所需要合成的肽链长度。多肽合成完成后再将合成的多肽产物从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱的纯化最终得到合成产物。
基于以上的原理，多肽合成可以是手工操作合成，也可以采用多肽合成仪经过输入合成序列和程序自动化合成。如今固相法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用方法。这里需要说明的是Xn-Linker-Y多肽产物的合成方式是通过首先合成Y多肽或寡肽片段，然后再继续合成Linker，即接上一个具有2个可缩合氨基酸的活化氨基的赖氨酸(＞K-)，在其上的2个活化氨基上再同时进行氨基酸的缩合反应，并在以后的氨基酸加成缩合反应中同时得到延伸达到同时合成多拷贝X功能片段的目的。在合成直链多肽的过程中由于使用的是只有一个活化氨基的赖氨酸(-K-)，其上的另一个氨基不参与缩合反应，所以往下延伸的是直链肽。当我们需要合成多拷贝肽段时，选用两个氨基均被活化可进行缩合反应的赖氨酸(＞K-)(有商品原料提供)由此一个赖氨酸(＞K-)就可以缩合连接上2个氨基酸，如果被连接上的是2个赖氨酸(＞k2＞K-)又可以继续往下连接4个氨基酸，如果被连接上的是4个赖氨酸(＞K4＞k2＞K-)又可以连接上8个氨基酸，依次往下继续进行氨基酸加成缩合反应就可以得到连有8个拷贝X片段的多肽产物。
多肽分子是一类具有生物活性的分子，它们的氨基酸序列和结构决定了它们的生物学作用。本发明涉及将以X和Y为代表的两种不同但具生物学相关性的多肽或寡肽功能片段通过赖氨酸(＞K-)构成的Linker的连接制备出单拷贝的Y片段与多拷贝的X片段相连接产生的生物活性物质。多肽合成的顺序是首先从肽的羧基端开始，首先合成Y片段，通过在其后连接具有2个活化氨基的赖氨酸(＞K)进行后续的缩合反应产生的Linker可以是＞K-Y、＞K2＞K-Y或＞K4＞K2＞K-Y，或利用Y片段的氨基末端具有的赖氨酸做多拷贝连接，由此可以在Y片段的后面连接上2个、4个或8个拷贝的X片段。采用合成的方式将多拷贝X和单拷贝Y两种不同的功能片段连接在一起，制备而成的活性产物可提高X和Y两种功能片段相互之间的协同作用，提高了两种功能片段的生物活性作用。目前多肽合成的商业服务可根据客户的要求提供合成产物，在此只着重多肽产物的结构设计和应用。关于多肽合成的具体细节和原理我们在此不再累叙，请参见由盛树力主编，科学技术文献出版社(1998年)出版的“多肽激素的当代理论和应用”一书。
实施例1 采用固相合成的方式(Fmoc)合成的Y片段为3肽囊素KHG-NH2，连接多拷贝X为4肽促吞噬素TKPR所形成的生物活性物质。首先合成的囊素分子(赖氨酸-组氨酸-甘氨酰胺，Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH2)的羧基端是甘氨酰胺，所以采用“甘氨酰胺”与树脂相连的氨基树脂启动合成，然后逐个结合氨基酸延长肽链并通过赖氨酸(＞K-)的双活性氨基的缩合作用制备出连接多拷贝促吞噬素TKPR的分子，可分别制备出2个拷贝的产物(TKPR)2＞KHG-NH2，4个拷贝的产物(TKPR)4＞K2＞KHG-NH2和8个拷贝的产物(TKPR)8＞K4＞K2＞KHG-NH2，它们的分子量分别是1320，2542和4983道尔顿。合成产物经过高效液相色谱的反复纯化可取得纯度＞98.0％的合成产物。应用鸡新城疫灭活疫苗与合成肽产物联合使用，接种到无特定病原体(Specefic pathogen Free，SPF)雏鸡进行检测红细胞凝集抑制试验(HI)，观察合成肽对比促吞噬素和囊素对雏鸡是否有免疫增强作用。
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象，这是一种特异性的抗体中和反应，其原理是根据病毒的血凝素可凝集红细胞，但若先用特异性抗体与病毒作用，再加入红细胞，则不出现红细胞凝集，称为血凝抑制试验(HI)，检测所用的抗血清稀释的最高倍数即是抗体的滴度。待测抗体的滴度越高说明免疫的效果越好。HI方法具有以下优点①敏感性强，可以检测到微量的抗体，结果也较为准确，是较敏感的血清学反应之一；②特异性强，病毒凝集红细胞只能被特异的抗体所抑制；③检测速度快，1次HI试验只需2h左右，即可判定结果；④HI试验对环境要求不高，操作简单，1次还可检测大量的样品。因此细胞凝集抑制试验(HI)已经成为一种常用于检测禽类动物血清抗体的检测方法，具体细节请参见由郭鑫主编，中国农业大学出版社2007年出版的“动物免疫学实验教程”。
材料与方法 疫苗鸡新城疫灭活疫苗(La Sota株) 无特定病源(Specefic pathogen Free，SPF)鸡1月龄左右。
免疫分组(每组10只鸡) 对照组未接种疫苗。
常规免疫组接种常规疫苗0.3ml。
促吞噬素组接种常规疫苗0.3ml，加有TKPR 4肽(20微克/0.1ml/只)。
囊素组接种常规疫苗0.3ml加有囊素KHG-NH2(20微克/0.1ml/只)。
2拷贝组接种常规疫苗0.3ml，加有2拷贝合成肽(TKPR)2-KHG-NH2(含20微克/0.1ml/只)。
4拷贝组接种常规疫苗0.3ml，加有4拷贝合成肽(TKPR)4-K2-KHG-NH2(含20微克/0.1ml/只)。
8拷贝组接种常规疫苗0.3ml，加有8拷贝合成肽(TKPR)8-K4-K2-KHG-NH2(含20微克/0.1ml/只)。
饲养同时饲养在隔离器内自由取食饮水。
采血接种前，接种后21天和28天分别采血，分离血清进行红血球凝集抑制试验(HI试验)。
结果 检测结果表明，2拷贝组、4拷贝组和8拷贝组的HI抗体比正常免疫组、囊素组和促吞噬素组的抗体几何平均滴度(CMT)高约1个滴度，具体结果见表如下 以上结果表明将两种具有提高免疫功能的片段“囊素”和“促吞噬素”按照多拷贝连接的方式(TKPR)n-Linker-KHG-NH2得到的产物具有提高其生物活性的作用，合成产物具有随着与囊素连接的“促吞噬素”拷贝数的增加免疫效果提高的作用，将它们与疫苗联用能够显著提高接种动物对疫苗的抗体反应，能够达到预期的增强免疫能力，提高免疫的效果。
试验结果直接证明了当Y代表的一种免疫片段囊素与2个、4个或8个拷贝的X代表的另一种免疫片段促吞噬素做多拷贝连接后可以达到增强和提高机体免疫应答水平的目的。这种多肽功能片段的结构设计方式所产生的产物可以作为免疫佐剂与疫苗联用以提高疫苗的免疫效果。它们也可以作为刺激机体免疫机能的药物单独使用，此类药物可用于抗肿瘤、抗病毒、抗感染或提高人或动物的机体免疫抵抗能力对疾病的治疗或预防中。
实施例2 病毒性疾病的传播给人类和动物造成严重的疾患和经济损失，其中的鸭肝炎病毒给禽类养殖业中的肉鸭造成致病和死亡，给养殖业带来巨大的经济损失。应用多肽技术制备病毒的多肽疫苗，期望在不涉及或不接触致病病毒的前提下快速制备多肽疫苗为未感染的禽类(鸭)做疾病的免疫预防。
我们选取鸭肝炎病毒(包括Strain A66，Strain ZJ，Strain R和Strain SH)的共享多肽片段YLKDELRKKEKIKE(外壳蛋白1944-1957，14肽)，通过人工合成的方式将多拷贝YLKDELRKKEKIKE片段(X)与具有免疫增强的片段”促吞噬素”TKPR(Y)连接制备成一个具有高免疫应答效果的多肽抗原产物。合成产物通过高效液相色谱仪的纯化得到纯度＞98％的产物。促吞噬素TKPR片段能与免疫细胞表面的FC受体起反应(Immunol.Lett(1982)Vol4，215)，刺激和提高免疫细胞的功能，提高机体对与其相连接的多拷贝抗原片段产生的免疫应答反应。应用TKPR作为载体来携带(连接)多拷贝的抗原片段，TKPR与抗原片段对体内淋巴细胞起到的协调作用能够刺激和提高机体对抗原片段的免疫应答水平。
按照前述的制备方式合成如下的产物 对照组(8拷贝抗原片段) (YLKDELRKKEKIKE)8＞K4＞K2＞K 分子量15322.5道尔顿 试验组(8拷贝抗原片段与与促吞噬素连接) (YLKDELRKKEKIKE)8＞K4＞K2＞K-TKPR 分子量15804.8道尔顿 试验目的 选择含有8拷贝的多肽抗原片段制备的活性分子与单纯含有8拷贝的多肽抗原片段做免疫效果比较。试验中不采纳单拷贝YLKDELRKKEKIKE多肽抗原片段做对照的原因为由于单拷贝的YLKDELRKKEKIKE多肽片段的分子太小难以激发机体的免疫应答反应所以不能单独作为抗原使用(单拷贝的多肽抗原片段必须与不相关大分子偶联之后才能作为抗原使用)。而将单拷贝的多肽抗原片段做多拷贝的连接，或与免疫增强片段做多拷贝的连接形成的产物分子足够能激发机体产生免疫应答反应，因此可以免去与不相关大分子做偶联的复杂操作过程。
材料与方法 试验动物 新西兰大耳白兔雌雄不限，6-12月龄，体重1.5-2.0kg/只，每组5只。
免疫方式 经冻干的合成产物用生理盐水溶解并配制成0.5mg/0.5ml/只的使用量，以同体积的弗氏全佐剂(Sigma公司)混合并乳化。在动物的背部做皮下多点免疫(约100ul/点)。在第一次免疫后的第28天进行第二次免疫，方式同前但使用弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，以后每隔7天对兔的脚掌肉垫内给予加强免疫一次，剂量如前但无佐剂，共免疫4次。
结果测定 在动物免疫之前和第4次免疫之后的第7天分别从每只兔耳缘静脉取血2ml，室温静置1小时后离心取血清。
采用酶联免疫检测法(ELISA)测定血清中针对YLKDELRKKEKIKE多肽片段所产生的抗体效价。将YLKDELRKKEKIKE多肽配成5mg/L的浓度，取100ul/孔包被ELISA板，每个稀释度2孔。对照组和试验组均为第四次免疫后所取血清，将血清做从1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000范围的稀释，取100ul/孔并与免疫前血清做空白对照。用HRP标记的羊抗兔IgG结合兔反应抗体并用酶标仪检测A450nm的读数，以A450＞0.23为阳性。ELISA的具体操作参见由鲍建芳，沈建根主编的由浙江大学出版社2006年出版的“免疫学实验技术”，在此不再累叙。
ELISA检测结果 试验证明，将多拷贝多肽抗原片段与单拷贝免疫增强片段连接制备的多肽抗原具有如下优点 1.由于单拷贝多肽抗原片段YLKDELRKKEKIKE的分子量比较小，作为免疫原不足以激发机体产生抗体，如作为抗原需将短肽片段与大分子载体蛋白如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)做偶联。由于制备的抗原产物(YLKDELRKKEKIKE)8＞K4＞K2＞K和(YLKDELRKKEKIKE)8＞K4＞K2＞K-TKPR分子量足以激发免疫系统的反应，因此免去了做分子偶联的步骤。
2.由于免疫增强片段与多肽抗原片段相互连接使得抗原片段更易接近免疫细胞，在免疫增强片段的作用下机体的免疫活力有所提高，使机体对多肽抗原片段的免疫应答水平得到相应提高。
根据这种设计方式，X代表的“第一功能片段”可以是任意一类能够激发机体免疫细胞应答反应的多肽抗原片段，如能够激发B淋巴细胞产生抗体，激发T淋巴细胞产生细胞毒作用的多肽抗原片段，它们可以是肿瘤特异蛋白或肿瘤相关蛋白来源的多肽抗原片段；可以是外源性致病微生物包括细菌、真菌、病毒等特异蛋白来源的多肽抗原片段；可以是内源性变异细胞或致病相关蛋白来源的特异多肽抗原片段。
Y所代表的“第二功能片段”可以是任意一类具有免疫增强功能的多肽或寡肽片段，如促吞噬素Tuftsin(TKPR或TKLK)，囊素Busin(KHG-NH2)等；可以是任意一类能够与细胞表面受体结合的多肽或寡肽配体片段；可以是任意一类细胞膜表面的多肽或寡肽信号肽片段、穿膜片段；可以是任意一类能够与细胞内亚细胞器结合或起生物学反应的多肽或寡肽片段，如内质网滞留信号肽(KDEL或RDEL)；可以是任意一类细胞因子中的功能片段等及其它具有特定生物学功能的多肽或寡肽片段。
以上试验证明了多肽活性分子是可以按照人为的方式设计，应用多肽合成技术将X代表的多拷贝“第一功能片段”通过赖氨酸(＞K-)为桥梁的Linker与Y为代表的单拷贝“第二功能片段”连接在一起形成Xn-Linker-Y的多肽结构产物，如此可以通过合成的方式将两种生物功能不同但又具相关性的多肽片段连接在一起并高效率地产生出来。合成产物能够有效地发挥两种功能片段之间产生的相互协同作用来加强或提高生物学活性作用，通过这种方式可以制备出人工合成的多肽抗原，制备出多肽疫苗用于抗肿瘤、抗病毒等相关疾病的治疗及预防。
文中阐述的将两种功能不同但又具生物学相关性的肽类片段通过Xn-Linker-Y的连接方式所产生的多肽可广泛地应用在多肽药物设计、多肽疫苗的设计，其产物可成为药物或疫苗应用到对疾病的治疗及预防领域中。
权利要求
1、一种多拷贝多肽，其特征为，其分子结构为Xn-Linker-Y；其中X为第一功能片段，n代表X的拷贝数，Y为第二功能片段，X和Y分别代表两种不相同的但具相关性的生物功能的多肽或寡肽片段，Linker代表由赖氨酸(Lys，或K)形成的连接将X以多拷贝的形式与单拷贝Y连接。
2、根据权利要求1所述的多拷贝多肽，其特征在于所述的Linker为＞K-、＞K2＞K-或＞K4＞K2＞K-，其中的K为赖氨酸，是具有2个活化氨基可供进行氨基酸加成缩合反应的赖氨酸。
3、根据权利要求2所述的多拷贝多肽，其特征在于所述的Xn中的n为2、4、或8。
4、一种多拷贝多肽，其特征在于是对权利要求1-3任一项所述的多拷贝多肽中的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化所得到的产物。
5、一种多拷贝多肽，其特征在于是对权利要求1-3任一项所述的多拷贝多肽中的氨基酸侧链基团上、产物的氨基端或羧基端添加氨基酸或其他任意化学元素。
6、一种多拷贝多肽，其特征在于是对权利要求1-3任一项所述的多拷贝多肽中在由赖氨酸组成的Linker中插入任意氨基酸或其他任意化学元素。
7、一种肽类药物，其特征在于其包含权利要求1-5任一项所述的多拷贝多肽。
8、一种免疫增强剂，其特征在于其包含权利要求1-5任一项所述的多拷贝多肽。
9、一种疫苗，其特征在于其包含权利要求1-5任一项所述的多拷贝多肽。
10、权利要求1-5任一项所述的多拷贝多肽作为肽类药物、免疫增强剂或者多肽疫苗的应用。
全文摘要
本发明是关于一种多拷贝多肽及其应用。该多肽分子结构为Xn-Linker-Y，其中X和Y分别代表生物学功能不同但具相关性的多肽或寡肽片段，通过由赖氨酸组成的Linker将多拷贝X与单拷贝Y连接，通过两种片段之间的生物协同作用提高产物的生物活性，以此方式制备的多肽适用于生物医药领域。
文档编号A61K38/10GK101607984SQ20081011095
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者苏 韩 申请人:北京中天康泰生物科技有限公司, 北京元森康泰医药研究有限公司