专利名称：用于预防类固醇性骨坏死的得自淫羊藿的类黄酮馏分的新型组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及巫山淫羊藿(五/7^W/Mm wws/wwe we)提取物、包含巫山淫羊 藿提取物的药物组合物、制备含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物的方法 及它们的应用，具体用于抑制血栓形成和脂质沉积，更具体地，用于预防 或治疗类固醇性骨坏死。
背景技术：
类固醇常用于治疗各种医学病状。脉冲式类固醇常常被指定为用于诸 如严重急性呼吸综合征(SARS)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等严重传染 病，或诸如系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)等慢性自身免疫性 疾病的救生药剂(l-4)。
不可避免地，常常报道有类固醇性骨坏死(5-9)，其在救治严重急性呼 吸综合征(SARS)患者后近来已被强调(10-12)。全关节置换是治疗骨坏死的 最后选择，然而经类固醇治疗的骨坏死患者的术后预后较差(7， 13-14)。因 此，极为理想的是在形成骨坏死损害之前预防类固醇性骨坏死的发展(8)。
对于类固醇性骨坏死达成共识的发病机理近来已经统一至血管内血栓 形成诱发的阻塞和血管外脂质沉积诱发的压迫，从而导致骨内血供系统的 结构功能受损(8、 9、 13、 15)。对于血管内血栓形成，易于同时造成高凝血 和低纤溶的凝血与纤溶间的失衡通常表现为血管内事件(16-18)。对于血管 外脂质沉积，脂质向外周组织的反常运输(9)和过量的PPARY2介导的脂肪 生成(20)涉及血管外事件。
2003年在中国的爆发的严重急性呼吸综合征(SARS)为研究类固醇性 骨坏死提供了独特的循证医学。SARS康复者的骨坏死的流行在华北
1032.7°/。(14)和华南5% 6°/。(10、 ll)之间存在显著差异。令人感兴趣的是，脉、 冲式类固醇治疗后在SARS患者康复过程的草药制剂在华南(具有世界卫生 组织(WHO)推荐的方案的传统中药干预)的使用频率比在华北(WHO推荐的 方案，未以传统中药干预)高得多(3、 20-22)。华南较低的骨坏死流行程度表 明与其对预防类固醇性骨坏死的潜在效果有关。具有免疫调节作用的抗病 毒草药淫羊藿是所述药草之一(21)，其一直也被用作传统中药中的广谱"壮 骨"药草以治疗许多肌骨疾病(23)。
由于抑制血栓形成和脂质沉积可以有助于预防类固醇性骨坏死，因此 对抑制机制的理解至关重要。另一方面，需要开发同时靶向血栓形成和脂 质沉积的强效且特异性的化学抑制剂用于预防或治疗类固醇性骨坏死。此 外，需要开发能够同时抑制血栓形成和脂质沉积并且易于在常规和工业化 学合成的应用中制备和操作的药物组合物。
发明内容
已经发现，本发明的化合物可同时抑制血栓形成和脂质沉积从而预防 或治疗类固醇性骨坏死。
因此，本发明提供了用于抑制血栓形成和脂质沉积的一种包含巫山淫 羊藿提取物的新型药物组合物。
因此，本发明包括一种药物组合物，其中提取物是式(I)的异戊烯基黄 酮苷化合物的组合-
<formula>formula see original document page 11</formula>!^选自由葡萄糖、鼠李糖、、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和 R3是氢或Q.6的烷基。
同样包括在本发明的范围之内的是含有巫山淫羊藿的提取物的药物组 合物，其中，所述提取物选自由淫羊藿属苷A(Epimedoside A)、温哥华苷 F(HexandrasideF)、朝藿定A(Epimedin A)、朝藿定B(EpimedinB)、朝藿定 C(Epimedin C)、淫羊藿苷(Icariin )、宝藿苷-I(Baohuoside-I)及其组合组成的组。
本发明还包括进一步含有一种或更多种药用载体或赋形剂的药物组合 物。进而，本发明包括被配制成剂型不同的各种制剂的药物组合物。
在本发明的另一个方面，提供了包括对有所需要的受试对象施用含有 巫山淫羊藿的提取物的药物组合物的抑制血栓形成和脂质沉积的方法。具 体而言，所述血栓形成是血管内血栓形成，所述脂质沉积是血管外脂质沉 积。
在本发明的又一个方面，提供了预防或治疗类固醇性骨坏死的方法， 所述方法包括对有所需要的受试对象施用含有巫山淫羊藿的提取物的药物 组合物。
在本发明的又一个方面，提供了含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物 在用于抑制血栓形成和脂质沉积的药物的制备中的应用。具体而言，所述 血栓形成是血管内血栓形成，所述脂质沉积是血管外脂质沉积。
在本发明的又一个方面，提供了含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物 在用于预防或治疗类固醇性骨坏死的药物的制备中的应用。
此外，在本发明的其他方面，提供了制备药物组合物的方法，其中所
述方法包括以下步骤
(a) 用溶剂提取植物巫山淫羊藿或其一部分以获得提取物；和
(b) 纯化所述提取物以获得式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物
12其中
R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口
R3是氢或CL6的烷基。
此外，在本发明的这一方面中，式I的异戊烯基黄酮苷化合物选自由 淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、
宝藿苷-I及其组合组成的组。
通过使用上述方法，已经发现，无论是小规模批量还是大规模批量， 均可以稳定地实现从巫山淫羊藿提取类黄酮馏分，并且具有可重复的结果。 本发明的另一个有利之处在于小规模批量提取和大规模批量提取均可实现 高产率。然后可对提取物进行纯化以使本发明的药物组合物具有较高的类 黄酮含量。
出于概括本发明及相对于现有技术取得的有利之处的目的，以上已经 描述了本发明的一些目标和优点。当然，应当理解的是，并非所有上述目 标或优点均可根据本发明的任何具体实施方式
来实现。因此，例如，本领
域的技术人员将承认可以以这样的方式来实施或进行本发明即实现或优 化本文所教导的一个优点或一组优点，而不必实现本文可教导或提出的其 他目标或优点。
本发明的其他特征和优点将由下列详细描述而变得更加清楚。然而， 应当理解表明本发明的优选实施方式的详细描述和具体实施例仅仅是以阐 释的方式给出，这种详细描述将使本发明的实质和范围内的各种变化和改 进对于本领域的技术人员将变得更加清楚。
13附配说明
下面结合附图对本发明进行描述。
图1A显示了式(I)的化合物的结构通式。图IB显示了类黄酮中7种主 要化合物的化学信息。共同结构是8-异戊二烯基山奈酚。R和R2由葡萄糖、
鼠李糖或木糖取代，R3由甲基置换。
图2显示了得自淫羊藿的类黄酮(EF)的2-DHPLC谱图。 图3显示了得自淫羊藿的类黄酮(EF)的3-DHPLC谱图。 图4显示了不同提取规模的得自淫羊藿的类黄酮的HPLC指纹的高度 相似性。上部的线是小规模批量，下部的线是大规模批量。使用三种流动 相(A)水，(B)甲醇，(C)乙腈。流出曲线为0分钟 25分钟，A:B:C(65:12:23)， 25分钟 30分钟，线性梯度达A:B:C(40:35:25)， 30分钟 60分钟，线性 梯度达A:B:C(35:40:25)， 61分钟 65分钟，线性梯度达A:B:C(20:55:25); 流速l.OmL/分钟；波长270nm;炉温30°C。
图5显示了小规模批量制剂与大规模批量制剂之间的相似性。 图6显示了组织病理学鉴定过程中的主要特征。图6A显示了作为包含 相当多的空腔隙的骨小梁而被发现的骨坏死(ON)损害。图6B显示了在ON" 兔中，血栓症主要发现于ON"兔的小骨髓管中，且骨髓主要由大量的脂肪 细胞占据。苏木精-伊红染色，x200。
图7显示了组织病理学数据分析。图7A显示了各组中的ON发生率 CON(13/14， 93%)， L-EF(9/16， 56%)， M-EF(2/16， 13%)， H-EF(1/16， 6%)。 图7B显示了在所有组中ON程度没有显著差异。图7C和图7D显示了在 血栓形成性血管计数和脂肪细胞面积分率中，均存在相似的随时间的变化 模式，即，与CON组相比L-EF组中被减弱或M-EF和H-EF两组中均被阻 止。參表示CON组；令表示L-EF组；隱表示M-EF组；A表示H-EF组；* 表示P0.05。
图8显示了血液学/细胞学数据分析。诱导后第1周在CON组中APTT 由基线的显著减少(图8B)和t-PA/PAI-I(图8C)在L-EF组中被削弱，或在
14M-EF和H-EF两组中被阻止，而诱导后CON组中显著增多的TM(图8A)、 LDL/HDL(图8C)和脂肪细胞阳性集落(图8D)在L-EF组中被削弱，或在 M-EF和H-EF两组中被阻止。PO.05用于与CON比较；# PO.05用于与基 线比较。鲁表示CON组；令表示L-EF组；園表示M-EF组；A表示H-EF组。
图9显示了纵向研究过程中的动态MRI数据。图9A中，诱导后第1 周，PEP在CON组中的明显减少在L-EF组中被削弱，或在M-EF和H-EF 两组中均被阻止。图9B中，整个试验期间，CON组中明显增多的PSp在 L-EF组中被削弱，或在M-EF和H-EF两组中均几乎被阻止。图9C显示了 诱导后第1周CON组与M-EF组之间的来自代表性的动态MRI的时间-强 度曲线的比较Z表示P0.05。參表示CON组；令表示L-EF组；b表示M-EF 组；A表示H-EF组。黑色曲线表示M-EF组；灰色曲线表示CON组。
图10显示了由基于MicroCT的血管造影术获得的代表性三维血管造影 照片和曲线图。图10A显示了诱导前的基线和诱导后第2周的M-EF组或 H-EF组中的血管造影结构单元的模式。图10B显示了诱导后第1周CON 组中的血管造影结构单元的模式。图10C显示了诱导后第2周CON组中的 血管造影结构单元的模式。图10D显示了在CON组中，40(Hmi 600|im或 36^im 200|im的血管造影结构单元在诱导后第1周少于基线，而200pm 400nm的血管造影结构单元在诱导后第1周多于基线。图10E显示了在诱 导后第1周时L-EF组中36)im 200pm或400(im 60(Vm的血管造影结构 单元稍稍少于基线。图10F显示了在诱导前的基线和诱导后第1周的M-EF 组或H-EF组之间不存在血管造影结构单元的模式的差异。图10G显示了 在诱导后第2周CON组中400pm 600nm的血管造影结构单元少于基线， 而在诱导后第2周CON组中36pm 20(^m的血管造影结构单元多于基线。 图10H显示了在诱导后第2周时L-EF组中400pm 60(Vm的血管造影结 构单元稍稍低于基线，而36)Lrni 200,的血管造影结构单元则稍稍高于基 线。图101显示了在基线和诱导后第2周的M-EF组或H-EF组之间不存在 血管造影结构单元的模式的差异。红色圆圈表示诱导后第1周的CON组。蓝色正方形表示诱导前的基线。褐色菱形表示L-EF组。绿色菱形表示M-EF 组或H-EF组。
图11显示了在用于基于MicroCT的血管造影术的灌注过程中存在血管 外渗漏颗粒。图11A和11B显示出在诱导后第2周时CON组中的代表性 的颗粒(由箭头表示)在血管外分布的组织学图像，而在诱导后第2周时 M-EF组中颗粒在血管内分布。图11C和11D显示血管外渗漏颗粒主要为 200^m 400(im的代表性的曲线图。从诱导后第1周起发现，CON组中的 血管外渗漏颗粒更多，而诱导后这些颗粒极少见于M-EF组和H-EF组中， 而有少量见于在L-EF组中。參表示CON组；令表示L-EF组；b表示M-EF 组；A表示H-EF组。
具体实施例方式
己经首次证明包含巫山淫羊藿提取物的药物组合物可用于抑制血栓形 成和脂质沉积，并且这些组合物可预防或治疗类固醇性骨坏死。
尽管不希望受限于理论，不过这些效果极有可能是由靶向由类固醇引 发的骨坏死的两种途径的独特机制所得到。也就是说，通过抑制血管内血 栓形成和血管外脂质沉积而获得这些效果。
因此，本发明的药物组合物代表了可通过两种途径发挥作用的一类新 的药物。本发明的药物组合物可同时靶向血管内血栓形成和血管外脂质沉 积。其次，本发明的药物组合物可用于预防或治疗类固醇性骨坏死。
因此，在本发明的一方面，本发明包括其中的提取物是式(I)的异戊烯 基黄酮苷化合物的组合的药物组合物
<formula>formula see original document page 16</formula>其中
A选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和 R3是氢或CL6的垸基。
式(I)的化合物包括其中！^选自由鼠李糖、葡萄糖-鼠李糖、木糖-鼠李 糖和鼠李糖-鼠李糖组成的组的那些化合物。式(I)的化合物包括其中R2是葡 萄糖或氢的那些化合物。式(I)的化合物包括其中R3是氢或d-3的烷基的那 些化合物。在本发明的实施方式中，R3是甲基。
更具体而言，在本发明的实施方式中，所述化合物选自由淫羊藿属苷
A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及 其组合组成的组。
此处使用的术语"C,.n的烷基"是指包含1个 n个碳原子的直链和/或支 链的饱和烷基，其包括(取决于n的数值)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁 基、仲丁基、异丁基、叔丁基、2,2-二甲基丁基、正戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基和正己基等。
在本发明的药物组合物的实施方式中，淫羊藿属苷A以约0.5重量％ 3.5重量％的量存在，温哥华苷F以约0.2重量°/。 2.5重量％的量存在，朝 藿定A以约0.5重量°/。 3.0重量°/。的量存在，朝藿定B以约0.5重量％ 3.5 重量％的量存在，朝藿定C以约2.0重量％ 6.0重量°/。的量存在，淫羊藿 苷以约70.0重量％ 约95.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约0.5重量％ 约 4.0重量％的量存在。
在本发明的药物组合物的更具体的实施方式中，淫羊藿属苷A以约1.3 重量％ 2.3重量％的量存在，温哥华苷F以约0.5重量％ 1.5重量％的量 存在，朝藿定A以约0.7重量°/。 1.7重量％的量存在，朝藿定B以约1.0 重量％ 2.0重量％的量存在，朝藿定C以约3.2重量％ 5.2重量％的量存 在，淫羊藿苷以约75.0重量％ 约85.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约1.5 重量％ 约2.5重量％的量存在。本发明的药物组合物可以以适宜体内施用的生物相容形式配制以施用 于人类对象。因此，在另一方面，本发明包括进一步包含一种或更多种药 用载体或赋形剂的本发明的药物组合物。
可以将本发明的药物组合物施用于受试对象，以使有效量的活性物质
与药用载质结合成为混合物。适宜的载质例如在Remington's Pharmaceutical Sciences (2003-20th edition)禾卩1999年出版的The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF 19)中有所描述。在此基础上，所述组合 物包括，但并不绝对，结合一种或更多种药用载质或稀释剂的所述物质的 溶液，并且包含在具有适宜的pH和与生理溶液等渗的缓冲溶液中。
术语"药用"指的是与动物、尤其是人的治疗相容。
根据本发明的方法，其中所述的药物组合物可依据选择的施用途径以 各种形式施用于患者，正如本领域的技术人员所理解的。本发明的组合物 可以例如通过口服、胃肠外、含服、舌下、鼻、直肠、贴剂、泵或透皮(局 部)施用而给药。胃肠外施用包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、透上皮、 鼻、肺内、鞘内、直肠和局部等施用模式。胃肠外施用可通过在选择的一 段时间内而连续输注。
可以通过下述方式来口服施用本发明的药物组合物例如，与惰性稀 释剂或能被吸收的可食用载体结合，或者可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊 中，或者压制成片剂，或者直接与日常食品结合。对于治疗性口服施用， 本发明的组合物可以与赋形剂结合，并以可摄取的片剂、含片剂、锭剂 (troche)、胶囊剂、酏齐j、悬浮剂、糖浆剂和薄片剂等形式使用。
本发明的组合物还可以胃肠外施用。本发明的组合物的溶液可以在水 中适当地与诸如羟丙基纤维素等表面活性剂混合来制备。分散液也可以在 丙三醇、液态聚乙二醇、DMSO以及这些物质的混合物(含有或不含有醇) 中，以及油中制备。在普通的存储和使用条件下，这些制剂含有抑制微生 物生长的防腐剂。本领域的技术人员知道如何制备合适的制剂。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在所有的情况中，所述形式必须无菌， 并且流动性必须达到具有易于注射性的程度。安瓿是方便的单位剂量。
用于鼻部给药的组合物可方便地配制为气雾剂、滴剂、凝胶剂和散剂。 气雾剂制剂通常包括活性物质在生理学可接受的水性或非水性溶剂中的溶 液或微细悬浮液，并通常以无菌形式的单剂量或多剂量的量存在于密封容
器中，所述容器可采用盒(cartridge)或内胆(refill)的形式以用在雾化装置上。 作为选择，密封容器可以是单位式分配装置，如单剂量鼻吸入器，或配有 用于使用后处理的计量阔的喷雾器。剂型包括喷雾器的情况中，其包含可 以是诸如压縮空气等压縮气体的推进剂，或诸如氟氯烃等有机推进剂。气 雾剂剂型还可采用泵-喷雾器的形式。
适于含服给药或舌下给药的组合物包括片剂、含服锭剂(lozenge)和软 锭剂，其中活性组分与载体如糖、阿拉伯胶、黄蓍胶或明胶和甘油配制。 用于直肠给药的组合物可以方便地是包含可可油等常见栓剂基质的栓剂的 形式。
用于局部给药的组合物可包括例如丙二醇、异丙醇、矿物油和丙三醇。 适于局部给药的制剂包括液体或半液体制剂，例如擦剂、洗剂、涂敷剂、 水包油或油包水乳液如乳剂、软膏剂或糊剂；或者溶液或悬浮液如滴剂。 除了前述组分之外，局部用制剂可包含一种或更多种其他组分，如稀释剂、 缓冲剂、芳香剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂如羟基 苯甲酸甲酯(包括抗氧化剂)和乳化剂等。
可以配制缓释的组合物或一次释放的组合物，例如脂质体，或者其中 活性化合物以具有差别的可降解包衣来保护，例如通过微囊化、多层包衣 等。还可以冻干本发明的化合物，并使用所得的例如用于制备注射用产品 的冻干物。
本发明的药物组合物可单独地或结合上述的其他药用载体、和/或与其 他用于预防或治疗类固醇性骨坏死的药物活性剂结合施用给受试对象，其 比例由组合物的溶解度和化学性质、所选择的给药途径和标准药学实践确定。
在本发明的实施方式中，所述药物组合物被配制成剂型不同的各种制 剂。本发明的组合物的剂量可随许多因素变化，例如组合物的药效学性质、 给药模式、受者的年龄、健康状态和体重、症状的性质和程度、治疗的步页 率和同时治疗(如果有的话)的类型，以及所述组合物在受治疗动物体内的、清 除率。本领域的技术人员可基于上述因素确定适宜的剂量。本发明的药物 组合物最初以合适剂量施用，根据临床反应可按照需要调节所述剂量。对 于短期的细胞的离体治疗，例如30分钟至1小时或更长，可使用的化合物 的剂量高于用于长期体内治疗的剂量。
本发明的药物组合物可单独地使用，也可以结合其他药剂或治疗使用。 在本发明的更具体的实施方式中，所述药物组合物可用于抑制血管内血栓 形成。在本发明的另一个更具体的实施方式中，所述药物组合物可用于抑 制血管外脂质沉积。在本发明的又一个实施方式中，本发明的药物组合物 可用于预防或治疗类固醇性骨坏死。
进而，也包括在本发明的范围内的是含有巫山淫羊藿提取物的药物组
合物，其中所述提取物选自由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿 定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组合组成的组，以用于抑制血栓 形成和脂质沉积。具体的，在本发明的实施方式中，淫羊藿属苷A以约0.5 重量％ 3.5重量％的量存在，温哥华苷F以约0.2重量％ 2.5%重量的量存 在，朝藿定A以约0.5重量％ 3.0重量°/。的量存在，朝藿定B以约0.5重 量°/。 3.5重量％的量存在，朝藿定C以约2.0重量％ 6.0重量％的量存在， 淫羊藿苷以约70.0重量％ 约95.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约0.5重 量％ 约4.0重量°/。的量存在。
在本发明的更为具体的实施方式中，淫羊藿属苷A以约1.3重量％ 2.3重量％的量存在，温哥华苷F以约0.5重量％ 1.5重量％的量存在，朝 藿定A以约0.7重量％ 1.7重量。/。的量存在，朝藿定B以约1.0重量％ 2.0 重量％的量存在，朝藿定C以约3.2重量％ 5.2重量％的量存在，淫羊藿苷以约75.0重量％ 约85.0重量％的量存在，宝藿苷-1以约1.5重量％ 约 2.5重量％的量存在。
在本发明的实施方式中，所述药物组合物可进一步包含一种或更多种 药用载体或赋形剂。
此外，在本发明的实施方式中，所述组合物被配制成剂型不同的各种 制剂。
本发明的药物组合物可用于抑制血管内血栓形成。在本发明的其他实 施方式中，所述药物组合物用于抑制血管外脂质沉积。此外，在本发明的 实施方式中，所述药物组合物可用于预防或治疗类固醇性骨坏死。
本发明还包括抑制血栓形成和脂质沉积的方法，所述方法包括对有所 需要的受试对象施用有效量的本发明的药物组合物。本发明还包括本发明 的药物组合物抑制血栓形成和脂质沉积的应用以及本发明的药物组合物在 用于抑制血栓形成和脂质沉积的药物的制备中的应用。
更具体的，抑制血栓形成和脂质沉积的方法包括对有所需要的受试对
象施用含有巫山淫羊藿的提取物的药物组合物。
在本发明的实施方式中，所述方法用于抑制血管内血栓形成。同样也 在本发明的范围内的是，所述方法用于抑制血管外脂质沉积。
应该明确的是，在上述的方法中，所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮 苷化合物的组合<formula>formula see original document page 21</formula>
R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组; R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和R3是氢或CL6的垸基。
在本发明的实施方式中，所述提取物选自由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、
朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组合组成的组。
在上述方法的另一个实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或 更多种药用载体或赋形剂。进而，在上述方法的实施方式中，所述药物组 合物被配制成剂型不同的各种制剂。
同样处于本发明范围内的是预防或治疗类固醇性骨坏死的方法，所述 方法包括对有所需要的受试对象施用含有巫山淫羊藿的提取物的药物组合 物。在本发明的实施方式中，所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物
的组合<formula>formula see original document page 22</formula>
其中
R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口
R3是氢或Cw的垸基。
在本发明的更具体的实施方式中，所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
此外，在上述的本发明的方法的实施方式中，所述药物组合物还包含 一种或更多种药用载体或赋形剂。迸而，在上述的本发明的方法的实施方 式中，所述药物组合物被配制成剂型不同的各种制剂。
将化合物施用给受试对象包括体内、离体和体外治疗。
此处使用的术语药剂的"有效量"或"足够量"是足以产生有益的或所需的结果(包括临床结果)的量，因而，"有效量"取决于其被应用的背景。例如， 在施用预防或治疗类固醇性骨坏死的药剂的情况中，药剂的有效量例如是 与不施用所述药剂而获得的响应相比足以实现该治疗的量。
正如此处使用的以及在本领域中所理解的，"治疗"是用于获得有益的 或所需的结果(包括临床结果)的方法。有益的或所需的临床结果可以包括但 不限于缓解或改善一种或更多种症状或病状，削弱疾病的程度，稳定(即， 不恶化)疾病的状态，防止疾病的传播，延迟或减缓疾病的发展，改善或减 轻疾病的状态，以及好转(无论是部分或者全部)，无论是否可检测到。"治 疗"还可以表示与不接受治疗的预计存活期相比延长存活期。
此处使用的术语"受试对象"包括动物界的全体成员，包括人类。所述 受试对象适宜为人类。
此外，本发明包括含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物在用于抑制血 栓形成和脂质沉积的药物的制备中的应用。在本发明的实施方式中，所述 药物组合物在药物制备中的应用是用于抑制血管内血栓形成。在本发明的 其他实施方式中，所述应用是用于抑制血管外脂质沉积。
特别是，在上述的应用中，所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮苷化合 物的组合
R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口
R3是氢或C,.6的垸基。
在本发明的实施方式中，所述提取物选自由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、、宝藿苷-I及其组合组成的组。
在本发明的其他实施方式中，所述药物组合物还包含一种或更多种药 用载体或赋形剂。
在本发明的另一些实施方式中，所述药物组合物被配制成剂型不同的 各种制剂。
同样在本发明范围内的是含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物在预防 或治疗类固醇性骨坏死的药物的制备中的应用。
在本发明的具体实施方式
中，所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮苷化
合物的组合
其中
R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组；
R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口 R3是氢或CL6的烷基。
在本发明的更具体的实施方式中，所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
此外，在本发明的实施方式中，所述药物组合物可以进一步包含一种 或更多种药用载体或赋形剂。进而，所述药物组合物可被配制成剂型不同 的各种制剂。
本发明的药物组合物可使用包括以下步骤的方法制备
(a) 用溶剂提取植物巫山淫羊藿或其一部分以获得提取物；和
(b) 纯化所述提取物以获得式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物其中
^选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和 R3是氢或Cw的烷基。
在本发明的实施方式中，所述植物是巫山淫羊藿的叶。
在本发明的具体的实施方式中，步骤(a)中的所述溶剂是约40°/。 90% 的醇，适宜为约40°/。 80%的醇，更适宜为约60% 75°/。的醇。在本发明的 更具体的实施方式中，所述醇选自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己 醇组成的组。在本发明的进而更具体的实施方式中，步骤(a)中的所述溶剂 是约60% 80%的乙醇，更适宜为约70%的乙醇。
在本发明的实施方式中，在上述方法中，在步骤(a)之后，使提取物悬 浮在水中以形成溶液。在本发明的实施方式中，将所述溶液过滤以获得滤 液。在本发明的更具体的实施方式中，所述滤液分配在水和醇之间以获得 水溶部分和醇溶部分，其中所述提取物在醇溶部分中。进而，在本发明的 实施方式中，所述醇选自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇和己醇组成的 组。具体而言，在本发明的实施方式中，所述丁醇是正丁醇。
本发明的方法中的一个实施方式是通过选自由色谱法、重结晶、过滤 及其组合组成的组的纯化技术来纯化步骤(b)中的提取物。本发明的更具体 的实施方式是通过柱色谱来纯化步骤(b)中的提取物，其中对所述提取物进 行分馏以获得多种馏分。
具体而言，在本发明的实施方式中，提取物以氯仿-甲醇洗提。在本发 明的实施方式中，所述氯仿-甲醇的范围是约9:1 6:4。进而更具体的，在本发明的实施方式中，所述氯仿-甲醇的范围是约8:2 7:3。
在上述方法的其他实施方式中，对多种馏分分析式(I)的异戊烯基黄酮 苷化合物。具体而言，在本发明的实施方式中，式(I)的异戊烯基黄酮苷化 合物选自由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、 淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组合组成的组。
下列实施例对本发明进行了更详细的描述，不过应当理解本发明并不 限于特定的实施例。
实施例 众合激
由巫山淫羊藿提取七种异戊烯基黄酮苷，并鉴定为淫羊藿属苷A(l)、 温哥华苷F(2)、朝藿定A(3)、朝藿定B(4)、朝藿定C(5)、淫羊藿苷(6)和宝 藿苷-1(7)，如图1所示。
在HPLC谱图中，在270nm处，各化合物的曲线下面积(AUC)的百分 比分别为1.8°/0、 1.0%、 1.2%、 1.5%、 4.2%、 80.9%和2.1%。本发明的发明 人发现，对得自巫山淫羊藿的类黄酮馏分的HPLC-UV-MS/MS谱图的研究 可快速鉴定其中92.7%的成分(图1 3)。
被鄉微射激微成 潜欽微
巫山淫羊藿的叶采自中国贵州省雷山(Lei Shan)，其是具有对于巫山淫 羊藿的良好农业规范(GAP)认证的种植地，并由沈阳药科大学中药学院授 权。凭证标本(EW 2006)保存在中国深圳的深圳中药及天然药物研究中心 (Shenzhen Research Center of Traditional Chinese Medicines and Nature Products)。
微
德漠微
用70。/。的乙醇对巫山淫羊藿的叶(2kg)进行提取(20L，回流，2小时，2次)。减压下除去乙醇以得到残留物(21g)，将其悬浮在水中并搅拌。静置约
12小时后，将溶液过滤，然后使滤液在水和正丁醇之间分配。正丁醇部分 (6.4g)通过真空蒸发浓縮，然后进行硅胶柱色谱。用氯仿-甲醇体系洗涤柱。 对于得到的类黄酮提取物利用薄层色谱(TLC)来进行分析。类黄酮提取物 (2.3g)随后在8:2 CHCl3-MeOH和7:3 CHCl3-MeOH洗提液中浓縮。 力蕭微
用70。/。的乙醇对巫山淫羊藿的叶(50kg)进行提取(500L，回流，2小时， 2次)。减压下除去乙醇以得到残留物(490g)，将其悬浮在水中并搅拌。静置 约12小时后，将溶液过滤，然后使滤液在水和正丁醇之间分配。正丁醇部 分(168g)通过真空蒸发浓縮，然后进行硅胶柱色谱。用氯仿-甲醇体系洗涤 柱。对于得到的类黄酮提取物利用薄层色谱(TLC)进行分析。类黄酮提取物 (49g)随后在8:2 CHCl3-MeOH和7:3 CHCl3-MeOH洗提液中浓縮。
德/,微默麟微微梦
为获得可重复的结果，植物资源由贵州的良好农业规范(GAP)植物生境 保证。通过使用向量夹角法量化两批(小规模制备和大规模制备)样品之间的 相似性，从而证实由巫山淫羊藿制备类黄酮馏分的方法的稳定性。小规模 批次和大规模批次之间的HPLC色谱图的相似性依据保留时间为98.2%，依 据峰面积为99.9%(图4，图5)。
#辦減 动欽微
在第0天(O周)对兔静脉内注射每kg体重为IO昭的脂多糖(LPS; ^&c/^r/c/^ co// 0111:B4， Sigma-Aldrich， Inc. USA)。 24小时后，以24小曰寸 的时间间隔进行三次20mg/kg的甲泼尼龙(Methylprednisolone)(MPS; Pharmacia & Upjohn, USA)的肌内注射。
体重为4kg 5kg的112只28周龄的雄性新西兰白兔饲养在威尔士亲王医院(香港中文大学的附属医院)的实验动物服务中心(Laboratary Animal Service Center)。用标准实验室膳食和水随意喂养这些动物。实验方案由香 港的动物实验伦理委员会(Animal Experiment Ethics Committee)批准。对所 有的兔给予上述注射方案(动物模型)以诱发类固醇性骨坏死，从而评价得自 淫羊藿的类黄酮(EF)的预防效果。将兔分成四组用于下列每日口服给药低 齐(J量EF组(L-EF; n=28; 10mg/kg体重/天)，中等剂量EF组(M-EF; n=28; 20mg/kg体重/天)，高剂量EF组(H-EF; n=28; 40mg/kg体重/天)，一个对 照组每天给予EF的相应载质(CON; n=28)。
EF的植物化学概况由HPLC鉴定，其中EF的共同结构是8-异戊二烯 基山奈酚。EF的二维HPLC谱图显示在图2中，EF的三维HPLC谱图显 示在图3中。在诱导后第O周(即将进行LPS注射之前)、第1周和第2周， 采集血样用于全面检査凝固指数、纤溶指数和脂质转运指数。同时获取来 自髂嵴的骨髓样品用于间充质干细胞的成脂潜力指数(adipogenic potential index)的局部评价。在诱导后的第O周(即将进行LPS注射之前)、第1周和 第2周，处死所述动物之前对各动物的股骨近端局部进行动态MRI以用于 骨内灌注功能指数。此外，在诱导后的第0周、第1周和第2周分别处死 各组中的4、 8和16只兔。使用过量的戊巴比妥钠处死动物后，解剖双侧 近端股骨以用于基于MicroCT的血管造影术、对局部ON损害的组织病理 学检査、血管内血栓形成和血管外脂质沉积。存档被杀死前的每只兔的体 重。记录整个实验期间各组中的存活情况。
絲敝微资会激微艘径，舒淑虛飾*舒/#常微脔 * ,膽一织微学厕凝 游,伴
就组织病理学而言，血栓症主要发现于诱导后第1周的CON组中的小 骨髓管中(图6)。CON组中的血栓性血管计数在诱导后第1周增至峰值水平， 然后一直维持到诱导后第2周。血栓性血管计数随时间改变的模式在CON组与兰个EF组间有所不同。在整个试验阶段，在CON组中增犬的血栓性血管计数在L-EF组中削弱，或者在M-EF和H-EF组中被抑制(被阻止)。Fisher的确切概率检验显示，在诱导后第1周血栓性血管计数的顺序与诱导后第2周相似，即，CON〉L-EF〉M-EF-H隱EF(图7)。
对于对血管内血栓形成最初起作用的内皮损伤事件，CON组中的TM在诱导后第1周呈现明显增加(P-O.OOO)，然后朝向基线下降。TM随时间变化的模式在CON组与三个EF组间显著不同(对于L-EF对CON为P<0.05，对于M-EF对CON和H-EF对CON均为P<0.01)。尤其是，CON组中明显增大的TM在诱导后第1周时在L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图8A)。
对于对血管内血栓形成起作用的高凝血事件，CON组中的APTT在诱导后第1周显著减少(PO.Ol)，然后朝向基线下降。根据重复测量的方差分析，APTT随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(对于L-EF对CON为P<0.05，对于M-EF对CON和H-EF对CON均为PO.Ol)。尤其是，CON组中的APTT的明显减少在诱导后第1周的L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图犯)。
对于对血管内血栓形成起作用的低纤溶事件，CON组中的tPA/PAI-I在诱导后第1周呈现明显减少(PO.Ol)，然后向基线返回。tPA/PAI-I随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(对于L-EF对CON为P<0.05，对于M-EF对CON和H-EF对CON均为PO.Ol)。尤其是，CON组中tPA/PAI-I的明显减少在诱导后第1周时在L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图8C)。
* ,微辦群淑赫/爐條伴
就组织病理学而言，诱导后CON组中骨髓主要由大量的脂肪细胞占据(图6)。诱导后第1周CON组中的脂肪细胞面积分率明显增大，然后一直维持到诱导后第2周(二者均为P<0.05)。脂肪细胞面积分率随时间改变的模式在CON组与三个EF组间不同。在整个试验阶段，CON组中明显增大的脂肪细胞面积分率在L-EF组中削弱，或者在M-EF和H-EF组中被抑制。Fisher的确切概率检验显示，诱导后第1周时脂肪细胞面积分率的顺序与诱导后第2周类似，g卩，CON〉L-EF〉M-EF二H-EF(图7)。
对于对血管外脂质沉积起作用的脂肪生成事件，CON组中的脂肪细胞阳性集落在诱导后第l周明显增加(PO.Ol)，随后朝向基线适度恢复。脂肪细胞阳性集落随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(对于L-EF对CON为P<0.05，对于M-EF对CON和H-EF对CON均为PO.Ol)。尤其是，CON组中明显增加的脂肪细胞阳性群体在诱导后第1周时在L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图8D)。
对于对血管外脂质沉积起作用的脂质转运事件，CON组中的LDL/HDL在诱导后第1周明显增大(PO.Ol)，然后返回基线。LDL/HDL随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(L-EF对CON、 M-EF对CON和H-EF对CON分别为P〈0.05)。尤其是，CON组中明显增大的LDL/HDL在诱导后第1周的L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图8E)。
微錢
整个试验期间各组中均未发现出血或死亡。各组中诱导后第2周才发现骨坏死损害。骨坏死损害以包含相当多的空腔隙的骨小梁为组织病理学特征(图6)。骨坏死的发生率分别为在CON组中为93Q/。(15/16)，在L-EF组中为56%(9/16)，在M-EF组中为13%(2/16),在H-EF组中为6%( 1/16)。Fisher的确切概率检验显示，L-EF、M-EF和H-EF组的骨坏死发生率明显低于CON组的发生率(分别为P-0.039, P=0.000和P=0.000)。 M-EF和H-EF组的骨坏死发生率明显低于L-EF组的骨坏死发生率(二者为P=0.023, P=0.005)，而M-EF和H-EF组间未发现骨坏死发生率的差异(二者均为P4.000)(图7A)。在CON组(2.8士0.8)、L-EF组(2.5士0.6)、 M-EF组(2.4士0.7)和H-EF组(2.6士0.5)之间不存在骨坏死程度的明显差异(图7B)。秀潘学,薪
对f淑,/M飾辦辦縦辦教群遂径條喊趁毅縦
对于基于动态MRI的血管指数，CON组中的PEP在诱导后第1周明显下降( <0.01)，然后在诱导后第2周时明显增大超过基线(PO.Ol)。 PEP随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(对于L-EF对CON、M-EF对CON和H-EF对CON分别为P<0.01)。尤其是，CON组中PEP的明显减少在诱导后第1周时在L-EF组中减弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图9A、 9C)。
对于基于动态MRI的渗透指数，CON组中的PSp在诱导后第1周明显增大(PO.Ol)，然后在诱导后第2周进一步明显增大(PO.Ol)。 PSp随时间变化的模式在CON组与三个EF组间明显不同(对于CON组对CON为P<0.05，对于M-EF对CON和H-EF对CON均为PO.Ol)。尤其是，在整个试验期间，CON组中明显增大的PSp在L-EF组中削弱，或者在M-EF和H-EF组中几乎被抑制(图9B、 9C)。
图10A 10C中显示了代表性的三维血管造影照片，图10D 10I显示了代表性的曲线图。
与基线情况相比时，诱导后第1周CON组中的血管造影照片显示了同时由大量中等尺寸的散布的渗漏颗粒样结构单元(200(im 400^im)和少量血管样结构单元(36nm 20(Vm或400pm 600nm)所环绕的扩张血管样的结构单元(〉60(HimX图10D)。相对于诱导后第1周的CON组中的情况，在M-EF组和H-EF组中均未发现由大量中等尺寸的散布的渗漏颗粒样结构单元(200iam 40(Hmi)所围绕的典型的扩张血管样的结构单元，除了有少量在L-EF组中。在M-EF组和H-EF组中均极少发现对血管样结构单元(36pm 200|im或400pm 60(^m)的减少的灌注，但在L-EF组中适度发现(图〗0E和IOF)。与基线情况相比时，诱导后第2周，CON组中的'血管造影照片展示了 同时由大量小尺寸的血管样结构单元(36^m 200^m)和大量中等尺寸的散 布的渗漏颗粒样结构单元(200^im 40(^m)所环绕的扩张血管样的结构单元 (〉600^m)(图IOG)。相对于诱导后第2周的CON组中的情况，在M-EF组 和H-EF组中均未发现由许多小尺寸的血管样结构单元(36pm 200nm)和大 量中等尺寸的散布的渗漏颗粒样结构单元(20(^m 400^im)所环绕的扩张血 管样的结构单元，但在L-EF组中适度发现，在M-EF组和H-EF组中均极 少发现对血管样结构单元(400pm 60(Vm)的减少的灌注，但在L-EF组中 适度发现(图IOH和101)。
虛舒/渗濕微游尉分恭微邀
在用于基于MicroCT的血管造影术的灌注过程中在诱导后的CON组 中发现了更多的血管外渗漏颗粒，而在诱导后的M-EF和H-EF组中都很少 发现，除了有少量在L-EF组中。所有的曲线图均显示渗漏颗粒的尺寸是 200^im 400iim(图11A 11D)。
EF对抑制血栓形成和脂质沉积具有剂量依赖性影响，以维持兔模型的 骨内血管的结构-功能的完整性，并由此减少类固醇性ON的发生率。内在 机制可通过其对高凝血、低纤溶、过度脂肪生成和突出的脂质向外周组织 转运的对抗作用来解释。
尽管本发明参考目前被视为优选实施例的方案进行描述，不过应当理 解本发明并不限于所公开的实施例。相反，本发明意图涵盖包括在所附权 利要求的实质和范围内的各种修正和等同方式。
所有公报、专利和专利申请的全部内容以引用的方式并入本文，程度 与将各单独的公报、专利或专利申请的全部内容具体地、个别地指出并以 引用的方式引入相同。本申请中的术语的定义与通过引用方式并入本文的 文献中不同的，以本文提供的定义作为所述术语的定义。本说明书中所引用的全部参考文献
1. Garin EH， Sleasman JW, Richard GA, Iravani AA， Fennell RS. Pulsed methylprednisolone therapy compared to high dose prednisone in systemic lupus erythematosus nephritis. Eur J Pediatr 1986; 145: 380-383.
2. Adebajo AO， Hall MA. The use of intravenous pulsed methylprednisolone in the treatment of systemic-onset juvenile chronic arthritis. Br J Rheumatol 1998， 37: 1240-1242.
3. So LK, Lau AC, Yam LY， Cheung TM， Poon E， Yung RW， Yuen KY Development of a standard treatment protocol for severe acute respiratory syndrome. Lancet 2003; 361:1615-1617， 2003,
4. Scribner AN, Troia-Cancio PV, Cox BA, Marcantonio D， Hamid F， Keiser P， Levi M， Allen B, Murphy K, Jones RE, Skiest DJ. Osteonecrosis in HIV: a case-control study. J Acquir Immune Defic Syndr 25:19-25， 2000.
5. Mok CC， Lau CS, Wong RW. Risk factors for avascular bone necrosis in systemic lupus erythematosus. Br J Rheumatol. 1998; 37: 895-900.
6. Marston SB, Gillingham K, Bailey RF, Cheng EY, Osteonecrosis of the femoral head after solid organ transplantation: a prospective study. J Bone Joint Surg Am. 2002; 84-A: 2145-2151.
7. Assouline-Dayan Y, Chang C， Greenspan A, Shoenfeld Y， Gershwin ME. Pathogenesis and natural history of osteonecrosis. Semin Arthritis Rheum. 2002; 32: 94-124.
8. Lieberman JR， Berry DJ, Mont MA， Aaron RK， Calaghan JJ， Rajadhyaksha AD， Urbaniak JR. Osteonecrosis of the hip: management in the 21st century. Instr Course Lect. 2003;52:337-55.
9. Wang GJ， Cui Q， Balian G. The pathogenesis and prevention of steroid- induced osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res 2000; 295-310.
10. Griffith JF, Antonio GE， Kumata SM等，Osteonecrosis of hip and knee in patients with severe acute respiratory syndrome treated with steroids. Radiology 2005; 235: 168-75.
U. Shen， J， Liang BL， Zeng 等.Report on the investigation of lower extremity osteonecrosis with magnetic resonance imaging in recovered severe acute respiratory syndrome in Guangzho仏Zhonghua Yixue Zazhi 2004: 84: 1814-7.
12. Li ZR， Sun W， Qu H等.Clinical research of correlation between osteonecrosis and steroid. Zhonghua Waike Zazhi 2005; 43: 1048-53.
13. Aaron RK. Osteonecrosis: etiology, pathophysiology and diagnosis. In: Callaghan JJ， Rosenberg AG, Rubash HE， editors. The adult hip. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1998; 457.14. Saito S, Saito M， Niihina T等.Long-term results of total hip arthroplasty for osteonecrosis of the femoral head, A comparison with osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res 1989; 244: 198-207.
15. Qin L， Zhang G, Sheng H等.Multiple imaging modalities in evaluation of experimental osteonecrosis induced by a combination of Lippolysaccharide and Methylprednisolone. Bone 2006j 39: 863-871.
16. Glueck CJ， Freiberg RA， Fontaine RN等.Hypofibrinolysis, thrombophilia, osteonecrosis. Clin Orthop Relat Res 2001; 386: 19-33.
17. Glueck CJ， Freiberg RA， Wang P. Role of thrombosis in osteonecrosis. Curr Hematol Rep 2003; 2: 417-422.
18. Irisa T， Yamamoto T， Miyanishi K等.Osteonecrosis induced by a single administration of low-dose lipopolysaccharide in rabbits. Bone 2001; 28: 641-9.
19. Miyanishi K， Yamamoto T， Irisa T等.A high low-density lipoprotein cholesterol to high-density lipoprotein cholesterol ratio as a potential risk factor for corticosteroid-induced osteonecrosis in rabbits. Rheumatology (Oxford) 2001; 40: 196-201.
20. Li X, Jin L, Cui Q等.Steroid effects on osteogenesis through mesenchymal cell gene expression. Osteoporosis Int 2005; 16: 101-108.
21. Lau TF， Leung PC， Wong EL等.Using herbal medicine as a means of prevention experience during the SARS crisis. Am J chin Med 2005; 33: 345-56.
22. Liu X, Zhang M, He L等.Chinese herbs combined with Westermn medicine for severe acute respiratory syndrome (SARS). Cochrane Database Syst Rev 2006:1:CD004882.
23. Qin L, Zhang G， Shi YY等.Prevention and treatment of osteoporosis with traditional herbal medicine. In: Deng HW et al.， editor. Current topics of osteoporosis. World Scientific Publisher; 2005; 513-31.
权利要求
1.一种药物组合物，所述药物组合物包含用于抑制血栓形成和脂质沉积的巫山淫羊藿的提取物。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，其中所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物的组合其中 Ri选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口R3是氢或C,-6的垸基。
3. 如权利要求2所述的药物组合物，其中R,选自由鼠李糖、葡萄糖-鼠李糖、木糖-鼠李糖和鼠李糖-鼠李糖组成的组。
4. 如权利要求2所述的药物组合物，其中R2是葡萄糖或氢。
5. 如权利要求2所述的药物组合物，其中R3是氢或Q.3的垸基。
6. 如权利要求5所述的药物组合物，其中R3是甲基。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的药物组合物，其中所述化合物选自 由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、 宝藿苷-I及其组合组成的组。
8. 如权利要求7所述的药物组合物,其中淫羊藿属苷A以约0.5重量°/。
3.5重量％的量存在，温哥华苷F以约0.2重量％ 2.5重量％的量存在，朝 藿定A以约0.5重量％ 3.0重量％的量存在，朝藿定B以约0.5重量％ 3.5 重量％的量存在，朝藿定C以约2.0重量％ 6.0重量°/。的量存在，淫羊藿苷以约70.0重量°/。 约95.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约0.5重量％ 约 4.0重量％的量存在。
9. 如权利要求8所述的药物组合物，其中淫羊藿属苷A以约1.3重量％ 2.3重量°/。的量存在，温哥华苷F以约0.5重量o/。 1.5重量M的量存在，朝 藿定A以约0.7重量°/。 1.7重量y。的量存在，朝藿定B以约1.0重量％ 2.0 重量％的量存在，朝藿定C以约3.2重量％ 5.2重量％的量存在，淫羊藿 苷以约75.0重量°/。 约85.0重量°/。的量存在，宝藿苷-I以约1.5重量％ 约 2.5重量％的量存在。
10. 如权利要求1 9中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进 一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
11. 如权利要求IO所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成剂型 不同的各种制剂。
12. 如权利要求1 11中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于抑 制血管内血栓形成。
13. 如权利要求1 11中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于抑 制血管外脂质沉积。
14. 如权利要求1 13中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于预 防或治疗类固醇性骨坏死。
15. —种包含巫山淫羊藿的提取物药物组合物，其中所述提取物选自由 淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、 宝藿苷-I及其组合组成的组，用于抑制血栓形成和脂质沉积。
16. 如权利要求15所述的药物组合物，其中淫羊藿属苷A以约0.5重 量％ 3.5重量％的量存在，温哥华苷F以约0.2重量％ 2.5重量％的量存 在，朝藿定A以约0.5重量％ 3.0重量％的量存在，朝藿定B以约0.5重 量％ 3.5重量％的量存在，朝藿定C以约2.0重量％ 6.0重量％的量存在， 淫羊藿苷以约70.0重量％ 约95.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约0.5重量％ 约4.0重量％的量存在。
17. 如权利要求16、所述的药物组合物，其中淫羊藿属苷A以约1.3重 量°/。 2.3重量％的量存在，温哥华苷F以约0.5重量％ 1.5重量°/。的量存 在，朝藿定A以约0.7重量°/。 1.7重量°/。的量存在，朝藿定B以约1.0重 量°/。 2.0重量％的量存在，朝藿定C以约3.2重量°/。 5.2重量％的量存在， 淫羊藿苷以约75.0重量％ 约85.0重量％的量存在，宝藿苷-I以约1.5重量％ 约2.5重量°/。的量存在。
18. 如权利要求15 17中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物 进一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
19. 如权利要求18所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成剂型 不同的各种制剂。
20. 如权利要求15 19中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于 抑制血管内血栓形成。
21. 如权利要求15 19中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于 抑制血管外脂质沉积。
22. 如权利要求15 21中任一项所述的药物组合物，所述组合物用于 预防或治疗类固醇性骨坏死。
23. —种抑制血栓形成和脂质沉积的方法，所述方法包括对有所需要的 受试对象施用含有巫山淫羊藿的提取物的药物组合物。
24. 如权利要求23所述的方法，其中血栓形成是血管内血栓形成。
25. 如权利要求23所述的方法，其中脂质沉积是血管外脂质沉积。
26. 如权利要求23 25中任一项所述的方法，其中所述提取物是式① 的异戊烯基黄酮苷化合物的组合- <formula>formula see original document page 4</formula>其中Rj选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和 R3是氢或Cw的烷基。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
28. 如权利要求23 27中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进 一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述药物组合物被配制成剂型不 同的各种制剂。
30. —种预防或治疗类固醇性骨坏死的方法，所述方法包括在对有所需 要的受试对象施用含有巫山淫羊藿的提取物的药物组合物。
31. 如权利要求30所述的方法，其中所述提取物是式(I)的异戊烯基黄 酮苷化合物的组合其中R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；禾口 R3是氢或Q—6的烷基。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
33. 如权利要求30 32中任一项所述的方法，其中所述药物组合物进 一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述药物组合物被配制成剂型不 同的各种制剂。
35. 含有巫山淫羊藿提取物的药物组合物在用于抑制血栓形成和脂质 沉积的药物的制备中的应用。
36. 如权利要求35所述的应用，其中血栓形成是血管内血栓形成。
37. 如权利要求35所述的应用，其中脂质沉积是血管外脂质沉积。
38. 如权利要求35 37中任一项所述的应用，其中所述提取物是式(I) 的异戊烯基黄酮苷化合物的组合其中R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和R3是氢或C.6的烷基。
39. 如权利要求38所述的应用，其中所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
40. 如权利要求35 39中任一项所述的应用，其中所述药物组合物进一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
41. 如权利要求40所述的应用，其中所述药物组合物被配制成剂型不 同的各种制剂。
42. 具有巫山淫羊藿的提取物的药物组合物用于制备预防或治疗类固醇性骨坏死的药物的应用。
43.如权利要求42所述的应用，其中所述提取物是式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物的组合<formula>formula see original document page 7</formula>其中R,选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和R3是氢或Q—6的垸基。
44. 如权利要求43所述的应用，其中所述提取物选自由淫羊藿属苷A、 温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组 合组成的组。
45. 如权利要求42 44中任一项所述的应用，其中所述药物组合物进 一步包含一种或更多种药用载体或赋形剂。
46. 如权利要求45所述的应用，其中所述药物组合物被配制成剂型不 同的各种制剂。
47. —种制备药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤(a) 用溶剂提取植物巫山淫羊藿或其一部分以获得提取物；和(b) 纯化所述提取物以获得式(I)的异戊烯基黄酮苷化合物其中Rj选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖及其组合组成的组； R2选自由葡萄糖、鼠李糖、木糖和氢组成的组；和 R3是氢或Cw的垸基。
48. 如权利要求47所述的方法，其中所述植物是巫山淫羊藿的叶。
49. 如权利要求47或48所述的方法，其中步骤(a)中的所述溶剂是约 40% 卯％的醇。
50. 如权利要求49所述的方法，其中所述醇选自由甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、戊醇和己醇组成的组。
51. 如权利要求49所述的方法，其中步骤(3)中的所述溶剂是约60% 80%的乙醇。
52. 如权利要求47 49中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之后将所 述提取物悬浮在水中以形成溶液。
53. 如权利要求52所述的方法，其中将所述溶液过滤以获得滤液。
54. 如权利要求53所述的方法，其中所述滤液分配在水和醇之间以获 得水溶部分和醇溶部分，并且其中所述提取物在所述醇溶部分中。
55. 如权利要求54所述的方法，其中所述醇选自由甲醇、乙醇、丙醇、 丁醇、戊醇和己醇组成的组。
56. 如权利要求55所述的方法，其中所述丁醇是正丁醇。
57. 如权利要求47所述的方法，其中将步骤(b)中的所述提取物通过选 自由色谱法、重结晶、过滤及其组合组成的组的纯化技术纯化。
58. 如权利要求57所述的方法，其中将步骤(b)中的所述提取物通过柱 色谱法纯化，其中对所述提取物进行分馏从而获得多种馏分。
59. 如权利要求58所述的方法，其中所述提取物用氯仿-甲醇洗提。
60. 如权利要求59所述的方法，其中所述氯仿-甲醇的范围是约9:1 6:4。
61. 如权利要求60所述的方法，其中所述氯仿-甲醇的范围是约8:2 7:3。
62. 如权利要求58所述的方法，其中对于所述多种馏分分析所述式(I) 的异戊烯基黄酮苷化合物。
63. 如权利要求62所述的方法，其中所述的式(I)的异戊烯基黄酮苷化 合物选自由淫羊藿属苷A、温哥华苷F、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、 淫羊藿苷、宝藿苷-I及其组合组成的组。
全文摘要
本发明涉及包含巫山淫羊藿提取物的新型药物组合物、它们的制备方法以及它们在抑制血栓形成和脂质沉积中的应用。本发明还提供了通过应用本发明的药物组合物来预防或治疗类固醇性骨坏死的方法。不论是小规模提取还是大规模提取，本发明的制备方法均稳定，并且提供可重复的结果。
文档编号A61K36/296GK101641112SQ200880002423
公开日2010年2月3日 申请日期2008年1月23日 优先权日2007年1月23日
发明者姚新生, 戈 张, 王新峦, 王晓春, 辉 盛, 岭 秦 申请人:同济堂药业