用于消化道或泌尿道病症的细菌提取物及其制备方法

专利名称：：用于消化道或泌尿道病症的细菌提取物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及可用作适应症(例如消化道或泌尿道病症)的治疗的得自细菌菌株的提取物、包含该提取物的组合物、和使用不引起朊病毒病(priondisease)的风险的培养基制造该提取物的方法。发明背景和概述本发明涉及可用于治疗适应症(例如泌尿道或消化病症)的包含细菌提取物的组合物。该提取物可包含得自选自一种或更多种大肠杆菌物种的培养物的细菌裂解产物。在一些实施方案中，提取物可包含一种或更多种选自下列大肠杆菌的菌株的物种NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707、和9708及I:081、082、083、084、085、086、087、088、和089。这些菌株根据布达佩斯条约(Bud即estTreaty)保藏。名单中所指示的具有I-号码的菌株由法国巴斯德研究所国立微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturedesMicroorganismesattheInstitutPasteur，25rueduDr.Roux，75724巴黎，法国)编入索引。所有其他菌株由伦敦国立典型培养物保藏中心(NationalCollectionofTypeCulturesinLondon)编入索弓l。在一些实施方案中，提取物从所有这些菌株制备。在其他实施方案中，仅选择一些菌株。在一些实施方案中，例如，一种或更多种菌株选自"I"组和一种或更多种菌株选自"NCTC，，组。在一些实施方案中，一种或更多种上述特定菌株可被省略、或用来自大肠杆菌或来自不同物种的细菌的不同菌株取代。提取物可在细胞于培养基中生长至适当光学密度之后通过碱裂解的方法获得。在一些实施方案中，细菌各自在不引起朊病毒病相关疾病的风险或其他可通过摄取得自基于动物的培养基的产物传染的疾病的风险的培养基上生长。例如，在一些实施方案中使用基于植物的培养基(例如基于大豆的培养基)来培养细胞。在一些实施方案中，合成培养基可用于细胞培养，或可使用包括生物提取物(例如酵母提取物和马血清)的培养基，其也不引起此类疾病的风险。也可过滤裂解产物以除去核酸和较大细胞碎片。由于过滤，在一些实施方案中，存在于提取物中的核酸的量小于100微克/毫升。在一些实施方案中，也通过过滤除去不溶性化合物，例如细胞壁碎片和降解不足的脂多糖(LPS)。因此，在一些实施方案中，所产生的提取物包含可溶性分子成分且不包含显著量的不溶或颗粒物质。糖成分可保持在提取物中，包括脂多糖(LPS)成分。在裂解方法期间，糖可变成化学修饰的，例如裂解成较小结构或用其他官能团取代。在裂解方法期间氨基酸的外消旋作用也从天然蛋白质中所发现的天然存在的L-氨基酸产生D-氨基酸。D-氨基酸在增加提取物的有效时间上会是有益的，因为它们在哺乳动物的肠中不被有效地消化。因此，在裂解期间被化学修饰而包含D-氨基酸的提取物中的抗原性分子留在病人的身体中较长时间，潜在地允许较强免疫剌激作用。虽然在现有技术中已使用细菌提取物来剌激免疫系统抵抗消化和泌尿道疾病，但仍存在对更好标准化和控制这些提取物的需要以便使其更安全、更有效、和较持久。例如，为了安全理由，原先认为应从细菌提取物中除去糖成分，包括潜在有毒的脂多糖(LPS)成分。(参见例如，美国专利第5，424，287号)。然而，本发明提供一种产生充分化学修饰的LPS成分且安全地保留糖的方法。保留这些成分也可通过提供额外抗原而改良功效。例如，发明人已发现监测裂解作用的pH和时间可允许潜在地变应性或有毒的细胞壁成分的充分降解。较低PH或较短时间的先前裂解条件，对比之下，产生其中细胞壁成分和LPS化学修饰不足的提取物。(参见例如，GB2054374A)。所产生的提取物对欲安全施用的患者而言变应原性过强。总的来说，发明人已发现在太低pH和/或在太短时间裂解的产物具有较高毒性、较低蛋白质提取、和较低过滤性。除此之外，本发明在不引起疾病风险(例如来自朊病毒病)的培养基中生长细菌菌株。在一些情形中过滤方法也可影响所产生的提取物的性质，如过滤器的孔径，和有时，过滤器表面的化学性质，改变被除去和保留的物质的类型。例如，本发明使用一种保留某些糖但除去其他分子成分(例如核酸)的过滤方法。因此，本发明提供标准化细菌提取物以帮助维持一致的安全性和功效的参数。附图简述图1:用于在细菌裂解之后制备细菌提取物的切向流过滤(TFF)系统的示意图。该示意图显示过滤器的2种不同配置其中所有过滤器同时工作的平行模式和其中过滤器以连续模式配置的蛇形模式。图2:提取物在外周血单核细胞(PBMC)试验中的活性，用于裂解的起始生物质(biomass)浓度为12.5克/升(部分A)和25克/升(部分B)(更多细节参见实施例5A)。图3:提取物在PBMC试验中的活性，用于裂解的起始生物质浓度为25克/升(部分A)和100克/升(部分B)。图4:提取物在外周血单核细胞(PBMC)试验中的活性，裂解时间为24小时(部分A)和72小时(部分B)。图5:在裂解期间NaOH的浓度对巨噬细胞的一氧化氮(NO)活性的影响。图6:在不同实验组的膀胱(部分A)和肾(部分B)组织中的平均总菌落形成单位(CFU)值。图7:用104CFU鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)感染后在21天期间实验组中的死亡记录。发明的详述定义提取物提取物，如在本文中定义的，表示在一种或更多种细菌菌株的裂解作用之后所获得的物质。在一些情形中，该提取物仅得自一种菌株而在其他情形中提取物为得自数种不同菌株的提取物的混合物。6碱裂解其为一种在碱性条件下(例如使用有机或无机碱)裂解细菌细胞的方法。裂解产物一种得自细胞裂解方法的细菌的提取物。过滤一种过滤方法，如在本文中描述的，表示提取物或提取物的混合物通过一种或更多种过滤器例如微过滤器(即微过滤)或超滤器(即超滤)。该过滤可不需要除去100%的计划除去的成分。在一些情形中，在数个通路或循环中重复过滤。初始pH:该术语表示于步骤(例如细菌裂解作用或过滤)的开始时测量的pH。糖糖，如在文中定义的，包括单糖、二糖、以及较大的糖例如直链和支链多糖。糖也包括经取代或化学修饰的糖，例如脂多糖(LPS)和它们的化学修饰变体。D-氨基酸该术语是指以右旋异构形式存在的氨基酸，而不是以左旋异构形式存在的生物合成所产生的L-氨基酸。外消旋作用该术语指L-氨基酸至少部份化学修饰成D-氨基酸。避免基于朊病毒(prion)的疾病的风险的培养基表示一种使用于制备该提取物的任何阶段且不包含取自动物(例如牛或羊)、或取自任何可传染基于朊病毒的疾病的其他动物的物质例如血清或肉提取物的培养基。该培养基的例子包括基于植物的或合成的化学成分明确的培养基以及使用马血清的培养基或包含取自不传染朊病毒病的动物物种的物质的培养基。基于朊病毒的疾病的例子包括(例如)疯牛病、羊骚痒症、和克雅病(Creutzfeld-Jacobdisease)。非动物培养基为一种不包含得自动物的成分的培养基。例子包括基于植物的(即植物性)培养基，例如大豆培养基、和合成培养基。治疗，如在本文中使用的，表示现有感染及其他症状的治疗(例如)，以及预防或防止新感染的发展(例如)二者。受试者，如在本文中使用的，表示任何动物受试者，包括哺乳动物受试者，例如人和驯养的哺乳动物。应了解本文所定义和本发所使用的特定细菌菌株可包括得自本文所列举的原保藏或其遗传克隆的菌株，包括在较迟的时间再保藏的具有不同保藏码名字但遗传上被认为是与原保藏版本相同的菌株的菌株。本文中所使用的所有数字是大约的，考虑在其测量中的固有误差、舍入、和有效数字。提取物的制备本发明的细菌提取物可通过发酵接着生物质的热灭活、浓縮和收获、在确定的条件下单一细菌生物质的碱裂解或细菌生物质的混合物的碱裂解制备。不同条件下的碱裂解产物可在通过过滤纯化之前进行混合。所得滤液可进一步纯化，例如除去颗粒物质，且也可进行冷冻干燥和/或配制。对于各菌株，为了获得足够量的物质，发酵培养物可从工作种子批次开始接着接种于较大发酵容器中。各物种所使用的培养基可以相同。然而，可引入补充生长因子以提高一些物种的生长。在一些实施方案中，避免基于朊病毒的疾病的风险的培养基可用于生长至少一些，或全部，菌株。例子包括非动物培养基例如基于植物的培养基和合成培养基。其他例子包括包含马血清或另一动物提取物的培养基，其取自不引起朊病毒病的威胁的动物物种，与在7可引起该风险的牛血清或肉提取物的存在下生长的菌株不同。在一些实施方案中，发酵可用小量培养物(例如O.1至1.0升)开始，于30至40°C(例如37°C)培养约3至6小时以获得3.0至5.0的于700nm处的光学密度(OD)。小规模培养步骤之后，在一个或一系列较大发酵槽中的额外培养可在3(TC至4(TC下进行3小时至20小时，例如3-10小时，或8小时。发酵之后，来自各菌株或一组菌株的生物质可通过热处理灭活、浓縮、和冷冻。在解冻冷冻的生物质之后，可用氢氧根离子(例如来自NaOH)的浓溶液稀释和碱化细菌悬浮液以裂解细菌细胞。在一些实施方案中，约10至约120克/升的来自一种菌株或菌株混合物的细菌干重被裂解，例如约15至约80克/升，或约15至约35克/升，例如15、20、25、30、或35克/升。在一些实施方案中，约40至约80克/升被裂解，例如40、50、60、70、或80克/升。(细菌干重浓度以每升裂解液的干生物质的量定义。干重浓度通过在小瓷皿中于105t:干燥5毫升的物质直到其达到恒定质量然后以克/升记录该质量而测量)。在一些实施方案中，使用0.01N至1.2N的强碱浓度，例如，从0.ION至I.1N、或从0.ION至O.65N、或从O.ION至O.4N、或从0.1、0.2、0.3、或0.4N开始或结束的范围、或从0.6N至1.1N、或从0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、或1.1N开始或结束的范围、或使用碱浓度以达到12或更高的初始pH、或大于12的pH、大于12且小于13.5的pH、例如大于12.5、大于12.6、大于12.8、或从pH12.6至pH13.4。在可溶性化合物的提取后，在裂解作用期间的pH可降低。因此，在该步骤期间可调整pH。裂解温度可为30至60°C，例如从35-40°C，例如37°C。裂解作用的时间可为20小时至数天，例如5、6、7、8、9、或10天、或从30至120小时、或从30至50小时，例如30、35、40、45、或50小时、或从60至120小时，例如60、72、84、96、108、或120小时。然后可使提取物回到较低PH，混合在一起(需要时)，和过滤。裂解之后，可溶性干重可为20至180毫克/毫升。(可溶性干重通过与上述细菌干重相同的方法测量且可选择地以毫克/克单位报告，假定可溶性裂解产物的密度为1克/毫升)。通过Lowry方法测量的剩下的蛋白质浓度可为8至75毫克/毫升，例如10至70毫克/毫升，20至60毫克/毫升，或从10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、或70毫克/毫升开始或结束的范围。通过总还原糖的蒽酮方法(在菌株的混合物的裂解之后)测定的糖的浓度可为0.8至4毫克/毫升，例如1至3.5毫克/毫升，1.2至3毫克/毫升，或从1、1.5、2、2.5、3、3.5、或4毫克/毫升开始或结束的范围。裂解可以一次只对一种菌株进行、或对全部所需菌株的混合物进行。例如，混合的提取物可通过混合(例如)二种或更多种细菌裂解产物获得。每一种裂解产物可包含io克/升的生物质干重至90克/升，例如15-85克/升，或20-80克/升，或25-75克/升、或30-70克/升，或35-65克/升或40-60克/升，或15-35克/升，或40-80克/升。每一种裂解产物可包含(例如)约20体积％至80体积％的总提取物。混合二种裂解产物的体积比例可为(例如)25%-75%、或75%-25%、70%_30%、或30%_70%、或60%-40%、或40%-60%、或50-50%。裂解产物可通过离心和/或过滤纯化。例如，裂解产物可于9000x重力下离心，接着0.2微米过滤器上的一次或多次过滤可用于纯化提取物。在一些情形中，可使用连续几次在较大孔过滤器上的过滤接着在O.2微米过滤器上过滤。也可采用超滤方法以便帮助从该提取物中提取可溶性物质，例如，循环超滤渗透物(permeate)以进一步微过滤。在一些实施方案中，切向流过滤(tangentialflowfiltration,TFF)方法可用于过滤提取物和用于从较大细胞碎片中提取可溶性分子。(参见图l)。(参见例如，SeparationsTechnology,PharmaceuticalandBiotechnologyApplications,WayneP.Olson，Editor,InterpharmPress,Inc.，BuffaloGrove，IL，美国，第126至135页-ISBN:0-935184-72-4)。在该TFF方法的开始时，稀释的细菌裂解产物可储存在第一个槽中。开始微过滤(MF)回路(loop)，和泵抽产物。回收所产生的MF滞留物(retentate)，而MF渗透物被转移到第二个槽。到达适当程度的浓度之后，可开始超滤(UF)回路。为了从裂解产物中连续提取可溶性化合物，UF渗透物可再循环回到第一个槽而UF滞留物储存在第二个槽中。在连续提取期间，在槽1和2中的体积可通过调节微过滤和超滤渗透物的速率调整。可用TFF或另一过滤方法进行数个该提取循环。在使用TFF的实施方案中，在最后一个循环结束时，可关闭超滤回路且可单独进行微过滤回路和将MF渗透物转移到槽2。微过滤回路可装设1.2微米至0.1微米的过滤器，例如0.65至0.2微米、或0.45微米的过滤器。交叉流可在1000升/小时米2(LHM)和3000LHM之间，例如在1500和2500LHM之间、或2000LHM且具有0.6至2巴(例如在0.8和1.5巴之间、或1.0巴)的透膜压力(TMP)。超滤回路可装设10KDa至1000KDa(例如从10KDa至100KDa、或从10KDa至30KDa、或从30KDa至100KDa)的过滤器。交叉流可在30LHM和1000LHM之间，例如在20和500LHM之间且具有0.2至1.5巴(例如在0.4禾P1.2巴之间、或0.5巴)的TMP。在5和20之间的渗滤体积可用于从细菌细胞壁提取可溶性化合物。在一些实施方案中，使用在8和15之间的体积。因此(例如)在一些实施方案中，可使用在5和15次循环之间的过滤，在一些情形中在8和15次循环之间，例如8、9、10、11、12、13、14、或15次循环。过滤之后，可进一步浓縮或离心提取物(如果需要)。例如，可进行另一使用较小孔过滤器，例如0.2微米过滤器的微过滤。过滤之后，通过Lowry测量的可溶性蛋白质的产率可为50至90%或大于60%。过滤之后，提取物可在使用配制之前冷冻干燥。在一些本发明的实施方案中，可选择裂解条件以获得"强"或"温和"裂解作用。例如，在一些实施方案中，强裂解可通过于30-4(TC，例如35-40°C、30-35"、或37"用0.6至1.1N氢氧根离子，例如0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、或1.1N或由这些浓度限制的较小范围裂解约15至约35克/升细菌干重，例如15、20、25、30、和35克/升或由这些浓度限制的较小范围(例如15-20、20-25、20-30、等等)，持续60至120小时，例如60、70、80、90、100、110、和120小时或由这些时间限制的较小范围达到。因此，如在本文中使用的，"强"裂解作用包括落在上述各最宽范围内的细菌干重浓度、氢氧根离子浓度、时间、和温度的使用。在其他实施方案中，温和裂解作用可通过于30-4(TC，例如35-40°C、30-35t:、或37。C用0.1至0.4N氢氧根离子(即0.1、0.2、0.3、或0.4)裂解约40至约80克/升细菌干重(例如40、45、50、55、60、65、70、75、或80)30至50小时(例如30、35、40、45、或50小时)达到。因此，如在本文中使用的，"温和"裂解作用包括落在上述各最宽范围内的细菌干重浓度、氢氧根离子浓度、时间、和温度的使用。在一些实施方案中，可制备如上所述的二种细菌裂解产物例如强和温和裂解产物的混合物，例如以体积计10%对90%混合物，20/80、25/75、35/65、50/50混合物(参见(例如)下述实施例8和9)。在一些实施方案中，用于提取的所有菌9株可进行强及温和裂解作用二者，接着混合所产生的裂解产物。或者可选地，一些菌株可进行强裂解作用而其他进行温和裂解作用。裂解产物的过滤可在混合之前或之后发生，例如，通过TFF方法经由具有O.65至0.2微米过滤器(例如O.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、或0.25微米过滤器)的MF回路和具有10或30KDa过滤器的UF回路，经总共8_15次循环、例如8、9、10、11、12、13、14、或15次循环。一旦制备，可纯化本发明的提取物以除去颗粒物质。细菌提取物的化学性质—些根据本发明的实施方案可包含(例如)5-75毫克/毫升的蛋白质、或10-65毫克/毫升，或20-45毫克/毫升，或5-40毫克/毫升，或5-20毫克/毫升的蛋白质或从5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75毫克/毫升开始或结束的范围；1.5至2.5毫克/毫升的游离氨基酸(A.A.)，或1.5至2毫克/毫升，或2至2.5毫克/毫升的游离A.A.，或从1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、或2.5毫克/毫升开始或结束的范围的游离A.A.，从谷氨酸(147.1克/摩尔)计算；及0.3至4.5毫克/毫升的多糖和单糖、或0.3至4毫克/毫升，或0.4至4毫克/毫升，或0.5至3.5毫克/毫升，或0.6至3毫克/毫升或0.3至1毫克/毫升或从0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、或4.5毫克/毫升开始或结束的范围的多糖和单糖。例如，一些实施方案包含约5至9毫克/毫升的蛋白质、2毫克/毫升的游离氨基酸(A.A.)，从谷氨酸(147.1克/摩尔)计算和/或约0.3至0.6毫克/毫升的多糖和单糖。在一些实施方案中，基于鲎变形细胞裂解物(limulusamoebocytelysate，LAL)产色试验的LPS当量的浓度小于5000纳克/毫升，或小于2000纳克/毫升，或小于1000纳克/毫升，或小于750纳克/毫升，或小于500纳克/毫升，或小于200纳克/毫升，或小于100纳克/毫升。根据本发明的细菌的裂解作用可导致两亲性化合物(例如脂多糖和脂肽)的部份水解作用。根据本发明的细菌的裂解作用也可导致蛋白质的部份水解作用以及脱氨基作用、脱酰胺基作用、和氨基酸从L至D的部分外消旋化。在根据本发明提取物的一个分析研究中，在提取物的总HC1水解作用和氨基酸的衍生作用之后，观察到D-天冬氨酸和D-天冬酰胺、0-谷氨酸和D-谷氨酰胺.D-丝氨酸J-甲硫氨酸.D-组氨酸.D-丙氨酸.D-精氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-缬氨酸、D-苏氨酸的气相层析峰。在该研究中这些种类的0-氨基酸的百分比范围从3%至80%。因此，一些本发明的实施方案允许丝氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和赖氨酸中的一种或多种的外消旋化作用，例如所有的上述氨基酸、或任何一种以上但小于全部的上述氨基酸的选择，例如，丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和赖氨酸，或这些氨基酸的选择。在一些实施方案中，至少10%的一种或更多种的上述氨基酸可从L外消旋化变成D。在其他实施方案中，至少30%的一种或更多种的上述氨基酸可变成外消旋化的。细菌提取物的生物活性根据本发明的提取物可有效治疗罹患或处于发展泌尿道或消化道病症(例如消化和泌尿道感染)的风险的患者。根据本发明的提取物可有效预防复发性泌尿道感染。可通过本发明提取物治疗的病症的例子包括大肠杆菌和其他细菌感染、尿道炎、肾小管间质性肾炎、阻塞性肾盂肾炎、由阻塞性和反流性尿路病变导致的泌尿道感染、包括慢性膀胱炎的膀胱炎、包括慢性前列腺炎的前列腺炎、前列腺膀胱炎、雌性骨盆炎性疾病、克罗恩病(Crohn，sdisease);禾口肠易激综合征(irritablebowelsyndrome)。提取物的生物活性可通过数种测定测量。例如，外周血单核细胞(PBMC)测定检测了来自PBMC的细胞因子IL-6的产生且可筛选提取物剌激免疫系统的能力。例如，在一些实施方案中，在用本发明提取物剌激的PBMC的上清液中测量的体外IL-6浓度范围为2000皮克/毫升至70，000皮克/毫升、2000皮克/毫升至50，000皮克/毫升、2000皮克/毫升至30，000皮克/毫升、2000皮克/毫升至20，000皮克/毫升、2000皮克/毫升至10，000皮克/毫升、或5000皮克/毫升至70，000皮克/毫升、5000皮克/毫升至50，000皮克/毫升、5000皮克/毫升至30，000皮克/毫升、5000皮克/毫升至25，000皮克/毫升、或5000皮克/毫升至10，000皮克/毫升、或15，000皮克/毫升至25，000皮克/毫升。当LPS用作激动剂对照时(于0.01微克/毫升)，所得值取决于供体、范围从5，000皮克/毫升至70,000皮克/毫升。鼠一氧化氮(N0)试验测量鼠巨噬细胞所产生的NO，其也指示免疫剌激。例如，巨噬细胞产生NO以便杀死侵入细菌。在一些实施方案中，本发明实施方案的一氧化氮(N0)体外活性(在0.001毫克/毫升至10毫克/毫升的可溶性干重的浓度下检测)提供范围为3iiM至100iiM—氧化氮、或3iiM至90iiM、3iiM至80iiM、3iiM至70iiM、3iiM至60iiM、3iiM至50iiM、3iiM至40iiM、3iiM至30iiM、3iiM至20iiM、3iiM至10iiM、或5iiM至80iiM、5iiM至60iiM、5iiM至40iiM、5iiM至20iiM、或10iiM至80iiM、10iiM至70iiM、10iiM至50iiM、10至30iiM、或10iiM至15iiM、或从3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100yM开始或结束的范围的最大反应。在体外人类外周血单核细胞和鼠巨噬细胞中所观察到的活性可取决于变量例如待裂解的细菌干重，即用于裂解的"起始材料"的量，碱裂解的持续时间、和NaOH的初始百分比或裂解作用中所使用的初始pH。体外活性试验例如PBMC和NO与LPS浓度的测定(例如通过LAL)的组合也可提供关于给定的细菌提取物的活性对毒性风险的平衡的信息。在感染模型动物体内观察到的活性显示一些本发明的实施方案具有保护效果。参见(例如)实施例9，显示动物用根据本发明的示例性提取物进行重复的治疗。在大肠杆菌泌尿道感染的体内模型(实施例8)中，接受根据本发明的示例性提取物的预防性重复口服施用的动物显示在泌尿道(膀胱和肾)中的较低细菌量。例如，当这些小鼠首先用有效量的本发明的一些实施方案处理10天时，至少8只LPS-不敏感小鼠用尿道致病性大肠杆菌菌株1677攻击之后13天的存活率为至少60%。可选择用于攻击的尿道致病性大肠杆菌的剂量以使未处理的小鼠或用水或包含赋形剂但没有提取物的空白制剂对照处理的小鼠具有60%或更少的存活率，例如50%或更少。在一些情形中，在该模型中用本发明的实施方案处理的小鼠的存活率为至少70%，至少80%，至少80%，至少90%、或至少95%。作为另一例子，当这些小鼠首先用有效量的本发明的一些实施方案处理10天时，至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌攻击13天之后的存活率为至少60%。可选择用于攻击的鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使未处理的小鼠或用水或包含赋形剂但11没有提取物的空白制剂对照处理的小鼠具有60%或更少的存活率，例如50%或更少。在一些情形中，提取物处理的小鼠的存活率为至少70%，至少80%，至少80%，至少90%、或至少95%。包含细菌提取物的组合物可以许多不同的方式配制根据本发明的提取物用于最后施用。例如，可制备口服片剂、胶囊、丸剂，以及液体制剂或气雾剂。也可制备输注或注射用制剂。本发明的实施方案可被配制(例如)成固体剂型或液体剂型。示例性固体剂型可包括(例如)包含提取物和任选的一种或更多种营养和/或膳食补充剂的片剂，例如包衣片、咀嚼片、泡腾片、舌下片、粒剂、粉剂、或胶囊。固体剂型也可包含稀释剂、填充剂、和/或其他赋形剂。可加入其他赋形剂成分，例如防腐齐U、着色齐U、调味齐U、和甜味齐IJ。也可能制备粉末或颗粒制剂。液体剂型如溶液、糖浆、悬浮液、或滴剂也可用于口服途径。实施例实施例1.大肠杆菌菌株的培养物的制备用于大肠杆菌(E.coli)1-081(E81)、大肠杆菌1-082(E82)、大肠杆菌1-083(E83)、大肠杆菌1-084(E84)、大肠杆菌1-085(E85)、大肠杆菌1-086(E86)、大肠杆菌1-087(E87)、大肠杆菌1-088(E88)、大肠杆菌1-089(E89)、大肠杆菌NCTC8603(E8603)、大肠杆菌NCTC8621(E8621)、大肠杆菌NCTC8622(E8622)、大肠杆菌NCTC8623(E8623)、大肠杆菌NCTC9026(E9026)、大肠杆菌NCTC9111(E9111)、大肠杆菌NCTC9119(E9119)、大肠杆菌NCTC9707(E9707)，和大肠杆菌NCTC9708(E9708)的培养基通过将下列成分溶解在纯化的水中而制得氯化钠3.75克/升；磷酸氢二钠2.5克/升；乙酸钠0.625克/升；植物蛋白胨(大豆木瓜蛋白酶消化物(Soyap即aicdigest))50克/升；肌苷0.125克/升；氯化钙0.025克/升；氯化钾0.125克/升；碳酸氢钠0.75克/升；精氨酸1克/升；丙酮酸钠0.35克/升；葡萄糖3克/升；和"浓縮的元素的溶液"O.625毫升/升(其包含硫酸铜3毫克/升；氯化铁830毫克/升；硫酸锌860毫克/升；和硫酸1.1毫升/升)。用1.5毫升的冷冻细菌接种0.l升的培养基且在300毫升锥形瓶中于37t:培养4小时并搅拌。然后，1.0升的培养基在3000毫升锥形瓶中用30毫升的前述300毫升培养物接种且在搅拌下于37t:再次培养4小时。表1.1:连续培养步骤的光学密度<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>制备用于在较大规模发酵槽中的下一次培养的与上述相同的培养基，但在灭菌之前加入0.05毫升/升聚丙二醇和6克/升的葡萄糖。培养温度调整为37°C，并在培养期间搅拌及曝气。pH调整为6.8。在培养期间加入十二千克的葡萄糖。约10.5小时之后，通过加热至90至IO(TC将培养物灭活并将其转移到收获槽。然后通过离心分离培养基的生物质和浓縮。根据所述培养基和培养条件，制备培养物，如下表和说明书中所示。表1.313<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例1.20以与实施例1.2所述相同的条件用合成培养基培养NCTC9111。培养基通过将下列溶解在540升的纯化的水中而制得0.2220千克的肌苷、0.3330千克的一水合柠檬酸、I.4430千克的谷氨酸、1.1655千克的氯化铵、0.7825千克的硫酸镁2H20、1.5096千克的磷酸钾(KH2P04)、0.3330千克的精氨酸、0.1110千克的尿嘧啶、0.0189千克的氯化钙、II.8200千克的氯化钠、0.5435千克的L-亮氨酸、0.5435千克的L-赖氨酸HCL、0.5435千克的L-丝氨酸、0.5435千克的L-甲硫氨酸、0.5435千克的L-缬氨酸、0.5435千克的L-丙氨酸、0.5435千克的L-天冬酰胺、14.0000升氢氧化铵、0.3420升的氢氧化钾、40.5000千克的葡萄糖、4.1667克的氯化铁、4.1667克的氯化钴、4.1667克的钼酸钠、4.1667克的硫酸锰、4.1667克的硫酸锌、4.1667克的硫酸镍、0.0833克的硼酸、0.1667硫酸铜、1.8333毫升的硫酸(95-97%)。实施例2:细胞的碱裂解实施例2.1在室温下解冻包含1810克细菌干重的一等分试样的各下列菌株E81、E82、E83、E084、E085、E086、E087、E088、E89、E9111、E8603、E8621、E8622、E8623、E026、E9119、E9707、和E9708,然后用纯化的水稀释至26克/升的细菌生物质(干重)。以0.8M氢氧化钠进行碱化作用。裂解2小时之后测量pH且为13.1。然后，该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育120小时。温育之后，用浓HC1将pH调整至11.3。(可溶性干重)；SDW:59.4毫克/毫升；Prot:17.4毫克/毫升。可溶性干重通过获得5毫升的得自该裂解作用的可溶性级分且在小瓷皿中于105t:将其干燥至恒定质量而测量。实施例2.2在根据实施例1.1至1.19，室温下解冻包含总计9264克细菌干重的3等分试样的E81、E82、E084、E086、E087、E89、2等分试样的E83和E085、4等分试样的E088、6等分试样的E9111、9等分试样的E8603、E9119、7等分试样的E8621、E9707和8等分试样的E8622、E8623、E9026、和E9708，然后用纯化的水稀释至50.1克/升的细菌生物质浓度(干重)。碱化(用0.2N氢氧根离子)为12.3。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育32小时。裂解期间，监测pH以使其减少不超过1.3pH单位。添加浓HC1将pH调整至11.3。(可溶性干重);SDW:60.7毫克/毫升;Prot:32.0毫克/毫升。实施例2.3根据表2，将生物质稀释至58克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育l天。(可溶性干重)；SDW:96.8毫克/毫升；Prot:35.3毫克/毫升。实施例2.4根据表2，将生物质稀释至92克/升的细菌生物质浓度。以10NNaOH进行于0.4M的碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育l天。SDW:146.6毫克/毫升；Prot:62.9毫克/毫升。实施例2.5根据表2，将生物质稀释至58克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育7天。SDW:97.7毫克/毫升；Prot:42.4毫克/毫升。实施例2.6根据表2，将生物质稀释至92克/升的细菌生物质浓度。以0.4丽aOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育7天。SDW:153.0毫克/毫升；Prot:78.9实施例2.7根据表2，将生物质稀释至58克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育3天。SDW:98.6毫克/毫升；Prot:29.6毫克/毫升。实施例2.8根据表2，将生物质稀释至92克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育3天。SDW:127.4毫克/毫升；Prot:60毫克实施例2.9根据表2，将生物质稀释至43克/升的细菌生物质浓度。以0.2MNa0H进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育168小时。SDW:43.2毫克/毫升；Prot:8.2实施例2.10根据表2，将生物质稀释至57克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育3天。SDW:69.5毫克/毫升；Prot:20.2毫克/毫升。实施例2.11根据表2，将生物质稀释至30克/升的细菌生物质浓度。以l丽aOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育3天。SDW:86.9毫克/毫升；Prot:13毫克实施例2.12根据表2，将生物质稀释至27克/升的细菌生物质浓度。1MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育3天。SDW:91.3毫克/毫升；Prot:11.8毫克/实施例2.13根据表2，将生物质稀释至14克/升的细菌生物质浓度。以0.1MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育1天。SDW:25.2毫克/毫升；Prot:5.8毫克实施例2.14根据表2，将生物质稀释至14克/升的细菌生物质浓度。以0.2MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育3天。SDW:26.6毫克/毫升；Prot:5.7毫克实施例2.15根据表2，将生物质稀释至14克/升的细菌生物质浓度。以0.1MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育IO天。SDW:20.0毫克/毫升；Prot:2.1毫克/毫升。实施例2.16根据表2，将生物质稀释至114克/升的细菌生物质浓度。以l丽aOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育1天。SDW:163.3毫克/毫升；Prot:68.4毫克/毫升。实施例2.17根据表2，将生物质稀释至114克/升的细菌生物质浓度。以0.4MNaOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育3天。SDW:163.0毫克/毫升；Prot:60.3实施例2.18根据表2，将生物质稀释至114克/升的细菌生物质浓度。以l丽aOH进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育10天。SDW:171.2毫克/毫升；Prot:71.017实施例2.19根据表2，将生物质稀释至25克/升的细菌生物质浓度。以0.45MNa0H进行碱化作用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育4天。SDW:48.5毫克/毫升；Prot:15.2毫克/毫升；A.A:4.0毫克/毫升；糖0.86毫克/毫升。实施例2.20根据表2，将生物质稀释至28克/升的细菌生物质浓度。用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育4天。SDW:59.4毫克/毫升；A.A:5.4毫克/毫升；糖1.22毫克/毫升。实施例2.21根据表2，将生物质稀释至58克/升的细菌生物质浓度。用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育4天。SDW:64.4毫克/毫升；A.A:5.6毫克/毫升；糖1.84毫克/毫升。实施例2.22根据表2，将生物质稀释至56克/升的细菌生物质浓度。用。该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育3天。SDW:61.0毫克/毫升；A.A:5.6毫克/毫升；糖1.88毫克/毫升。实施例2.23根据表2，将生物质稀释至39克/升的细菌生物质浓度。用。该裂解作用在连续搅拌下于35-40。C温育4天。SDW:78.32毫克/毫升；A.A:7.8毫克/毫升；糖1.54毫克/毫升。实施例2.24在室温下解冻包含1810克细菌干重的一等分试样的各下列菌株E82、E83、E084、E086、E087、E088、E9111、E8603、E8621、E8622、E8623、E026、E9119、E9707、和E9708，然后用纯化的水稀释至25克/升的细菌生物质(干重)。以1.0M氢氧化钠进行碱化作用。裂解2小时之后测量pH且为13.5。然后，该裂解作用在连续搅拌下于35-4(TC温育72小时。温育之后，用浓HC1将pH调整至11.4。(可溶性干重);SDW:75.4毫克/毫升;Prot:14.8毫克/毫升；A.A:5.4毫克/毫升；糖0.9毫克/毫升。表2:大肠杆菌裂解产物的组合物以O.;克/以O.;克/以o.;克/以o.克6MNaOH进行碱化作毫升；Prot:16.8毫2MNaOH进行碱化作毫升；Prot:32.4毫2MNaOH进行碱化作毫升；Prot:30.0毫7MNaOH进行碱化作/毫升;Prot:20.60CO寸卜一ON一豕CM实零寸零豕so零例1.17例1.18军C3实军零豕豕零嗜嗜，嗜裙，，竭嗜，裙嗜裙裙裙谅械械械械钛械挑械沐'铋械咏CO械沐咏械I—械OO械\oCN04SOCOOQOOOOpqOOpqOOOOpqOOOOOOOOOOIX]CT>ONON2.32.4X2.5X2.6X2.7XXxXXX2.8XxXXXXXX2.9X2.10X2.11XXxXXXX2.12XXXXX2.13XXXXXXXXXXXXXXXX2.14xXXXXXXXXXXXXXx2.15XXXXXXxxXXX2.16XXXXXXXXXXXXXXX2.17XXXXXXXXXXXXXXXXX2.18XXXXXXXXXXXXXXXXX2.19XXXXXXXXXXXXXXX2.20XXXXXXXXXXXXXXX2.21XXXXXXXXXXXXX2,22XX^XXXXXXXXXXXX2.23XXX>;XXXXXXX实施例3:裂解产物的混合物混合一些细菌提取物并调整pH，结果如下实施例3.10.845千克的大肠杆菌实施例2.4和1.4千克的大肠杆菌实施例2.3混合。混合物用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为可溶性干重(SDW):29.7毫克/毫升；Prot:10.0毫克/毫升。实施例3.21.4千克的大肠杆菌实施例2.7和0.85千克的大肠杆菌实施例2.8混合。混合物用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为可溶性干重(SDW):32.3毫克/毫升；Prot:10.3毫克/毫升。如实施例2中所述测量SDW。蛋白质浓度通过Lowry测定测量(参见欧洲药典2.5.33，"总蛋白质-方法2")。实施例3.31.4千克的大肠杆菌实施例2.5和0.86千克的大肠杆菌实施例2.6混合。混合物19用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:26.8毫克/毫升；Prot:9.6毫克/毫升。实施例3.42.4千克的大肠杆菌实施例2.7和1.5千克的大肠杆菌实施例2.8混合。混合物用纯化的水稀释至20千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:22.0毫克/毫升；Prot:9.5毫克/毫升。实施例3.59.0千克的大肠杆菌实施例2.9用纯化的水稀释至9.3千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:45.7毫克/毫升；Prot:20.6毫克/毫升。实施例3.68.1千克的大肠杆菌实施例2.10用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:39.7毫克/毫升；Prot:17.3毫克/毫升。实施例3.73.2千克的大肠杆菌实施例2.11和3.2千克的大肠杆菌实施例2.12混合。混合物用纯化的水稀释直至12.8千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:39.9毫克/毫升；Prot:8.0毫克/毫升。实施例3.8248千克的大肠杆菌实施例2.19用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:31.6毫克/毫升；Prot:10.2毫克/毫升；游离氨基酸(A.A.):2.6毫克/毫升；糖0.59毫克/毫升。根据D.Herbert等人，Meth.Microbiol.5B:266及以下(1971)在酸水解和衍生化之后分析糖浓度。总游离氨基酸浓度通过将氨基酸转化成异吲哚衍生物和于340nm处测量吸光值而测得(根据RothM.，Fluorescencereactionforaminoacids，Anal.Chem.，43，880-882，(1971))。结果以谷氨酸的当量表示。实施例3.9248千克的大肠杆菌实施例2.20用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:38.9毫克/毫升；Prot:10.8毫克/毫升；A.A.:3.6毫克/毫升；糖0.74毫克/毫升。实施例3.10247千克的大肠杆菌实施例2.21用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:40.08毫克/毫升；Prot:20.0毫克/毫升；A.A.:3.6毫克/毫升；糖1.17毫克/毫升。实施例3.11247千克的大肠杆菌实施例2.22用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:43.9毫克/毫升；Prot:19.1毫克/毫升；氨基酸(A.A.):3.9毫克/毫升；糖1.27毫克/毫升。实施例3.121.9千克的大肠杆菌实施例2.21和6千克的大肠杆菌实施例2.23混合。混合物用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为20SDW:45.4毫克/毫升；Prot:12.6毫克/毫升；A.A.:3.8毫克/毫升；糖0.82毫克/毫升。实施例3.134千克的大肠杆菌实施例2.21和4千克的大肠杆菌实施例2.23混合。混合物用纯化的水稀释至12千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:47.0毫克/毫升;Prot:15.0毫克/毫升；A.A.:3.9毫克/毫升；糖1.14毫克/毫升。实施例3.1472.4千克的大肠杆菌实施例2.1和185.2千克的大肠杆菌实施例2.2混合。混合物用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:40.8毫克/毫升;Prot:17.7毫克/毫升；A.A.:3.7毫克/毫升；糖1.24毫克实施例3.1575.4千克的大肠杆菌实施例2.24和185.2千克的大肠杆菌实施例2.2混合。混合物用纯化的水稀释至400千克。将稀释的细菌裂解产物混合物转移至微过滤槽。分析结果为SDW:43.6毫克/毫升;Prot:17.0毫克/毫升；A.A.:3.3毫克/毫升；糖1.16毫克实施例4:裂解产物的纯化实施例4.1将实施例3.1的细菌裂解产物的混合物转移到微过滤(MF)槽。微过滤(MF)单元使用蛇形模式的0.45微米切向流过滤(TFF)过滤器(PALLProcette)或平行模式的Schleicher&Schuell过滤器。(参见图1TFF装置的示例性示意图)。对于蛇形模式，交叉流调整为2000升/小时米、LHM)且透膜压力(TMP)调整为1.3巴。将渗透物转移到超滤(UF)槽。—旦裂解产物在微过滤槽中的体积达到初始体积的一半，启动UF单元。交叉流调整至1500LHM且TMP调整至0.3巴。MF(MF的初始体积称为ViMF)和UF槽的体积维持于相同水平。在各渗滤体积(对应于ViMF)下，在蛋白质提取后通过Braford微量菌斑测定(microplaqueassay)进行蛋白质的测量。通过此测量，确定提取循环的数目以提取所有的可溶性化合物。IO渗滤体积之后，停止UF，且在MF槽中浓縮细菌裂解产物。回收体积为9.55千克。然后将产物稀释至7.0毫克/毫升和然后通过0.2微米无菌过滤器过滤。可溶性干重(SOT):24.2毫克/毫升;Prot:6.4毫克/毫升。A.A:1.3毫克/毫升，糖0.5毫克/毫升。D-氨基酸百分比:29%D-Ala，4%D-Thr，11%D_Leu，45%D_Ser，36%D_Asx，29%D-Met，26%D-Phe，21%D_Glx，25%D_Tyr，9%D-Lys。在20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后测量NOx(巨噬细胞一氧化氮)产量且结果如下:C1:6.3ilM、C2:7.4ilM、和C3:13.lilM。如下所述通过切向流过滤(TFF)过滤一些另外的混合物。实施例4.2将实施例3.2的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2500LHM和TMP调整为1.30巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循21环中的渗透通量(permeateflux)为38.2LHM。干重提取产率为65%，蛋白质提取产率为80%和体积产率为80%。所得浓縮物包含SDW:26.1毫克/毫升；Prot:8.1毫克/毫升；A.A.:1.4毫克/毫升；糖0.6毫克/毫升；DNA:4.8微克/毫升。D_氨基酸百分比29%D-Ala，4%D-Thr，11%D_Leu，45%D_Ser，36%D-Asx，29%D-Met，26%D-Phe，21%D-Glx，25%D-Tyr，9%D-Lys。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量Cl:5.5iiM，C2:7.5iiM，C3:5.5iiM。实施例4.3将实施例3.3的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2450(升/小时米2)LHM和(透膜压力)TMP调整为1.3巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为26.2升/小时.米2。干重提取产率为65%，蛋白质提取产率为75%和体积产率为88%。所得浓縮物包含SDW:24.5毫克/毫升；Prot:7.0毫克/毫升；A.A.:2.1毫克/毫升；糖0.5毫克/毫升；DNA:8.2微克/毫升。D_氨基酸百分比45%D-Ala，11%D-Leu，48%D_Ser，44%D-Asx，41%D-Met，26%D_Phe，25%D-Glx，38%D-Tyr，27%D-Lys。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量C1:5.1iiM，C2:6.8iiM，C3:13.7iiM。实施例4.4将实施例3.4的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2000(升/小时米2)LHM和透膜压力TMP调整为1.8巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为22.5升/小时.米2。干重提取产率为67%，蛋白质提取产率为84%和体积产率为92%。所得浓縮物包含SDW:21.5毫克/毫升；Prot:6.1毫克/毫升；A.A.:1.5毫克/毫升；糖0.3毫克/毫升；DNA:5.6微克/毫升。D_氨基酸百分比44%D-Ala，15%D-Thr，12%D_Leu，48%D_Ser，40%D_Asx，40%D_Met，30%D-Phe，26%D-Glx，31%D-Tyr，18%D-Lys。实施例4.5将实施例3.5的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2000(升/小时米"LHM和透膜压力TMP调整为1.3巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为27.7升/小时.米2。干重提取产率为72%，蛋白质提取产率为69%和体积产率为86%。所得浓縮物包含SDW:36.9毫克/毫升；Prot:16.9毫克/毫升；A.A.:2.8毫克/毫升；糖0.815毫克/毫升；DNA:46.7微克/毫升。D-氨基酸百分比27%D-Ala，16%D-Thr，11%D_Leu，48%D_Ser，40%D_Asx，39%D_Met，36%D-Phe，32%D-Glx，31%D-Tyr。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量Cl:6.2iiM，C2:10.9yM，C3:18.3yM。实施例4.6将实施例3.6的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2000(升/小时米"LHM和(透膜压力)TMP调整为1.3巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为15.7升/小时.米2。干重提取产率为53%，蛋白质提取产率为51%和体积产率为81%。所得浓縮物包含SDW:30.l毫克/毫升；Prot:12.7毫克/毫升；A.A.:2.6毫克/毫升；糖0.364毫克/毫升。D-氨基酸百分比40%D-Ala，16%D-Thr，12%D_Leu，49%D_Ser，43%D_Asx，44%D_Met，40%D_Phe，38%22D-Glx，36%D-Tyr，24%D-Lys。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量Cl:5.8iiM，C2:7.1iiM，C3:15.1iiM。实施例4.7将实施例3.7的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2000(升/小时米^LHM和(透膜压力)TMP调整为1.35巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为30.0升/小时.米2。干重提取产率为82%，蛋白质提取产率为83%和体积产率为92%。所得浓縮物包含SDW:38.2毫克/毫升；Prot:5.4毫克/毫升。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量C1:0.4线C2:2.1线C3:16.3iiM。实施例4.8500毫升的实施例2.13的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。体积产率为45%。所得浓縮物包含SDW:25.21毫克/毫升；Prot:5.85毫克/毫升；DNA:7.5微克/毫升。D-氨基酸百分比:24%D-Ala，16%D_Thr，9%D_Leu，43%D_Ser，20%D-Asx，16%D-Met，10%D-Phe，8%D_Glx，7%D—Tyr。实施例4.9500毫升的实施例2.14的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。体积产率为53%。所得浓縮物包含SDW:26.62毫克/毫升；Prot:5.75毫克/毫升；DNA:6.5微克/毫升。D-氨基酸百分比:35%D-Ala，22%D-Thr，腦D_Leu，45%D_Ser，35%D-Asx，35%D-Met，31%D_Phe，24%D_Glx，22%D-Tyr，12%D-Lys。于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:9232皮克/毫升。实施例4.10500毫升的实施例2.15的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。体积产率为53%。所得浓縮物包含SDW:20毫克/毫升；Prot:2.13毫克/毫升；DNA:3.5微克/毫升。D-氨基酸百分比:35%D-Ala，4%D-Thr，11%D_Leu，46%D_Ser，34%D_Asx，32%D-Met，24%D-Phe，24%D_Glx，15%D-Tyr。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.01毫克/毫升(CI)，0.1毫克/毫升(C2)，禾P1.0毫克/毫升(C3);Cl:3.6iiM，C2:4.4iiM，C3:7.9iiM。实施例4.11500毫升的实施例2.16的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。体积产率为33%。所得浓縮物包含SDW:163.33毫克/毫升；Prot:68.42毫克/毫升；DNA:14.l微克/毫升。D-氨基酸百分比:38%D-Thr，l%D_Leu，49%D_Ser，43%D_Asx，64%D-Met，30%D-Phe，31%D_Glx，4%D-Tyr。实施例4.12500毫升的实施例2.17的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HCl将pH调整至lO.5。体积产率为17%。所得浓縮物包含SDW:162.78毫克/毫升；Prot:60.26毫克/毫升；DNA:14.8微克/毫升。D-氨基酸百分比:10%D-Leu，40%D_Ser，34%D_Asx，62%D_Met，27%D-Phe，23%D-Glx，5%D-Tyr。实施例4.13500毫升的实施例2.18的裂解产物于9000g离30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。体积产率为13%。所得浓縮物包含SDW:171.16毫克/毫升；Prot:71.02毫克/毫升；DNA:16.9微克/毫升。实施例4.14将实施例3.8的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2300(升/小时米2)LHM和透膜压力TMP调整为1.5巴。11渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为32.5升/小时.米2。干重提取产率为86%，蛋白质提取产率为87%和体积产率为90%。所得浓縮物包含SDW:26.6毫克/毫升；Prot:8.1毫克/毫升；A.A.:2.3毫克/毫升；糖0.42毫克/毫升；DNA:68.5微克/毫升。于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:29898皮克/毫升，IL-10:446皮克/毫升，TNF-a:3429皮克/毫升。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.02毫克/毫升(Cl)，O.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3);C1:2.3iiM，C2:16.6yM，C3:4.OyM。实施例4.15将实施例3.9的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2375(升/小时米2)LHM和透膜压力TMP调整为1.3巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为32.5升/小时.米2。干重提取产率为83%，蛋白质提取产率为79%和体积产率为92%。所得浓縮物包含SDW:24.9毫克/毫升；Prot:7.2毫克/毫升；A.A.:2.3毫克/毫升；糖0.49毫克/毫升。于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:23709皮克/毫升，IL-10:385皮克/毫升，TNF-a:2917皮克/毫升。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3);C1:1.1线C2:13.8ilM，C3:4.2ilM。实施例4.16将实施例3.10的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2500(升/小时米^LHM和透膜压力TMP调整为1.0巴。10渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为15.0升/小时.米2。干重提取产率为58%，蛋白质提取产率为59%和体积产率为79%。所得浓縮物包含SDW:22.0毫克/毫升；Prot:8.1毫克/毫升；A.A.:1.6毫克/毫升；糖0.46毫克/毫升；DNA:23.9微克/毫升。于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:21458皮克/毫升，IL-10:281皮克/毫升，TNF-a:123皮克/毫升。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.02毫克/毫升(Cl)，O.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3);C1:14.6线C2:23.8线C3:16.9yM。D-氨基酸百分比27%D-Ala，22%D—Thr，11%D—Leu，44%D—Ser，27%D—Asx，26%D—Met，22%D—Phe，16%D-Glx，15%D-Tyr，8%D-Lys。实施例4.17将实施例3.11的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模24式，将交叉流调整为2500(升/小时米2)LHM和透膜压力TMP调整为1.0巴。10渗滤体积之后停UF且第一个循环中的渗透通量为17.5升/小时.米2。干重提取产率为69%，蛋白质提取产率为69%和体积产率为78%。所得浓縮物包含SDW:22.2毫克/毫升；Prot:8.3毫克/毫升；A.A.:1.8毫克/毫升；糖0.5毫克/毫升；DNA:33.3微克/毫升。于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:19304皮克/毫升，IL-10:343皮克/毫升，TNF-a:220皮克/毫升。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.02毫克/毫升(CI)，0.2毫克/毫升(C2)和2.0毫克/毫升(C3);Cl:14.4iiMC2:20.5yMC3:18.9yM。D-氨基酸百分比:30%D-Ala，18%D-Thr，10%D_Leu，44%D_Ser，29%D_Asx，28%D_Met，23%D-Phe，18%D-Glx，18%D-Tyr，11%D-Lys。七十升的液体形式用196毫升的HC125%中和且然后与10.44千克的甘露醇混合。然后冷冻干燥混合物。冷冻干燥循环期间产物冷冻于-5(TC然后加热至-25t:。冷冻干燥器中的压力维持于0.2和0.5毫巴之间且通过过滤的空气喷射控制。然后，在第二次干燥中，将产物加热直至其最终冷冻干燥温度(+30°C)同时保持0.2毫巴以下的真空程度。当冷冻干燥循环完成时，在冷冻干燥器中用过滤的空气再建立常压。冷冻干燥产物通过适合的振动筛筛分。回收11.95千克的冷冻干燥产物。实施例4.18500毫升的实施例3.13的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。所得浓縮物包含SDW:42.8毫克/毫升；Prot:12.5毫克/毫升；A.A.:3.5毫克/毫升；糖1.13毫克/毫升；DNA:14.1微克/毫升。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量C1:0.4iiM，C2:5.7iiM，C3:25.liiM。浓縮物的稀释体积(毫升)的PBMC:稀释100:IL-6:2101皮克/毫升。D-氨基酸百分比:25%D-Ala，12%D_Thr，10%D-Leu，45%D_Ser，35%D_Asx，35%D_Met，29%D_Phe，26%D-Glx。实施例4.19500毫升的实施例3.12的裂解产物于9000g离心30分钟。然后上清液通过具有0.8微米、0.45微米和0.2微米孔隙度的连续过滤器过滤。用HC1将pH调整至10.5。所得浓縮物包含SDW:38毫克/毫升；Prot:9.7毫克/毫升；A.A.:3.1毫克/毫升；糖0.82毫克/毫升;DNA:80.1微克/毫升。20，000-倍(CI)、2000-倍(C2)、和200-倍(C3)稀释之后的NOx产量:Cl:0.3线C2:2.6线C3:19.2iiM。浓縮物的稀释体积(毫升)的PBMC:稀释100:IL-6:2802皮克/毫升。D-氨基酸百分比:35%D_Ala，25%D-Thr，10%D-Leu，46%D-Ser，40%D_Asx，38%D_Met，34%D_Phe，32%D_Glx，32%D_Tyr，24%D-Lys。实施例4.20将实施例3.14的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2500(升/小时米"LHM和透膜压力TMP调整为1.2巴。13渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为16.0升/小时.米2。干重提取产率为64%，蛋白质提取产率为62%和体积产率为78%。所得浓縮物包含SDW:22.4毫克/毫升；Prot:8.7毫克/毫升；A.A.:1.8毫克/毫升；糖0.54毫克/毫升；DNA:39.1微克/毫升。D-氨基酸百分比:32%D-Ala，18%D-Thr，于1毫克活性干重/毫升的PBMC:IL-6:22303皮克/毫升，IL-IO:561皮克/毫升，TNF-a:336皮克/毫升。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产25量O.02毫克/毫升(Cl)，O.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3):C1:11.3yM，C2:15.3iiM，C3:13.5iiM。D-氨基酸百分比:32%D_Ala，18%D-Thr，腦D_Leu，44%D-Ser，26%D-Asx，23%D-Met，17%D-Phe，15%D-Glx，14%D_Tyr，9%D-Lys。实施例4.21将实施例3.15的裂解产物转移到MF槽。TFF装置类似于实施例4.1。对于蛇形模式，将交叉流调整为2500(升/小时米"LHM和(透膜压力)TMP调整为1.0巴。13渗滤体积之后停止UF且第一个循环中的渗透通量为15.0升/小时.米2。干重提取产率为69%，蛋白质提取产率为66%和体积产率为77%。所得浓縮物包含SDW:21.4毫克/毫升；Prot:7.6毫克/毫升；A.A.:1.6毫克/毫升；糖0.5毫克/毫升；DNA:25.9微克/毫升。D-氨基酸百分比D-氨基酸百分比12.5%D-Ala，3.4%Val，16.6%，65%D-Ser，26.1%D-Asx，18.8%D-Met，15.6%D_Glx，9.1%D-Lys。以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.02毫克/毫升(Cl)，0.2毫克/毫升(C2)，和2.0毫克/毫升(C3):C1:10.3iiM，C2:15.2线C3:12.3iiM。如实施例4.17中所述冷冻干燥该液体形式。蛋白质含量(Lowry)为每克冷冻干燥产物44毫克蛋白质。冷冻干燥产物的以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.01毫克/毫升(Cl)，O.l毫克/毫升(C2)，和1.0毫克/毫升(C3):C1:6.4iiM，C2:12.9yM，C3:19.4iiM。胶囊通过混合50.4千克的冷冻干燥产物与64.68千克的淀粉1500PT、2.52千克的硬脂酸镁和50.4千克的甘露醇而制得。胶囊的以毫克活性干重/毫升表示的NOx产量0.01毫克/毫升(Cl)，0.1毫克/毫升(C2)，禾P1.0毫克/毫升(C3):C1:6.8ilM，C2:12.l线C3:19.liiM。实施例5实施例5A:"起始材料"的量对通过人类PBMC分泌的IL-6测量的细菌裂解产物的活性的影响人PBMC和细胞培养物的制备将得自健康供体的夕卜周血(Centredetransfusion,H6pita1Universitaire，日内瓦)离心以获得血沉棕黄层(buffycoat)。将血沉棕黄层和Hank氏平衡生理盐水(HBSS，Sigma，Buchs，瑞士)混合，在FicollPaquePlus(AmershamPharmacia)上分层至1.077克/毫升并离心(2800rpm，2(TC，25分钟)。从界面收获的细胞在室温下于800rpm在HBSS中洗涤15分钟且将沉淀细胞再悬浮于HBSS中。使用Neubauer细胞进行细胞计数。全部细胞培养在补充青霉素(100U/毫升)、链霉素(100微克/毫升)、L-谷氨酰胺(2毫摩尔/升)和10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基(全部得自Sigma)中进行。对于体外剌激，细胞以1X106活细胞/孔的浓度培养。剌激和IL-6在培养上清液中的测量外周血单核细胞(PBMC)于37C在5%C02氛围下培养，且本发明的产物以0.25、0.5、1、和2毫克/毫升"可溶性干重，SDW"(在RPMI-1640培养基中)进行测试。24小时之后收获培养物的上清液且根据制造商的说明，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(HumanIL-6ELISASet,BDOptEIA，SanDiego，USA)测量IL-6的浓度。检测极限为10皮克IL-6/毫升。首先在PBMC试验中测试活性。(参见图2a和2b，显示"起始材料"的量(细菌生物质的浓度，以克干重每升裂解产物表示)从12.5克/升(图2a)增加26至25克/升(图2b)的影响。提取物的活性依赖于经历碱裂解的"起始材料"的量(12.5克/升对25克/升)。Na0H(2X体积/体积)的百分比和碱裂解(72小时)的时间为恒定的。图3a和3b显示起始材料从25克/升增加至100克/升的影响。碱裂解的时间固定为168小时和NaOH的百分比固定为1%。根据图2和3，"起始材料"水平越高，所得活性越高。实施例5B:裂解的持续时间对本发明产物在PBMC试验中的活性的影响。"起始材料"为12.5克/升，且在24小时(图4a)或72小时(图4b)期间用2%NaOH处理。根据这些图，较长裂解时间产生较低活性。实施例6:NaOH的初始百分比(体积/体积)对本发明的细菌裂解产物在鼠一氧化氮试验中的活性的影响通过C02吸入杀死六周大雄性C57/BL6小鼠(六周大雄性，SPF品质，CharlesRivier，FR)。从后附肢移出髋骨、大腿骨、和胫骨。在切割两端部分之后通过将达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)(DH)注射通过骨从内腔提取骨髓。洗涤之后，将干细胞再悬浮(40，000细胞/毫升)于用20%马血清和30XL929细胞上清液补充的DH培养基。细胞悬浮液在培养箱中于37t:在8%C02及饱和湿气氛围下培养8天。然后用冰冷PBS分离巨噬细胞，洗涤和再悬浮于用5%胎牛血清(FCS)、氨基酸和抗生素补充的DH培养基(DHE培养基)中。将细胞密度调整至700，000细胞/毫升。产物的水溶液直接在微量滴定板中连续地稀释于DHE培养基中。以一式三份测试产物且每个微量滴定板包含由培养基组成的阴性对照。在各孔中最终体积为100微升。将100微升的细胞悬浮液加至该稀释的产物且细胞在培养箱中于37t:在8%C02及饱和湿气氛围下培养22小时。在培养期结束时，将100微升的上清液转移到另一微量滴定板且通过进行革利士(Griess)反应测定在各上清液中所产生的亚硝酸盐浓度。将在2.5%磷酸水溶液中的100微升的革利士试剂(5毫克/毫升的磺胺+0.5毫克/毫升的N-(l-萘基)乙二胺盐酸盐)加至各孔。用分光光度计(SpectraMaxPlus,MolecularDevices)，于562nm处(对照690nm处的参照)读取微量滴定板。亚硝酸盐浓度与所形成的一氧化氮含量成比例。亚硝酸盐含量根据标准曲线测定。结果以PM—氧化氮(NO)表达为平均值±标准偏差且绘制为剂量应答曲线。在图5中所显示的试验中，起始材料的量(25克/升)和裂解的时间(168小时)是相似的，测试的变量为用于获得二种裂解产物的NaOH的浓度(1%(部分A)对4%(部分B))。当使用4%NaOH(图5中的B)时，与1%NaOH(图5中的A)相比，观察到较低活性，暗示内毒素样分子的可能的碱剂量_依赖性降解。取决于起始材料、NaOH的浓度、和裂解的时间，在NO巨噬细胞试验中可产生不同的免疫活性。实施例7:鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验为了测定内毒素样分子的存在，用Bio-Whittaker的Chromogenic-LALKit进行LAL试验。此试验基于通过存在于LAL中的酶促级联利用脂多糖(LPS)或可比较结构的产物的活化作用。此酶促活化作用通过用蛋白酶切开连接到肽的色素原来证明。酶促反应于37t:进行和色素原随时间的形成在405nm处进行测量。记录达到0.2单位D.0.所需的时间和相对于LPS标准(标准曲线)计算的内毒素活性。根据本发明的提取物的该类示例性实验的结果以相对于标准化大肠杆菌LPS制剂的EU(内毒素单位)表示于下表中(1EU对应于0.09纳克当量LPS)。裂解条件(裂解时间、起始材料量、NaOH的初始百分比)EU/毫升纳克当量LPS/毫升T=24小时-12.5克/升-2%NaOH343±622±0.4T=24小时-12.5克/升-1%NaOH33530±1762163±11T=24小时-25克/升-2%NaOH908±5.158±0.3T=24小时-50克/升-4%NaOH48±0.43±0.1T=24小时-50克/升-3%NaOH355±1123±0.7T=72小时-12.5克/升-2%NaOH<50<3T=72小时-25克/升-3%NaOH65±0.94.±0.1T=72小时-50克/升-2%NaOH196±613±0.4T=72小时-50克/升-3%NaOH45±33±0.2T=72小时-50克/升-4%NaOH162±311±0.2T=168小时-12.5克/升-2%NaOH26±0.72±0.1T=168小时-12.5克/升-3%NaOH45±33±0.2T=168小时-25克/升-3%NaOH25±12±0.04T=168小时-50克/升-2%NaOH55±14±0.04T=168小时-50克/升-3%NaOH1035±4267±2.7T=168小时-50克/升-4%NaOH46±23±0.1水<0.005<0.0003实施例8:本发明的实施方案在泌尿道大肠杆菌感染模型(在小鼠的LPS-不敏感28株系中)中的效果根据本发明的实施方案在大肠杆菌泌尿道感染模型中(在LPS-不敏感小鼠中)进行测试(参见Hopkins等人，InheritanceofsusceptibilitytoinducedEscherichiacolibladderandkidneyinfectionsinfemaleC3H/HeJmice,JInfectDis.2003Feb1;187(3):418-23)。三组10-12周大雌性C3H/HeJ小鼠(每组8只小鼠)在大肠杆菌感染之前用三种提取物之一口服处理(参见下文)10天。C3H/HeJ小鼠包含在Toll样受体基因(TLR4)中的突变且对TLR4激动剂例如脂多糖(LPS)不敏感。因此此模型适合于检测经由其他途径而非TLR4起作用的药效。小鼠在处理期间维持在18-26°C的周围温度和30至70%的相对湿度的正常条件下。光方案设定为12:12小时的光暗循环。动物用由HarlanSpragueDawley(Indianapolis,IN)实验室提供的标准膳食饲养。随意提供自来水，除非另有说明。所试验的三种提取物为a)通过18种大肠杆菌菌株的强裂解作用获得的提取物b)通过18种大肠杆菌菌株的温和裂解作用获得的提取物c)通过a)和b)(分别为1/4和3/4)的混合物获得的提取物。每只小鼠每天一次口服给予二十五毫克的细菌提取物连续10天。根据减少肾的反流相关接种的可能性和在所有接种的动物中诱发感染的最小接种方案，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)或用尿道致病性大肠杆菌菌株1677膀胱内(intravesically)接种小鼠。在这些实验中使用大肠杆菌菌株1677，其分离自具有发热性UTI的妇女的尿液。此菌株为06且包含(例如)溶血素、产气菌素(aerobactin)、P菌毛(fimbriae)、和1型菌毛的基因，但不包含(例如)非菌毛黏附物质(afimbrialadhesin)1、细胞毒性坏死因子1、和S菌毛的基因。为了制备接种物，在胰蛋白胨肉汤(Difco实验室)中通过2个通路从冷冻原液生长细菌，用PBS洗涤，且再悬浮到2X101Q细菌/毫升的浓度。剥夺小鼠的水1小时且紧在接种之前从他们的膀胱取出尿。在异氟醚麻醉下通过导尿术将十微升的细菌接种物滴入膀胱内，产生每只小鼠2X108大肠杆菌的剂量。使这些动物从麻醉恢复和1小时后恢复水。接种10天之后杀死小鼠以评估膀胱和肾感染的强度。取出各动物的膀胱和两个肾，称重，且在无菌PBS中均质化，其后将均质物连续地涂布在列文氏(Levine's)伊红-亚甲蓝琼脂(Difco实验室)上。在37t:下培养过夜之后计数在各平板上的大肠杆菌菌落的数目且用于计算在各膀胱或每对肾中的细菌的总数。使用费雪保护最小显著差数法(Fisher'sprotectedleastsignificantdifferencetest)测定不同组小鼠的平均总菌落形成单位(CFU)值之间的统计上显著的差异(PBS、未处理的感染组、和处理且感染的组)。膀胱和肾感染数据使用总CFU二loglO[(CFU+100)/毫克组织]转换，其中CFU为每个组织样品所计算的菌落形成单位总数。膀胱和肾的所得结果分别地说明于图6a和6b中。总的来说，3种试验的细菌提取物将所获得的对数值减少因子>3(膀胱)和>2(肾)，暗示从膀胱和肾培养的菌落的数目分别地减少至少1000和100的因子。这些结果证明本发明实施方案的免疫活性。如在C3H/HeJ小鼠中产生的结果，观察到的效果不依赖于TLR4。实施例9:本发明的实施方案在腹膜内鼠伤寒沙门氏菌感染的鼠模型(在小鼠的LPS敏感性株系中)中的效果也在具有正常LPS-敏感性的C57/bl小鼠中测试实施例8中所述的三种本发明提取物。所试验的三种提取物为a)通过18种大肠杆菌菌株的强裂解作用获得的提取物b)通过18种大肠杆菌菌株的温和裂解作用获得的提取物c)通过a)和b)(分别为1/4和3/4)的混合物获得的提取物。C57BL/6小鼠在用上述物质口服处理之前保持7天。实验由4个实验组-3组用本发明的化合物处理，和一个对照组-组成。各实验组包含20只小鼠。对照组中小鼠通过使用每天口服施用0.5毫升水接受假处理10天。对于其他组，每天将提取物溶解在蒸馏水中以便在0.5毫升的最终体积中具有单一剂量。用沙门氏菌(Salmonella)攻击所有小鼠之前，将0.5毫升体积每天一次口服给予各小鼠连续10天。在每次施用中给予每只动物10毫克细菌提取物。为了攻击，将鼠伤寒沙门氏菌菌株415的悬浮液腹膜内注入各小鼠(I.MechnokovInstituteforVaccinesandSera，RussianAcademyofMedicalSciences)。达到攻击的初步剂量(未显示)的范围在每只小鼠102至105CFU的沙门氏菌内。主要的实验选择104CFU的剂量，因为在未处理的动物中此剂量提供大约50%的存活者。攻击之后，将小鼠保持在实验用动物的标准条件下。在感染后的21天期间每天观察和纪录死亡。化合物的抗感染功效(参见下表)根据对每个实验组计算的感染后存活率(SR)、感染后平均寿命(ADL)、防御因子(DF)、和制剂功效指数(EI)评估。SR为在感染后第21天实验组中的活动物的百分比。ADL、DF和EI使用下列公式计算ADL=(X1+X2+...+Xn):N，其中ADL为平均寿命、X1至Xn为实验小鼠#1至#n的感染后寿命，和N为实验组中动物的总数。DF=CD:ED，其中DF为防御因子，CD为对照组中的死亡百分比，和ED为实验组的死亡百分比。EI=[(DF_1):DF]X100%，其中EI为制剂功效指数和DF为防御因子。在用104CFU的鼠伤寒沙门氏菌感染后21天期间纪录实验组中的死亡。相同的结果表示于图7中。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>*:在所示天数发现的死亡小鼠的数目提取物在鼠伤寒沙门氏菌致死感染模型中(在C57BL/6小鼠中)的防御功效。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>从强碱裂解(强)和从强和温和裂解的混合物(混合物)制造的提取物(a)和(c)具良好耐受性。从温和裂解(温和)制造的提取物(b)显示高于其他的毒性。在用提取物(b)处理的组中观察到小鼠身体大小的减少、和小鼠生长的延迟，虽然未进行测量。在处理期间在实验组(b)或"温和"中20只小鼠有四只死亡。因此，在此组中稍后仅16只小鼠用沙门氏菌攻击。在用水预处理的小鼠的对照组中，在观察期间(21天)存活率为58%，和ADL为15.3天。提取物(b)似乎没有提供对抗沙门氏菌感染的防卫，且提取物加速感染动物的死亡。特别地，90X的小鼠在感染后7天内死亡，和ADL为3.3天。在感染后21天内此组中的存活率低至6%(参见上表和图7)。对比之下，从强裂解(强)或从强和温和裂解的混合物(混合物)制造的提取物(a)和(c)增加小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的抗性。两物质显示良好的保护功效。特别地，存活率在用提取物(c)，(混合物)攻击之后为90%，而在用提取物(a)，(强)攻击之后，其为85%(上表和图7)。额外的实施例得自一种或更多种大肠杆菌菌株的提取物，其中，在该提取物的制备期间，该一种或更多种细菌菌株在大于12的pH下裂解，且该提取物经处理以除去核酸；并且其中该提取物在施用给患者后不引起朊病毒病的风险。前述段落的提取物，其得自至少一种选自NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9H1、9119、9707、和9708、及I:081、082、083、084、085、086、087、088、和089的大肠杆菌菌株。前述段落的提取物，其得自下列大肠杆菌菌株的每一种NCTC:8603、S621、8622、8623、9026、9111、9119、9707、和9708及I:081、082、083、084、085、086、087、088、和089。三个前述段落的任何提取物，其中该提取物包含小于100微克/毫升的核酸。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含至少0.3毫克/毫升的糖。任何前述段落的提取物，其中至少一种糖选自单糖、二糖和多糖。前述段落的提取物，其中至少一种多糖为支链多糖。任何前述段落的提取物，其中至少一种糖被化学修饰。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含在0.3和4.5毫克/毫升之间的糖。任何前述段落的提取物，其中裂解在12.6至13.4的pH下进行。任何前述段落的提取物，其中该提取物通过用15至80克/升的生物质裂解30至120小时而获得。任何前述段落的提取物，其中该提取物经处理以除去颗粒和/或不溶性成分。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含在1.5至2.5毫克/毫升之间的游离氨基酸。任何前述段落的提取物，其中各细菌菌株培养于不引起朊病毒病的风险的培养基中。任何前述段落的提取物，其中从其获得提取物的各细菌菌株培养于植物性或合成培养基。任何前述段落的提取物，其中至少一种选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、和赖氨酸的氨基酸被外消旋至少10%。任何前述段落的提取物，其中该提取物的游离氨基酸包含在l和80X之间的D-氨基酸。任何前述段落的提取物，其中该提取物的游离氨基酸包含在10和45%之间的D-氨基酸。前述段落的提取物，其中该提取物的游离氨基酸包含在25和35%之间的D-氨基酸。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含至少一种选自D-天冬氨酸和D-天冬酰胺、0-谷氨酸和D-谷氨酰胺.D-丝氨酸J-甲硫氨酸.D-组氨酸.D-丙氨酸.D-精氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-缬氨酸、和D-苏氨酸的D-氨基酸。前述段落的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在1和50X之间的游离氨基酸浓度。前述段落的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在10和40%之间的游离氨基酸浓度。前述段落的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度包含在15和35%之间的游离氨基酸浓度。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含小于5000内克的根据鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验的LPS当量。任何前述段落的提取物，其中该提取物包含在8和75毫克/毫升之间的一种或更多种蛋白质。任何前述段落的提取物，其中该一种或更多种蛋白质具有小于30kDa的分子量。任何前述段落的提取物，其中该一种或更多种蛋白质具有小于10kDa的分子量。任何前述段落的提取物，其中至少8LPS不敏感小鼠用尿道致病性大肠杆菌菌株1677攻击之后13天的存活率为至少70%，其中选择该尿道致病性大肠杆菌菌株1677的剂量以使至少8只对照小鼠的存活率为60%或更低。前述段落的提取物，其中该存活率为至少80%。前述段落的提取物，其中该存活率为至少90%。任何前述段落的提取物，其中至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌攻击之后13天的存活率为至少70%，其中选择该鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使至少8只对照小鼠的存活率为60%或更低。前述段落的提取物，其中该存活率为至少80%。前述段落的提取物，其中该存活率为至少90%。—种药物组合物，其包含任何上述段落的提取物。用于治疗罹患消化道或泌尿道病症或处于发展消化道或泌尿道病症的风险的受试者的方法，其包括将有效量的任何上述段落的提取物施用给所述受试者。任何前述段落的方法，其中该受试者为人。任何前述段落的方法，其中该消化道或泌尿道病症选自尿道炎、肾小管间质性肾炎、阻塞性肾盂肾炎、由于阻塞性和反流性尿路病变引起的泌尿道感染、包括慢性膀胱炎的膀胱炎、包括慢性前列腺炎的前列腺炎、前列腺膀胱炎、雌性骨盆炎性疾病、克罗恩病、和肠易激综合征。制备获自一种或更多种大肠杆菌的菌株的提取物的方法，其包括(a)在不引起朊病毒病的风险的培养基中培养各菌株；(b)在大于12的pH下裂解各菌株；禾口(c)将(b)的产物通过微过滤器至少一次和通过超滤器至少一次。前述段落的方法，其中该提取物得自至少一种选自下列的大肠杆菌菌株NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707、和9708及I:081、082、083、084、085、086、087、088、和089。前述段落的方法，其中该提取物得自下列大肠杆菌菌株的每一种NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707、和9708及I:081、082、083、084、085、086、087、088、和089。任何前述段落的方法，其中该裂解在大于12.5的初始pH下进行。任何前述段落的方法，其中该裂解在12.6至13.4的初始pH下进行。任何前述段落的方法，其中该裂解在0.1N至1.1N的初始氢氧根离子浓度下进行。33任何前述段落的方法，其中该裂解在0.2N至IN的初始氢氧根离子浓度下进行。任何前述段落的方法，其中该裂解在30-6(TC进行20小时至10天。任何前述段落的方法，其中该裂解在35t:至4(TC进行40小时至72小时。任何前述段落的方法，其中该微过滤器为0.45微米和超滤器为30KDa。任何前述段落的方法，进一步包括将(c)的产物通过0.2微米的第二个微过滤器。任何前述段落的方法，其中(c)部分通过切向流过滤进行。前述段落的方法，其中该切向流过滤进行5至15个循环。任何前述段落的方法，其中该切向流过滤如图1中所述进行。任何前述段落的方法，其中该切向流过滤如图1中所述，以蛇形模式进行。任何前述段落的方法，其中(b)部分用10-120克/升细菌干重的物质进行。任何前述段落的方法，其中(b)部分用15-80克/升细菌干重的物质进行。通过任何前述段落的方法获得的产物。用于治疗罹患消化道或泌尿道病症或处于发展消化道或泌尿道病症的风险的受试者的方法，其包括将有效量的通过任何一种上述段落的方法获得的任何产物施用给该受试者。前述段落的方法，其中该受试者为人。3权利要求得自一种或更多种大肠杆菌细菌菌株的提取物，其中，在所述提取物的制备期间，所述一种或更多种细菌菌株在大于12的pH下裂解，且所述提取物经处理以除去核酸；并且其中所述提取物在施用给患者后不引起朊病毒病的风险。2.权利要求1的提取物，其得自至少一种选自NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707和9708以及I:081、082、083、084、085、086、087、088和089的大肠杆菌菌株。3.权利要求1的提取物，其得自下列大肠杆菌菌株的每一种NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707和9708以及I:081、082、083、084、085、086、087、088和089。4.权利要求1、2或3的提取物，其中所述提取物包含小于100微克/毫升的核酸。5.权利要求1、2、3或4的提取物，其中所述提取物包含至少0.3毫克/毫升的糖。6.权利要求5的提取物，其中所述提取物包含在0.3和4.5毫克/毫升之间的糖。7.权利要求5的提取物，其中至少一种糖选自单糖、二糖和多糖。8.权利要求7的提取物，其中至少一种多糖为支链多糖。9.权利要求5的提取物，其中至少一种糖被化学修饰。10.权利要求1-9中任一项的提取物，其中裂解在12.6至13.4的pH下进行。11.权利要求i-io中任一项的提取物，其中所述提取物经处理以除去颗粒和/或不溶性成分。12.权利要求1-11中任一项的提取物，其中各细菌菌株培养于不引起朊病毒病的风险的培养基中。13.权利要求12的提取物，其中从其获得提取物的各细菌菌株培养于植物性或合成培养基。14.权利要求1-13中任一项的提取物，其中所述提取物包含在1.5至2.5毫克/毫升之间的游离氨基酸。15.权利要求1-14中任一项的提取物，其中所述提取物包含至少一种被外消旋至少10%的选自天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸的氨基酸。16.权利要求14-15中任一项的提取物，其中在所述提取物中游离氨基酸包含在1和80%之间的0-氨基酸。17.权利要求16的提取物，其中在所述提取物中游离氨基酸包含在10和45%之间的D-氨基酸。18.权利要求17的提取物，其中在所述提取物中游离氨基酸包含在25和35%之间的D-氨基酸。19.权利要求l-18中任一项的提取物，其中所述提取物包含至少一种选自D-天冬氨酸和D-天冬酰胺、D-谷氨酸和D-谷氨酰胺、D-丝氨酸、D-甲硫氨酸、D-组氨酸、D-丙氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-亮氨酸、D-赖氨酸、D-缬氨酸和D-苏氨酸的D-氨基酸。20.权利要求19的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度在游离氨基酸浓度的1至50%之间。21.权利要求20的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度在游离氨基酸浓度的10至40%之间。22.权利要求21的提取物，其中任何一种D-氨基酸的浓度在游离氨基酸浓度的15至35%之间。23.权利要求1-22中任一项的提取物，其中所述提取物包含小于5000纳克的根据鲎变形细胞裂解物(LAL)产色试验的LPS当量。24.权利要求1-23中任一项的提取物，其中所述提取物包含在8和75毫克/毫升之间的一种或更多种蛋白质。25.权利要求24的提取物，其中所述一种或更多种蛋白质具有小于30kDa的分子量。26.权利要求24的提取物，其中所述一种或更多种蛋白质具有小于10kDa的分子量。27.权利要求1-24中任一项的提取物，其中至少8LPS不敏感小鼠用尿道致病性大肠杆菌菌株1677攻击后13天的存活率为至少70%，其中选择所述尿道致病性大肠杆菌菌株1677的剂量以使至少8只用水处理的对照小鼠的存活率为60%或更低，且其中在攻击之前实验和对照小鼠用所述提取物或用水处理10天。28.权利要求27的提取物，其中所述存活率为至少80%。29.权利要求27的提取物，其中所述存活率为至少90%。30.权利要求1-29中任一项的提取物，其中至少8只具有野生型LPS敏感性的小鼠用鼠伤寒沙门氏菌攻击之后13天的存活率为至少70%，其中选择所述鼠伤寒沙门氏菌的剂量以使至少8只用水处理的对照小鼠的存活率为60%或更低，且其中在攻击之前实验和对照小鼠用所述提取物或用水处理10天。31.权利要求30的提取物，其中所述存活率为至少80%。32.权利要求30的提取物，其中所述存活率为至少90%。33.—种适合施用给人受试者的药物组合物，其包含权利要求1-32中任一项的提取物。34.用于治疗罹患消化道或泌尿道病症或处于发展消化道或处泌尿道病症的风险的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求1-32中任一项的提取物或权利要求33的药物组合物。35.权利要求34的方法，其中所述受试者为人或驯养的哺乳动物。36.权利要求34或35的方法，其中所述消化道或泌尿道病症选自尿道炎、肾小管间质性肾炎、阻塞性肾盂肾炎、由阻塞性和反流性尿路病变引起的泌尿道感染、包括慢性膀胱炎的膀胱炎、包括慢性前列腺炎的前列腺炎、前列腺膀胱炎、雌性骨盆炎性疾病、克罗恩病和肠易激综合征。37.制备得自一种或更多种大肠杆菌的菌株的提取物的方法，其包括(a)在不引起朊病毒病的风险的培养基中培养各菌株；(b)在大于12的pH下裂解各菌株；禾口(c)将(b)的产物通过微过滤器至少一次和通过超滤器至少一次。38.权利要求37的方法，其中所述提取物得自至少一种选自下列的大肠杆菌菌株NCTC:8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707和9708以及I:081、082、083、084、085、086、087、088和089。39.权利要求38的方法，其中所述提取物得自下列大肠杆菌菌株的每一种NCTC:‘8603、8621、8622、8623、9026、9111、9119、9707和9708以及I:081、082、083、084、085、086、’087、088和089。40.权利要求37、38或39的方法，其中所述裂解在大于12.5的初始pH下进行。41.权利要求34的方法，其中所述裂解在12.6至13.4的初始pH下进行。42.权利要求37、38或39的方法，其中至少一部分的裂解在0.IN至1.IN的初始氢氧根离子浓度下进行。43.权利要求37、38或39的方法，其中至少一部分的裂解在0.2N至IN的初始氢氧根离子浓度下进行。44.权利要求37-43中任一项的方法，其中至少一部分的裂解在30至4(TC进行30至50小时。45.权利要求37-43中任一项的方法，其中至少一部分的裂解在30至4(TC进行60至120小时。46.权利要求37-45中任一项的方法，其中微过滤器为0.45微米且超滤器为30KDa。47.权利要求37-46中任一项的方法，其进一步包括将(c)的产物通过0.2微米的第二个微过滤器。48.权利要求37-47中任一项的方法，其中(c)部分通过切向流过滤进行。49.权利要求48的方法，其中所述切向流过滤进行5至15个循环。50.权利要求37-49中任一项的方法，其中(b)部分用10-120克/升细菌干重的物质进行。51.权利要求37-50中任一项的方法，其包括在强裂解条件下裂解至少一种菌株和在温和裂解条件下裂解至少一种菌株，且进一步包括将强和温和裂解的产物混合在一起。52.权利要求37-50中任一项的方法，其包括在强和温和裂解条件两者下裂解各菌株，和进一步包括将强和温和裂解的产物混合在一起。53.通过权利要求37-53中任一项的方法获得的产物。54.用于治疗罹患消化道或泌尿道病症或处于发展消化道或泌尿道病症的风险的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求53的产物。55.权利要求54的方法，其中所述受试者为人或驯养的哺乳动物。全文摘要本发明涉及可用作病症(例如消化道或泌尿道病症)的治疗的来自细菌菌株的提取物、包含该提取物的组合物和从不引起朊病毒病的风险的培养基制造该提取物的方法。文档编号A61K39/108GK101743019SQ200880010610公开日2010年6月16日申请日期2008年3月5日优先权日2007年3月5日发明者C·驰阿瓦洛丽,J·A·鲍尔,J-P·L·维格洛克斯,L·查尔维特,M·萨尔瓦格尼申请人:Om药物公司