副百日咳杆菌全菌体疫苗组合物的制作方法

专利名称：副百日咳杆菌全菌体疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有以副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物为免疫
原的、用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物及其制造方法。本发 明还涉及一种副百日咳引起的百日咳的预防方法，其包括向对象给药副百日咳杆菌的全菌 体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。
背景技术：
百日咳(whooping cough， pertussis)是一种以咳嗽为主要症状的呼吸器官 传染病，其由感染百日咳杆菌(Bordetella pertussis)或副百日咳杆菌(Bordetella parapertussis)而引起。如其病名，患者表现出长期(2周 数月)的咳嗽发作。由于由百 日咳杆菌引起的百日咳占较大比例，因此以百日咳杆菌为靶的疫苗得到很好开发，目前市 场上已有有效且安全的百日咳疫苗，百日咳的患者人数、死者人数都大大地减少了 。
副百日咳杆菌和百日咳杆菌属于博德特杆菌(Bordetella)属，均为以人为宿主 的需氧性菌。两种细菌产生的致病因子(腺苷酸环化酶毒素、坏死毒素、气管细胞毒素、丝 状血凝素等)具有非常高的同源性，其致病机理也被认为基本相同。营养需求性也类似，最 适培养条件也基本相同。两种细菌的不同之处在于百日咳毒素的产生(仅百日咳杆菌产 生)，这可能与百日咳杆菌的流行优势性相关。 根据近年的调查，由副百日咳杆菌的感染引起的百日咳在其严重性方面，与百日 咳杆菌引起的百日咳没有很大区别，并且也广泛分布于世界范围内。另一方面，尽管副百日 咳杆菌与百日咳杆菌具有非常高的相似性，但已清楚目前的百日咳疫苗(由百日咳杆菌制 造)对副百日咳杆菌几乎或完全没有效果(非专利文献1 3)。另外，虽然由感染治愈获 得的自然免疫引起交叉反应，但据报告已知的疫苗并不引起对两种细菌的交叉防御(非专 利文献3 5)。该结果强烈地暗示，当通过进一步推进采用已知的疫苗对百日咳杆菌的控 制来减少自然环境中分布的百日咳杆菌时，很有可能助长副百日咳杆菌的流行。
目前，虽然以博德特杆菌的突变株为免疫原的疫苗(专利文献1)、属于在副百日 咳杆菌中表达的外膜蛋白且与百日咳杆菌粘附素相关的疫苗等的研究正在进行中(专利 文献2)，但实际上它们对副百日咳杆菌引起的百日咳的效果并不明确，能够有效地防御由 副百日咳杆菌感染引起的百日咳的疫苗尚未为人所知。另外，对副百日咳杆菌运用有效的 疫苗评价体系也非常困难，到目前为止尚未成功。 此外，关于全菌体疫苗的新开发，如针对志贺氏菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、疟疾等 很多病原体的开发以失败而告终那样，在全菌体百日咳杆菌疫苗的开发、制造中，制成有效 的疫苗是非常困难的(非专利文献6)。 由以上内容可知，正在努力开发能够高效地控制副百日咳杆菌的活性的疫苗。
另外，与本申请的发明相关的现有技术文献信息如下所示。
专利文献1 :日本注册2655583
专利文献2 :日本特表2003-533990
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非专利文献1 :Liese， J. G. et al. Arch Dis Chid 88(8) :684-687,2003
非专利文献2 :Mastrantonio， P. et al. Dev Biol Stand 89 :255—259， 1997
非专利文献3 :Watanabe， M. and Nagai， M. Expert Rev Anti-infect Ther 2(3): 447-454,2004 非专利文献4 :Khelef ， N. et al. Infect I匪n 61 (2) :486-490， 1993
非专利文献5 :Watanabe，M. and Nagai，M. Infect I匪n 69(11) :6981-6986,2001
非专利文献6-Griffiths, E. In Pathogenesis and Immunity in Pertussis. P.354-355. 1988

发明内容
本发明是鉴于上述情况而完成的发明，本发明的目的在于提供含有以副百日咳杆 菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物为免疫原的、用于预防副百日咳杆菌引起的百 日咳的全菌体细菌疫苗组合物及其制造方法。 另外，本发明的目的还在于提供一种副百日咳引起的百日咳的预防方法，其包括 向对象给药副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。
由于副百日咳杆菌的活菌的毒性高，不能直接进行接种，因此需要将细菌产生的 各种各样的毒素灭活(inactive)。但是，确定灭活的条件非常困难，虽然在一般的高浓度灭 活剂等强烈的条件下能够完全破坏细菌的毒性，但是也同时失去了作为疫苗的效力。而在 低浓度灭活剂等较弱的条件下，疫苗的效力有增高的倾向，但是细菌的毒性残留，有可能使 得疫苗本身是有害的，例如导致接种动物死亡等。在全菌体疫苗、特别是在由与副百日咳杆 菌相关的百日咳杆菌制作的全菌体型百日咳疫苗中，为了将其毒性灭活，使用约0. 5%甲醛 进行灭活，但是在该条件下，无法制备有效的副百日咳疫苗。 本发明的发明人为了解决上述课题，进行了深入研究。百日咳杆菌具有被称为百 日咳毒素的强有力的毒素，该毒素与疫苗的副作用和毒性相关。但是，由于副百日咳杆菌不 具有百日咳毒素，因此认为副百日咳杆菌菌体的毒性低。另外，本发明的发明人发现，在小 鼠实验体系中，副百日咳杆菌比百日咳杆菌被更早地从生物体内排除(图6)。因此认为，是
否即使降低福尔马林浓度来制备疫苗，也能够制作不显示毒性的有效的疫苗。 具体而言，首先，将副百日咳杆菌在37t:的条件下培养3天，然后将菌体浓度调节
至101Q细胞/mL，添加甲醛溶液，并使甲醛的最终浓度达到0. 2%来进行灭活。加入灭菌磷
酸缓冲生理盐水，并将该菌体调节至以菌体浓度换算计为101Q细胞/mL，从而得到疫苗组合物。 将该疫苗组合物每个0. 125mL(相当于1/4人单次接种量，SHD)皮下接种给小鼠 (3.5周龄)，然后在其14天后进行追加接种(等量)。追加免疫的14天后，在戊巴比妥麻 醉下将副百日咳杆菌悬浮液(以活菌浓度计为约108CFU/mL，50i!L/小鼠)经鼻感染，结果 接种了本发明疫苗组合物的小鼠与未接种疫苗的阴性对照组的小鼠相比，可见肺内活菌数 降低，表明感染防御活性高。此外，对疫苗组合物的接种用量进行了研究，结果表明即使使 用通常的百日咳疫苗接种量的1/30，也显示对副百日咳杆菌的感染防御活性。
也就是说，本发明的发明人通过成功地制造对副百日咳杆菌具有感染防御活性 的、含有以副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物为免疫原的、用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物，从而完成了本发明。
更具体而言，本发明提供下述(1) (12)的技术方案。 (1) —种用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物，其含有 副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物作为免疫原。
(2)根据(1)所述的疫苗组合物，其中，抗原为通过下述工序(a)和(b)得到的抗原。 (a)将副百日咳杆菌在37t:下培养1 3天、从而制造最终菌体浓度达到101Q细 胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序。
(3)根据(1)所述的疫苗组合物，其中，抗原为通过下述工序(a)和(b)得到的抗原。 (a)将副百日咳杆菌在37t:下、以丝状血凝素(FHA)量为指标进行培养、从而制造 最终菌体浓度达到101Q细胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序。 (4)根据(2)或(3)所述的疫苗组合物，其特征在于，副百日咳杆菌的灭活是利用 含有最终浓度为0. 1 0. 2%的甲醛的福尔马林溶液来进行的。 (5)根据(1) (4)中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，副百日咳杆菌为抗 生素抗性突变株(antibiotic resistant mutant)。 (6)根据(1) (5)中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，在疫苗制剂的最终 菌体浓度为101Q细胞/mL的情况下，对小鼠的有效给药量为0. 100mL/kg体重 3mL/kg体重。
(7)根据(1) (5)中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，在疫苗制剂的最终 菌体浓度为101Q细胞/mL的情况下，对人的单次接种的有效给药量为0. 02mL 0. 5mL。
(8)根据(1) (7)中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，将其给药1次或多 次。
(9) —种疫苗组合物的制造方法，其包括下述工序(a) (c)。 (a)将副百日咳杆菌在37t:下培养1 3天、从而制造最终菌体浓度达到101Q细
胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序。
(c)将已灭活的全菌体副百日咳杆菌与医药上可容许的添加物混合的工序。
(10) —种疫苗组合物的制造方法，其包括下述工序(a) (c)。
(a)将副百日咳杆菌在37t:下、以丝状血凝素(FHA)量为指标进行培养、从而制造 最终菌体浓度达到101Q细胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序； (c)将已灭活的全菌体副百日咳杆菌与医药上可容许的添加物混合的工序。
(11) —种预防副百日咳杆菌引起的百日咳的方法，其包括向对象给药副百日咳杆 菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。 (12) —种诱导对象产生对副百日咳杆菌的免疫的方法，其包括向对象给药副百日 咳的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。


图1为表示副百日咳杆菌的培养时间与菌体浓度和丝状血凝素的有无之间的 关系的图。将副百日咳杆菌按照达到10亿/mL的方式悬浮到添加有酪蛋白氨基酸的 Stainer-Scholte液体培养基中，取其中的10mL放入75cm2培养烧瓶中，在37。C下静置培 养。回收培养24、48、72、96和120小时后的培养液，测定细菌浓度和红细胞凝集活性(FHA 活性，用作致病因子产生指标)。副百日咳杆菌增殖到72小时后，可见由其后溶菌导致的细 菌浓度的减少。将培养液稀释100倍得到的试样中的FHA活性可在24 72小时后检出， 其后消失。从以上结果来看，作为疫苗材料最适的培养时间为72小时。
图2为表示使用小鼠经鼻感染实验体系来测定各疫苗对副百日咳杆菌的效果的 结果的图。具有感染防御效力的疫苗与未接种疫苗组(黑圈，未接种)相比，肺内的副百日 咳杆菌活菌数受到抑制。已知的百日咳疫苗(黑方块)和百日咳杆菌全菌体疫苗(黑三角) 与未接种疫苗组之间未见显著性差异。另一方面，副百日咳杆菌疫苗(白圈，v丽l)的肺内 活菌数在统计学上显著地降低，显示出作为疫苗的效力。相对于*:阴性对照组(None)，具 有显著性差异(P < 0. 05)。 图3为表示小鼠的副百日咳杆菌疫苗的剂量反应关系的图。表示将小鼠经鼻感染 实验体系中的通常接种量(0. 125mL)作为l，在接种该量的1/3(0. 3剂量)、1/10(0. l剂量) 和1/30 (0.03剂量)的组中，感染后第5天的肺内活菌数。图中，仅表示0.3、0. 1和0.03 剂量的数据。未接种疫苗组中的肺内活菌数为约l(fCFU(7.03士0.02(Log CFU/肺))，与此 相对，在图中所示的全部接种用量中，均检出了作为疫苗的效果。另外，图下表示在小鼠的 数据和在人时与其对应的接种量(根据相关性来予测)。可预测当将该疫苗接种给人时，以 0. 02 0. 5mL的量接种将显示出效果。 图4为表示用SDS-PAGE法分析副百日咳疫苗中所含的蛋白质的结果的照片。 SDS-PAGE使用Bio-Rad公司制的ReadyGelJ，染色使用该公司的Biosafe Coomassie液。 加载小鼠的单次接种量(10"细胞/mL，0. 125mL)和该量的约30倍量(按每kg小鼠体重换 算)，进行分析，结果得到如图所示的图形。显示分子量为约70kDa的百日咳杆菌粘附素在 任一区带均未检出。 图5为表示进行以确认是否引起了针对百日咳杆菌粘附素的免疫应答反应为 目的的Western blotting解析的结果的照片。将由百日咳杆菌精制的百日咳杆菌粘附 素(与副百日咳杆菌具有共通的抗原性)3ii g进行SDS-PAGE，从展开后的凝胶转印到硝 酸纤维素膜上。作为一次抗体，使用接种了副百日咳疫苗并诱导了疫苗的效果的小鼠的 血清(1000倍稀释)。作为二次抗体，使用稀释了 5000倍的碱性磷酸酶标记的抗小鼠 IgG(JacksonlmmunoResearch laboratory, U. S. A.)，按照通常的方法，用NBT/BCIP尝试检 测结合于百日咳杆菌粘附素的小鼠抗体。若百日咳杆菌粘附素抗体存在，则在约70kDa的 位置处能够检出黑色的条带(2区带，对照)，但结果中并未检出这样的抗体(4区带)。从
6该结果可知，副百日咳疫苗几乎不诱导百日咳杆菌粘附素抗体。 图6为表示将百日咳杆菌(黑圈)或副百日咳杆菌(白方块)经鼻感染给未接种 疫苗的小鼠，研究其后肺内活菌数的消长情况的结果的图。从该结果可知，与百日咳杆菌相 比，副百日咳杆菌被清除得稍快。由此可推测，与百日咳杆菌相比，副百日咳杆菌的病原性 更低。
具体实施例方式
本发明涉及一种用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物，
其含有副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物作为免疫原。 本发明的副百日咳杆菌疫苗制剂是通过将细菌抗原培养和收集后，按照后文中说
明的制法灭活抗原而制造的。 在本发明中，作为培养所使用的菌株，可以将副百日咳杆菌的野生株或临床分离
株等纯化后使用，或者也可以使用这些菌种的人工突变株。作为菌种，优选副百日咳杆菌
(Bordetella par即ertussis)，更优选该菌种中的野生分离株23054株。 本发明中使用的菌株还可以是抗生素抗性突变株。使用抗生素抗性突变株时，可
以通过在培养时向培养基中添加抗生素，从而阻止其他的杂菌混入。作为抗生素，只要是本
领域技术人员公知的抗生素，则没有特殊限制，但优选可列举出萘啶酸或链霉素、更优选可
列举出链霉素。 作为本发明中可使用的菌株的具体例子，可列举出使野生分离株23054株适应含
链霉素的培养基后得到的突变株。该突变诱导和选择是本发明的发明人通过北里研究所进
行的。由于该突变体为野生分离株，保持着病原性，并且由于链霉素抗性突变，因此即使在
数日的长期培养中也能够避免杂菌混入，因此优选作为本发明使用的菌株。 副百日咳杆菌23054株的链霉素抗性突变株BPP23054SMR已由本申请的申请人如
下进行了保藏。 (a)保藏机构的名称、地址 名称独立行政法人製品評価技術基盤机构 特許微生物寄託七 > 夕一 (NPMD)
地址日本国千葉果木更津市力'f S鎌足2-5-8 (郵便番号292-0818)
(b)原保藏日2007年5月8日
(c)保藏编号NITE BP-356 在本发明的疫苗组合物中，抗原可以通过下述工序(a)和(b)得到。 (a)将副百日咳杆菌在37t:下培养1 3天、从而制造最终菌体浓度达到101Q细
胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序。 另外，在本发明的疫苗组合物中，抗原可以通过下述工序(a)和(b)得到。 (a)将副百日咳杆菌在37t:下、以丝状血凝素(FHA)量为指标进行培养、从而制造
最终菌体浓度达到101Q细胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序； (b)向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的 工序。
下面对在本发明的疫苗制剂的制造方法中培养副百日咳杆菌以制造副百日咳杆 菌培养制备物的工序进行说明。 在本发明中，当将副百日咳杆菌作为菌种进行培养时，将该菌体涂布到 Bordet-gengou培养基上，在37"C下培养3天。从形成的集落将显示溶血环的再涂布到炭 粉琼脂培养基上，在37t:下培养1天。其后，为了增菌，进一步在炭粉琼脂培养基中传代， 在37t:下培养3天(1 3天)。其中，当连续培养副百日咳杆菌时，由于溶菌会导致增殖 减少，因此优选在溶菌发生前回收菌体。 另外，优选作为免疫原使用的副百日咳杆菌菌体具有病原性。具有病原性的副百 日咳杆菌例如可以以作为致病因子的丝状血凝素(FHA)的量为指标来进行回收。FHA是否 存在可以采用本领域技术人员公知的方法，利用研究培养液中的红细胞凝集反应来确认。
本发明的疫苗制造中使用的培养基只要是适于菌体增殖的组成，则不限于上述 培养基，任何组成均可使用。培养基中可以含有碳源、氮源、磷酸源、微量金属等。作为优 选的培养基的组成，可列举出实施例中记载的培养基。另外，上述培养基也可以使用市售 制品。若对作为市售的培养基的可用于副百日咳杆菌的培养的培养基进行举例，更优选 Bordet-Gengouagar base禾口 Charcoal ager(均来自Beckton， Dickinson, and Company, U. S.A.)等，但并不限于这些。 此外，培养基中还可以加入离子交换树脂、环糊精等用于吸附除去百日咳杆菌和 副百日咳杆菌的增殖抑制物质的添加物。 在本发明的菌体的培养中，培养容器可以使用玻璃容器、不锈钢容器、塑料容器、 市售的发酵槽等。 本发明的细胞培养中的培养温度通常为35 37t:，特别优选为37°C。 本发明的副百日咳杆菌培养中的pH范围通常为7 7. 5，对该pH没有特别限定，
只要在菌体不会死亡的酸性或碱性条件下均能够进行培养。 对副百日咳杆菌进行增菌时，根据需要测定副百日咳杆菌的菌数，以确认培养的 进度。菌数的测定可以通过在短期培养后用波长为650nm下的吸光度或浊度来进行测定。 最近也可以以使用定量PCR的DNA复制数来测定。副百日咳杆菌的培养、集菌、洗涤、纯化 操作必须在能够严密密封的环境下实施。通常需要日本国立传染病研究所规定的生物学安 全性级别2(BSL2)的环境。 在制造副百日咳杆菌培养制备物的工序中，采用上述方法培养生成后，要对全菌
体抗原进行洗涤、纯化、浓縮。下面对洗涤、纯化、浓縮的方法进行说明。 培养结束后、将菌体利用添加有食盐的磷酸缓冲液等进行洗涤、纯化。纯化可以使
用洗涤法、离心法、搅拌法、浓縮法、柱法等，但并不限定于这些。 关于洗涤、纯化、浓縮的时期，优选在灭活前实施，但也可以在灭活后实施。也可以 在灭活前后均实施。 下面对在本发明的疫苗制造方法中向副百日咳杆菌培养制备物等中添加灭活剂 以灭活副百日咳杆菌培养制备物等的工序进行说明。 抗原的灭活可以使用各种各样的方法，一般来说，最合适的灭活方法根据抗原是 全菌体还是蛋白质的不同而不同。灭活可以采用各种各样的化学品处理和物理化学的处理 方法来实施。若举出其中的一个例子，可以包括以下情况，但并不限定于这些。
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可以列举出下述物质来作为在以灭活为目的进行的菌体处理中使用的化学处理 物质。同时举出了可使用的浓度，但并不限定于这些。 甲醛(0. 04 4% )、苯酚(0. 1 5v/v% )、氯仿(10 60v/v% )、丙酮(10 80v/v% ) 、 SH试齐U (1 100mM)、过氧化氢(0. 1 5% )、过氧乙酸(0. 5 10w/v% ) 、二 氧化碳(5 90v/v% )、臭氧(0. 1 10v/v% )、表面活性剂(0. 01 5w/v% )。
另外，用于灭活的物理化学处理方法可以使用下述手段。下面同时举出了可使用 的条件的一个例子，但并不限定于这些。 加热处理(温度为30 7(TC;加热时间为10 120分钟)、Y射线照射(射线源 钴60 ;5 50kGy (千戈瑞))、激光照射(光源各种激光照射装置；波长为500 700mn ; 光量为0.01 lJ(焦耳)/cm2);电子射线照射(微波炉)、超声波照射等。
处理条件不是固定不变的，可以改变菌体量、温度、缓冲液的pH、处理时间等来设 定最适条件。通常在无菌条件下进行操作。 这些灭活方法可以单独使用，也可以多种方法组合使用。灭活时，通过使氨基酸、 胺类共存，有时能够改善灭活后的品质的稳定性，根据需要也可以添加这些物质。另外，除 了福尔马林灭活外，通过实施有机溶剂处理、加热处理、Y射线照射处理，能够得到难以发 生溶菌的品质稳定的灭活全菌体。 由于百日咳杆菌在低浓度甲醛下进行灭活处理时菌体的毒性残留，因此到目前为 止通常均是用高浓度进行灭活处理。即使在高浓度甲醛下进行灭活处理的情况下，百日咳 杆菌也显示作为疫苗的有效性，但当副百日咳杆菌在高浓度甲醛下进行灭活处理时会失去 作为疫苗的效果，因此到目前为止副百日咳杆菌利用甲醛的灭活处理是困难的。
本发明的发明人着眼于副百日咳杆菌不具有百日咳毒素、且与百日咳杆菌相比毒 性较低(图6)的情况，通过在适当条件下进行低浓度甲醛处理，初次成功地制备了毒性低 且显示作为疫苗的有效性的疫苗组合物。表1表示改变甲醛浓度制备的疫苗的有效性和毒 性。 表1
疫苗灭活时的甲醛浓度(％)效力小鼠致死率
百日咳杆菌0不清楚100% (5/5)
0. 2+25% (1/4)
0. 6+0% (5/5)
副百日咳杆菌0不清楚50% (2/4)
0. 2+0% (0/3)
0. 60% (0/4) 关于疫苗的效力，在呼吸道感染实验体系(喷雾感染实验体系或经鼻感染实验体
9系)中，将未接种疫苗组和接种疫苗组之间检出具有显著性差异(P<0.05)的情况作为
<formula>formula see original document page 10</formula> 关于小鼠致死率，记录接种疫苗所导致的每个实验组的小鼠死亡数。
作为本发明中使用的优选的灭活条件，可列举出下述的弱条件。首先，向副百日咳 杆菌活菌悬浮液中加入甲醛以使其最终浓度达到0. 2%，在4t:下静置1 5天、优选3天， 进行灭活。其后，在5000rpm下离心10分钟，除去上清后，悬浮到等量的添加有生理盐水的 磷酸缓冲液(0.01M，pH为7.2)，制备灭活的副百日咳杆菌悬浮液。灭活的完成可以通过在 灭活处理后取出试样的一部分、培养后没有细菌生长来进行确认。灭活处理后，用磷酸缓冲 液等进行洗涤以除去灭活中使用的化学药品。然后，调节菌数至约1 1X10"细胞/mL左 右。在本发明中，优选约1Xl(T细胞/mL的菌体浓度。 将上述副百日咳杆菌悬浮液或抗原蛋白液依次以规定量(例如0. 5mL、1. OmL、 10mL)分注到小瓶或注射器中来制造疫苗。 副百日咳疫苗的一般组成如下所例示，但疫苗制剂组成并不限定于下述组成。 抗原灭活全菌体副百日咳杆菌，菌体浓度为1X10"细胞/mL 缓冲液添加有食盐的0. 01M磷酸缓冲液 pH:7.0 渗透压l 容量0.6mL 防腐剂山梨糖醇2%、乳糖5% 本发明的疫苗制剂中也可以添加医药上可容许的添加剂。这里医药上可容许的添 加剂是指其自身是与抗原(或免疫原性)不同的物质，是在疫苗给药中可与抗原一起给药 的医药上可容许的材料。例如，可例举出佐剂、防腐剂、稳定剂等疫苗添加物，但并不限定于 这些。作为佐剂，作为被批准用于人用疫苗的佐剂，可以使用磷酸铝、氢氧化铝、MF59等，但 并不限定于这些。 作为稳定剂，可以使用0. 2%左右的明胶或葡聚糖、0. 1 1. 0%的谷氨酸钠、或者 约5%的乳糖或约2%的山梨糖醇等，但并不限定于这些。作为防腐剂，可以使用0. 01%左 右的硫柳汞、0. 1%左右的|3-丙内酯或0.5%左右的苯氧乙醇等，但并不限定于这些。
在制备注射剂时，根据需要，添加pH调节剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂等并按照常 用的方法制备成皮下、肌内、静脉内注射剂。关于注射剂，将溶液收纳到容器后，可以通过冷 冻干燥等制成固体制剂、也可以制成使用时调制的制剂。另外，可以将单个给药量收纳到容 器中，也可以将给药量收纳到同一容器中。 作为本发明的细菌疫苗的接种方法，可以使用公知的各种方法。作为接种方法，优 选皮下注射、肌内注射、经鼻接种、经口接种、经皮接种等，更优选肌肉注射，但并不限定于 这些。经鼻接种包括鼻腔内喷雾、粉末喷雾、滴加、涂布等。这些接种方法中更优选经口接 种或经鼻接种，其理由是因为呼吸道或消化道的粘膜是感染初期的重要部位。通过接种含 有适当的免疫增强活性强的佐剂的疫苗，能够诱发局部粘膜的免疫机能，使其尽可能地在 感染初期发挥防御效果。 哪种接种方法合适要考虑疫苗抗原的种类、剂型、抗体表达时期、抗体持续期间、 接种对象者的年龄等来决定。另外，作为进行接种的对象，除人以外，还可举出玩赏动物、家畜、野生动物、鸟类。接种方法通过专业人员的临床实验来最终决定，这些方法对于本领域 技术人员来说是公知的。可以是一次接种用制品，也可以是多次接种用制品。给药量根据 患者的体重和年龄、给药方法等而变化，只要是本领域技术人员即可对合适的给药量进行 恰当选择。
当将本发明的疫苗组合物向小鼠给药时，在疫苗制剂的最终菌体浓度为1(T细胞
/mL的情况下，可以以0. 100mL/kg体重 3mL/kg体重的给药量给药。 另一方面，一般来说，在适用于人的全菌体疫苗的情况下，可以以O. 1 0.5mL的
皮下注射或肌内注射来给药，在本发明中，与以采用同样的制法制备的百日咳杆菌为抗原
的疫苗制剂相比，可以以1/3 1/30的量给药。 例如，在将本发明的疫苗给人接种时，具体地，可以将上述组成的疫苗制剂(最终 菌体浓度为101Q细胞/mL)以0. 02 0. 5mL给药。 此外，本发明的疫苗的给药次数可以是1次，也可以是多次，优选是2 4次，最优 选是4次。 对于疫苗开发来说，进行疫苗有效性的判定是非常重要的。这些实验对于疫苗领 域的人员来说是公知的，在下文对这些方法的一个例子进行描述。将可能含有防御抗原或 者防止发病的抗原的抗原材料灭活后，对实验动物进行免疫。然后用副百日咳杆菌攻击经 免疫的动物，通过实验动物的存活情况或感染副百日咳杆菌数的减少等来对实验材料的有 效性进行判定。已知虽然副百日咳杆菌感染人、使人发病，但也可以对小鼠建立实验性的感 染。在实验动物中，判定存活情况或者测量肺中的副百日咳杆菌感染的程度是适合的。
本发明的副百日咳杆菌或其制备物、或者全菌体细菌疫苗组合物能够诱导接种对 象产生对副百日咳杆菌感染的免疫。 因此，本发明的副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物、菌体溶解物、或含有它 们作为免疫原的全菌体细菌疫苗组合物能够用于副百日咳杆菌引起的百日咳的预防。
需要说明的是，在本说明书中引用的全部现有技术文献引入本说明书作为参考。
实施例 下面基于实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明并不限于这些实施例。
本发明中使用的培养基的组成
〈Bordet-Gengou培养基>
氯化钠 5. 5g
琼脂 20g 含有1%甘油的马铃薯浸出液1L 在12rC下灭菌15分钟后，加入羊脱纤维素血液150mL。当使用具有耐药性的菌
株时，加入适当的抗菌剂。在上述情况下为链霉素200ii g/mL。〈炭粉琼脂培养基〉 牛心脏提取物 12g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 可溶性淀粉 10g 酵母提取液 3.5g0132] 活性炭粉 4g 0133] 琼脂 18g 0134] 超纯水 1L
0135] 在12rC下灭菌15分钟后，加入羊脱纤维素血液lOOmLc 株时，加入适当的抗菌剂。在上述情况下为链霉素200i! g/mL。
当使用具有耐药性的菌
0136] 0137] 0138] 0139] 0140] 0141] 0142] 0143] 0144] 0145] 0146] 0147] 0148]
添加有酪蛋白氨基酸的Stainer-Scholte液体培养基
谷氨酸钠
10. 72g 0. 24g
氯化钠 磷酸二氢钾 氯化钾 Tris盐酸盐 Tris
氯化镁六水合物 1M氯化钙溶液
5%淀粉溶液
2. 0g 0. 5g 0. 2g
3. 175g 0. 587g 0. lg
0. 135mL 2. 5g 10mL
将上述组分加入超纯水中制成1L并混和，在12rC下灭菌15分钟。放热后加入经
过滤灭菌的下述溶液c
0149] 0150] 0151] 0152] 0153] 0154] 0155]
L-半胱氨酸 硫酸亚铁七水合物 抗坏血酸 还原型谷胱甘肽
0. 04g 0. Olg 0. 02g 0. lg
用少量的盐酸和超纯水制成lOmL，并溶解。 (试验例1)百日咳疫苗的制备
作为已知疫苗对照，使用已知的无细胞百日咳疫苗(acelluler pertussisvaccine， aP)禾口全菌体百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine, wP)。 0156] 作为无细胞疫苗，使用市售的沉降精制百日咳白喉破伤风混合疫苗(DtaP，社团法 人北里研究所)。
0157] 全菌体百日咳疫苗如下制备。S卩，将冷冻保存的百日咳杆菌东浜株I相菌涂布到 Bordet-Gengou培养基上，在37。C下培养4天。从形成的集落中选择数个可见溶血环的集 落涂布到炭粉琼脂培养基上，在37t:下培养1天。其后为了增菌，将细菌进一步涂布到炭粉 琼脂培养基上，在37t:下培养4天。培养结束后，刮取培养基表面上的菌体，混悬到灭菌磷 酸缓冲生理盐水中。将菌体浓度调节为1(^细胞/mL后，添加甲醛溶液，使得甲醛的最终浓 度达到0.2%。将其稳定搅拌后，在4t:下静置3天。静置后离心(5000rpm、4。C、10分钟)， 去除上清，将离心沉淀混悬到灭菌磷酸缓冲生理盐水中。再次在相同条件下进行离心，将离 心沉淀混悬到灭菌磷酸缓冲生理盐水中，然后加入灭菌磷酸缓冲生理盐水并调节至以菌体 浓度换算计为101Q细胞/mL，将其作为全菌体百日咳疫苗。
(试验例2)百日咳杆菌和副百日咳杆菌的病原性比较
将百日咳杆菌或副百日咳杆菌的悬浮液(以活菌浓度计为约108CFU/mL， 50 y L/ 小鼠)在戊巴比妥麻醉下(0. 5mL腹腔内接种20倍稀释的Nembutal注射液)经鼻感染给小 鼠(6周龄)。0 (约2小时后)、2 20天后使用戊巴比妥无痛处死小鼠，在无菌条件下摘出 肺，在10mL的灭菌缓冲生理盐水中进行均质化。将匀桨分级稀释后，涂布到Bordet-Gengou 培养基上培养(37t:、4 5天)后，通过计数形成的集落数来算出肺内的各菌活菌数。在 百日咳杆菌感染小鼠中，到感染5天后为止，肺内活菌数增加，其后缓慢减少(图6)。而在 副百日咳杆菌感染小鼠中，几乎未见感染后的菌数增加，其减少也比百日咳杆菌感染小鼠 快(图6)。从该结果可见，与百日咳相比，副百日咳杆菌的病原性更低。
(实施例1)副百日咳杆菌疫苗
成为副百日咳杆菌疫苗的菌体的培养方法的研究 将副百日咳杆菌按照达到10亿细胞/mL的方式混悬到添加有酪蛋白氨基酸的 Stainer-Scholte液体培养基中，取其中的10mL放入75cm2培养烧瓶中，在37。C下静置培 养。该条件下的培养基液深度和静置条件与固体平板培养接近，固体平板培养能够对难以 测定的菌体增殖进行定量。另外，添加有酪蛋白氨基酸的Stainer-Scholte液体培养基与 炭粉培养基同样，含有副百日咳杆菌的增殖所需的充分的营养。另一方面，为了制备疫苗， 菌体必须是保持有病原性的状态。为了确认是否保持有病原性，以ioo倍稀释培养液中的 红细胞凝集反应为指标，在各个时点测定作为致病因子之一的丝状血凝素的存在。
得到的结果如图l所示。副百日咳杆菌增殖至培养第3 4天，其后发生溶菌。另 外，丝状血凝素直到第1 3天均能检出，其后消失。由于菌体溶菌，可能会释放出以内毒 素为代表的各种毒素，并且由于第4天以后病原性保持的指标消失，因此认为可耐受作为 疫苗材料使用的菌体应当使用培养1 3天的菌体，最优选第3天的菌体。
根据上述研究结果，含有副百日咳杆菌的菌体和产生成分的副百日咳杆菌疫苗如 下制备。将冷冻保存的副百日咳杆菌涂布到Bordet-Gengou培养基上，在37°C下培养3 天。从形成的集落中选择数个可见溶血环的集落涂布到炭粉琼脂培养基上，在37t:下培养 l天。 其后为了增菌，进一步在炭粉琼脂培养基上传代，在37C下培养3天。培养结束
后，刮取培养基表面上的菌体，混悬到灭菌磷酸缓冲生理盐水中。 灭菌磷酸缓冲生理盐水如下制备。 氯化钠 8g 氯化钾 0. 2g 磷酸氢二钠 1.44g 磷酸二氢钾 0.24g 超纯水 1L 在12rC下灭菌15分钟后使用。 将菌体浓度调节到101Q细胞/mL后，添加甲醛溶液并使福尔马林的最终浓度达到 0.2%。稳定搅拌后，在4t:下静置3天。静置后离心(5000rpm、4t:、10分钟)，除去上清后， 将离心沉淀混悬到灭菌磷酸缓冲生理盐水中。再次离心，将离心沉淀混悬到灭菌磷酸缓冲 生理盐水中后，调节至以菌体浓度换算计为101Q细胞/mL，将其作为副百日咳杆菌疫苗。
(实施例2)疫苗的感染防御活性(效力)的检测
使用与疫苗对人的效果具有强的相关性的小鼠经鼻感染法来判定各疫苗的感染 防御活性(效力)(Guiso，N. et al. ，Vaccine 17 :2366-2376， 1999.)。即，将各种疫苗以每 个O. 125mL(相当于1/4人单次接种量，SHD)皮下接种给小鼠(3.5周龄)，再在其14天后 进行追加接种(等量)。追加免疫的14天后，将副百日咳杆菌悬浮液(以活菌浓度计为约 108CFU/mL，50ii L/小鼠)在戊巴比妥麻醉下(0. 5mL腹腔内接种20倍稀释的Nembutal注射 液)经鼻感染。0 (约2小时后)、2 、 5和8天后利用戊巴比妥无痛处死小鼠，在无菌条件下摘 出肺，在10mL的灭菌缓冲生理盐水中进行均质化。将匀桨分级稀释，涂布到Bordet-Gengou 培养基上进行培养(37t:、4 5天)，然后通过计数形成的集落数来算出肺内的副百日咳杆 菌活菌数。在通过疫苗诱导感染防御(即可见疫苗的效果)的情况下，通过诱导的感染防 御免疫可以清除经鼻感染的副百日咳杆菌，因此与未接种疫苗的阴性对照组相比，肺内活 菌数可见更低。 M制寸晶l刚瞎細M,效果 表示了在未接种疫苗的阴性对照组(None)中，副百日咳杆菌的肺内活菌数缓慢 增加直到感染后第5天、并在第8天减少的图形(图2)。已知的沉降精制百日咳白喉破伤 风混合疫苗接种疫苗组(DTaP)和全菌体百日咳疫苗接种疫苗组(wP)的各数据点的肺内活 菌数与阴性对照组的数值没有显著性差异，对副百日咳杆菌的感染无效(图2)。另一方面， 在副百日咳杆菌疫苗(v丽l)中，在感染后2 8天的各点中，其副百日咳杆菌的肺内活菌 数与阴性对照组相比显著地降低，显示对副百日咳杆菌具有作为疫苗的效果(图2)。
以上内容证明，已知的百日咳疫苗对副百日咳杆菌感染不具有作为疫苗的效果。 该结果已经通过现场试验(日文原文为"野外試験")得到了确认，其证明本实验中使用的 小鼠实验体系与疫苗对人的效果强烈相关。 本发明的发明人发明的副百日咳杆菌疫苗具有针对副百日咳杆菌的作为疫苗的 效果。副百日咳杆菌疫苗为如下制造的疫苗刮取在培养基上生长的副百日咳杆菌并混悬， 使用灭活剂(这次为福尔马林)进行处理来制造。刮取的副百日咳杆菌除了菌体构成成分 外还含有分泌的因子，认为这些因子中的几种是作为防御抗原而发挥作用的。
(实施例3)副百日咳杆菌疫苗的剂量反应 将副百日咳杆菌疫苗稀释1/3、1/10和1/30后得到的稀释液接种给小鼠，研究剂 量反应关系。结果用经鼻感染2天后的肺内活菌数表示(图3)。其结果确认存在剂量反应 关系。副百日咳疫苗即使在l/30的用量下也能发挥感染防御效果。从该结果可知，在小鼠 实验体系中显示有效性的接种量为约0. lmL/kg体重(每只小鼠0. 003mL)。
在本发明中使用的小鼠实验体系中，为了确认疫苗的效果，接种O. 125mL(l/4SHD) 为标准，以该用量确认有效性的情况与在人接种0. 5mL的有效性相关。因此可认为，本疫苗 对人使用时，接种0. 015 0. 5mL可能显示有效性。 由以上内容可见，能够期待本发明的副百日咳杆菌疫苗作为疫苗的效果较高。
(实施例4)对本发明的疫苗中的百日咳杆菌粘附素的抗原性的研究
用SDS-PAGE分析本发明的副百日咳疫苗中的百日咳杆菌粘附素的含量，结果未 检测出百日咳杆菌粘附素(图4)。根据该检测体系的灵敏度计算，认为按每lkg动物体重 换算的疫苗量中所含的百日咳杆菌粘附素的含量为约0. 01 ii g以下。该含量远低于一般的 将百日咳杆菌粘附素蛋白质作为抗原(日本特愿2003-533990)诱导免疫应答时所需要的
14蛋白的量(lPg/kg)。另外，使用Western blotting法研究了接种了该疫苗的小鼠对百日
咳杆菌粘附素的免疫反应，结果在经免疫的小鼠中，未检测到对百日咳杆菌粘附素的免疫 应答(图5)。因此，在本发明的副百日咳杆菌疫苗的效果中，认为百日咳杆菌粘附素与其引
起的免疫反应几乎不起作用。 根据本发明，能够提供含有副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解
物作为免疫原的、用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物。 目前广泛使用的百日咳疫苗对副百日咳杆菌感染引起的百日咳几乎或者完全不
具有效果。本发明的疫苗组合物对于在症状方面与百日咳杆菌引起的百日咳没有明显差异
的副百日咳杆菌引起的百日咳的预防是有用的。本发明的副百日咳疫苗即使在通常的百日 咳疫苗的1/30用量下，也能够发挥感染防御效果，因此作为疫苗的效果高、并且是能够以 少量安全地使用的疫苗。 另外，在疫苗制造的过程中，由于在比通常的全菌体疫苗弱的条件下进行灭活，因 此疫苗生产时使用的灭活剂的量可以为少量，灭活处理也简便。
权利要求
一种用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物，其含有副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物作为免疫原。
2. 根据权利要求l所述的疫苗组合物，其中，抗原为通过下述工序(a)和(b)得到的抗原(a) 将副百日咳杆菌在37t:下培养1 3天、从而制造最终菌体浓度达到101Q细胞/ mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序；(b) 向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的工序。
3. 根据权利要求l所述的疫苗组合物，其中，抗原为通过下述工序(a)和(b)得到的抗原(a) 将副百日咳杆菌在37t:下、以丝状血凝素(FHA)量为指标进行培养、从而制造最终 菌体浓度达到101Q细胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序；(b) 向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的工序。
4. 根据权利要求2或3所述的疫苗组合物，其特征在于，副百日咳杆菌的灭活是利用含 有最终浓度为0. 1 0. 2%的甲醛的福尔马林溶液来进行的。
5. 根据权利要求1 4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，副百日咳杆菌为抗生 素抗性突变株。
6. 根据权利要求1 5中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，在疫苗制剂的最终菌 体浓度为101Q细胞/mL的情况下，对小鼠的有效给药量为0. 100mL/kg体重 3mL/kg体重。
7. 根据权利要求1 5中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，在疫苗制剂的最终菌 体浓度为101Q细胞/mL的情况下，对人的单次接种的有效给药量为0. 02mL 0. 5mL。
8. 权利要求1 7中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，将其给药1次或多次。
9. 一种疫苗组合物的制造方法，其包括下述工序(a) (c):(a) 将副百日咳杆菌在37t:下培养1 3天、从而制造最终菌体浓度达到101Q细胞/ mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序；(b) 向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的工序；(c) 将已灭活的全菌体副百日咳杆菌与医药上可容许的添加物混合的工序。
10. —种疫苗组合物的制造方法，其包括下述工序(a) (c):(a) 将副百日咳杆菌在37t:下、以丝状血凝素(FHA)量为指标进行培养、从而制造最终 菌体浓度达到101Q细胞/mL的副百日咳杆菌培养制备物的工序；(b) 向副百日咳杆菌培养制备物中添加灭活剂、从而灭活全菌体副百日咳杆菌的工序；(c) 将已灭活的全菌体副百日咳杆菌与医药上可容许的添加物混合的工序。
11. 一种预防副百日咳杆菌引起的百日咳的方法，其包括向对象给药副百日咳杆菌的 全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。
12. —种诱导对象产生对副百日咳杆菌的免疫的方法，其包括向对象给药副百日咳的 全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物的工序。
全文摘要
本发明的课题在于提供含有副百日咳杆菌的全菌体、全菌体的破碎物或菌体溶解物作为免疫原的、用于预防副百日咳杆菌引起的百日咳的全菌体细菌疫苗组合物及其制造方法。本发明的发明人为了解决上述课题，首先，将副百日咳杆菌在37℃的条件下培养3天，然后将菌体浓度调节至1010细胞/mL，添加甲醛溶液并使福尔马林的最终浓度达到0.2％，进行灭活。加入灭菌磷酸缓冲生理盐水，并将该菌体调节至以菌体浓度换算计为1010细胞/mL，得到疫苗组合物。将本发明的疫苗组合物接种给小鼠(3.5周龄)，使其感染副百日咳杆菌悬浮液，结果可知，其对副百日咳杆菌具有感染防御活性，并且即使以通常的百日咳疫苗接种量的1/30量接种也显示感染防御活性。
文档编号A61K39/10GK101795706SQ200880100918
公开日2010年8月4日 申请日期2008年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者小松荣司, 渡边峰雄 申请人:学校法人北里研究所