专利名称：：一种快速鉴定胚胎期小鼠性别的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种鉴定胚胎期小鼠性别的方法，特别是涉及鉴定胚胎期14.5天(E14.5d)至16天(E16d)小鼠性别的方法。
背景技术：
：小鼠作为实验动物的理想模型,被广泛用于医学，生物,农业等科研领域。而小鼠发育至胚胎期(尚未出生)14.5天左右的时候正是性腺激素分泌高峰时期，也是神经系统发育高峰期,此时期是许多科研取材用于与性腺激素调控相关的组织器官的研究以及与性腺激素相关信号通路的研究等方向的关键时期。因此，这一时期胎鼠性别的快速鉴定，对于科学研究具有重要意义。目前，胎儿性别鉴定的分子生物学方法主要有核型分析法，PCR法，X-连接酶检测法等。核型分析方法的准确率较高，但是鉴别时间长,需要对细胞进行建系。PCR法简单，灵敏，但要保证准确率，通常需要复合PCR的方法进行鉴定，也比较耗时。X-连接酶检测法使用的染料对胚胎的存活不利，酶失活时间也不易确定。许多时候，科研人员需将胎儿组织冷冻起来，先取部分样品借助分子生物学手段对其性别进行鉴定，之后才能选择特定性别的样品进行实验研究。也有研究人员，将性腺部位解剖后，通过生殖腺的内部早期发育特点判断性别，但这样做需要有长期的实践经验,不适用于所有人。那么，如果可以找到一种简单、快速而又直观的方法鉴定这-时期的胎鼠性别，无疑可以给科学研究人员提供极大的方便，既可以大大提高实验效率，保证实验的精确性，又能节省人力物力。小鼠乳腺的发育最早起始于Ell.5天,形似凸透镜，E16天后，腺芽顶端生长迅速，形成萌芽并进一步向真皮层乃至乳脂垫延伸出乳腺导管，并出现分叉。从乳腺组织雏形形成到乳腺导管形成之前的Ell.5E16天这段发育时期称为乳腺发育早期的乳腺原基(ma咖aryanlagen)时期(Robinson,2004;Veltmaatetal.2003)。在乳腺原基时期的E14dE16d,雌性小鼠和雄性小鼠的乳腺原基受雌激素和雄激素的不同刺激，将经历不同的发育变化。雄性小鼠乳腺原基周围的间叶组织表达雄激素受体(AR)，应答雄激素而诱导乳腺小芽发生退化。雌性小鼠乳腺原基周围的间叶组织没有活跃的AR表达而不会受到影响(Kratochwil&Schwartz1976)。基于这个理论，发明人观察这一特殊时期不同性别胎鼠乳腺原基的发育变化，意外发现通过观察乳腺原基的方法可以快速区分胎鼠E14.5E16天的性别，并通过分子生物学方法对这一判断方法的准确率进行了统计，证明此方法简单可行。
发明内容本发明的目的在于提供一种能快速准确的鉴定胚胎期14.5天至胚胎期16天小鼠性别的方法，为科学实验研究提供方便。本发明提供的快速鉴定胚胎期小鼠性别的方法，包括如下歩骤取胚胎期14.516天的胎鼠，置于体视镜下，观察胎鼠第4、5对乳腺,乳腺原基呈现为白色圆点的为雄性；3乳腺原基呈现为与皮肤界限模糊的圆晕的为雌性。雄性胎鼠乳腺原基呈现的白色圆点为针尖大小，直径约为250300um，与周围皮肤颜色差异显著。雌性胎鼠的乳腺原基则与周围皮肤界限不清晰，呈现出模糊的圆晕。在观察时体视镜的放大倍数以0.8*10倍(8倍)为宜，并且使用外光源辅助观察。当然，本领域技术人员应当理解，是否使用体视镜以及放大的倍数对本申请没有实质的影响。从子宫中取出胚胎，在观察前应当用PBS对胎鼠进行清洗，以便提高观察效果。此外，还可以进一步分离乳腺原基，观察乳腺原基的形态，中间具有透明空腔的为雌性，没有透明空腔的为雄性。经PCR验证表明，本发明方法通过乳腺原基的外观判断胎鼠的性别是可靠的。在胚胎期第1516天，其准确率可达到百分之百。本发明方法为科学研究人员提供极大的方便，既可以大大提高实验效率,保证实验的精确性，又能节省人力物力。图1是E15.5天胎鼠腹部体视镜拍摄外观图。E15.5天不同性别胎鼠腹部中线两侧的第4,第5对乳腺已呈现明显差异。左边为雌性胎鼠，箭头所示为雌性胎鼠乳腺原基(雌性乳腺原基呈圆晕状，与周围皮肤颜色差别不明显)；右边为雄性胎鼠，箭头所示为雄性胎鼠乳腺原基(雄性乳腺原基为白色圆点，与周围皮肤颜色差异显著)。图2显示的是体视镜下分离得到的不同性别胎鼠的乳腺原基。左....匕为雌性中间有透明空腔，右下为雄性，中间退化成黑色。图3显示的是不同性别胎鼠的核型差异。A、B为雌性，染色体总数为4()，最小染色体数为2;C、D为雄性，染色体总数为40，最小染色体数为1。图4SryY染色体特异基因的PCR扩增鉴定及电泳检测。泳道1为已知雌性小鼠的对照样本；2为已知雄性的对照样本；3和4为待检母鼠样本；5和6为待检公鼠样本；泳道7为l()()bpMarker。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1一、材料和器具1、实验动物正常野生型SPF级ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并于SPF级实验鼠房中按标准饲养，12小时光照，自由采食。2、药品DPBS为Gibco公司产品3、主要仪器设备1)电泳仪DYY-III2稳压电泳仪，北京六一仪器厂2)体视镜日本NIKON公司3)超净工作台北京净化设备厂4)低温离心机E卯endorf公司5)凝胶成像系统:ALPHA]:NN()TEC:H公司6)PHS-3C酸度计上海虹益仪器厂7)自动灭菌锅日本SANYO公司8)37°C恒温水浴仪美国LIFESCIENCE公司9)9700型:PCR仪:美国PERKINELMER公司10)二氧化碳培养箱美国PERKINELMER公司11)超纯水仪美国MILLIPORE公司4、试剂的配制DPBS缓冲液称取DPBS粉末9.55g，使用超纯水溶解，调节PH值=7.2，1L容量瓶定容，0.22"m滤膜过滤除菌，pH=7.27.4，4。C储藏备用。二、实验方法1、胎鼠的获得和日龄的确定将8周龄ICR雌性发情小鼠于下午4点左右放入种公鼠笼子中进行交配，隔日早上8点检查阴栓，确定是否受孕。以见栓日为第0.5天，14天后早上取得的胎鼠计为胚胎期14.5天；如此计算，晚....匕取得的胎鼠计为胚胎期15天；次日早....匕取得的胎鼠计为胚胎期15.5天；次日晚上取得的胎鼠计为胚胎期16天。2、不同日龄乳腺原基的分离将围产期指定日期(以胚胎期15.5天为例)的雌性母鼠脱颈处死，70%酒精消毒腹部。用已灭菌的手术剪刀、镊子小心剪开腹部皮肤，小心将子宫剪下，迅速放入盛有DPBS的培养皿中，用弯头镊小心将子宫壁撕破，取出胎儿，并将其转移至另一盛有DPBS的培养皿中，反复清洗3遍至液清为止。体视镜下，用外光源照射胎鼠腹部,根据乳腺原基的颜色和大小等外部特点区别雌雄，如图1所示胎鼠腹部中线两侧的第4，第5对乳腺已呈现明显差异。左边为雌性胎鼠，箭头所示为雌性胎鼠乳腺原基(雌性乳腺原基呈圆晕状，与周围皮肤颜色差别不明显)；右边为雄性胎鼠，箭头所示为雄性胎鼠乳腺原基(雄性乳腺原基为白色圆点，与周围皮肤颜色差异显著)。分装两个培养皿中。在体视镜下去除胎鼠头部及四肢，用眼科镊和游丝镊沿胎鼠体躯两侧壁分别剥离腹部皮肤,用游丝镊剥离乳腺原基，对乳腺原基进行观察(如图2)。取剩余组织进行细胞培养和提基因组DNA。3、核型分析(1)将不同性别的胎鼠组织样品(经外观判定性别，分离乳腺原基后的组织样品)，取-一部分经胰酶消化后，进行培养,培养到细胞处于对数生长期时即可。(2)去除培养瓶中的培养液，加入含有0.lug/ml秋水仙素的(DMEM+10%FBS)溶液10ml，放入C02培养箱12小时。(3)取出培养瓶观察细胞分裂相，多则优，倒出含秋水仙素的培养液于15ml离心管中，加入胰酶，将分裂中期的细胞消化下来，再加入刚刚放于15ml离心管的含秋水仙素的培养液终止胰酶活性，然后再全部移入15ml离心管中，1200rpm，离心4min。(4)去上清液，加入0.075M的KC1低渗溶液处理30min,低渗液应先在37。C水浴中预热半小时，低渗处理的细胞在离心管中也放入37"C水浴中预热。加低渗液时还要注意，第lml应逐滴加入，而且边滴边振摇。(5)低渗处理30min后，继续加入1ml4。C下预冷的固定液(乙酸甲醇=1:3)并按住瓶口立即倒置两次预固定。离心，l(X)()rpra，l()rain。(6)去上清液，往离心管中加10ml冷的固定液，第lml同样逐滴加入，边滴边摇匀，固定30min(即静置30min)，离心，1000rpm，10min。(7)二次固定，步骤同(6)，固定时间变为15min,离心，1000rpm，10min，去上清。[,](8)三次固定，重复(7)步骤。(9)去上清后，视细胞沉淀量的多少加入适量固定液重悬(100-500iU)。(10)重悬细胞使之均匀后即可滴片，玻片要求洁净湿冷，(从-201:冰箱中取出，再用口吹干玻片上的霜变成水使玻片透明可见即可)。滴加细胞悬液一滴一玻片。(11)吉姆萨染液染片lOmin，蒸馏水冲洗，显微镜下观察染色体形态。4、SryY染色体特异基因的PCR鉴定(1)SryY基因的DNA引物设计根据NCBI上已报道的小鼠Sry基因序列，使用DNAMAN设计引物上游5-CTGGAAATCTACTGTGGTCTG-3下游5-ACCAAGACCAGAGTTTCCAG-3(2)样品的基因组DNA的提取取已知性别的成年鼠尾各一个样品作为对照；将不同性别的胎鼠组织样品(经外观判定性别，分离乳腺原基后的组织样品)，另取一部分作为检测对象，提基因组DNA:1)剪取少量胚胎组织，尽可能剪碎；2)加入600u1组织提取缓冲液；3)加入20iilRNase(10mg/ml)，混匀，置37。C培养箱lh;4)加入20u1(2()mg/ral)蛋白酶K溶液，混匀，置37。C水浴过夜，其间时不时取出颠倒混匀；5)用等体积的苯酚抽提两遍；6)用等体积的酚仿异戊醇(25:24:i)抽提一遍(离心完毕后，先用移液器深入管底吸走大部分的酚相，只留5()ii1左右，然后再离心5rain，用剪过头的200y1的Tip头自上而下吸取水相，尽量避免携带酚相)；7)加入2倍体积的冰预冷乙醇，颠倒混匀，DNA便以絮状形式出现，用力摇动使絮状DNA成团。8)用灭菌牙签或Tip头将沉淀挑出。7()%的乙醇洗两遍，抽干，溶于3()()111灭菌双蒸水(务必充分溶解，可在55t:水浴中溶解)；9)取1li1电泳点样，检査DNA的提取效果。(3)链式聚合酶扩增反应(PCR)欲扩增片断长度196bp，反应体系2.5mMdNTP2u1Buffer2.5ii1引物各l"lTaq酶1U1基因组lii1H:2()至25U1反应条件94°C5min;94。C30sec，56°C30sec，72°C30sec，32个循环;72。C7min;4。C保存。(3)凝胶电泳检测2%琼脂糖凝胶。5、用以上方法分别对E14d、E14.5d、E15d、E15.5d、E16d的判定结果准确率进行统计表1雌性鉴定统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2雄性鉴定统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>三、实验结果1、胚胎期乳腺外观的直接鉴定将胚胎从子宫中小心分离出来后，PBS小心清洗三遍，在体视镜外光源下0.8*10倍放大,可以明显观察到雌性小鼠与雄性小鼠第4，5对乳腺(腹股沟)所处的位置，乳腺原基从外观上看已经呈现明显的差异——雄性小鼠乳腺呈现针尖大的白色圆点，颜色与周围皮肤明显差异；而雌性小鼠乳腺原基呈现与皮肤界限不是特别清晰的圆晕。如图1。2、乳腺原基的分离基于E14dE16d这一特殊时期，雄性胎鼠来源的乳腺原基会受雄激素诱导而发生退化这一理论,我们发现分离后的乳腺原基也明显呈现显著差异。雌性胎鼠的乳腺原基呈泡状，中间有-个透明的腔(如图2左上)；雄性胎鼠的乳腺原基中间发黑，没有透明的腔，原基的直径也小于雌性胎鼠的乳腺原基(如图2右下)。3、核型分析鉴定方法首先看染色体总数是否为40条(2n=40)，之后确定最小染色体数，若为奇数条，则为雄性(如图3C,D);若为2条或偶数条，则为雌性(如图3A,B)。4、PCR鉴定根据乳腺原基的外观直接判断胎鼠性别的胎鼠组织样品，提基因组后，经PCR扩增，电泳检测结果表明待检公鼠的两个泳道均有明亮的电泳条带(如图4泳道5和6),与己知公鼠对照(泳道2)相一致；待检母鼠的两个泳道(泳道3和4)均没有电泳条带出现，亦与已知母鼠对照(泳道l)相一致。5、统计结果表明E14E16天，雄性胎儿性别判定的准确率可达100%;而对于雌性胎儿性别判断，E14天准确率为70%左右；E14.5天准确率升高到85%以上;E1516天准确率可达100%。E16天以后，由于皮肤上的毛孔逐渐发育变大,再加上原基会向乳脂垫延伸，所以此方法不再适用。以上结果表明，通过乳腺发育早期的乳腺原基外观形态是可以准确、快速鉴定E14.516天胎鼠性别的有效方法。序列表〈110〉北京济普霖生物技术有限公司〈120〉一种快速鉴定胚胎期小鼠性别的方法〈130>KHP08113408.5〈160〉2〈17()〉Patent]:nversion3.5〈210>1〈211>21〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉1ctggaaat.ctactgtggtctg21〈210〉2〈211>2()〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>28accaagaccagagttt.ccag20权利要求一种快速鉴定胚胎期小鼠性别的方法，其包括如下步骤取胚胎期14.5～16天的胎鼠，置于体视镜下，观察胎鼠第4、5对乳腺，乳腺原基呈现为白色圆点的为雄性；乳腺原基呈现为与皮肤界限模糊的圆晕的为雌性。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于,观察时体视镜的放大倍数为8倍，并辅以外光源。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，雄性胎鼠乳腺原基呈现的白色圆点的直径为250300um。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于，在观察前还包括用PBS对胎鼠进行清洗。5.如权利要求14任一项所述的方法,其还包括进一步分离乳腺原基，观察乳腺原基，中间具有透明空腔的为雌性,没有透明空腔的为雄性。全文摘要本发明提供了一种快速鉴定胚胎期小鼠性别的方法，其包括如下步骤取胚胎期14.5～16天的胎鼠，置于体视镜下，观察胎鼠第4、5对乳腺，乳腺原基呈现为白色圆点的为雄性；乳腺原基呈现为与皮肤界限模糊的圆晕的为雌性。经PCR验证表明，本发明方法通过乳腺原基的外观判断胎鼠的性别是可靠的。特别是在胚胎期第15～16天，其准确率可达到百分之百。本发明方法为科学研究人员提供极大的方便，既可以大大提高实验效率，保证实验的精确性，又能节省人力物力。文档编号A61B10/00GK101756714SQ20081024659公开日2010年6月30日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者宋嘉哲,李宁申请人:北京济普霖生物技术有限公司