专利名称：：一种丹参总酚酸注射剂的质量控制方法
技术领域：
：本发明涉及中药质量控制领域，具体涉及一种丹参总酚酸注射剂的质量控制方法。
背景技术：
：丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根茎，是我国传统医学中应用最早且最为广泛的药物之一，经过长期的临床应用和现代医学研究，对其临床效果、药理作用有了全面的认识。传统中医药理论认为丹参能活血祛瘀；调经止痛；养血安神；凉血消痈，主治妇女月经不调；痛经；经闭；产后瘀滞腹痛；心腹疼痛；癥瘕积聚；热痹肿痛；跌打损伤；热入营血；烦躁不安；心烦失眠；痈疮肿毒。现代药理学研究表明，丹参具有脑缺血保护、改善冠脉血流量及微循环、促进组织修复、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗炎抑菌等功效，临床上主要用于冠心病冠心病、急性心肌梗塞、脑梗塞、慢性肝炎等病。近年来研究还发现，丹参对失眠、慢性肝炎、肿瘤和消化道溃疡等病症也有一定疗效。(中国专利，申请号200710111232.4，申请日2007.6.18)。丹参中的有效成分包括脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分是以丹参酮为代表的醌类化合物，具有良好的抗炎作用；水溶性成份主要有丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(A、B)，总称为总酚酸，也有报道称为丹参多酚酸盐或丹参多酚酸。丹参总酚酸具有明显的抗血栓形成、溶纤和抗脂质过氧化等作用，是治疗心肌缺血、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病的有效成分，其中丹酚酸B的含量最高，而且是其主要的活性成分。(丹参中总酚酸的分离纯化工艺研究，杨小宁等，中草药，2007，38(6):843-846)。丹参总酚酸注射剂包括丹参总酚酸的注射液、粉针剂和输液等，功能主治为活血通络。用于中风病中经络瘀血阻络症发病l周到6个月，症见半身不遂，口舌歪斜，舌强言謇或不语，动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞见上述症候者。临床上广泛应用于心绞痛、心肌梗死等心脑血管疾病的治疗和预防。丹参总酚酸注射剂质量标准中的指标多为理化检验指标及部分安全性(热源等)的生物指标。对丹参总酚酸注射剂有效成分(丹参总酚酸)进行定量分析是其质量标准的重要内容，对保证临床用药的安全有效有着特殊的重要意义。但是丹参总酚酸注射剂成分复杂，测定各个单一成分不仅难度大，且不足以全面反映丹参总酚酸注射剂的内在质量。
发明内容为了解决上述问题，本发明通过检验样品有效性的生物指标(即观察样品的药效结果)，方便有效地实现丹参总酚酸注射剂质量控制。本发明的质量控制方法是通过观察样品对试验动物体内血小板聚集功能影响为指标实现的，优选以对比样品与对照对试验动物体内血小板聚集抑制率为指标。本发明的质量控制方法，通过下述技术方案实现(1)以生理盐水或葡萄糖注射液或注射用水为对照；3(2)样品及对照均采用注射给药；(3)测定样品与对照对实验动物的血小板最大聚集率；(4)根据各组血小板最大聚集率计算血小板聚集抑制率；(5)结果判断样品组与对照组血小板最大聚集率进行组间比较(t检验)，应有显著性差异。所述步骤(3)按比浊法，采用血小板聚集仪测定样品与对照对实验动物的血小板最大聚集率。优选步骤为分别取试验及对照动物血样，抗凝，离心，分别制成富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，温育，将聚集诱导剂加入PRP中，记录血小板最大聚集率。进一步优选为包括如下步骤分别取试验及对照动物血样，置硅化离心管中，以3.8%柠檬酸钠溶液9:1抗凝，1000rpm离心5分钟，制成富血小板血浆(PRP)，以2000rpm离心IO分钟，制成贫血小板血浆(PPP)，按比浊法，采用血小板聚集仪测定血小板的最大聚集率。以0.2mlPRP置测定管中，O.2mlPPP置另一侧测定管中(对照管)校正100%透过率值。温育5分钟，再将0.2mlPRP置测定管中加入200iimo1的聚集诱导剂(5'-腺苷二磷酸二钠盐)10ii1，随即记录5分钟内血小板最大聚集率。所述步骤(4)中，血小板聚集抑制率计算方法为血小板聚集抑制率(％)=(对照组聚集率_给药组聚集率)/对照组聚集率。本发明的丹参总酚酸注射剂可以按照包括如下步骤的方法制备丹参用水或含水乙醇提取；提取液在除去乙醇后经聚酰胺层析或非极性或弱极性大孔树脂层析或聚酰胺与大孔树脂组合进行纯化，得丹参总酚酸，加入适合的辅料，得到丹参总酚酸注射剂。优选地，本发明的注射剂可以按照包括如下步骤的方法制备丹参用含水乙醇，提取液浓縮至无醇；提取物经过聚酰胺层析，用水或30%以下的乙醇洗去杂质，以30-100%乙醇或0.01-0.5%碳酸氢钠或0.01-0.5%碳酸钠洗脱，收集洗脱液，调节pH值不高于5.5，通过大孔树脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去杂质，30-100%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓縮、干燥，得丹参总酚酸，加入适合的辅料，得到丹参总酚酸注射剂。更优选地，本发明的注射剂可以按照包括如下步骤的方法制备丹参用浓度20%_90%乙醇提取，提取液浓縮至无醇；提取物经过聚酰胺层析，用水或30%以下的乙醇洗去杂质，以30-95%乙醇或0.05-0.3%碳酸氢钠或0.01-0.3%碳酸钠洗脱，收集洗脱液，调PH1-5.5，通过弱极性或非极性大孔树脂柱，水洗或20%以下乙醇洗去杂质，30-95%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓縮、干燥，得丹参总酚酸，加入适合的辅料，得到丹参总酚酸注射剂。更优选地，本发明的注射剂可以按照包括如下步骤的方法制备(1)原料制备丹参饮片1000克，6000ml水煮沸提取三次，每次0.5小时。合并提取液，过滤，滤液用10%盐酸调ph值3.5后通过1000克AB-8大孔树脂柱，10000ml水冲洗，50%乙醇10000ml洗脱，洗脱液浓縮到无醇，浓縮液通过500克聚酰胺，12000ml30X乙醇冲洗，12000ml95%乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，喷雾干燥。得提取物28克，丹酚酸B含量59%、丹参总酚酸83.1%。4(2)制剂处方组成和制备丹参总酚酸100g，甘露醇100g，注射用水加至2500ml取丹参总酚酸，加注射用水1000ml适量使溶解，搅匀；另取甘露醇，加注射用水500ml使溶解，加入上述溶液中，搅匀，0.5克活性炭保温搅拌20分钟，过滤，滤液调节pH值为4.55.O，加注射用水至2500ml，除菌过滤，分装，冷冻干燥，制成1000支，即得。目前已分离得到的丹酚酸化合物有18种，除较常见的原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸和丹参素外还有縮酚酸类的丹酚酸A、B、C、D、E、紫草酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯和属新縮酚酸类的丹酚酸F、G、H、I、J及异酚酸C。由此可见丹酚酸类成分异常复杂。中药的成分复杂，由于工艺原因及药材产地、品质的不同，很难保证各批次间化学成分组成的稳定及各成分比例的稳定。药物疗效的基础是其化学成分，化学成分的不稳定直接影响到产品疗效。传统的中药质量标准只是简单的测定其中的一种(少数测定几种)成分含量，不可能将中药中所有的成分进行测定，再者，由于现有技术的限制，含量测定的成分不一定是起到疗效的主要成分。由以上原因，含量测定不能有效控制中药的药效。本发明通过检验样品有效性的生物指标(即观察样品的药效结果)，通过测定样品的生物活性来检验产品质量，方便有效地实现了丹参总酚酸注射剂质量控制，整体上表征了丹参总酚酸注射剂的质量，简单易行，结果准确可靠。丹参总酚酸为本领域的通用命名，现有技术中还有丹参多酚酸、丹参多酚酸盐等命名，实质与丹参总酚酸相同。具体实施例方式下面通过具体的实施方式对本发明的质量控制方法进一步说明，但不作为对本发明的限制。实施例1l供试样品与试剂1.1注射用丹参总酚酸天津天士力之骄药业有限公司20060601、20060801、20061101批。1.2聚集诱导剂5腺苷二磷酸二钠盐(ADP):规格0.lg:瓶，批号A2754，美国SIGMA公司生产。1.3盐酸肾上腺素规格lmg/ml/支，批号0608181，天津金耀氨基酸有限公司。1.4胶原蛋白规格lg/瓶，批号124H7060，美国SIGMA公司生产。1.50.9X氯化钠注射液规格500ml/瓶，批号6180C，由中国大冢制药有限公司生产。2仪器BS-634血小板聚集仪，北京生化仪器厂生产。3动物3.1小鼠，品系CD-1(ICR)，体重26-28克，雄性，SPF级。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)-2002-0003。3.2大鼠品系SD，体重220-240克，雄性，SPF级。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK(京)-2002-0003。试验方法与结果取SD大鼠40只，雄性，均分为4组，设对照组，给予等量生理盐水，试验组给予注射用丹参总酚酸20060601、20060801、20061101批39.9mg/ml(相当于人日临床用量的30倍)。给药体积10ml/kg，给药速度为2ml/min，各组大鼠均自尾静脉注射连续给药3天，测定前一天禁食，于末次给药后20分钟，大鼠腹腔注射20%乌拉坦lg/5ml/kg麻醉。仰卧位固定。以硅化注射器自大鼠腹主动脉采血，置硅化离心管中，以3.8%柠檬酸钠溶液9:1抗凝，1000rpm离心5分钟，制成富血小板血浆(PRP)，以2000rpm离心10分钟，制成贫血小板血浆(PPP)，按比浊法，采用BS-634型血小板聚集仪测定血小板最大聚集率，每只大鼠取PRP0.2ml置于测定管中，将0.2mlPPP置于另一测定管中(对照管)校正100%透过率值。温育5分钟，再将0.2mlPRP置测定管中加入200ymolADP溶液10y1，随即记录5分钟内血小板最大聚集率。以各组的血小板最大聚集率进行组间比较(t检验)，并计算出血小板聚集抑制率。结果见下表血小板聚集抑制率(％)=(对照组聚集率_给药组聚集率)/对照组聚集率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果与对照组比较，样品组有显著性差异。符合规定。本领域的技术人员可以结合本领域的普通知识，将上述方法应用到丹参总酚酸注射剂的其他形式，如粉针剂、输液等，而无需花费创造性地劳动。本发明的质量控制方法可以扩展到所有以体内血小板抑制率为药效指标的药物和剂型，例如丹参总酚酸的颗粒剂、片剂、胶囊等，均落在本发明的保护范围之内。实施例2丹参总酚酸注射液的制备——原料制备丹参饮片1000克，6000ml水煮沸提取三次，每次0.5小时。合并提取液，过滤，滤液用10%盐酸调ph值3.5后通过1000克AB-8大孔树脂柱，10000ml水冲洗，50%乙醇10000ml洗脱，洗脱液浓縮到无醇，浓縮液通过500克聚酰胺，12000ml30X乙醇冲洗，12000ml95%乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，喷雾干燥。得提取物28克，丹酚酸B含量59%、丹参总酚酸83.1%。实施例3丹参总酚酸注射液的制备——原料制备丹参饮片1000克，6000ml水回流提取四次，每次0.5小时。合并提取液，离心，上清液通过500克聚酰胺，12000ml水冲洗，无水乙醇12000ml洗脱，洗脱液浓縮到无醇并加水到约1克药材/ml，调pH值4.5，通过1000克大孔树脂，4000ml水冲洗，8000ml50%乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，减压干燥。得提取物30克，丹参水溶性提取物B含量58.3%、迷迭香酸3.5%、紫草酸4.2X、丹参水溶性提取物E0.5%，四种成分总含量66.5%。总酚酸85%。实施例4丹参总酚酸注射液的制备——原料制备丹参饮片1000克，5000ml75%乙醇回流提取三次，每次1小时。合并提取液，浓縮至无醇，过滤，滤液调pH值3.5后通过300克聚酰胺，12000ml水冲洗，50%乙醇12000ml洗脱，洗脱液浓縮到无醇并加水到约1克药材/ml，浓縮液调pH5.O，通过1000克大孔树脂，4000ml水冲洗，1000ml50X乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，减压干燥。得提取物45克，丹参水溶性提取物B含量71%、迷迭香酸3.1%、紫草酸2.7%、丹参水溶性提取物EO.2%，四种成分总含量77%。总酚酸92%。实施例5丹参总酚酸注射液的制备——原料制备丹参饮片1000克，5500ml水回流提取三次，第一次1小时，第二、三次0.5小时。合并提取液，调ra值2.5，离心，上清液通过500克聚酰胺，12000ml水冲洗，0.1%碳酸氢钠12000ml洗脱，洗脱液调pH2.O，浓縮液通过1000克大孔树脂，4000ml水冲洗，8000ml50%乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，减压干燥。得提取物30克，丹参水溶性提取物B含量55.48%、迷迭香酸3.55X、紫草酸4.42、丹参水溶性提取物E0.32%，四种成分总含量63.77%。总酚酸87%。实施例6丹参总酚酸注射液的制备——原料制备丹参饮片1000克，5500ml90%乙醇回流提取三次，第一次1小时，第二、三次0.5小时。合并提取液，调ra值l，离心，上清液通过500克聚酰胺，12000ml水冲洗，O.3%碳酸氢钠12000ml洗脱，洗脱液调pH1.O，浓縮液通过1000克大孔树脂，4000mll5%乙醇冲洗，8000ml95%乙醇洗脱，浓縮乙醇洗脱液，减压干燥。得提取物30克，丹参水溶性提取物B含量54.00%、迷迭香酸3.55%、紫草酸5.02、丹参水溶性提取物E0.40%，四种成分总含量62.97%。总酚酸87%。实施例7丹参总酚酸注射液的制备——成品制备处方丹参总酚酸100g甘露醇100g注射用水加至2500ml取丹参总酚酸，加注射用水1000ml适量使溶解，搅匀；另取甘露醇，加注射用水500ml使溶解，加入上述溶液中，搅匀，0.5克活性炭保温搅拌20分钟，过滤，滤液调节pH值为4.55.O，加注射用水至2500ml，除菌过滤，分装，冷冻干燥，制成1000支，即得。权利要求一种丹参总酚酸注射剂质量控制方法，其特征在于以观察样品的药效结果为指标。2.权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于以观察样品对试验动物体内血小板聚集功能影响为指标。3.权利要求2所述的质量控制方法，以对比样品与对照对试验动物体内血小板聚集抑制率为指标。4.权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于包括以下步骤(1)以生理盐水或葡萄糖注射液或注射用水为对照；(2)样品及对照均采用注射给药；(3)测定样品与对照对实验动物的血小板最大聚集率；(4)根据各组血小板最大聚集率计算血小板聚集抑制率；(5)结果判断样品组与对照组血小板最大聚集率进行组间统计学比较，如有显著性差异认为合格，否则认为不合格。5.权利要求4所述的质量控制方法，所述步骤(3)按比浊法，采用血小板聚集仪测定样品与对照对实验动物的血小板最大聚集率。6.权利要求5所述的质量控制方法，所述步骤(3)步骤为分别取试验及对照动物血样，抗凝，离心，分别制成富血小板血桨和贫血小板血桨，温育，将聚集诱导剂加入富血小板血浆中，记录血小板最大聚集率。7.权利要求6所述的质量控制方法，所述步骤(3)步骤为分别取试验及对照动物血样，置硅化离心管中，以3.8%柠檬酸钠溶液9:l抗凝，1000rpm离心5分钟，制成富血小板血浆(PRP)，以2000rpm离心10分钟，制成贫血小板血浆(PPP)，按比浊法，采用血小板聚集仪测定血小板的最大聚集率。以O.2mlPRP置测定管中，0.2mlPPP置另一侧测定管中(对照管)校正100%透过率值。温育5分钟，再将0.2mlPRP置测定管中加入200iimo1的聚集诱导剂(5'_腺苷二磷酸二钠盐)1(^1，随即记录5分钟内血小板最大聚集率。8.权利要求4所述的质量控制方法，所述步骤(4)中，血小板聚集抑制率计算方法为血小板聚集抑制率(％)=(对照组聚集率-给药组聚集率)/对照组聚集率。全文摘要本发明提供了一种丹参总酚酸注射剂的质量控制方法，该方法通过检验样品有效性的生物指标(即观察样品的药效结果)，方便有效地实现丹参总酚酸注射剂质量控制。通过测定样品的生物活性来检验产品质量，方便有效地实现了丹参总酚酸注射剂质量控制，整体上表征了丹参总酚酸注射剂的质量，简单易行，结果准确可靠。文档编号A61P7/02GK101744880SQ20081015379公开日2010年6月23日申请日期2008年12月5日优先权日2008年12月5日发明者岳洪水申请人:天津天士力之骄药业有限公司