专利名称：：免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
技术领域：
：0001本发明涉及杂交人Fc和免疫球蛋白融合蛋白，在其中杂交人Fc连接到生物活性分子。具体地，它涉及杂交人Fc，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亚类的组合或人IgD和IgG的组合；以及融合蛋白，在其中这种Fc经共价键偶联到生物活性分子。0002
背景技术：
：0003生物活性分子在治疗上可以具有很大的优势。但是，它们作为治疗剂可能具有缺点，因为它们具有较低的体内稳定性。它们具有较短的循环半衰期或血清半衰期，因为它们被活体内各种酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循环半衰期。0004已知增加蛋白质大小，通过阻止经肾去除蛋白质可以增加它的半衰期(Knauf等，J.Biol.Chem.1988.263:15064-15070)。例如，已经报道通过将活性蛋白偶联到人白蛋白可增加蛋白质稳定性(Kinstler等，Pharm.Res.1995.12:1883-1888)。但是，由于活性蛋白至人白蛋白的偶联只是略微增加它的滞留期，因此发展含有偶联到人白蛋白的活性蛋白的有效药物制剂不是有效方法。0005其它报道的方法是调整蛋白质的糖基化。在蛋白质上增加糖基化和将唾液酸引入蛋白质可防止肝中蛋白质的降解。但是，蛋白质糖基化的增加也导致了蛋白质活性的降低。0006为了稳定蛋白质和防止经肾的清除，将蛋白质连接到聚乙二醇(PEG)。共价连接到PEG已经被广泛使用以递送具有延长的半衰期的药物(Delgado等，1992.9:249-304)。但是，己经报道PEG连接到细胞因子或激素导致受体结合亲和力的降低，原因在于该连接所引起的位阻。0007最近，已经研究和发展了使用免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)制备的融合蛋白。Ig是血液的主要成分。人Ig(humanIg，hlg)包括不同种类，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE(Roitt等，"Immunology"1989，GowerMedicalPublishing,London,U.K.;NewYork,N.Y.)。人IgGs可以进一步分为各种亚型，其己知为人IgGl(hlgGl)、人IgG2(hlgG2)、人IgG3(hlgG3)和人IgG4(hlgG4)。0008免疫球蛋白由四条多肽链组成，两条重链和两条轻链，它们经过二硫键形成四聚体。每条链由可变区和恒定区组成。基于同种型(isotypes)，重链的恒定区进一步地分成三个或四个区(CH1、CH2、CH3和CH4)。基于Ig同种型，重链恒定区的Fc部分包括铰合部、CH2、CH3和/或CH4结构域。0009关于血清半衰期，IgGl、IgG2和IgG4具有21天的长半衰期，而其它免疫球蛋白具有小于一周的相对短的半衰期。融合到IgG的Fc部分的嵌合蛋白质显示增加的稳定性和增加的血清半衰期(Capon等，Nature1989.337:525-531)。生物活性蛋白已融合在CH1区域的N-端、Fc区域的N-端或IgGCH3区域的C-端。0010在开始期，用细胞表面受体例如CD4(Capon等，Nature1989.337:525-531)、TNFR(Mohler等，J.Immunology1993.151:1548-1561)、CTLA4(Linsley等，J.Exp.Med.1991.173:721-730)、CD86(Morton等，J.Immunology1996.156:1047-1054)的胞外结构域产生IgG融合蛋白。同时，存在几种已融合到IgG结构域的细胞因子和生长激素。但是，与用细胞表面受体的胞外结构域的融合不同，与非融合细胞因子或生长因子相比，用可溶性蛋白质融合到IgG导致生物活性的降低。嵌合蛋白质作为二聚体存在，其导致由于与它们的靶分子类似受体的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的两种活性蛋白质的存在。因此，这个问题应该被克服以产生有效的融合蛋白。0011Fc融合技术的其它限制是存在不期望的免疫反应。免疫球蛋白的Fc结构域同时具有效应子功能例如抗体依赖的细胞介导细胞毒反应(antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)或补体依赖性细胞毒(complement-dependentcytotoxicity,CDC)。这种效应子功能一般经过Ig的Fc区域与在效应细胞上FcRs的相互作用或经过补体结合取得。因此，应该进行Fc的效应子功能的阻断以减少不期望的反应例如细胞杀死、细胞因子释放或炎症。0012发明公开技术问题0013总的说来，有对具有生物活性的最小损失和具有不期望的免疫反应的最小风险的改良Fc融合蛋白的需求。0014技术方案0015本发明提供杂交Fc(杂合Fc)，其源于人IgG亚类的组合或人IgD和IgG的组合。当杂交Fc连接到生物活性分子时，杂交Fc有效增加了生物活性分子的血清半衰期，以及当编码Fc-多肽融合蛋白的核苷酸被表达时，增加了多肽的表达水平。0016本发明同时提供在其中杂交Fc连接到生物活性分子的杂交Fc融合多肽。该融合蛋白有时称为"生物活性分子-Fc融合蛋白"或简称为"融合蛋白"。该融合蛋白可以具有Fc和生物活性分子之间的连接体。Fc可以在其N-端偶联到生物活性分子的C-端。0017可通过如下步骤产生融合蛋白构建编码和能够表达融合蛋白的核苷酸；在宿主细胞中表达它；和收获融合蛋白。可选地，该融合蛋白可以通过表达编码Fc的核苷酸，并以常规方式将它连接到生物活性分子而产生。0018根据本发明的一种实施方式的多肽可以用下式表示.-0019N'-(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'0020其中N'是多肽的N-端和C'是多肽的C-端；0021Zl表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的90到98位置的氨基酸残基的至少C-端部分或在SEQIDNO:14的90-98位置的氨基酸残基的至少一部分；0022Y表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的99到113位置的氨基酸残基的至少C-端部分或在SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分；0023Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:12的111到147位置的氨基酸残基的至少N-端部分或在SEQIDNO:14的163到199位置的氨基酸残基的至少一部分；0024Z3表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的118-223、SEQIDNO:12的114-219、SEQIDNO:24的165-270或SEQIDNO:13的115到220位置的氨基酸残基的至少C-端部分；0025Z4表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:ll的224-330、SEQIDNO:12的220-326、SEQIDNO:24的271-377或SEQIDNO:13的221-327位置的氨基酸残基的至少N-端部分以及0026p是0或1的整数，0027其中Z2和Z3氨基酸残基总数是在80和140之间，两端数值包括在内。0028Zl可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQIDNO:11的90-98位置的氨基酸残基C-端侧的5到9个连续氨基酸残基，或者来自于SEQIDNO:14的90-98位置的氨基酸残基C-端侧的5-9个连续氨基酸残基。在一些实施方式中，Zl可以是IgGlCHI结构域(SEQIDNO:11)或IgDCHI结构域(SEQIDNO:14)的5、6、7、8或9个C-端氨基酸残基。0029在另一个实施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:ll的90-98位置的氨基酸残基或SEQIDNO:14的90-98位置的氨基酸残基。Zl可以是由SEQIDNO:ll的90-98的位置或SEQIDNO:14的90-98的位置5到9个氨基酸残基组成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQIDNO:11的90到98氨基酸残基或SEQIDNO:14的90到98的氨基酸残基组成的氨基酸序列。0030Y可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQIDNO:11的99到113位置的氨基酸残基的C-端侧的5个或更多个、或10个或更多个连续氨基酸残基，或来自于SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基C-端侧的10个或更多个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:ll的99到113位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的158到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的153到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的143到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的133到162位置的氨基酸残基或SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基。0031Z2可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQIDNO:12(hlgG2)的111到147位置的氨基酸残基的N-端侧的4到37个或6-30个连续氨基酸残基，或来自于SEQIDNO:14(WgD)的163到199位置的氨基酸残基的N-端侧的6-30个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Z2可以是人IgG2CH2结构域的6个N-端氨基酸残基或人IgDCH2结构域的8个N-端氨基酸残基。0032Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是80和140之间。在一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是90和120之间，两端数值包括在内。在另一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是105和115之间，两端数值包括在内。在一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数是108。在更一个实施方式中，Z2和Z3的氨基酸残基总数是109。0033Z4可以是氨基酸序列，其包括来自于SEQIDNO:11(hlgGl)的224-330、SEQIDNO:12(hlgG2)的220-326、SEQIDNO:24(hlgG3)的271-377或SEQIDNO:13(hlgG4)的221至U327位置的氨基酸残基的90或更多个、或100或更多个连续氨基酸残基。Z4可以是SEQIDNO:11的224-330、SEQIDNO:12的220-326、SEQIDNO:24的271-377或SEQIDNO:13的221到327位置的氨基酸残基的氨基酸序列。0034根据实施方式，Z3-Z4是选自以下的氨基酸序列(i)由SEQIDNO:11的118到223位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:11的224到330位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(ii)由SEQIDNO:12的114到219位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:12的220到326位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(iii)由SEQIDNO:24的165到270位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:24的271到377位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，禾P(iv)由SEQIDNO:13的115到220位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:13的221到327位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列。0035根据本发明的一个实施方式，多肽的氨基酸残基总数是从154到288。0036在一个实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的99-113位置的氨基酸残基的至少一部分，p可以是0或l;Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:12的111-147位置的氨基酸残基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的118-223、SEQIDNO:12的114-219、SEQIDNO:24的165-270或SEQIDNO:13的115到220位置的氨基酸残基的至少一部分。在这个实施方式中，当p是l时，Zl可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的卯到98位置的氨基酸残基的至少一部分。0037在进一步的实施方式中，Z3可以是SEQIDNO:11的118-223、SEQIDNO:12的114-219、SEQIDNO:24的165-270或SEQIDNO:13的115-220位置的73到106个连续氨基酸残基，并且Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是110。Z2可以是SEQIDNO:12的111-116位置的氨基酸残基，和Z3可以是SEQIDNO:11的120-223、SEQIDNO:12的116-219、SEQIDNO:24的167陽270或SEQIDNO:13的118到220位置的氨基酸序列。0038在另一个实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分，p可以是l或0(零)；Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:14的163-199位置的氨基酸残基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:13的121到220位置的氨基酸残基的至少一部分。在这个实施方式中，当p是l时，Zl可以氨基酸序列，其包括SEQIDNO:14的90到98位置的氨基酸残基的至少一部分。0039在进一步的实施方式中，Y可以是SEQIDNO:14的99-162位置的氨基酸残基的C-端侧的20个连续氨基酸残基或更多个、30个连续氨基酸残基或更多个、40个连续氨基酸残基或更多个、50个连续氨基酸残基或更多个、或60个连续氨基酸残基或更多个。Z2可以是SEQIDNO:14的163到170位置的氨基酸残基，Z3可以包括SEQIDNO:11的124-223、SEQIDNO:12的120-219、SEQIDNO:24的171-270或SEQIDNO:13的121-220位置的氨基酸残基的C-端侧的71-100个连续氨基酸残基。Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是108。0040在一个实施方式中，多肽可以由选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27的核苷酸序列编码。多肽是选自SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的氨基酸序列。0041在一个实施方式中，多肽在它的N-端与生物活性分子融合，与所述生物活性分子的天然形式(nativeform)的循环半衰期比较，该生物活性分子显示增加的循环半衰期。该生物活性分子可以是多肽、蛋白质或非肽(叩eptide)。该生物活性分子可以是多肽、肽或蛋白质药物。生物活性分子可以是可溶性蛋白质，例如但不限于激素、细胞因子、生长因子、共刺激分子、激素受体、细胞因子受体、生长因子受体或短肽。该生物活性分子可以是EPO或它的变体/片段、p40或它的变体/片段(例如，含有Asn303Gln置换的p40变体)、G-CSF或它的变体/片段、TNF受体、GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-IO、IL-10受体、TGF-卩、TGF-卩受体、IL-17、IL-17受体、因子VII、CXCL-ll、FSH、人生长激素、骨形态生成蛋白-1(bonemorphogeneticprotein-1，BMP-1)、CTLA4、PD-1、GLP-1、卩动物纤维素(betacdlulin)、OPG、RNAK、a干扰素(interferon-alpha)、卩干扰素(interferon-bete)或它们的变体/片段。该生物活性分子可以是分泌性蛋白，其可以是成熟的形式。0042在一个实施方式中，提供产生根据权利要求1的多肽的方法，其中该方法包括以下步骤(i)将编码所述多肽的DNA分子引入哺乳动物宿主细胞，(ii)将细胞在其培养基中在所述多肽可以被表达的条件下生长；和(iii)收获表达的多肽。哺乳动物宿主细胞可以是CHO、COS或BHK细胞。0043在另一个实施方式中，提供以下方法(i)减少自身免疫性疾病的症状、预防或治疗自身免疫性疾病，(ii)抑制移植排斥，或(iii)治疗或预防内毒素诱导的休克，其包括施用治疗有效量的以上所述多肽，其中该多肽融合到生物活性分子。0044在一个实施方式中，提供分离的核酸分子，其编码根据本发明的实施方式的多肽。多肽可以具有选自以下的氨基酸序列SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29。核酸分子可以具有以下序列中显示的核苷酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26或SEQIDNO:27。核酸分子可以进一步地包括信号序列或前导序列。0045根据本发明的实施方式，提供包括所述核酸分子的表达载体和含有所述载体的宿主细胞。表达载体的例子包括但不限于pADllEPO-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp40N303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADlp40N303Q-hFc-6、pADHEPO-hFc-5、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc-5和pADllTNFR-hFc-5。0046在一个实施方式中，提供向哺乳动物递送生物活性分子的方法，其包括向需要其的哺乳动物施用核酸分子的步骤。0047在另一个实施方式中，多肽包括在N-端到C-端方向由铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成的Fc结构域，其中所述铰链区包括人IgD铰链区或人IgGl铰链区的氨基酸残基的至少一部分；所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4-37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端部分或人IgDCH2结构域的N-端部分的氨基酸残基的至少一部分置换，和所述CH3结构域包括人IgG4CH3结构域的氨基酸残基的至少一部分。0048铰链区可以包括人IgGl的铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4-37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端区的氨基酸残基的至少一部分置换。0049铰链区可以包括人IgD的铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括人IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分，其中在人IgG4CH2结构域的N-端的4-37个连续氨基酸残基用人IgG2CH2结构域的N-端区的氨基酸残基的至少一部分置换。0050多肽可以进一步包括CH1结构域，其中所述CH1结构域包括人IgGlCH1结构域的氨基酸残基的至少一部分，并且其中所述CH1结构域偶联到所述铰链区的N-端。多肽可以进一步包括CH1结构域，其中所述CH1结构域包括人IgDCH1结构域氨基酸残基的至少一部分，并且其中所述CH1结构域偶联到所述铰链区的N-端。多肽可以进一步包括偶联到所述铰链区的N-端的第二多肽，其中该第二多肽是生物活性的非免疫球蛋白多肽。多肽可以进一步包括通过连接体偶联到所述CH1结构域的N-端或偶联到所述CH4结构域C-端的生物活性分子，其中所述生物活性分子不是免疫球蛋白多肽。多肽和生物活性分子可以经连接体彼此连接。连接体分子是白蛋白连接体或合成的连接体。该白蛋白连接体包括SEQIDNO:25的321到323、318到325、316到328、313到330、311到333或306到338的氨基酸序列。该合成连接体可以是由Gly和Ser残基组成的10到20个氨基酸残基的肽。在-一个实施方式中，这禾中Gly-Ser连接体是GGGGSGGGGSGGGSG(SEQIDNO:32)。0051本发明也包括含有重组的Fc区的抗体分子，该重组的Fc区如上所述。0052附图简述0053图1显示杂交Fcs(hybridFcs，hFcs)的示意图，其可以用作以"X"表示的生物活性分子的载体蛋白。0054图2显示hFcs的图示，其中对源于IgGl(SEQIDNO:11)、IgG2(SEQID:12)、IgG4(SEQID:13)和IgD(SEQID:14)的氨基酸位置进行详细描述。除非另有说明，本申请全部多肽中氨基酸位置的命名采用相同规则。0055图3显示hFcs图示，其中通过以"AL"表示的白蛋白连接体，在C-端每个hFc偶联到以"X"表示的生物活性分子。0056图4显示与连接体偶联的hFcs的图示，其中对源于人白蛋白(SEQIDNO:25)的白蛋白连接体的氨基酸位置进行详细描述。0057图5显示hFc-6的疏水性分布(hydrophobicityplot)的结果。0058图6(a)显示使用特异性ELISA分析的MabThera⑧(Rituximab)、hlgGl、Enbrel(etanercept)、EPO-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc-5的FcyRJ结合活性结果；图6(b)显示使用特异性ELISA分析的MabThera(Rituximab)、hlgGl、Enbrel(etanercept)、EPO-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc陽5的Clq结合活性结果。0059图7(a)显示在人F36E细胞系中与EPO生物活性相比较的EPO-IgGlFc、EPO-hFc-l、EPO-hFc-5、EPO-hFc-6和Aranesp(derbepoetinalfa)的生物活性结果；图7(b)显示在小鼠造血细胞系(NFS-60)中Neulasta⑧(pegfilgrastim)和G-CSF-hFc-5的体外生物活性结果；图7(c)显示在人PBMCs中p40和p40N303Q-hFc-5的体外生物活性结果；图7(d)显示在鼠科L929细胞中Enbrel(etanercept)禾BTNFR-hFc-5的体外生物活性结果；和图7(e)显示在人WISH细胞中thFc-l-AL(0)-IFN-(3和thFc-l-AL(3)-IFN-p的体外生物活性结果。0060图8(a)显示经SC途径(左图)和IV途径(右图)向猕猴施用的Aranesp(derbepoetinalfa)、EPO-hFc-l或EPO-hFc-5的体内半衰期的结果；图8(b)显示经皮下注射途径(左图)和静脉注射途径(右图)向SpragueDawley大鼠施用的LEUCOSTIM⑧(非格司亭)和G-CSF-hFc-l的药物动力学的结果；图8(c)显示经皮下注射途径向猕猴施用的Enbrel(etanercept)的药物动力学的结果；图8(d)显示经皮下注射途径向SpragueDawley大鼠施用的TNFR-hFc-5和Enbrel(etanercept)的药物动力学的结果。0061图9(a)显示经皮下注射途径(左上图)和静脉注射途径(右下图)向猕猴施用的Aranesp(derbepoetinalfa)和EPO-hFc-5的体内生物活性的结果，图9(b)显示经皮下注射途径(上图)和静脉注射途径(下图)向SpragueDawley大鼠施用的LEUCOSTIM⑧(非格司亭)和G-CSF-hFc-l的体内生物活性的结果。0062实现本发明的最佳方式0063本发明提供杂交人免疫球蛋白Fc片段，其从N-端到C-端包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，其中该铰链区是人IgD铰链区或人IgGl铰链区的至少部分氨基酸序列；CH2结构域是人IgG4CH2结构域，在CH2结构域的N-端区一部分被人IgG2CH2或人IgDCH2结构域的N-端区的4-37氨基酸残基替代。当被连接到生物活性分子，例如生物活性多肽的生物活性分子，用于产生Fc融合蛋白时，这种杂交Fc片段使Fc融合蛋白的非特异免疫反应最小化，延长生物活性多肽的生物活性分子的血清半衰期，并使生物活性多肽的生物活性分子的活性最优化。0064根据本发明的一种实施方式中的Fc融合蛋白中，设计IgDCH2结构域的N-端与IgG4CH2结构域的剩余部分的组合，使得在两个不同Ig亚基重组处产生的融合蛋白的区域是疏水性的。产生的融合蛋白的疏水区应位于折叠蛋白内部，其最小化不期望的非特异免疫反应。0065如本文所用，术语"Fc片段"或"Fc"是指蛋白质，其含有免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，并且不含有所述免疫球蛋白的重链和轻链的可变区以及轻链恒定区1(CL1)。它可以进一步地包括在重链恒定区的铰链区。杂交Fc或杂交Fc片段在本文有时称为"hFc"。0066另外，本发明的Fc片段可以是以具有天然糖链、与天然糖链相比增加的糖链、与天然糖链相比减少的糖链的形式，或者可以是以去糖基化的形式。通过本领域常见方法，例如化学方法、酶学方法和使用微生物的基因工程方法，可以获得免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除。从Fc片段去除糖链引起与第一补体成分Cl的Clq部分的结合亲和力的锐减以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖性细胞毒作用(CDC)的减少或丧失，因此不会诱导不必要的体内免疫反应。就这点而言，在一些情况下，去糖基化或非糖基化"glycosylated)形式的免疫球蛋白Fc片段作为药物载体可能更适合于本发明的目标。0067如本文所用，术语"去糖基化"是指糖部分从Fc片段通过酶进行去除，和术语"非糖基化"(aglycosylation)意思是通过原核生物、优选地大肠杆菌产生未糖基化形式的Fc片段。0068如本文所用，术语"杂交(杂合)"是指编码不同来源的两种或更多种免疫球蛋白Fc片段的序列是以单链免疫球蛋白Fc片段出现。0069在一个实施方式中，杂交人Fc在N-端到C-端方向上包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，其中该铰链区是人IgD铰链区或人IgGl铰链区的至少部分氨基酸序列；以及CH2结构域是人IgG4CH2结构域，其在N-端区的一部分被人IgG2CH2或人IgDCH2结构域的N-端区的4-37个氨基酸残基替代。该杂交人Fc可以经过共价键在它的N-端连接到生物活性分子的C-端。0070在另一个实施方式中，生物活性分子-杂交Fc融合多肽可以用下式表示0071N'-X-(Zl)p-Y-Z2-Z3陽Z4-C'，或0072N'-(Z1)p-Y陽Z2-Z3陽Z4-(连接体)q-X-C'0073其中N'是多肽的N-端和C'是多肽的C-端；Zl表示氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的90到98位置的氨基酸残基的至少C-端部分，或SEQIDNO:4的90-98位置的氨基酸残基的至少一部分；Y表示氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的99到113位置的氨基酸残基的至少C-端部分，或SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基的至少一部分；Z2表示氨基酸序列，其包括SEQIDNO:12的111到147位置的氨基酸残基的至少N-端部分，或SEQIDNO:14的163到199位置的氨基酸残基的至少N-端部分；Z3表示氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的118-223、SEQIDNO:12的114-219、SEQIDNO:24的165-270或SEQIDNO:13的115到220位置的氨基酸残基的至少C-端部分；Z4表示氨基酸序列，其包括SEQIDNO:13的221-327位置的氨基酸残基的至少N-端部分，并且p和q每个均是0或1的整数，其中Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是80和140之间，两端数值包括在内，连接体是连接体分子，以及X是感兴趣的生物活性分子。0074在一个实施方式中，Z3-Z4是选自以下的氨基酸序列(i)由SEQIDNO:11的118到223位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:11的224到330位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(ii)由SEQIDNO:12的114到219位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:12的220到326位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(iii)由SEQIDNO:24的165到270位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:24的271到377位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，和(iv)由SEQIDNO:13的115到220位置的氨基酸残基的C-端部分和SEQIDNO:13的221到327位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列。0075根据本发明的一种实施方式，所述多肽的氨基酸残基总数是从154到288。0076当施用到目标者时，与单独的X相比较，式N'-X-(Z1)P-Y-Z2-Z3-Z4-C和N'-(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(连接体)q-X-C'的多肽增加了生物活性分子X的循环半衰期。0077连接体可以源于人白蛋白(CAA00606SEQIDNO:25)。该连接体可以包括SEQIDNO:25的321到323、318到325、316到328、313到330、311到333或306到338位的氨基酸序列。可选地，连接体可以是合成的连接体。该合成连接体可以是由总共10-20个Gly和Ser氨基酸残基组成的肽。在一个实施方式中，该Gly-Ser连接体是GGGGSGGGGSGGGSG(SEQIDNO:32)。0078Zl可以包括人IgGl(SEQIDNO:ll)或IgD(SEQIDNO:14)的CHI结构域的至少一部分。Z1可以包括IgGlCHI结构域的C-端区(SEQIDNO:11的90-98的位置)或IgDCHI结构域的C-端区(SEQIDNO:14的90-98的位置)的5到9或7到9个连续氨基酸残基。在一些实施方式中，Z可以是IgGlCHI结构域或IgDCHl结构域的5、6、7、8或9个C-端氨基酸残基。0079在一些实施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:ll的90至98位置的氨基酸残基或SEQIDNO:14的90至98位置的氨基酸残基。Zl可以是由SEQIDNO:ll的90至98的位置或SEQIDNO:14的90-98的位置的5到9个氨基酸残基组成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQIDNO:11的90到98氨基酸残基或SEQIDNO:14的90到98的氨基酸残基组成的氨基酸序列。0080Y可以包括人IgGl或IgD的铰链区的至少一部分。Y可以包括IgGl铰链区(SEQIDNO:11的99到113位置的氨基酸)或IgD的铰链区(SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸)的C-端的5个或更多个、或10个或更多个的连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:ll的99到113位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的158到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的153到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的143到162位置的氨基酸残基、SEQIDNO:14的133到162位置的氨基酸残基或SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基。0081Z2可以包括人IgG2CH2结构域的N-端(SEQIDNO:12的111到147位置的氨基酸残基)或IgDCH2结构域的N-端(SEQIDNO:14的163到199位置的氨基酸残基)的4到37、6到30、6到12、6到8、8或6个连续氨基酸残基。在某些实施方式中，Z2可以是人IgG2CH2结构域的6个N-端氨基酸残基(SEQIDNO:12的111-116位置的氨基酸残基)或人IgDCH2结构域的8个N-端氨基酸残基(SEQIDNO:14的163-170位置的氨基酸残基)。0082Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是90和120之间，两端数值包括在内；或105和115之间，两端数值包括在内。0083Z4可以是氨基酸序列，其包括IgG4CH3结构域(在SEQIDNO:11的224-330、SEQIDNO:12的220-326、SEQIDNO:24的271-377或SEQIDNO:13的221到327位置的氨基酸残基)的90或更多个、或100或更多个连续氨基酸残基。Z4可以是大于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4CH3结构域的98%或95%的氨基酸残基。在一个示例性实施方式中，Z4是包括人IgGCH3结构域全部氨基酸序列的氨基酸序列。例如，Z4是人IgG4CH3结构域的氨基酸序列，对应于人IgG4的氨基酸残基341-447，如根据EUIndex，Kabat编号(其对应于SEQIDNO:13的221-327位置的氨基酸残基)。0084在一个实施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括人IgGl铰链区的C-端氨基酸残基(SEQIDNO:11的99到113位置)的至少一部分，p可以是1或0;Z2可以是氨基酸序列，其包括人IgG2CH2的N-端区(氨基酸残基在SEQIDNO:12的111-147位置)的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括人IgG亚类任意一个的C-端区(氨基酸残基在SEQIDNO:11的118-223、SEQIDNO:12的114-219、SEQIDNO:24的165-270或SEQIDNO:13的115到220位置)的至少一部分。在该实施方式中，当p是l时，Zl可以是包括人IgGlCHI结构域的C-端区(SEQIDNO:11的90到98位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQIDNO:11的90到98位的氨基酸残基。0085在进一步的实施方式中，Z3可以是人IgG4CH2结构域(在SEQIDNO:13的115-220位置)、人IgGlCH2结构域(在SEQIDNO:11的118-223位置)、人IgG2CH2结构域(在SEQIDNO:12的114-219位置)、人IgG3CH2结构域(在SEQIDNO:24的165-270位置)的C-端区的73到106个连续氨基酸残基，并且Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是110。例如，Z2可以是在SEQIDNO:12的111-116位置的氨基酸残基的氨基酸序列，以及Z3可以是在SEQIDNO:13的117到220位置的氨基酸残基的氨基酸序列。0086在另-一个实施方式中，Y可以是包括人IgD铰链区的C-端区(SEQIDNO:14的99到162位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列，p可以是1或0(零)；Z2可以是包括人IgDCH2结构域的N-端区(SEQIDNO:14的163到199位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列，和Z3可以是包括人IgG4CH2结构域的C-端区(SEQIDNO:13的121到220位置的氨基酸残基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Y可以是在SEQIDNO:14的158到162、133到162、或99到162位置的氨基酸残基，Z2可以是在SEQIDNO:14的163到170位置的氨基酸残基和Z3可以是在SEQIDNO:13的121-220位置的氨基酸残基。0087在这个实施方式中，当p是1时，Zl可以是包括人IgDCHI结构域的C端区(氨基酸残基在SEQIDNO:14的90到98位置)的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQIDNO:14的卯到98位的氨基酸残基。0088在这个实施方式中，Y可以是人IgD铰链区的C-端侧(氨基酸残基在SEQIDNO:14的99-162位置〉的20个连续氨基酸残基或更多个、30个连续氨基酸残基或更多个、40个连续氨基酸残基或更多个、50个连续氨基酸残基或更多个、或60个连续氨基酸残基或更多个。Z3可以包括SEQIDNO:13的121-220位置的氨基酸残基C-端侧的71到100个连续氨基酸残基。Z2和Z3的氨基酸残基总数可以是亂0089表1显示在构建根据本发明的实施方式的hFcs中有用的人IgGl、IgG2、IgG3和IgD片段的氨基酸序列。0091表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>00920093*EU索引在"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition,UnitedStatesDepartmentofHealthandHumanServices."中描述。0094"每条氨基酸序列中的下划线区域表示可接受氨基酸残基范围的最短片段。00950096在一个实施方式中，本发明提供杂交Fc，其是如图1和2显示的hFc-l、hFc-2、hFc-3、hFc-4、hFc-5或hFc-6或如图3和4显示的thFc-l或thFc-2之一。虽然图1和3描述的是双链Fcs，但是本发明包括单链杂交Fc分子。hFc-l到hFc-6的氨基酸序列分别显示在SEQIDNOs:18-23中，以及Fc-1和thFc-2氨基酸序列分别显示在SEQIDNO:28和SEQIDNO:29中。本发明也包括编码杂交Fc的多聚核苷酸分子。它们包括但不限于如SEQIDNO:1(hFc-l)、SEQIDNO:2(hFc-2)、SEQIDNO:3(hFc-3)、SEQIDNO:4(hFc-4)、SEQIDNO:5(hFc-5)、SEQIDNO:6(hFc-6)、SEQIDNO:26(thFc-l)禾BSEQIDNO:27(thFc-2)所示的多聚核苷酸序列。0097人免疫球蛋白氨基酸序列是本领域已知的，并且它们存放于可公开访问的存放处。例如，人lgGl恒定区、人lgG2恒定区、人lgG3恒定区、人lgG4恒定区和人IgD恒定区的氨基酸序列分别获自CAA75032、CAC20455、CAC20456、AAH25985和P01880。这些序列分别成为(reproducedas)SEQIDNO:11、12、24、13和14。0098生物活性分子X可以是可溶性蛋白质。它可以包括但.不限激素、细胞肉子、生长因子、共刺激分7、激素受体、细胞闵子受体、生L〈因了受体或短肽。例如，X可以是EPO、p40、G-CSF、TNF受体或其变体/片段。X可以是GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-10受体、TGF陽(3、TGF-J3受体、IL-17、IL-17受体、因子VII、CXCL-1KFSH、人生长激素、骨形态生成蛋白-1、CTLA4、PD-1、GLP-1、(3动物纤维素、OPG、RNAK、a干扰素、卩干扰素或它们的变体/片段。它也可以包括但不限于抗体的Fab区。生物活性分子也可以是分泌性蛋白质。在一个实施方式中，该生物活性分子不属于免疫球蛋白家族。0099术语"变体"是指不同于参考核酸或多肽、但保留其基木性质的多聚核苷酸或核酸。一般而言，变体总体上极为相似，并且在许多区域与参考核酸或多肽相同。同时，术语"变体"是指生物活性分子药物的生物活性部分，并保留其如在本文另有描述的或本领域其它已知的至少一种功能和/或治疗性质。一般而言，变体总体上非常相似，并且在许多区域与感兴趣的生物活性多肽的氨基酸序列相同。0100本发明也提供蛋白质，其包括与例如SEQIDNOs:18-23和28-29中所示多肽的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95°/。、96%、97%、98%、99%或100%相同的氨基酸序列或可选地由之组成。本发明也提供这些多肽的片段。进一步地，本发明包括的多肽是由这样的多聚核苷酸编码的多肽，在严谨杂交条件下(例如，在大约45'C于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合DNA的滤膜杂交，接着在大约50-65"在0.2xSSC,0.1%SDS中清洗一次或多次)、高严谨条件下(例如，在大约45'C于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与结合DNA的滤膜杂交，接着在大约68'C在0.2xSSC,0.1%SDS中清洗一次或多次)或本领域普通技术人员已知的其它严谨条件下(参见，例如，Ausubel,F.M.等，eds.,1989CurrentprotocolinMolecularBiology,Greenpublishingassociates,Inc.,andJohnWiley&SonsInc.,NewYork,第6.3.16.3.6和2.10.3页)，该多核苷酸与编码本发明的多肽的核酸分子的互补链(complement)杂交。本发明也包括编码这些多肽的多聚核苷酸。0101对于具有与查询氨基酸序列(aqueryaminoacidsequence)至少例如95%"同一性"的氨基酸序列的多肽，其意图是目标(subject)多肽的氨基酸序列与查询氨基酸序列相同，除了在查询氨基酸序列的每100个氨基酸中，目标多肽序列可以包括最多5个氨基酸改变。换句话说，为获得具有与查询氨基酸序列至少95%的同一性的多肽，在目标序列中最多5%的氨基酸残基可以被插入、剔出或用另外一种氨基酸置换。这些参考序列的改变可以出现在参考氨基酸序列的氨基或羧基端的位置或者在这两端位置之间的任意位置，其单个地散布在参考序列的残基中或者是在参考序列内一个或多个的相邻组中的残基中。0102实际上，任意具体的多肽是否与例如本发明的白蛋白融合蛋白的氨基酸序列或其片段至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同通常可以使用已知的计算机程序测定。测定查询序列(本发明的序列)和目标序列之间最佳总匹配的优选方法，也称为序列全局比对，可以使用基于Bmtlag等的算法(Comp.App.Biosci.6:237245(1990))的FASTDB计算机程序测定。在序列比对中，查询和目标序列为或者两者均是核苷酸序列或者两者均是氨基酸序列。序列全局比对的结果以同一性百分比表示。在FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是矩阵-PAM0，k-元组-2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机组长度=0，切断得分=1，窗口大小=序列长度，空位罚分=5，空位大小罚分=0.05,窗口大小=500或目标氨基酸序列的长度，无论哪一个是较短的。0103变体与标准HA或治疗蛋白通常具有至少75。/。(优选地至少约80%、90%、95%或99%)序列同一性，所述标准HA或治疗蛋白与变体具有相同长度。在核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或同一性使用被设计为查找序列相似性的程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:22642268(1990)和Altschul,J,Mol.Evol.36:290300(1993)，通过引用全部并入)所采用的算法通过BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)分析进行测定。0104本发明的多核苷酸变体可以含有在编码区、非编码区或两者中的变化。特别优选的是多核苷酸变体，其含有产生沉默置换、增加或缺失但不改变编码多肽的性质或活性的变化。由于基因密码的简并性而由沉默置换所产生的核苷酸变体是优选的。而且，在其中小于50、小于40、小于30、小于20、小于10、或5-50、5-25、5-10、1-5、或1-2个氨基酸被以任意组合置换、缺失、增加的多肽变体也是优选的。多核苷酸变体可以由于多种原因而产生，例如用来最优化具体宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变为细菌宿主诸如酵母或大肠杆菌(E.coli)优选的密码子)。0105为了构建各种Fc融合蛋白诸如EPO-Fc融合构建体、G-CSF-Fc融合构建体或人p40-Fc融合构建体，人EPO、人G-CSF,人p40和人TNF受体的氨基酸序列可分别从NP—0007卯(SEQIDNO:15)、CAA27291(SEQIDNO:16)、AAG32620(SEQIDNO:17)和NPJ)01057(SEQIDNO:31)获得。在一个实施方式中，将其中303位的氨基酸残基Asn用Gln替换的被修饰的人p40连接到多肽。0106根据本发明的另一方面，提供含有改造的Fc区的全抗体。如本文所用，术语"抗体"包括全抗体和包含CH1、铰链区、CH2或CH3中至少两个的抗体片段。全单克隆抗体是优选的。抗体的重链可变区被选择用于其结合特异性并且可以为任意类型，诸如，例如非人的、人源化的或完全人的(fullyhuman)。当抗体的重链可变区为非人的(诸如，例如鼠)并且与根据本公开的改造的Fc区重组地组合时，所产生的重组抗体被称为嵌合抗体。当抗体的重链可变区为人源化的并且与根据本公开的改造的Fc区重组地组合时，所产生的重组抗体被称为人源化抗体。当抗体重链可变区为人的并且与根据本公开的改造的Fc区重组地组合时，所产生的重组抗体被称为完全人抗体。例如，重链可变区为人源化的并且包括人骨架区和非人(在该情况下为鼠)互补决定区(complementarydeterminingregions,CDRs)。应该理解为，骨架区可以源自一种来源或一种以上来源，以及CDRs可以源自一种来源或一种以上来源。抗体人源化的方法对本领域技术人员是己知的并且在本领域是已知的。0107抗体的轻链可以是人的、非人的或人源化的。在图IB显示的实施方式中，轻链是人源化的并且包括人骨架区、非人(在该情况下为鼠)CDRs和人恒定区。应该理解为，骨架区可以源自一种来源或一种以上来源，以及CDRs可以源自一种来源或一种以上来源。0108含有改造的Fc区的抗体基于其结合到细胞表面分子或可溶性分子的能力进行选择，所述可溶性分子结合到细胞表面分子。因此，例如抗体可以基于其结合这些细胞表面分子的能力进行选择，诸如细胞因子受体(例如，IL-2R、TNF-aR、IL-15R等)、粘附分子(例如，E-选择素、P-选择素、L-选择素、VCAM、ICAM等)、细胞分化或活化抗原(例如，CD3、CD4、CD8、CD20、CD25、CD40等)以及其它。可选地，抗体可以基于其结合可溶性分子的能力进行选择，所述可溶性分子结合到细胞表面分子。这些可溶性分子包括，但不限于细胞因子和和趋化因子(例如，白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6等)、生长因子(例如，EGF、PGDF、GM-CSF、HGF、IGF、BMP-1等)、诱导细胞分化的分子(例如，EPO、TPO、SCF、PTN等)以及其它。0109一般而言，本文公开的抗体的构建通过使用基因工程技术中所采用的公认的操作完成。例如，这些技术在本领域中是周知的分离DNA、制备和选择表达DNA的载体、纯化和分析核酸、制造重组载体DNA的具体方法、用限制酶剪切DNA、连接DNA、通过稳定或瞬时的方法将包含载体DNA的DNA导入宿主细胞、在选择性或非选择性培养基中培养宿主细胞以选择和维持表达DNA的细胞。0110本文公开的单克隆抗体可以使用本领域中已知的杂交瘤方法或本领域中众所周知的其它重组DNA的方法进行衍生。在杂交瘤方法中，用DNA、肽或蛋白质免疫小鼠或其它适合的宿主动物，所述DNA、肽或蛋白质引起淋巴细胞产生抗体。0111可选地，淋巴细胞可以在体外被免疫。然后，用适合的融合剂诸如聚乙二醇，将应答抗原产生的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。然后，所述杂交瘤细胞被接种和生长在适合的培养基中，所述培养基优选地包含一种或更多种抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或生存的物质。优选的骨髓瘤细胞是那些骨髓瘤细胞它们有效地融合、支持选择的产生抗体的细胞稳定地产生抗体并且对培养基诸如HAT培养基(SigmaChemicalCompany,St.Louis，Mo.，CatalogNo.H-0262)不敏感。0112含有改造的Fc区的抗体还可以用作单独施用的组合物，所述组合物结合治疗剂给出。为了诊断目的，所述抗体可以被标记或不被标记。0113未标记的抗体可以与其它已标记的抗体(第二抗体)结合来使用，所述其它已标记的抗体与改造的抗体反应，诸如对人免疫球蛋白恒定区特异的抗体。可选地，抗体可以直接被标记。可以使用许多种标记，诸如放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(特别是半抗原)等。可利用多种免疫测定并且对本领域技术人员而言是众所周知的。0114根据一个实施方式，本发明提供产生融合蛋白的方法，该方法包括(i)将编码融合蛋白的DNA分子引入哺乳动物宿主细胞，(ii)在表达融合蛋白的条件下使细胞在其生长培养基中生长；以及(iii)收获产生的融合蛋白。0115在其它示例性的实施方式中，提供包含上述融合蛋白或抗体分子或抗体片段的药物组合物。还提供通过施用所述药物组合物治疗或预防某些症状的方法。例如，提供如下方法(i)减少自身免疫性疾病的症状，预防/治疗自身免疫性疾病，(ii)抑制移植排斥，(iii)治疗/预防内毒素诱发的休克，其包括施用治疗上有效量的杂交Fc和p40蛋白或其变体/片段的融合蛋白。0116组合物可以包括药学载体。药学载体可以是任何相容的、无毒的物质，其适于将抗体递送到患者。无菌水、乙醇、脂肪、蜡和惰性固体可以包括在载体中。药学上可接受的佐剂(缓冲剂、分散剂)也可以掺入药物组合物中。0117抗体组合物可以各种方法施用给对象。例如，药物组合物可以肠胃外，例如，皮下、肌肉或静脉施用。这些组合物可以通过常用的、周知的灭菌技术进行灭菌。组合物可以包含药学上可接受的辅助物质，所述辅助物质是获得近似的生理条件所需的，诸如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。融合蛋白、抗体或抗体片段在这些配方中的浓度可以广泛地变化，例如，按重量计从小于约0.5%，通常为或至少约1%至高达15或20%，以及其主要根据所选的具体施用方式基于液体体积、粘度等进行选择。0118本发明还提供编码融合蛋白的分离的核酸分子，以及携带核酸分子的表达载体。该核酸可以直接被递送给需要所述核酸编码的多肽的对象。可选地，通过在培养基中表达核酸而产生多核苷酸，然后将其施用给对象。0119术语"肽"、"多肽"或"蛋白质"是指2至40个氨基酸的分子，以及优选3至20个氨基酸的分子和最优选6至15个氨基酸的分子。示例性的肽可以通过上述引用的任意方法随机产生，其被携带在肽文库中(例如，噬菌体展示文库)，或通过消化蛋白质而衍生。0120如本文所用，术语"药物"是指当施用给人或动物时显示治疗活性的物质，药物的实例包括，但不限于多肽、化合物、提取物和核酸。优选的是多肽药物。0121如本文所用，术语"生理活性多肽"、"生物活性分子"、"生理活性蛋白质"、"活性多肽"、"多肽药物"和"蛋白质药物"它们的含义可以互换，并且其特征在于它们以生理活性的形式显示各种体内生理功能。0122多肽药物具有不能将生理作用维持一段长时间的缺点，这是由于其容易被体内存在的蛋白水解酶变性或降解的性质。但是，当多肽药物被连接(或偶联)到根据本发明实施方式所述的免疫球蛋白Fc片段形成融合蛋白时，所述药物具有增加的结构稳定性和血清半衰期。还有，连接到Fc片段的多肽具有比其它已知的多肽药物配制物少得多的生理活性的降低。因此，与传统多肽药物的体内生物利用度相比，包含多肽药物和Fc片段的融合的多肽、或多肽药物和本发明所述Fc片段的结合物的特征在于具有显著改善的体内生物利用度。这也通过本发明的实施方式进行了清楚地描述。也就是说，当连接到本发明的Fc片段时，IFN-a、G-CSF、EPO、p40、TNF受体和其它蛋白质药物显示与其天然形式或其它传统融合形式相比增加的体内生物利用度。0123可以理解为，本发明发展了传统的重组DNA方法学，以产生Fc融合蛋白、包含根据本发明的改造的Fc区抗体以及用于本发明实践的抗体片段。Fc融合构建体优选在DNA水平产生，以及所产生的DNA整合进入表达载体，并且表达以产生本发明的融合蛋白、抗体或抗体片段。0124如本文所用，术语"载体"被理解为含义是包含这样的核苷酸序列的任意核酸，所述核苷酸序列能够掺入宿主并且与宿主细胞基因组重组且整合进入宿主细胞基因组，或能够作为附加体自主复制。这些载体包括线性核酸、质粒、抗菌素、粘粒、RNA载体、病毒载体等等。病毒载体的非限制性实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺-相关的病毒。如本文所用，术语目标蛋白的"基因表达"或"表达"被理解为含义是转录DNA序列、翻译mRNA转录物，以及分泌Fc融合蛋白产物或抗体或抗体片段。0125有用的表达载体是RcCMV(Invitrogen,Carlsbad)或其变体。有用的表达载体应携带人巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子，以促进哺乳动物细胞中感兴趣的基因的组成型转录，以及携带牛生长激素多腺苷酸化信号序列，以增加转录后RNA的稳定状态水平。在本发明的实施方式中，表达载体是pADll，其为RcCMV的修饰载体。携带编码生物活性分子药物的核苷酸序列的表达载体的实例可以包括，不限于pADllEPO-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp40N303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADllp40N303Q-hFc-6、pAD11EPO-hFc-5、pAD11G-CSF-hFc-5、pAD11p40N303q-hFc-5或pAD11TNFR-hFc-5，如实施例中更详细地描述。0126适合的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，以及用于目标蛋白的表达和/或分泌。目前用于本发明的优选的宿主细胞包括无限增殖的杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和COS细胞。0127已经用于在哺乳动物细胞中产生高水平表达的融合蛋白或抗体或抗体片段的一个表达系统是在5'至3'方向上编码分泌表达盒的DNA构建物，其包括信号序列和免疫球蛋白Fc区，以及目标蛋白，诸如p40、EPO、G-CSF、TNF受体。几种目标蛋白已在这一系统中成功地表达以及包括，例如IL2、CD26、Tat、Rev、OSF-2、ss;IG-H3、IgE受体、PSMA和gp120。这些表达构建物公开在Lo等人的美国专利第5,541,087号和第5,726,044号中，其内容通过引用并入本文。0128本发明的融合蛋白或抗体分子或抗体片段在表达时可以包括或不包括信号序列。如本文所用，术语"信号序列"被理解为含义是引导生物活性分子药物；融合蛋白的分泌并且其后在宿主细胞中翻译后被剪切的片段。本发明的信号序列是编码氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列启动蛋白质跨内质网膜的转运。用于本发明的信号序列包括抗体轻链信号序列，例如抗体14.18(Gillies等，J.Immunol.Meth.1989.125:191-202)，抗体重链信号序列，例如MOPC141抗体重链信号序列(Sakano等，Nature1980.286:676-683)，以及本领域已知的任意其它的信号序列(参见，例如Watson等，NucleicAcidsResearch1984.12:5145-5164)。0129信号序列在本领域中已经被充分定性并且已知包含16至30个氨基酸残基，以及可以包含更多或更少的氨基酸残基。典型的信号肽由三个区组成碱性N-端区、中心疏水区和更具极性的C-端区。中心疏水区包含4至12个疏水残基，所述疏水残基在新生多肽的转运期间跨过膜脂双层锚定信号肽。在启动后，信号肽通常在内质网腔内被己知为信号肽酶的细胞酶剪切。信号肽的潜在剪切位点一般遵循"(-3，-l)规则"。因此，典型的信号肽在-1和-3位中具有小的、中性的氨基酸残基以及在该区中缺少脯氨酸残基。0130信号肽酶剪切在-1和+1氨基酸之间的这种信号肽。因此，信号序列在分泌期间可以从融合蛋白的氨基末端被剪切。这导致由免疫球蛋白Fc区和目标蛋白组成的Fc融合蛋白的分泌。信号肽序列的详细论述由vonHeijne(1986)NucleicAcidsRes.14:4683A提供。0131如对本领域技术人员是显而易见的，用于分泌表达盒的具体的信号序列的适合性可能需要一些常规实验。0132此类实验包括测定信号序列引导Fc融合蛋白分泌的能力，还有测定待使用的序列的最佳构型(configuration)、基因组或cDNA以达到Fc融合蛋白的有效分泌。此外，本领域的技术人员能够按照vonHeijne(1986)提供的规则制备合成的信号肽，以及通过常规的实验对这种合成信号序列的功效进行测试。信号序列还可以称为"信号肽"、"前导序列"或"前导肽"。0133信号序列和免疫球蛋白Fc区的融合有时被称为分泌表达盒。用于本发明实践的示例性的分泌表达盒是多核苷酸，所述多核苷酸在5'至3'方向上编码免疫球蛋白轻链基因的信号序列和人免疫球蛋白yl基因的Fcyl区。免疫球蛋白Fcyl基因的Fcyl区优选地包括至少一部分免疫球蛋白铰链结构域和至少CH3结构域，或更优选至少一部分铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。如本文所用，免疫球蛋白铰链区的"部分"被理解为含义是一部分免疫球蛋白铰链，其包含至少一个、优选两个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基能够形成链间二硫键。编码分泌表达盒的DNA可以在其基因组构型或其cDNA构型中。在某些情况下，从人免疫球蛋白Fcy2重链序列产生Fc区是有利的。尽管基于人免疫球蛋白yl和y2序列的Fc融合行为与小鼠相似，基于y2序列Fc融合在人体中可以展示优良的药物代谢动力学。0134在另一实施方式中，DNA序列编码插入在分泌表达盒和目标蛋白之间的蛋白酶剪切位点。剪切位点提供编码的融合蛋白的蛋白酶剪切，所述编码的融合蛋白从而将Fc结构域从目标蛋白分离。如本文所用，"蛋白酶剪切位点"被理解为含义是优先被蛋白水解酶或其它蛋白酶剪切剂剪切的氨基酸序列。有用的蛋白酶剪切位点包括被诸如胰蛋白酶、纤溶酶、或肠激酶K的蛋白水解酶识别的氨基酸序列。已知许多剪切位点/剪切剂对(参见，例如美国专利第5,726,044号)。0135进一步，这些恒定区的构建物的置换或缺失——其中恒定区结构域的一个或更多个氨基酸残基被置换或删除——也是有用的。一个实例是将氨基酸置换导入上面的CH2区内，以产生Fc变体，所述Fc变体对Fc受体的亲和力降低(Cole等(1997)J.Immunol.159:3613)。本领域的技术人员可以使用周知的分子生物学技术制备这些构建物。0136能够被结合到本发明的免疫球蛋白Fc片段的蛋白药物的非限制性实例包括人生长激素、骨形态发生蛋白-1(BMP-1)、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素和干扰素受体(例如，干扰素-cx、-卩和-Y、水溶性I型干扰素受体等)、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落形成刺激因子(GM-CSF)、胰高血糖素样肽(例如，GLP-1等)、G蛋白偶联受体、白细胞介素(例如，白细胞介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白细胞介素受体(例如，IL-1受体、IL-4受体等)、酶(例如，葡糖脑苷脂酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、(x-半乳糖苷酶-A、阿加糖酶(agalsidase)a和(3、ot-L-艾杜糖醛酸酶、丁酰胆碱酯酶、壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂肪酶、尿酸酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶等)、白细胞介素和细胞因子结合蛋白(例如，IL-18bp、TNF-结合蛋白等)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白质A、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制剂(tumorsuppressors)、癌转移生长因子(metastasisgrowthfactor)、a-l抗胰蛋白酶、白蛋白、a-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、促血管生成素；血色素、凝血酶、凝血酶受体活化肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子viia、因子vni、因子ix、因子xni、纤溶酶原活化因子、纤维蛋白结合肽(fibrin-bindingpeptide)、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白质C、C-反应性蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、痩素、血小板源性生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白(bonestimulatingprotein)、降血钙素、胰岛素、心纳素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通路抑制剂、卵泡刺激素、促黄体生成素、促黄体素释放激素、神经生长因子(例如，神经生长因子、睫状神经营养因子、轴突再生因子-1(oogenesisfactor-1)、脑钠尿肽、胶质细胞源性神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子、neutmin等)、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素(autotoxin)、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体(例如，TNFR(P75)、TOFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、B细胞活化因子受体等)、受体拮抗剂(例如，IL1-Ra等)、细胞表面抗原(例如，CD2、3、4、5、7、lla、llb、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、病毒疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和Fd)以及病毒源性免疫抗原。抗体片段可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd或scFv，其能够连接到特异性抗原，以及优选Fab'。Fab片段包含轻链的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)以及重链的可变结构域(VH)和第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段不同于Fab片段，所述Fab'片段将来自铰链区的几种氨基酸残基包括一个或更多个半胱氨酸残基添加到CH1结构域的羧基端。Fd片段仅仅包含VH和CH1结构域，以及F(ab')2片段通过二硫键连接或化学反应作为一对Fab'片段产生。scFv(单链Fv)片段包含VL和VH结构域，所述VL和VH结构域通过肽连接体彼此连接以及因此以以单多肽链存在。0137具体而言，作为生物活性分子优选的是对于治疗或预防疾病在施用到人体后需要频繁给药的那些，包括人生长激素、干扰素(干扰素-a、-P、-y等)、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、TFN受体、p40和抗体片段。此外，某些衍生物被包括在本发明的生物活性分子的范围内——只要它们与生物活性分子的天然形式相比具有基本上相同或改进的功能、结构、活性或稳定性。本发明中，最优选的多肽药物是干扰素-a。0138在本发明的另一方面，IgG-Fc和IgG-CH融合蛋白，例如被合成为单体，所述单体可以装配形成二聚体。典型地，所述二聚体通常通过在IgG铰链区的二硫键连接。分泌IgG融合蛋白的细胞的条件培养基可以包含IgG融合蛋白单体和二聚体的混合物。为了用作人体治疗，可以期望使用IgG融合蛋白单体或二聚体的均匀群体，而不是两种形式的混合物。0139还提供获得基本上纯的二聚活性多肽-IgG融合蛋白制备物的方法。该方法一般通过如下来实现获得能够表达IgG融合蛋白的宿主细胞，，收集条件培养基，以及通过柱色谱法从单体的融合蛋白、聚集体(aggregates)和污染蛋白质纯化二聚融合蛋白。表达IgG融合蛋白的适合的宿主细胞包括酵母、昆虫、哺乳动物或其它真核细胞。在一个实施方式中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞，具体地是COS、CHO或BHK细胞。0140还提供多肽药物和Fc片段的新型融合蛋白。在一个实施方式中，诸如EPO、p40、G-CSF或TOF受体的多肽药物被直接连接到杂交的Fc片段，而不用插入肽连接体。在另一实施方式中，多肽药物被彼此连接，其通过1至50个氨基酸的肽连接体，以及更优选通过1至7个氨基酸的肽连接体进行连接。用于该目的的特别有用的连接体包括免疫失活肽，其由Gly和Ser残基(例如，GlyGlySerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSEQIDNO:32)组成或由在人白蛋白中衍生的SEQIDNO:25的282-314位处的氨基酸组成。0141在当使用连接体的情况下，连接体和多肽药物可以呈一定的方向。即，连接体可以连接到杂交Fc片段的N-端、C-端或游离基团，以及也可以连接到多肽药物的N-端、C-端或游离基团。当连接体是肽连接体时，连接可以发生在一定的连接位点。当多肽药物和杂交Fc被分别表达和然后被彼此连接时，可以使用本领域中己知的许多偶联剂中的任意一种进行偶联。偶联剂的非限制性实例包括1,1-双(二偶氮乙酰基)-2-苯乙垸、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯诸如具有4-叠氮水杨酸的酯、亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3,3'-二硫代双(珀酰亚胺丙酸酯)，以及双官能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺基-l,8-辛烷。0142本发明还提供生产多肽药物-杂交Fc片段的方法。0143本发明还提供治疗症状(conditions)的方法，所述症状通过施用多肽药物而缓解。这些方法包括给具有症状的哺乳动物施用有效量的本发明的多肽，所述症状可以或可以不直接与与感兴趣的疾病相关。例如，编码期望的多肽药物-杂交Fc片段融合蛋白的诸如DNA或RNA的核酸可以作为治疗剂施用给对象，优选哺乳动物。另外，包含编码多肽药物-杂交Fc片段融合蛋白的核酸的细胞可以作为治疗剂施用给对象，优选哺乳动物。此外，多肽药物-杂交Fc片段融合构建体可以作为治疗剂施用给对象，优选哺乳动物。这些嵌合多肽可以经静脉内、皮下、经口、经颊(buccally)、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经肺途径施用。0144本发明的EPO(包括其变体/片段)-fc融合蛋白可以用于提高和维持哺乳动物的血细胞比容。0145p40是IL-12的亚基。IL-12是75kDa异源二聚体的细胞因子，其在体内具有几种功能。例如，IL-12刺激活化T和NK细胞增殖并且促进Thl型辅助细胞应答。IL-12通过结合到活化T和NK细胞的质膜上的IL-12受体发挥其生物效应，以及IL-12结合到IL-12受体的能力己被归因于IL-12的p40亚基。冈此，本发明的p40(包括其变体/片段)-fc融合蛋白可以用于(i)减少自身免疫性疾病的症状，预防/治疗自身免疫性疾病，(ii)抑制移植排斥，或(iii)治疗/预防内毒素诱发的休克。而且，本发明的p40(包括其变体/片段)-fc融合蛋白可以用于治疗/预防/改善风湿性关节炎、强制性脊柱炎、炎症性肠病、多发性硬化症或牛皮癣的症状。变体和片段在本领域中是已知的，其包括但不限于WO97/20062，其内容作为引用并入本文。p40变体的一个实施方式包括但不限于包含Asn303Gln置换的p40。046粒细胞集落形成刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,G-CSF)是粒细胞，特别是嗜中性粒细胞的增殖和分化必需的蛋白质。粒细胞吞没并且吞噬微生物侵入和细胞碎片，并且因此对感染应答是至关重要的。化学疗法破坏粒细胞和/或减少粒细胞的产生。因此，本发明的G-CSF(包括其变体/片段)-fc融合蛋白可以用于治疗/预防/改善在骨髓移植、急性白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、严重的慢性嗜中性白细胞减少症或移植的外周血干细胞活化后化学疗法诱发的嗜中性白细胞减少症骨髓抑制的症状。0147本发明的融合蛋白不仅用作治疗剂，而且本领域的技术人员应认识到融合蛋白可用于生产诊断用途的抗体。同样地，适当施用DNA或RNA，例如，以载体或这些用途的其它递送系统，也包括在本发明的方法中。0148本发明的组合物可以通过与具体分子相容的任意途径施用。可以理解的是将本发明的组合物通过适合的方法直接(例如，局部地，如通过注射、植入或局部施用到组织部位)或系统地(例如，肠胃外或经口)提供给动物。在肠胃外提供组合物的情况下，诸如，通过静脉内、皮下、眼、腹膜内、肌肉内、经颊、直肠、阴道、眼眶内(intraorbital),大脑内、头颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、鼻内或通过气雾剂施用，组合物优选地包括部分水相的或生理相容的液体悬浮液或溶液。因此，载体(carrier或vehicle)是生理上可接受的，以便除了将期望的组合物递送到患者之外，其不会另外地不利影响患者的电解液和/或体积平衡。因此，药剂的液体介质可以包括生理盐水。0149本发明的DNA构建物(或基因构建物)还可以用作基因治疗方法的一部分，以递送编码多肽药物或其融合蛋白构建物的核酸。0150本发明的特征是表达载体，其用于在具体的细胞类型中在体内转染和表达感兴趣的多肽药物或其融合蛋白构建物，以便重组或补充期望的多肽药物的功能。期望的多肽药物的表达构建物，或其融合蛋白构建物可以以任意生物学上有效的载体施用，例如能够在体内有效地将编码期望的多肽药物的基因或其融合蛋白构建物递送给细胞的任意制剂或组合物。0151方法包括在病毒载体中插入目标基因，所述载体包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺-相关病毒以及单纯疱疹病毒-1，或重组细菌或真核质粒。对于人，每次施用编码本发明融合蛋白的核酸的优选剂量在0.1mg-100mg范围内，更优选lmg-10mg，以及最优选2mg-10mg。可以理解的是施用的最佳剂量和方式可以通过在本领域技术水平内熟知的常规实验确定。0152对于人，每次施用的融合蛋白的优选剂量在0.1mg-1,000mg范围内，更优选lmg-100mg，以及最优选5mg-20mg。但是，可以理解的是最佳剂量还取决于所治疗的疾病以及副作用的存在。但是，最佳剂量可以使用常规实验确定。施用融合蛋白可以通过定期团注(periodicbolusinjections),或通过从外部贮存器(anexternalreservoir)(例如，从静脉输液包)或内部(例如，从生物可蚀性植入物)连续静脉内、皮下或腹膜内施用。0153此外，应理解的是本发明的融合蛋白还可以与多种不同的生物活性分子一起施用给需要的接受者。但是，应理解的是融合蛋白和其它分子的最佳组合、施用方式、剂量可以通过在本领域技术水平内熟知的常规实验确定。0154发明方式0155通过下列非限制性实施例对本发明进行进一步说明。01560157<实施例1>制备hFc-l、hFc-2、hFc-3、hFc-4、hFc-5和hFc-6融合蛋白的表达载体。0158hFc-l包括IgGlCH1区C-端的9个氨基酸(90-98)、IgGl的铰链区(99-113)、IgG2CH2区N-端的6个氨基酸(111-116)、IgG4CH2区的103个氨基酸(118-220)以及IgG4CH3区的107个氨基酸(221-327)(图l和2)。hFc-l的氨基酸序列显示在SEQIDNO:18中。为了获得密码子优化的核苷酸——所述核苷酸每个分别编码hFc-l(SEQIDNO:1)、人EPO(SEQIDNO:7)、人G-CSF(SEQIDNO:8)和人p40N303Q(源自在人p40亚基第303位氨基酸Gin置换Asn的突变体)(p40N303Q的核苷酸序列显示为SEQIDNO:9，以及人p40的氨基酸序列显示为SEQIDNO:17)，通过TOPGeneTechnologies(Quebec,Canada)(www.topgenetech.com)的定制服务(customservice)合成这些核苷酸分子。为了增加蛋白质表达水平，优化基因的密码子使用是非常有帮助的。密码子使用的方式在生物体之间不同。一些密码子在一种生物体内被更频繁地使用，而在另-一种生物体内很少被使用。这种密码子使用的偏好已经归因于翻译效率，生物体合成编码蛋白的能力。为了将每个融合基因插入到表达载体pADll(SEQIDNO:10)，在EPO、G-CSF和p40N303Q的ATG序列的5'端产生EcoRI位点以及在hFc-l的终止密码子的3'端产生XbaI位点。表达载体pADll从RcCMV骨架(可从Invitrogen,Carlsbad获得)获得。pADl1包括源自巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)的启动子、源自牛生长激素的poly(A)序列、源自兔(3球蛋白(MolCdlBiol,19888:4395)的球蛋白间插序列(globininterveningsequence,gIVS)等。为了制备pADll载体，有几种RcCMV载体(Invitrogen)的修饰。通过用XhoI酶处理移除新霉素抗性区以及在CMV启动子区的3'处添加gIVS。此外，在CMV启动子的5'处添加小鼠二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因(Pubmed,NM010049)。与几种包括上述这些的元件组合，在许多表达试验后形成了pADll载体。在我们未公开的结果中，pADll载体与RcCMV载体(Invitrogen)相比显示在表达水平上约12倍的增加。为了在读码框(frame)内产生EPO、G-CSF和p40N303Q的3'端和hFc-l的5'端之间的连接位点，在EPO、G-CSF和p40N303Q编码序列的3'端处以及在hFc-l编码序列的5'端处产生了NheI位点。在使用每个限制酶位点进行亚克隆后，产生了与EPO、G-CSF或p40N303Q融合的hFc-l的最终表达载体，以及然后分别命名为pADllEPO-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-1和pADllp40N303G-hFc-l。0159hFc-2、hFc-3、hFc-4、hFc-5和hFc-6的氨基酸序列分别显示在SEQIDNOs:19-23中。hFc-6包括C-端的IgDCHI结构域的9个氨基酸(90-98)，IgD铰链区的64个氨基酸(99-162)、N-端的IgDCH2结构域的8个氨基酸(shtqplgv163-170)、IgG4CH2结构域的100个氨基酸(121-220)和IgG4CH3结构域的107个氨基酸(221-327)(图1和2)。为了获得密码子优化的编码hFc-6(SEQIDNO:6)的核苷酸分子，通过TOPGeneTechnologies(www.topgenetech.com)的定制服务合成基因。为了在读码框内制备EPO、G-CSF或p40N303Q的3'端和hFc-6的5'端之间的融合，使用包括在hFc-6的N-端编码区(90和91个氨基酸)中的NheI位点(gctagc:Ala-Ser)。还有，为了将每个hFc-6融合基因插入pAD11载体，在hFc-6基因的3'端处产生了Xbal位点。在使用每个限制酶位点进行亚克隆后，融合有EPO、G-CSF和p40N303Q的hFc-6的最终表达载体产生以及然后分别命名为pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6和pADllp40N303Q陽hFc-6。hFc-2、hFc-3、hFc-4和hFc-5具有相同的CH2和CH3区，但它们具有不同大小的IgD铰链(图1和2)。hFc-2(SEQIDNO:19)、hFc-3(SEQIDNO:20)、hFc-4(SEQIDNO:21)和hFc-5(SEQIDNO:22)分别包括C-端IgD铰链的5个氨基酸(158-162)、IO个氨基酸(153-162)、20个氨基酸(143-162)、30个氨基酸(133-162)(图1和2)。为了制备在EPO、G-CSF、p40N303Q或TNFR(肿瘤坏死因子受体II)(SEQIDNO:30)和编码这些hFcs(SEQIDNOs:2-5)的核酸分子之间的融合基因，通过TOPGeneTechnologies(www.topgenetech.com)的定制服务进行合成在融合基因的总大小中最小的基因片段。与编码每个hFc-2、hFc-3、hFc-4或hFc-5的铰链和N-端CH2区的核苷酸分子融合的每个EPO、G-CSF、p40N303Q或TNFR的合成片段包括从全部EPO、G-CSF、p40N303Q或TNFR序列至相同的酶位点——位于lgG4(SEQIDNO:13)中的CH2区第138-140位氨基酸残基处的BstEII位点(GGTGACC)——范围的序列。包含几种基因片段的亚克隆载体用分别位于5'端和3'端处的EcoRI和BstEII切割，以及然后连接到hFc-6的CH2-CH3区。最后，使用EcoRI和XbaI位点将每个融合基因亚克隆到pADll,以及然后分别命名为pADllEPO-hFc-2、pADllEPO-hFc-3、pADllEPO-hFc-4、pADllEPO-hFc匿5、pADllG-CSF-hFc-2、pADllG-CSF-hFc-3、pADllG-CSF-hFc-4、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc-2、pADllp40N303Q-hFc陽3、pADllp40N303Q-hFc-4、pADllp40N303Q-hFc-5和pADllTNFR-hFc-5。01600161<实施例2>制备偶联到IFN-b的thFc-1和thFc-2表达载体0162thFc-l包括人组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator,tPA)的信号序列的23个氨基酸(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS),IgGl铰链区的15个氨基酸(99-113)，N-端IgG2CH2区的6个氨基酸(111-116)，IgG4CI-12区的103个氨基酸(118-220)以及IgG4CH3区的107个氨基酸(221-327)(图3)。thFc-l的氨基酸序列显示在SEQIDNO:28中。thFc-2包括tPA信号序列的23个氨基酸(MDAMLRGLCCVLLLCGAVFVSPS),IgD铰链区的15个氨基酸(148-162)，N-端IgDCH2区的8个氨基酸(163-170)，IgG4CH2区的100个氨基酸(121-220)以及IgG4CH3区的107个氨基酸(221-327)(图3)。thFc-2的氨基酸序列显示在SEQIDNO:29中。为了获得密码子优化的核苷酸——所述核苷酸编码偶联到被删除其信号序列的人IFN-p的N-端的thFc-l(SEQIDNO:26)或thFc-2(SEQIDNO:27)，通过TOPGeneTechnologies(Quebec,Canada)(www.topgenetech.com)的定制服务合成这些核苷酸分子。为将每个融合基因插入到表达载体pADll(SEQIDNO:10)，在thFc-1或thFc-2的5'端产生EcoRI位点和在IFN-卩终止密码子的3'端产生NotI位点。在使用每个限制酶位点进行亚克隆后，最终表达载体分别命名为pADllthFc-l-AL(O)-IFN-P禾tlpADllthFc-2-AL(0)-歴-卩。0163为了制备经由不同大小的白蛋白连接体或Gly-Ser连接体偶联到IFN-卩的thFc，通过TOPGeneTechnologies(www.topgenetech.com)的定制服务合成范围从thFc-l的CH3区PstI位点的基因片段，所述thFc-l经由不同的白蛋白连接体(3aa、8aa、13aa、18aa、23aa和33aa)或Gly-Ser连接体(15aa)偶联到被删除其信号序列的IFN-(3(图4)。为将7种不同大小的基因片段插入到表达载体pADllthFc-l-AL(0)-IFN-(3和pADllthFc-2-AL(0)-IFN-{3，在它们的5，端处产生PstI位点以及在IFN-P终止密码子的3'端处产生NotI位点。在使用每个限制酶位点进行亚克隆后，最终表达载体分别命名为pADllthFc-l-AL(l)-IFN-|3、pADllthFc-1-AL(2)-IFN-(3、pAD11thFc-1-AL(3)-IFN-卩、pAD11thFc陽1-AL(4)-IFN-(3、pAD11thFc-l-AL(5)-IFN-卩、pADllthFc-l-AL(6)-IFN-卩、pADllthFc-l匿GS-IFN-卩、以及pADllthFc-2-AL(l)-IFN-卩、pADllthFc-2-AL(2)-IFN-(3、pADllthFc-2-AL(3)-IFN-卩、pAD11thFc-2-AL(4)-IFN-卩、pAD11thFc-2-AL(5)-IFN-p、pAD11thFc-2-AL(6)-IFN-卩pADll和thFc-2-GS-IFN-卩。01640165<实施例3〉人EPO-hFcs、人G-CSF-hFcs、人p40N303Q-hFcs、人TNFR-hFc-5和thFcs-IFN-(J蛋白的表达0166COS-7细胞被用于表达试验并且用添加有10%胎牛血清(Hyclone，SouthLogan)和抗生素(Invitrogen,Carlsbad)的DMEM培养基(Invitrogen,Carlsbad)培养。使用传统的电穿孔法将编码EPO-hFcs、G-CSF-hFcs、p40N303Q-hFcs、TOFR-hFc-5、thFcs-IFN-卩的载体转染到5><106COS-7细胞。在转染后48h时，收获上清液和细胞。为检测每个载体的融合蛋白的表达，所有样品通过几种试剂盒(R&D系统，Minneapolis,#DEP00，用于EPO;Biosource,Camarillo,#KHC2032，用于G-CSF;R&D系统，Minneapolis,#DY1240用于p40N303Q;R&D系统，Minneapolis,弁DRT200用于TNFR,PBLBiomedicalLaboratories,#41410-1A用于IFN-卩)用于ELISA测定和通过抗-人IgG抗体(SantaCruzBiotechnology,SantaCmz)用于蛋白质印迹分析。结果，所有载体在上清液和细胞裂解液中显示正确的表达模式(未显示数据)。01670168<实施例4>1^0融合蛋白的纯化0169用a-MEM(Invi加gen，Carlsbad)、10%透析的胎牛血清(JRHBiosciences,Kansas)、HT补齐U(HTsupplement)(Invitrogen,Carlsbad)禾口抗生素(Invi加gen,Carlsbad)培养CHO/DHFR一细胞(中国仓鼠卵巢细胞，DG44,ATCC)。根据传统的CaP04共沉淀法，将表达载体转染到CHO细胞。在转染后48h，从平板将CHO细胞分离并且成倍稀释(1/2、1/5、1/20、1/50、1/100、1/200、1/500)。将稀释的细胞平铺到100mm培养皿并且用无HT补剂的培养基进行培养。在筛选过程中，将不含HT补剂的新鲜培养基提供给没有传代的细胞。在平铺后2-3周产生集落并且将单集落转移到48孔板。在用于EPO、G-CSF、p40N303Q和TNFR检测的ELISA测定后，筛选阳性集落。将显示最高表达的每个集落使用不含血清的培养基(JRHBiosciences,Kansas)进行大规模(5L)培养。将收获的不含血清的上清液用于每种融合蛋白的纯化。为了纯化，用20mM磷酸钠(pH7.0)平衡HiTrap重组蛋白AFF(Amershambiosciences,Piscataway)柱。将过滤的上清液添加到所述柱并且用0.1M柠檬酸钠(pH3.0)洗脱。在用膜(MWCO1214K,Spectrapor,RanchoDominguez)透析三次以上之后，最终获得洗脱的蛋白。所有蛋白质样品的浓度通过用于测量总蛋白质的BCA试剂盒(PierceBiotechnology,Rockford)禾口用于测量EPO-hFcs、G-CSF-hFcs、p40N303Q-hFcs、TNFR-hFc-5禾QthFcs-IFN-卩的ELISA试剂盒进行测定。01700171<实施例5>FcgRI和Clq结合测定0172为了研究hFc-5融合蛋白是否结合到FcgRI禾卩Clq，MabThem(Rituximab，Roche)、hlgGl(Calbiochem,Cat#,400120)、Enbrel(etanercept,Amgen)、EPO-hFc-5、G-CSF-hFc-5和p40N303Q-hFc-5被连续稀释(以2倍从2ug/ml至16ng/ml)并且被包被在8孔带上(COSTAR，NewYork)4度过夜(overnightat4)。为制作标准曲线，FcgRI(R&D,cat#BAF1257)或Clq(AbDserotech,Ca汰2221-5504)也被连续稀释(以2倍从2ug/ml至32ng/ml)被涂布在8孔带上(COSTAR,NewYork)4度过夜。在室温下用洗涤液(含0.05%吐温的PBS)洗涤样品的每个带和用PBS中的10%FBS封闭1小时后，将FcgRI或Clq以2ug/ml添加进每个孔，然后室温下(roomtemprature，RT)温育2小时。用洗涤液洗涤所有的带。为进行Clq结合试验，将HRP结合的抗-Clq(AbDserotech,cat#.2221-5004P)被以2.5ug/ml添加进每个孔，然后在黑暗条件下室温下温育30min。为进行FcgRI结合试验，将生物素化的抗-FcgRI(R&D，cat#.1257-FC)以2ug/ml添加进每个孔，然后室温下温育1小时。在用洗涤液洗涤它们后，将3,000倍稀释的Streptavidine-HRP(BD,cat#.554066)添加进每个带，然后在黑暗条件下室温下温育30分钟。在洗涤带后，添加TMB溶液(TMB过氧化物底物和过氧化物底物溶液B的1:1混合物，KPL,cat#.50-76-01,cat#,50-65-00)用于显色以及添加2N112304用于停止显色。如图6(a)和图6(b)中所示，MabTheraEnbre劇和hlgGl显示很好地结合到FcgRI和Clq，但EPO-hFc-5、G-CSF-hFc-5禾Qp40N303Q-hFc-5却没有。01730174<实施例6>纯化的hFc融合蛋白的体外生物活性0175为研究EPO-hFc蛋白的体外生物活性，在补充有10MFBS、抗生素和5IU/ml重组人EPO(DongA,RepublicofKorea)的RPMI1640培养基中(Cambrex,CharlesCity)培养人F35E细胞系。通过将2"04个细胞接种到96孔细胞培养板(Corning,Netherlands)的测定孔来进行生物测定。将EPO、EPO-hFc-l、EPO-hFc陽5、EPO-hFc陽6、EPO-IgGlFc或Aranesp(darbepoetinalfa,Amgen)的连续稀释(以5倍从0、0.064mIU/ml至25IU/ml)的样品添加到这些孔并且将板在湿润的5%的C02培养箱中37'C下温育72小时。根据制造商的方案，通过使用细胞生长比色测定试剂盒(Sigma-Aldrich.Korea)进行MTT测定。人F35E细胞系对rEPO显示强的增殖应答，如在细胞数和吸收值中剂量依赖性方式所证明。如图7(a)中所示，偶联到IgGlFc或hFcs的Aranesp⑧和EPO蛋白与EPO蛋白相比显示丧失生物活性。但是，EPO-hFc-l、EPO-hFc-5和EPO-hFc-6显示明显高于EPO-IgGlFc的生物活性。此外，EPO-hFc-5和EPO-hFc-6显示略微高于Aranesp⑧的生物活性，这表明这些hFc融合蛋白在维持EPO蛋白的生物活性方面似乎好于Aranesp。0176为了研究G-CSF-hFc蛋白的体外生物活性，在添加有10%FBS、抗生素和lOOunits/ml重组小鼠IL-3(R&Dsystem,Minneapolis)的RPMI1640培养基(Cambrex,CharlesCity)中培养小鼠造血细胞系，NFS-60。通过将2404细胞接种到96孔细胞培养板(Corning,Netherlands)的孔建立生物测定。将G-CSF-hFc-5和Neulasta(pegfilgrastim，Amgen)的连续稀释(用3倍从0至10,000pg/ml)的样品添加到这些孔并且将板在湿润的5%C02培养箱中37。C下温育72小时。在三个重复孔中测定蛋白样品并且重复进行该实验5次。在温育后72小时，根据制造商的方法，通过使用细胞生长比色测定试剂盒(Sigma-Aldrich.Korea)进行MTT测定。如图7(b)中所说明，G-CSF-hFc-5显示略微高于Neulasta⑧的体外生物活性。0177为研究p40N303Q-hFc蛋白的体外生物活性，在添加有10%FBS和抗生素的RPMI1640培养基(Cambrex,CharlesCity)中，用2ug/ml的抗-人CD3抗体(R&Dsystem,#MAB100)并用或不用10ng/ml的人p40(R&Dsystem)或p40N303Q-hFc-5温育风湿性关节炎患者的外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)。在6天后，通过FACS分析，测定对CD4和IL-17阳性的细胞。如图7(c)中所示，对于CD4+ZIL-17+细胞的产生，p40N303Q-hFc-5显示强于p40蛋白的抑制效应，这表明p40N303Q-hFc-5对Thl7极化的抑制功能。0178为了研究TNFR-hFc蛋白的体外生物活性，在添加有10%FBS和抗生素的RPMI1640培养基(Cambrex，CharlesCity)中培养鼠L929细胞。通过将3x104个细胞接种到96孔细胞培养板(Corning,Netherlands)的孔中来进行致细胞病变抑制测定，然后用lng/ml的TNF-a进行处理。将TNFR-hFc-5和Enbrel(etanercept,Amgen)的连续稀释(以2倍从15.6至1，000ng/ml)的样品添加到这些孔并且将板在湿润的5%CCb培养箱中在37'C培养48小时。在温育后，根据制造商的方法，通过使用细胞生长比色测定试剂盒(Sigma-Aldrich.,Korea)进行MTT测定。如图7(d)中所说明，TNFR-hFc-5显示略微高于EnbreM)的体外生物活性。0179为了研究thFc-l-AL(O)-IFN-卩和thFc-l-AL(3)-IFN-卩蛋白的体外生物活性，在添加有10%FBS和抗生素的DMEM/F12(Cambrex,CharlesCity)中培养WISH细胞(ATCC,CCL-25)。通过将3x104个细胞接种到96孔细胞培养板(Corning,Netherlands)的孔来进行致细胞病变抑制测定，然后用1,500PFU/孔的VSV(ATCC,VR-158)进行处理。将重组IFN-p(WHO标准，NIBSC00/572)、thFc-l-AL(0)-IFN-卩和thFc-l-AL(3)-IFN-卩蛋白的连续稀释(以2倍从40IU/ml)的样品添加到这些孔并且将板在湿润的5%C02培养箱中在37'C温育48小时。在温育后，通过根据制造商的方法，使用细胞生长比色测定试剂盒(Sigma-Aldrich.Korea)进行MTT测定。如图7(e)中所说明，thFc-l-AL(3)-IFN-卩显示高于thFc-l-AL(O)-IFN-P约20倍的体外生物活性，这表明白蛋白类似物(albuminliker)对维持融合到Fc的IFN-卩的生物活性的重要作用。01800181〈实施例7〉纯化的hFc融合蛋白的体内半衰期0182为了比较EPO-hFc-l、EPO-hFc-5和Amnesp的半衰期，用这些蛋白以2,400IU/kg的剂量经由单次皮下(SC)注射或单次静脉(IV)注射对15只猕猴进行处理。在注射前和注射后l、3、6、12、24、30、48、54、72、78、96、120、168、336、504和672小时获得每只猴子的血液样品。将血液样品在室温下温育30min，以使其凝结。在以3000rpm离心10min后，获得每个样品的血清并且储存在深度冷冻器。将在每个点获得的所有样品通过EPOELISA试剂盒(R&D,cat#.DEP00)进行EPO的定量测定。如图8(a)所示，经由SC或IV途径注射EPO-hFc-l或EPO-hFc-5的所有猴子个体显示比经由SC或IV途径注射Aranesp⑧的猴子个体更长的半衰期。0183为了研究G-CSF-hFc-l的药代动力学，将100ug/kg的LEUCOSTIM(filgrastim,DongA,RepublicofKorea)作为对照禾口100ug/kg的G-CSF-hFc-l经由SC或IV途径施用给每组2只雄性SpragueDawley大鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington)。在注射前和注射后1、2、3、4、8、12、24、48、72、96、120禾口192小时获得血液。在室温下温育30min后，通过以3,000rpm离心lOmin获得血清，并且储存在深度冷冻器。使用G-CSF试剂盒(Biosource,Camarillo，#KHC2032)用几种稀释倍数诸如1/2、1/5、1/50、1/250、1/500对样品进行定量。如图8(b)中所示，经由SC或IV途径注射的G-CSF-hFc-l显示比LEUCOSTIM⑧更长的半衰期，在SC施用后，G-CSF-hFc-l和G-CSF分别具有8.76h和2.36h的体内tI/2，以及在IV施用后，分别具有10.42h禾n1.78h的体内t1/2。因此，与LEUCOST1M相比，G-CSF-hFc-l显示在SC注射后提高3.7倍以及在IV注射后提高5.9倍。0184为了研究p40N303Q-hFc-5禾卩Enbrel⑧的药代动力学，以100ug/kg的剂量用单次SC注射对每组3只猕猴进行处理。在注射前和注射后8、24、48、72、96、120、168、336、504和672小时获得每只猴子的血液样品。将血液样品室温下温育30min，以使其凝结。在以3000rpm离心10min后，获得每个样品的血清并且储存在深度冷冻器。通过ELISA试剂盒(分别为R&Dsystem,Minneapolis,#DY1240和弁DRT200)，对在每个点获得的所有样品进行人p40和人TOFRII的定量试验。如图8(c)中所示，p40N303Q-hFc-5显示比Enbre,长的半衰期(平均值为199h比127h)——尽管p40N303Q-hFc-5显示比Enbre吸低的Cmax值(平均值为3ng/ml比7ng/ml)。0185为了研究TNFR-hFc-5和Enbre,的药代动力学，以500ug/kg的剂量用单次SC注射对每组3只雄性SpragueDawley大鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington)进行处理。在注射前和注射后2、4、8、12、24、30、48、72和120小时获得每只大鼠的血液样品。将血液样品在室温下温育30min，以使其凝结。在以3,000rpm离心10min后，获得每个样品的血清并且储存在深度冷冻器。通过ELISA试剂盒(R&Dsystem,Minneapolis,#DRT200)对所有在每个点获得的样品进行人TNFRII的定量试验。如图8(d)中所示，TNFR-hFc-5显示略微高于Enbrel的AUC水平(平均值为198.1比172.9ug*h/ml)——尽管TNFR-hFc-5显示与Enbrel⑧类似的半衰期(平均值为28.6h比29.4h)。01860187<实施例8>纯化的hFc融合蛋白的体内生物活性0188为了比较EPO-hFc-5和Aranesp⑧的体内生物活性，以2,400IU/kg的剂量用单次IV注射对每组3只猕猴进行处理。在注射前和注射后l、3、6、12、24、30、48、54、72、78、96、120、168、336、504和672小时获得每只猴子的血液样品。测量包括网状细胞在内的各种血细胞的数量，以评价EPO-hFc-5和Aranesp的体内生物活性。如图9(a)中所示，在增加猴子网状细胞方面在SC和IV途径中，EPO-hFc-5均显示略微高于Aranesp⑧的体外效价。0189为了研究G-CSF-hFc-1的体内生物活性，将LEUCOSTIM⑧(filgrastim,DongA，RepublicofKorea)作为对照和G-CSF-hFc-1以100ug/kg的剂量经由SC或IV途径施用给每组两只雄性SpragueDawley大鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington)。在注射前和注射后1、2、3、4、8、12、24、48、72、96、120禾口192小时，使用EDTA管获得血液。将每个血液样品用RBC裂解液(BDBioscience,Korea)处理4分钟并且使用血细胞计数器将稀释在FACS缓冲液中的全部WBC(白细胞)重复计数三次。使用FACS仪通过利用FSC(前向散射，forwardscatter)测定细胞大小和利用SSC(侧向散射，sidescatter)测定颗粒来测量粒细胞数。如图9(b)中所示，经由SC和IV途径处理的LEUCOSTIM⑧在注射后24小时引起WBC和粒细胞的峰值数，而G-CFS-hFc-l在SC注射后72小时和IV注射后48小时引起WBC和粒细胞的峰值数。从注射后24h至120h，与LEUCOSTIM⑧相比，G-CSF-hFc-l具有更加持久的体内生物活性。01900191尽管通过参考其示例性的实施方式已经对本发明进行了具体的显示和描述，但是本领域的普通技术人员应理解其中可以进行形式上和详细的多种改变，而不背离下列权利要求所限定的本发明的精神和范围。0192工业应用性0193本发明公开了包含生物活性分子和连接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc结构域的融合蛋白。所述Fc结构域为(i)IgGl、IgG2或IgG4或(ii)IgG4和IgD的杂交人Fc结构域。杂交Fc被用作生物活性分子的载体。权利要求1.由下式表示的多肽N′-(Z1)p-Y-Z2-Z3-Z4-C′其中N′是所述多肽的N-端和C′是所述多肽的C-端；Z1是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO11或(ii)SEQIDNO14的90到98位置的氨基酸残基的至少C-端部分；Y是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO11的99到113位置或(ii)SEQIDNO14的99到162位置的氨基酸残基的至少C-端部分；Z2是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO12的111到147位置或(ii)SEQIDNO14的163到199位置的氨基酸残基的至少N-端部分；Z3-Z4是选自下列的氨基酸序列(i)由在SEQIDNO11的118到223位置的氨基酸残基的C-端部分和在SEQIDNO11的224到330位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(ii)由在SEQIDNO12的114到219位置的氨基酸残基的C-端部分和在SEQIDNO12的220到326位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，(iii)由在SEQIDNO24的165到270位置的氨基酸残基的C-端部分和在SEQIDNO24的271到377位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列，以及(iv)由在SEQIDNO13的115到220位置的氨基酸残基的C-端部分和在SEQIDNO13的221到327位置的氨基酸残基的N-端部分组成的连续氨基酸序列；以及p是0或1的整数，其中Z2和Z3的氨基酸残基总数在80到140之间，两端数值包括在内；以及其中多肽的氨基酸残基总数在154到288之间，两端数值包括在内。2.权利要求1所述的多肽，其中Zl是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO:11或(ii)SEQIDNO:14的卯-98位置的所述氨基酸残基的5至9个连续氨基酸残基。3.权利要求2所述的多肽，其中Zl是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO:11或(ii)SEQIDNO:14的90至98位置的氨基酸残基。4.权利要求l所述的多肽，其中Z1是氨基酸序列，其由在(i)SEQIDNO:11或(ii)SEQIDNO:14的卯至98位置的5至9个氨基酸残基组成。5.权利要求4所述的多肽，其中Z1是氨基酸序列，其由(i)SEQIDNO:11或(ii)SEQIDNO:14的90至98的所述氨基酸残基组成。6.权利要求1所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO:11的99至113位置或(ii)SEQIDNO:14的99至162位置的所述氨基酸残基的10个或更多个连续氨基酸残基。7.权利要求6所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的99至113位置的氨基酸残基，在SEQIDNO:14的158至162位置的氨基酸残基，在SEQIDNO:14的153至162位置的氨基酸残基，在SEQIDNO:14的143至162位置的氨基酸残基，在SEQIDNO:14的133至162位置的氨基酸残基或在SEQIDNO:14的99至162位置的氨基酸残基。8.权利要求1所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO:12的111至147位置或(ii)SEQIDNO:14的163至199位置的所述氨基酸残基的4至37个连续氨基酸残基。9.权利要求1所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在(i)SEQIDNO:12的111至147位置或(ii)SEQIDNO:14的163至199位置的所述氨基酸残基的6至30个连续氨基酸残基。10.权利要求1所述的多肽，其中Z2和Z3的氨基酸残基总数在90和120之间，两端数值包括在内，或105和115之间，两端数值包括在内。11.权利要求1所述的多肽，其中Z4是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:13的221至327位置的所述氨基酸残基的90个或更多个，或100个或更多个连续氨基酸残基。12.权利要求ll所述的多肽，其中Z4是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:13的221至327位置的所述氨基酸残基。13.根据权利要求1所述的多肽，其中Zl是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的94至98位置的所述氨基酸残基。14.根据权利要求1所述的多肽，其中Zl是氨基酸序列，其由在SEQIDNO:11的90至98位置的所述氨基酸残基组成。15.根据权利要求13所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的109至113位置的所述氨基酸残基。16.根据权利要求15所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其由在SEQIDNO:11的99至113位置的所述氨基酸残基组成。17.根据权利要求15所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:12的111至114位置的所述氨基酸残基。18.根据权利要求15所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:12的111至116位置的所述氨基酸残基。19.根据权利要求1所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的99-113位置的所述氨基酸残基的至少一部分，以及其中p是0(零)。20.根据权利要求19所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:12的111-116位置的所述氨基酸残基。21.根据权利要求1所述的多肽，其中Z3是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:13的150至220位置的所述氨基酸残基。22.权利要求21所述的多肽，其中Z3包括SEQIDNO:13的115-220位置的所述氨基酸残基的71至106个连续氨基酸残基。23.权利要求22所述的多肽，其中Z2和Z3的所述氨基酸残基总数为109。24.权利要求23所述的多肽，其中Z2是在SEQIDNO:12的111-116位置的所述氨基酸残基的氨基酸序列以及Z3是在SEQIDNO:13的118至220位置的所述氨基酸残基的氨基酸序列。25.根据权利要求1所述的多肽，其中Zl是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的94至98位置的所述氨基酸残基。26.根据权利要求25所述的多肽，其中Z1是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的90至98位置的所述氨基酸残基。27.根据权利要求25所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的158-162位置的所述氨基酸残基。28.根据权利要求27所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的133-162位置的所述氨基酸残基。29.根据权利要求28所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的99-162位置的所述氨基酸残基。30.根据权利要求29所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的163至166位置的所述氨基酸残基。31.根据权利要求27所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的163至168位置的所述氨基酸残基。32.根据权利要求l所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的99至162位置的所述氨基酸残基的至少一部分以及p是0(零)。33.根据权利要求32所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的163至199位置的所述氨基酸残基的至少一部分。34.根据权利要求25所述的多肽，其中Y是下列氨基酸序列在SEQIDNO:14的99-162位置的所述氨基酸残基的20个连续氨基酸残基或更多个、30个连续氨基酸残基或更多个、40个连续氨基酸残基或更多个、50个连续氨基酸残基或更多个、或60个连续氨基酸残基或更多个。35.根据权利要求33所述的多肽，其中Z2是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:14的163至170位置的所述氨基酸残基。36.根据权利要求33所述的多肽，其中Z3是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:13的121至220位置的所述氨基酸残基。37.权利要求36所述的多肽，其中Z3是氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:13的121-220位置的所述氨基酸残基的71至100个连续氨基酸残基。38.根据权利要求37所述的多肽，其中Z2和Z3的所述氨基酸残基的所述总数为108。39.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27的核苷酸序列编码。40.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有选自SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的氨基酸序列。41.根据权利要求40所述的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:18的所述氨基酸序列。42.根据权利要求40所述的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:22的所述氨基酸序列。43.根据权利要求40所述的多肽，其中所述多肽具有SEQIDNO:23的所述氨基酸序列。44.嵌合多肽，其包括权利要求1所述的多肽和生物活性分子，其中所述生物活性分子被融合在权利要求1所述的多肽的N-端或C-端，以及其中所述生物活性分子显示与所述生物活性分子的天然形式的循环半衰期相比增加的循环半衰期。45.根据权利要求44所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是可溶性蛋白。46.根据权利要求45所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是激素、细胞因子、生长因子、共刺激分子、激素受体、细胞因子受体、生长因子受体或短肽。47.根据权利要求46所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是EPO或其变体/片段。48.根据权利要求46所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是p40、TNF受体或它们的变体/片段。49.根据权利要求48所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是p40变体，所述p40变体包含Asn303Gln置换。50.根据权利要求46所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是G-CSF或其变体/片段。51.根据权利要求46所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是GM-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL陽6、IL-7、IL-8、人生长激素、骨形态发生蛋白-1、干扰素-a、IL-IO、FSH、因子VII、CTLA4、IFN-卩、PD-1、IL-10R、CXCL-ll、TGF-卩受体、TGF-卩、IL-17R、GLP-1、BTC、OPG、RANK或它们的变体/片段。52.根据权利要求44所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是分泌性蛋白。53.根据权利要求52所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是所述分泌性蛋白的成熟形式。54.根据权利要求46所述的嵌合多肽，其中所述生物活性分子是抗体的Fab区。55.根据权利要求44所述的嵌合多肽，其中所述多肽和所述生物活性分子经由连接体彼此偶联。56.根据权利要求55所述的嵌合多肽，其中所述连接体是白蛋白连接体或合成的连接体。57.根据权利要求56所述的嵌合多肽，其中所述连接体分子是白蛋白连接体。58.根据权利要求57所述的嵌合多肽，其中所述白蛋白连接体包含SEQIDNO:25的321至323、318至325、316至328、313至330、311至333或306至338的氨基酸序列。59.根据权利要求56所述的嵌合多肽，其中所述合成的连接体是10至20个氨基酸残基的肽，其中所述肽由Gly和Ser残基组成。60.根据权利要求59所述的嵌合多肽，其中所述Gly-Ser连接体是GGGGSGGGGSGGGSG(SEQIDNO:32)。61.产生根据权利要求1所述的多肽的方法，其中所述方法包括下列步骤(i)将编码所述多肽的DNA分子引入哺乳动物宿主细胞，(ii)将所述细胞在其培养基中在所述多肽可以被表达的条件下生长；以及(Hi)收获所表达的多肽。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是CHO、COS或BHK细胞。63.(i)减少自身免疫性疾病的症状、预防或治疗自身免疫性疾病，(ii)抑制移植排斥，或(iii)治疗或预防内毒素诱发的休克的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求44、48、或49或94中任意一项所述的嵌合多肽。64.根据权利要求63所述的方法，其中所述嵌合多肽经静脉内、皮下、经口、经颊、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经由肺部途径施用。65.(i)治疗、(ii)预防或(iii)改善风湿性关节炎、强制性脊柱炎、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、遗传性过敏症、骨关节炎或骨质疏松症的症状的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求44、48、或49或94中任意一项所述的嵌合多肽。66.根据权利要求65所述的方法，其中所述嵌合多肽经静脉内、皮下、经口、经颊、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经由肺部途径施用。67.(i)治疗、(ii)预防或(iii)改善在骨髓移植、急性白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、严重的慢性嗜中性白细胞减少症或用于移植的外周血干细胞活化后化学疗法诱发的嗜中性白细胞减少症骨髓抑制的症状的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求44或50所述的嵌合多肽。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述嵌合多肽经静脉内、皮下、经口、经颊、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经由肺部途径施用。69.(i)提高或(ii)维持哺乳动物血细胞比容水平的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求44或47所述的嵌合多肽。70.根据权利要求69所述的方法，其中所述嵌合多肽经静脉内、皮下、经口、经颊、舌下、经鼻、肠胃外、直肠、阴道或经由肺部途径施用。71.根据权利要求70所述的方法，其中所述嵌合多肽经皮下或静脉施用。72.分离的核酸分子，其编码根据权利要求44所述的嵌合多肽。73.根据权利要求72所述的核酸分子，其中所述嵌合多肽具有选自SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的氨基酸序列。74.根据权利要求73所述的核酸分子，其中所述核酸分子是选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27的核酸分子。75.根据权利要求72至74中任意一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包括信号序列或前导序列。76.根据权利要求75所述的核酸分子，其中所述信号序列是tPA信号序列。77.表达载体，其包括根据权利要求72所述的核酸分子。78.根据权利要求77所述的表达载体，其中所述表达载体选自pADllEPO-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp標303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADllp40N303Q-hFc-6、pADllEPO-hFc-5、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc-5和pADllTNFR-hFc-5。79.宿主细胞，其包括根据权利要求77所述的表达载体。80.宿主细胞，其包括根据权利要求79所述的表达载体。81.向哺乳动物递送生物活性分子的方法，其包括向需要其的哺乳动物施用根据权利要求72所述的核酸的步骤。82.根据权利要求44所述的多肽，其中所述生物活性分子不属于免疫球蛋白家族。83.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽缺少抗体的可变区、VH和84.多肽，其包括Fc结构域，所述Fc结构域在N-端至C-端方向上由铰链区、CH2结构域和CH3结构域组成，其中所述铰链区包括人IgD铰链区或人IgGl铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分——除在所述CH2结构域的N-端的4-37个连续氨基酸残基包括人IgG2CH2结构域或人IgDCH2结构域的相应N-末端区的氨基酸残基之外，以及所述CH3结构域包括人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4CH3结构域的氨基酸残基的至少一部分。85.根据权利要求84所述的多肽，其中所述铰链区包括所述人IgGl铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括所述人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分——除在所述CH2结构域的N-端的4-37个氨基酸残基包括所述人IgG2CH2结构域的相应的N-端的氨基酸残基之外。86.根据权利要求84所述的多肽，其中所述铰链区包括所述人IgD铰链区的氨基酸残基的至少一部分，所述CH2结构域包括所述人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4CH2结构域的氨基酸残基的至少一部分——除在所述CH2结构域的N-端的4-37个氨基酸残基包括所述人IgDCH2结构域的相应的N-端的氨基酸残基之外。87.根据权利要求85所述的多肽，其中所述多肽进一歩包括CH1结构域，其中所述CH1结构域包括所述人IgGlCH1结构域的氨基酸残基的至少一部分，以及其中所述CH1结构域偶联到所述铰链区的N-端。88.根据权利要求86所述的多肽，其中所述多肽进一歩包括CH1结构域，其中所述CH1结构域包括所述人IgDCH1结构域的氨基酸残基的至少一部分，以及其中所述CH1结构域偶联到所述铰链区的N-端。89.嵌合多肽，其包括权利要求84所述的多肽和生物活性分子，其中所述生物活性分子融合在权利要求84所述的多肽的N-端或C-端，以及其中所述生物活性分子显示与所述生物活性分子的天然形式的循环半衰期相比增加的循环半衰期。90.根据权利要求84所述的多肽，其中所述多肽包括选自SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29的氨基酸序列。全文摘要本发明公开包括生物活性分子和连接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc结构域的融合蛋白。该Fc结构域是(i)IgG1、IgG2或IgG4，或(ii)IgG4和IgD的杂交人Fc结构域。该杂交Fc用作生物活性分子的载体。文档编号A61K38/16GK101687933SQ200880016313公开日2010年3月31日申请日期2008年5月30日优先权日2007年5月30日发明者成永喆,梁世焕申请人:浦项工科大学校产学协力团;格纳西尼有限公司