具有高抗过敏活性的乳酸菌组合物和该乳酸菌的制造方法

专利名称：：具有高抗过敏活性的乳酸菌组合物和该乳酸菌的制造方法
技术领域：
：本发明涉及具有高抗过敏活性的乳酸菌组合物以及该乳酸菌的制造方法；尤其涉及通过对具有优异的抗过敏活性的乳酸菌副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其变异株进行加热处理，从而赋予其高而稳定的抗过敏活性，制造具有高抗过敏活性的乳酸菌菌体的方法；并且还涉及以该具有高抗过敏活性的乳酸菌菌体为有效成分的抗过敏用组合物。
背景技术：
：在发达国家，过敏是频率最高的疾病之一。过敏的发病机制通常分为I型至IV型四种。I型过敏与IgE抗体有关，以花粉症、哮喘、荨麻疹、过敏性休克等为代表。II型过敏与IgG抗体、IgM抗体有关，是将补体系统激活的细胞伤害性反应，胎儿成红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血就属于这种过敏。III型过敏为由抗原抗体复合体引起的组织伤害，是以7A'7々》反应、血清病、肾小球肾炎为代表的反应。IV型过敏为与T细胞有关的延迟型过敏(延迟型过敏症)，是以结核菌素反应、接触性皮炎为代表的反应。过敏中，食物过敏的发病与I型、II型和IV型有关。另一方面，已知环境过敏，即花粉症、特应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等过敏，主要具有I型的发病机制。上述I型过敏的特征在于，过敏原特异性IgE的诱导和组胺、白三烯等化学介质的释放。免疫应答由各种细胞的相互作用而产生，辅助性T细胞(Th)是一种与之相关的细胞。辅助性T细胞分类属于T细胞亚群，具有识别抗原并产生各种细胞因子(辅助性因子)、调节免疫应答诱导的功能。辅助性T细胞根据其细胞因子产生能力分为Thl细胞和Th2细胞两类。为了使B细胞中发生抗体类别转换，产生IgE抗体，IL-4、IL-5、IL-13等Th2细胞因子是必须的。实际上，已知过敏患者的淋巴细胞中Th2细胞增加。S卩，从外界侵入的过敏原通过树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞，以其一部分结合于MHCII类分子的状态呈递给T细胞，从而使Th2细胞激活、分化。Th2细胞释放的Th2细胞因子诱导B细胞的类别转换，产生IgE抗体，IgE抗体结合于组织内的肥大细胞、血中的嗜碱性细胞表面的Fc*R。过敏原在下次侵入时，被结合在肥大细胞、嗜碱性细胞表面的IgE抗体识别，并在IgE抗体间形成交联。以该剌激为诱因，肥大细胞、嗜碱性细胞爆发性游离释放出化学介质，从而表现出各种过敏症状。在预防和治疗由IgE、化学介质介导的过敏中，例如有下列药物或方法通过与组胺竞争性结合组胺受体从而阻断来自末梢神经的信号传导的抗组胺药物、通过使产生化学介质的细胞的活性减弱来试着减轻症状的抗过敏药物、通过降低免疫应答性来减轻炎症的甾体药物、以及通过定期注射过敏原本身来诱导耐受性的脱敏疗法等。但是，这些药物或方法都存在副作用的问题，并且效果也不确定。近年来，通过调节Th2细胞因子的产生来抑制IgE的方法备受关注。据报道，结核菌、溶血性链球菌、乳酸菌等一些种类的细菌，通过增强Thl免疫来抑制Th2，从而达到降低IgE的效果(临床免疫，1999年，第32巻，454页；<>夕一*-〉3*A7—力<7"^才7"7kA￥—7>卜'<厶乂口^一，1998年，第115巻，278页；日本特开平9-2959号公报)。其中，从安全性方面考虑，乳酸菌较易应用于食品等，是有用的原材料。但是，虽然都叫乳酸菌，然而并不是所有的乳酸菌都有很好的增强Thl免疫的效果，必须选择有用的菌株。据教导，通过将公知的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)LGG菌株作为抗过敏乳酸菌而让妊娠妇女摄取，可抑制幼儿的特应性皮炎的发病(，'7卜，2001年，第357巻，1076页)。在多个专利公报中也公开了将乳酸菌作为抗过敏药物使用。例如，日本特开平9-2959号公报公开了，在添加嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳杆菌(Latobacillusbrevis)、布赫纟内氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、以及干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)等乳酸菌来培养小鼠淋巴细胞时，将IgE产量为30ng/ml以下的菌株用作抗过敏药物；日本特开平10-309178号公报公开了，将婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlong咖)、和两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifid咖)等双歧杆菌作为用于治疗特别是食物过敏而使用的抗过敏药物；以及日本特开2000-95697号公报公开了，将粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)等乳酸菌作为过敏性支气管哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎等I型过敏的抑制剂使用。另一方面，已知乳酸菌等增强Thl免疫是指，通过产生IL12、IFN-Y等来激活巨噬细胞、T杀伤细胞、NK细胞的细胞免疫，其与抑制病毒、细菌感染、癌的发生有关。具体而言，巨噬细胞产生的IL-12，通过将未分化的辅助性T细胞向Thl细胞分化，并激活单核细胞、巨噬细胞、NK细胞，从而获得对入侵物、癌症的抵抗性。因此，提示能够诱导大量IL-12产生的乳酸菌株可作为免疫激活剂来使用(*^>寸一<厶乂口-一<厶乂七，匕°一，2000年，第49巻，157页;日本特开平7-228536号公报;日本特开2002-80364号公报)。近年来，很多被认为是发生了由过敏引起的体质变化的人，都出现特应性皮炎、花粉症等症状，这已成为社会问题。其中，尤其对于重症患者来说，使用各种药物进行治疗行为。但事实上，大部分对象并未达到进行规范治疗的程度，而是在日常生活过程中，应对性地进行包括民间疗法在内的对应治疗。鉴于这种状况，最近通过食物来抑制过敏的研究非常活跃。其结果发现，例如，紫苏油、鱼油、特定的茶多酚等多种饮食品成分具有抗过敏效果，并将它们用于进行治疗。已知作为具有抗过敏效果的饮食品的成分，上述特定的乳酸菌也具有相同效果，使用该乳酸菌的酸奶、乳酸菌饮料，作为具有抗过敏效果的饮食品，已经部分得到实际应用。虽然采用这种抗过敏用饮食品进行预防或治疗，可以在安全且温和的条件下摄取，但是需要每天持续摄取，并且这种持续摄取需要以可能的量来发挥功效。然而，在现有技术中尚未明确选取这种高抗过敏活性菌株的方法，因此未能取得有效的菌株，并且无法满足实际应用。因此，最近公开了发现显示出特定数值以上的白细胞介素12和特定数值以下的白细胞介素4的产量的乳酸菌，对包含该乳酸菌的具有优异抗过敏活性的抗过敏用组合物进行了开发(日本特开2005-139160号公报)。作为该乳酸菌，可以列举副干酪乳杆菌(Xactobacillusparacasei)KW3110株、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KW4110株、副干酪乳杆菌KW3925菌株、副干酪乳杆菌KW3926菌株、或者唾液链球菌4(Streptococcussalivarius)KW3210株。另外，同时公开了在该乳酸菌中，作为具有特别优异的抗过敏活性的乳酸菌，对以副干酪乳杆菌KW3110株及其变异株作为有效成分的、具有优异抗过敏功能的饮食品进行开发(日本特开2005-137357号公报；特许3585487号公报)。之后，关于副干酪乳杆菌KW3110株的抗过敏作用形成了如下报告。例如，体外(invitro)系统试验中从约100株乳酸菌中选出具有最强的IL-12产生诱导能力和IL-4抑制能力的副干酪乳杆菌KW3110株。据报道，使用选择的KW3110株，通过卵白蛋白(OVA，ovalbumin)采用变应性致敏小鼠进行体内(invivo)试验后，出现抑制血中IgE、产生IL-12、抑制IL-4倾向等抗过敏效果(Int.Arch.AllergyImmunol.，135,205，2004)。另外，据报道，使用具有抗过敏效果的KW3110株或效果没有那么高的德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)B菌株制作酸奶，用其对人进行实验后，确认了使用KW3110株制作的酸奶与Th2细胞增殖和嗜酸性细胞的激活抑制有关(AllergologyIn.54，143，2005)。如上所述，在各种已知的具有抗过敏活性的乳酸菌中，副干酪乳杆菌KW3110株具有特别优异的抗过敏作用，然而为了在将该乳酸菌作为有效成分在各种产品形态及各种使用对象中使用时，进一步增大其有效性，希望进一步增强该有效成分的抗过敏活性，并且开发出更稳定的抗过敏活性成分。专利文献1:日本特开平7-228536号公报。专利文献2:日本特开平9-2959号公报。专利文献3:日本特开平10-309178号公报。专利文献4:日本特开2000-95697号公报。专利文献5:日本特开2002-80364号公报。专利文献6:日本特开2005-137357号公报。专利文献7:日本特开2005-139160号公报。专利文献8:特许3585487号公报。非专利文献l:临床免疫，1999年，第32巻，454页。非专利文献2:<>夕一*-〉3*A7—力<7"^才7"7kA年'一7">卜'<厶乂口-一，1998年，第i15巻，278页。157页'非专利文献3:，>七'7卜，2001年，第357巻，1076页。非专利文献4Y>寸一<厶乂口-一<厶乂七，匕。一，2000年，第49巻，非专利文献5:Int.Arch.AllergyImmunol.，135，205，2004。非专利文献6-AllergologyInt.54，143，2005。
发明内容本发明的课题在于，在使用具有抗过敏活性的乳酸菌时，为了在各种产品形态及各种使用对象中进一步增大其有效性，提供一种增强该有效成分的抗过敏活性并且具有更稳定的抗过敏活性的乳酸菌。本发明人为了解决上述课题，对包含乳酸菌的具有高抗过敏活性的有效成分进行了深入研究，研究中发现，通过在特定温度范围内，对具有优异的抗过敏活性的乳酸菌副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其变异株进行特定时间的加热处理，可以使其抗过敏活性得到飞跃性提高，此外还可以停止乳酸菌本身的活动，并且尽量防止由加热处理造成的菌体本身的变性，得到具有稳定的高抗过敏活性的有效成分，从而完成了本发明。S卩，本发明包括制造具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的方法，该方法通过在60°C以上10(TC以下的温度下、10分钟以上60分钟以下的时间内，对副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株进行加热处理，从而得到使该乳酸菌的抗过敏活性得到飞跃性提高、同时具有稳定的抗过敏活性且具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株。另外，本发明还包括通过特别有效的加热处理而得到稳定的高抗过敏活性的乳酸菌菌体的方法，该方法在培养副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株后，通过对培养菌体进行洗涤处理除去培养基成分，然后对副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株进行加热处理。此外，本发明包括提供在各种产品形态及各种使用对象中使用时，进一步增大其有效性的抗过敏用组合物，该组合物以包含通过本发明的制造方法制成的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的、具有稳定的高抗过敏活性的乳酸菌菌体作为有效成分。S卩，具体而言，本发明包括(l)具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体的制造方法，其特征在于，该方法在60°C以上IO(TC以下的温度下、10分钟以上60分钟以下的时间内，对副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株进行加热处理；(2)上述(1)记载的具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体的制造方法，其特征在于，在培养副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株后，通过对培养菌体进行洗涤处理除去培养基成分，然后进行副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理；(3)通过上述(1)或(2)记载的制造方法制成的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体；(4)以通过上述(1)或(2)记载的制造方法制成的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体作为有效成分的抗过敏用组合物。图1是表示本发明的实施例中，本发明的乳酸菌的加热条件对应的抗过敏活性测定试验中，各加热条件对应的IL-12产量的比例(相对于对照组的比例)的图。具体实施例方式本发明包括，通过在6(TC以上10(TC以下的温度下、10分钟以上60分钟以下的时间内，对具有优异抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株进行加热处理，从而制造抗过敏活性得到飞跃性提高并具有稳定的高抗过敏活性的乳酸菌。(本发明中使用的乳酸菌)本发明中所用的具有优异抗过敏活性的乳酸菌即副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei，L.Paracasei)KW3110株，可以从日本乳业技术协会作为干酪乳杆菌(L.case)L14株得到。此外，根据日本乳业技术协会的记载，L14株记载为Lcasei，但是采用QUALICON公司制RiboPrinter('J求7°'J>夕一)进行限制性片段长度多态性(RFLP，RestrictionFlagmentLengthPolymorphism)禾口J广增片段长度多态性(AFLP，AmplifiedFlagmentLengthPolymorphism)分析后，判断该菌株为副干酪乳杆菌(L.Paracasei)，因此本发明中记载为副干酪乳杆菌(L.Paracasei)。本发明中作为抗过敏用组合物的有效成分使用的副干酪乳杆菌(LParacasei)KW3110，如上所述可以从日本乳业技术协会得到，此外，根据关于专利微生物保藏的布达佩斯条约，还保藏于国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏号为FERMBP-08634。本发明的有效成分乳酸菌，可以采用M.R.S.(deMan,Rogosa，Sharpe)培养基等本领域技术人员公知的乳酸菌培养用培养基进行适当培养增殖后，按照本发明的方法进行加热处理，再根据需要进行冷冻干燥或喷雾干燥而粉末化并加以使用。另外，在工序管理或对制成的乳酸菌菌体的抗过敏活性进行测定时，可采用以下利用乳酸菌的抗过敏活性的测定方法进行测定将用过敏原致敏的来源于动物脾脏的淋巴细胞混悬于含有该过敏原的培养基中，添加被测乳酸菌进行培养，从而产生Thl诱导细胞因子和/或Th2诱导细胞因子，再对Thl诱导细胞因子和/或Th2诱导细胞因子的量进行测定。本发明中使用的副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110的变异株可以通过使该乳酸菌变异，来制作抗过敏活性等较高的变异株并加以使用。作为菌株的变异手段，可以采用UV等公知变异手段进行，例如可以采用以下方法使副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110变异，使用本说明书记载的乳酸菌的抗过敏活性评价方法，得到增加了抗过敏活性的变异株。(衍生菌株的选择)本发明中，可以将由本发明得到的乳酸菌株变异后性状不同的菌株作为衍生菌株进行选择并加以使用。例如，使用MRS培养基之类的培养基，在规定温度下对副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110株进行静置培养至达到规定菌数，用新鲜的MRS培养基将培养液稀释后，将本菌体混悬液以占10X的比例混悬于用盐酸将pH值调整为3.0的PBS(以指定的浓度溶解大日本制药社药片)中，在37t:下培养3小时。用PBS稀释酸处理后的菌体混悬液，接种于MRS板(MRSplate)培养基上，形成菌落。以色调等为指标对形成的菌落进行选择，从根据该色调选择的菌落中再选出1株，在MRS培养基中培养48小时。用实施例1记载的抗过敏活性的测定法对该培养物的抗过敏活性进行测定，判断各菌落的抗过敏活性。通过该方法，从试验菌株中选取高抗过敏活性的菌株。本发明的实施例中，作为L.paracaseiKW3110株的衍生菌株而分离的菌株被命名为No.90株，根据关于专利微生物保藏的布达佩斯条约，保藏于国际保藏单位的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏号为FERMBP-08635。(本发明制造的乳酸菌的抗过敏作用)过敏的发病机制如下由抗原剌激产生IgE抗体，IgE抗体结合于组织内的肥大细胞、血中的嗜碱性细胞表面的Fc受体。过敏原在下次抗原剌激(过敏原的再侵入)时被结合在肥大细胞、嗜碱性细胞表面的IgE抗体识别，并在IgE抗体间形成交联，以该剌激为诱因，肥大细胞、嗜碱性细胞爆发性游离释放出化学介质，从而表现出各种过敏症状。因此，为了治疗、预防过敏，需要抑制IgE，进而需要增强Thl免疫并抑制Th2免疫。本发明的乳酸菌，在使用小鼠淋巴细胞的体外系统中，强烈诱导作为Thl免疫指标的白细胞介素12(IL_12)产生，同时强烈抑制作为Th2免疫指标的白细胞介素4(IL-4)产生。因此，本发明的乳酸菌通过增强Thl免疫并抑制Th2免疫，基于抑制IgE抗体产生这一作用机制，具有治疗、预防7(本发明的加热处理)本发明中，在规定温度下、规定时间内对副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110株或其变异株进行加热处理，以谋求其抗过敏活性的增大。作为加热温度，可以使用6(TC以上IO(TC以下的温度；作为加热时间，可以采用10分钟以上60分钟以下的时间。特别优选在6085t:、更优选85t:左右的温度下，优选10分钟以上60分钟以下的加热处理时间内进行加热处理。本发明的加热处理，是在规定温度下、规定时间内，将培养的乳酸菌菌体以混悬状态进行加热处理，作为这种情况下的加热手段，可以采用常用手段，没有特别限制。例如，可以在罐(tank)内使用热交换器对混悬的菌体进行加热。本发明中，进行乳酸菌菌体的加热处理时，为了得到有效的加热处理效果，特别优选以下方法使用例如离心分离机或陶瓷制的膜等，对培养的菌体进行洗涤处理，除去培养基成分，然后将浓縮的菌体以混悬液的状态进行加热处理。为了达到上述目的，在使用离心或陶瓷制的膜进行的洗涤处理中，可以使用常用的离心分离机、过滤器过滤机。(本发明的抗过敏用组合物)本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物，具有得到飞跃性提高的高抗过敏活性、以及稳定的高抗过敏活性，可适合于在各种产品形态及各种使用对象中有效使用。例如，实施了本发明的加热处理的乳酸菌，通过本申请发明的特定的加热处理，使乳酸菌本身的活动停止，因而将其作为抗过敏用组合物添加到各种饮食品等中时，可以尽量减少由乳酸菌本身的生物活性造成的对饮食品本来香味的影响，此外，将该抗过敏用组合物制成各种制剂形态时，也可以作为有效成分维持稳定的活性。(本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物的应用)本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物，对花粉症、特应性皮炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎*支气管哮喘等环境过敏特别有效。本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物，可以通过将本发明的有效成分与生理学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合进行制剂，可以作为抗过敏药物使用。本发明的抗过敏药物可口服给药或非口服给药。作为口服剂，可以列举颗粒剂、散剂、片剂(包括糖衣片)、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等。作为非口服剂，可以列举注射剂(例如，皮下注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、腹腔注射剂)、点滴剂、外用剂(例如，经鼻给药制剂、经皮制剂、软膏剂)、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)。这些制剂可以采用本领域的常用方法，与药学上可接受的赋形剂、添加剂一起制成制剂。另外，制成制剂时，本发明制造的乳酸菌的抗过敏组合物，为了能够在生物体内适当且有效地发挥其功能，即为了控制溶出开始时间、添加作为苦味掩盖剂的功能、提高对氧和湿度的稳定性的形式，例如可以优选与用日本专利3349677记载的以酵母细胞壁为主要成分的包衣(coating)剂包衣形成的包衣处理物、作为通过按照特定方法用软胶囊或硬胶囊制成胶囊而得到的胶囊剂一起用于医药制剂、健康食品等领域。作为药学上可接受的赋形剂、添加剂，可以列举载体、粘合剂、香料、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、混悬剂、防腐剂等。作为药学上可接受的载体，例如可列举碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、砂糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。制剂例如可采用以下方法来制造。S卩，口服剂可采用以下方法制造作为有效成分，添加例如赋形剂(例如，乳糖、白糖、淀粉、甘露醇)、崩解剂(例如，碳酸钙、羧甲基纤8维素钙)、粘合剂(例如，a-淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素)、或者润滑剂(例如，滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇6000)并压縮成形，然后为了掩盖气味、肠溶性或持续性，根据需要采用本身公知的方法进行包衣。作为包衣剂，例如可使用乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙二醇、邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯及丙烯酸树脂(才<卜'，年''7卜，Eudragit)(ROHM公司制，德国，甲基丙烯酸丙烯酸共聚物)等。注射剂可以采用以下方法制造将有效成分与分散剂(例如，吐温(Tween)80(ATLASPOWDER公司制，美国)、HC060(日光少S力^《制)、聚乙二醇、羧甲基纤维素、海藻酸钠等)、保存剂(例如，羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯甲醇、氯代丁醇、苯酚)、等渗剂(例如，氯化钠、甘油、山梨醇、葡萄糖、转化糖)等一起，在水性溶剂(例如，蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液等)或者油性溶剂(例如，橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油等植物油，丙二醇)等中溶解、混悬或乳化。此时，可以根据需要添加助溶剂(例如，水杨酸钠、乙酸钠)、稳定剂(例如，人血清白蛋白)、无痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因)等添加物。外用剂可以通过将有效成分制成固态、半固态或液态的组合物来制造。例如，上述固态组合物可以采用以下方式制造将有效成分直接形成粉状，或者添加赋形剂(例如，乳糖、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、白糖)、增稠剂(例如，天然胶类、纤维素衍生物、丙烯酸聚合物)等并混合形成粉状来制造。上述液态组合物可以采用与制造注射剂时大致相同的方法来制造。半固态组合物可以为水性或油性的凝胶剂、或者软骨状的制剂。另外，这些组合物均可添加pH调节剂(例如，碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、氢氧化钠)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯扎氯铵)等。栓剂可以通过将有效成分制成油性或水性的固态、半固态或液态的组合物来制造。作为该组合物中使用的油性基质，可以列举高级脂肪酸的甘油酯[例如，可可脂、Wit印sol(々<于7°'/A)类(夕、*7<卜乂一《A社制)]、中级脂肪酸[例如，Miglyol(S夕''J才一^)类(夕M*7<卜乂一《^社制)]、或者植物油(例如，芝麻油、豆油、棉籽油)。作为水性基质，可以列举聚乙二醇类、丙二醇。此外，作为水性凝胶基质，可以列举天然胶类、纤维素衍生物、乙烯聚合物、丙烯酸聚合物。[OOM](配合饮食品的使用)本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物可以配合饮食品，作为具有抗过敏功能的饮食品使用。为了将本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物配合在饮食品中使用，可以在饮食品的制造原料阶段或制成的产品阶段等，添加、配合该有效成分的有效量。其中，"有效成分的有效量"是指，在各种饮食品中以通常摄食量摄取时，使摄取的有效成分在如下所述范围内的含量。S卩，本发明的有效成分在饮食品中的有效量的给予量或摄取量，可以根据接受者、接受者的年龄和体重、症状、给药时间、剂型、给药方法、药物的组合等来决定。例如，将本发明的有效成分作为药物，口服给药时可以在成人每人O.1100mg/kg体重(优选110mg/kg体重)的范围内，每日13次，分次给药；非口服给药时可以在0.0110mg/kg体重(优选O.1lmg/kg体重)的范围内，每日13次，分次给药。与本发明的有效成分组合使用的具有其它作用机制的药物，也可以分别以临床上使用的用量为标准来适当决定。如果将本发明的有效成分在饮食品中的有效量的给予量或摄取量以乳酸菌的菌数来表示，则每日的摄取量优选为5X109个以上、更优选每日1X101Q个以上、进一步优选5X101Q个以上。因此，通常根据每日摄取的饮食品的量来决定每种食品所含的乳酸菌的菌数。本发明中，可以将本发明制造的乳酸菌的抗过敏用组合物的有效成分直接配合饮食品，或者以上述制剂形态配合饮食品。更具体而言，本发明的饮食品可以采用以下各种使用形态将本发明的有效成分与适当基材配合，直接作为饮食品进行配制的使用形态；或者进一步配合各种蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类等的使用形态；形成液态、半液态或固态的使用形态；还有向普通饮食品中添加、配合的使用形态等。以往，在使用乳酸菌的饮食品的领域，作为有效利用的形态分类，大致分为乳制品类、肉类、面包类、饮料和蔬菜类。在使用这些乳酸菌的饮食品的情况中，作为制成的该饮食品用的添加物，可以使用本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌，对该饮食品赋予抗过敏功能。作为本发明的食品，可以配制成具有抗过敏功能的健康食品、功能性食品、特定保健用食品或患者用食品。此外，对食品的形态没有特别限制，也可以是具有抗过敏功能的饮料形态。本发明的有效成分具有抗过敏作用，因此通过在日常摄取的食品、作为营养补充剂摄取的健康食品、功能性食品等中配合本发明的有效成分，可以提供能够持续摄取的、同时具有预防和治疗过敏发病的功能的食品。通过在例如茶类、饮料剂或片剂这样的、在该饮食品中不含引起过敏的成分的饮食品中，配合使用本发明的具有高抗过敏活性的乳酸菌，可以提供具有完全阻断过敏问题的抗过敏功能的饮食品。(饮食品制剂形态中的使用)本发明中，作为与本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌配合的健康食品和功能性食品，可以列举各种食品，关于这些健康食品和功能性食品的制造，可以在常用的饮食品制剂形态下使用，该饮食品制剂形态除食品素材、食品添加物之外，还可以使用赋形剂、填充齐u、粘合剂、崩解齐u、润滑齐u、分散齐u、保存齐u、润湿剂、助溶齐u、防腐齐u、稳定齐u、胶囊基质等助剂。作为该助剂的具体示例，可以配合乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、碳酸镁、合成硅酸镁、滑石粉、硬脂酸镁、碳酸钙、甲基纤维素、羧甲基纤维素及其盐、阿拉伯胶、聚乙二醇、糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、柠檬酸、氯化钠、亚硫酸钠(亜硫酸Y—夕')、磷酸钠、支链淀粉、卡拉胶、糊精、还原帕拉金糖(palatinose)、山梨醇、木糖醇、甜菊、合成甜味剂、柠檬酸、抗坏血酸、酸味剂、碳酸氢钠、蔗糖酯、植物硬化油脂、氯化钾、红花油、蜜蜡、大豆卵磷脂、香料等。关于这样的健康食品、功能性食品的制造，可以参考医药品制剂的参考书，例如"日本药局方解说书(制剂总则)"(广川书店)等。本发明中，作为特别适合于健康食品和功能性食品的形状，可以列举片状、胶囊状、颗粒状、粉末状、混悬液状、乳化液状等形状，从本发明要解决的课题考虑，与本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌配合的健康食品和功能性食品，特别优选与不含过敏特定原材料的原材料组合。作为片状健康食品和功能性食品的制造方法的具体示例，可以列举将配合本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌的处方药压縮成一定形状来制造，或者使用水或醇之类的溶剂湿润的捏合物形成一定形状或流入一定模型中成型来制造。作为胶囊状健康食品和功能性食品的制造法的具体示例，可以列举配合本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌的处方药以液状、混悬状、糊状、粉末状或颗粒状等形状填充到胶囊中，或者用胶囊基质包覆成型而制成的硬胶囊剂或软胶囊剂等。(与食品的配合)另外，本发明中，可以在食品中配合本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌，制成具有抗过敏功能的食品。作为这种饮食品，具体可列举布丁、小甜饼干(cookie)、咸饼干(cracker)、马铃薯片(potatochips)、饼干(biscuit)、面包、西式蛋糕(cake)、巧克力、炸面圈(doughnut)、果子冻等西式点心，煎饼、羊羹、大福饼、牡丹饼、除此之外的馒头、蛋糕(力》于，)等日式点心，冷冻点心(糖等)、口香糖等面包、点心类；面条、荞麦面、扁面条等面类；鱼糕、火腿、鱼肠等鱼肉制品；火腿、香肠、汉堡、罐装牛肉等畜肉制品；盐、胡椒、酱、酱油、沙司(sauce)、调味料(卜'^'7*>，"，dressing)、蛋黄酱、番茄酱、甜调味品、辣调味品等调味类；明石烧(明石焼巻)、章鱼烧、文字烧(i&i;々焼t)、杂样煎菜饼(扭好*焼巻)、炒面(焼t子K')、烧面(焼巻^&&)等铁板烧食品；奶酪、硬质酸奶等乳制品；纳豆、油炸豆腐(厚揚(f)、豆腐、筠篛、米粉团(団子)、腌渍品(漬物)、咸烹海味(佃煮)、饺子(餃子)、烧卖、炸肉饼、三明治、比萨饼(^平)、汉堡包、沙拉等各种家常菜；各种粉末(牛肉、猪肉、鸡肉等畜产品、虾、扇贝、蚬、海带等水产品；蔬菜、果实类、植物、酵母、藻类等)；将油脂类、香料类(香草、柑橘类、鲣鱼等)粉末固化的产品；粉末饮食品(速溶咖啡、速溶红茶、速溶奶粉、速食汤、酱汤等)等各种食品，但并不仅限于此。(与饮料的配合)本发明制造的乳酸菌的高抗过敏活性组合物，特别是以饮料的形态使用，能够每日持续摄取，并且这种持续摄取可以通过作为以可能的量发挥功效的具有抗过敏功能的饮料来提供。将本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌与饮料配合时，可以适当决定乳酸菌的配合量，通常采用以能够作为饮料持续摄取的量来充分发挥乳酸菌所具有的抗过敏活性的配合量。如果将本发明的有效成分在饮食品中的有效量的给予量或摄取量以乳酸菌的菌数来表示，则每日的摄取量优选为5X109个以上、更优选每日1X101Q个以上、进一步优选5X101Q个以上。因此，通常通过上述指标根据每日摄取的饮料的量来决定每种饮料所含的乳酸菌的菌数。例如，如果每日摄取100g饮料，则优选在每100g饮料中添加109个以上的菌数。另一方面，如果考虑到不会因乳酸菌的添加而损害饮料的香味、外观的范围，则优选10"个以下的菌数。更优选5X10"个以下的菌数。因此，作为具有抗过敏功能、具有稳定性、并且嗜好性、保存性高的饮料的乳酸菌的浓度，特别优选在每100g饮料中添加10910"个的范围的菌数。另外，对于乳酸菌的菌体数和干燥菌体重量的关系，副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110株中菌体数1012个相当于干燥菌体重量lg。本发明中，作为配合本发明制造的具有高抗过敏活性的乳酸菌的饮料，可以列举各种饮料，制造这些饮料时，可以使用任何常用于饮料处方设计的糖类、香料、果汁、食品添加剂等。关于饮料的制造，可以参考已知的参考书，例如"改订新版软饮料(softdrinks)"(株式会社光琳)等。作为配合的饮料的具体示例，可以列举酒精饮料(威士忌、波旁威士忌、烈性酒、利口酒、葡萄酒(wine)、果子酒、日本酒、中国酒、烧酒(焼酎)、啤酒、酒精度数1%以下的不含酒精啤酒、发泡酒(発泡酒)、苏打酒(酎八<)等)、非酒精饮料(饮料型的酸奶；苹果、橘子、葡萄、香蕉、梨、梅子、西瓜等的果汁；番茄、胡萝卜、芹菜、黄瓜等的蔬菜汁；清凉饮料；牛奶、豆奶；咖啡、可可；红茶、绿茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、焙茶、乌龙茶、姜黄茶、普洱茶、路依保斯茶(口<#》^<一茶)、玫瑰茶、菊花茶、薄荷茶、茉莉花茶等各种植物茶(herbtea);运动饮料、矿质水、营养饮料等)等各种饮料。根据饮料的种类来举例，可以列举绿茶、乌龙茶、红茶、麦茶、混合茶等茶类饮料，咖啡、含果汁饮料、蔬菜饮料、运动饮料、营养饮料等。本发明中，将具有抗过敏功能的饮料制成产品时，可以按照食品卫生法所规定的方法，适当进行饮料杀菌。作为该杀菌方法，可以根据饮料的pH分别使用巴氏("》卜A)杀菌、热敷包(hotpack)杀菌、超高温(UHT，UltraHighTemperature)杀菌、蒸馏杀菌等。作为产品形态，特别优选用于普通饮料产品形态的装在密封容器中的饮料形态，作为该密封容器，可使用罐、瓶、PET、纸容器的任意形态。另外，对容量没有特别限制，通常可以考虑消费者日常作为饮料摄取的量、配合的乳酸菌的菌数和每日的必要菌数来进行适当决定。以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并不受这些示例的限制。实施例1〈1.抗过敏活性测定方法>乳酸菌的体外抗过敏活性通过测定将乳酸菌与小鼠脾脏淋巴细胞进行混合培养后，释放到培养基中的IL-12量来进行测定。在第0天和第6天，向7-10周龄BALB/c小鼠(CharlesRiver)同时腹腔注射lmg卵白蛋白(OVA)和2mg氢氧化铝佐剂。在第13天解剖，取出脾脏，制备淋巴细胞。用添加有终浓度分别为10%和lmg/ml的FCS(Roche)和0VA的RPMI1640(SIGMA)培养基将脾脏淋巴细胞混悬，使得细胞浓度为2.5Xl(f个细胞/毫升。向上述培养基中添加乳酸菌，使其浓度为0.25iig/ml，然后在37°C、C02浓度5%的条件下培养1周。离心分离，回收培养上清液，用0ptEIAELISA(BectonDickinson)测定IL-12的产量。(实验结果的表示)将试样的IL-12产量与作为对照的副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110株的IL-12产量进行比较，以相对值来表示。(对照菌的作制)将使用MRS培养基在37t:下静置培养48小时的物质，用灭菌水洗涤3次，混悬于灭菌水后在10(TC下处理30分钟，进行杀菌。将其冷冻干燥，并混悬于PBS中。〈2.试样副干酪乳杆菌(L.Paracasei)KW3110株的制备培养>将含有与MRS培养基相同程度的氮源、碳源和无机物的培养基，放入50L罐(tank)中、进行12(TC、20分钟的蒸气杀菌。向其中添加用MRS培养基适当增殖的乳酸菌体，在32t:、60rpm条件下一边用氢氧化钠将pH值调整至5.5—边培养48小时。取出制成的培养液，离心洗涤，得到菌体混悬液。〈3.加热处理〉将上述2.所得的菌体混悬液以各温度调整的水浴加热，菌体混悬液到达各温度后，在各时间回收样品。将回收的样品冷冻干燥，供IL-12产生活性评价使用。〈4.实验结果〉上述实验结果如图1和表1所示。另外，本实验中，在85tH式验组中进行l次实12验，在6(TC试验组中重复进行2次实验、在其它实验组中每组重复进行3次实验，以其平均值表示。"非加热"表示洗涤培养液后、冷冻干燥所得的产物。图1表示各加热条件对应的IL-12产量的比例(相对于对照组的比例)。此外，表1表示各加热条件对应的IL-12产生活性值(相对于对照组的相对值(％))。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>工业适用性本发明提供可以使具有优异抗过敏活性的乳酸菌的抗过敏活性得到飞跃性提高的乳酸菌，此外，通过本申请发明的特定加热处理，可以停止乳酸菌本身的活动，并且尽量防止由加热处理造成的菌体本身的变性，可以提供具有稳定的高抗过敏活性的乳酸菌菌体。因此，根据本发明，可以提供抗过敏用组合物，其作为具有稳定的高活性的抗过敏用组合物的有效成分，可以在各种产品形态及各种使用对象中适当有效使用。权利要求具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其变异株的加热处理菌体的制造方法，其特征在于，该方法在60℃以上100℃以下的温度下、10分钟以上60分钟以下的时间内，对副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株进行加热处理。2.权利要求1所述的具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体的制造方法，其特征在于，在培养副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株后，通过对培养菌体进行洗涤处理除去培养基成分，然后进行副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理。3.通过权利要求1或2所述的制造方法制成的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体。4.以通过权利要求1或2所述的制造方法制成的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株的加热处理菌体作为有效成分的抗过敏用组合物。全文摘要本发明提供具有高抗过敏活性和稳定的抗过敏活性的乳酸菌，该乳酸菌在使用具有抗过敏活性的乳酸菌时，能够在各种产品形态及各种使用对象中有效使用。通过在60℃以上100℃以下的温度下、10分钟以上60分钟以下的时间内，对副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)KW3110株或其变异株进行加热处理，从而制造具有高抗过敏活性的副干酪乳杆菌KW3110株或其变异株，该乳酸菌的抗过敏活性得到飞跃性提高，并具有稳定的抗过敏活性。通过本发明的加热处理，可以提供以乳酸菌菌体为有效成分的抗过敏用组合物，该乳酸菌菌体的乳酸菌抗过敏活性得到飞跃性提高，并具有稳定的高抗过敏活性。文档编号A61K35/74GK101772571SQ200880016410公开日2010年7月7日申请日期2008年3月27日优先权日2007年3月30日发明者粟山仁,西田武央申请人:麒麟控股株式会社