经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的制作方法
【专利摘要】提供了衍生于母株Tohama的重组百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株使用等位基因交换载体pSS4245通过同源重组获得，这容许替换细菌染色体的部分而不会留下任何附属突变。编码PT亚基SI的片段经过替换而引入两个导致PT毒性活性失活的突变。这种菌株能够进一步修饰而表达增量的rPT和/或PRN。具有其启动子和ptl终止子并含有上述突变的ptx-ptl操纵子的五个PT结构基因的ptx簇的第二拷贝能够插入所述染色体上其他位置。另外，所述PRN基因的第二拷贝能够插入所述染色体上。在这两种情况下，遗弃的基因位点选择为所述插入位点而避免引入不期望的遗传改变。
【专利说明】经修饰的百日咳博德特氏菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明描述了衍生于标识为Tohama的母株并使用载体pSS4245整合突变和其它(附加，additional)基因拷贝的重组百日咳博德特氏菌(百日咳杆菌，Bordetellapertussis)菌株的构建。
【背景技术】
[0002]百日咳(Pertussis)或百日咳(whooping cough)是由上呼吸道的百日咳博德特氏菌感染所致的严重婴儿疾病[I]。疫苗已经面世几十年，其由百日咳博德特氏菌的灭活全细胞构成。它们作为三价白喉-破伤风-百日咳组合或者作为还提供抗乙型肝炎和b型流感嗜血杆菌侵袭性疾病的免疫力的新组合进行给药[2]。在少数几个国家中由于其令人质疑的安全谱使用全细胞疫苗已经减少、不鼓励或甚至受禁，这种令人质疑的安全谱是由于高水平内毒素和与灭活全细胞相关的其它细菌毒素所致[3，4]。 [0003]无细胞疫苗，以它们不包含全细胞而只有部分或广泛纯化的细菌抗原而得名，在1981年引入日本[5]。在无细胞疫苗中的所述组分抗原的较高纯度解读为到改善的临床安全谱。这些疫苗在验证其安全性和有效性的广泛现场试验之后于90年代中期引入工业化国家[6]。然而，由WHO更广泛引入到免疫扩展计划项目(Expanded Program ofImmunization)却受阻于无细胞疫苗的显著较高的成本。
[0004]百日咳博德特氏菌的主要毒力因子是百日咳毒素(PT) [7，8]而百日咳类毒素(PTd)是无细胞疫苗中的主要抗原[8]。不像白喉和破伤风毒素，可以通过甲醛的简单处理而失活，PT已经证明更难以通过化学方法灭活[9]。目前，不同的失活方法都适用于商业化生产。在广泛通用的PT变性中所有都是通过化学处理所致。两候选疫苗都是使用遗传灭活毒素(rPT)进行探究的[10~12]而这些候选疫苗之一列入了现场药效试验中[11-12]。
[0005]然而,含rPT的疫苗尚不可获得。
【发明内容】
[0006]根据本发明的第一实施方式，提供了一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株，其中所述Tohama菌株的具有ATCC登记号BAA-589的所述百日咳毒素SI基因，具有Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29突变并且由于所述突变而并未包括整合的抗生素抗性基因，其中所述经修饰的菌株能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)。
[0007]载体pSS4245可以用于引入所述SI突变而并未整合抗生素抗性基因。
[0008]所述菌株可以通过使用载体PSS4245将所述ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区而进一步进行修饰,其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Gly 129的SI基因，所述经修饰的菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的ptx操纵子而并未整合抗生素抗性基因，并能够表达相对于仅具有一个Ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素。[0009]所述ptx操纵子的拷贝可以整合于非功能假基因(伪基因，pseudogene)之内或之间。
[0010]所述Ptx操纵子的拷贝可以整合于假定的(putative)铵转运子(铵转运蛋白，ammonium transporter)假基因amtB和假定的自主转运子(自主转运蛋白、自转运蛋白，auto transporter)假基因之间。
[0011]所述整合的所述PtX操纵子的拷贝可以受控于Ptx-Ptl操纵子启动子之下。
[0012]其它所述ptl操纵子的拷贝可以不引入到所述菌株中。
[0013]所述菌株可以包括多于一个所述经修饰的ptx操纵子的插入拷贝。
[0014]所述菌株可以进一步通过使用载体PSS4245将编码百日咳杆菌粘附素(Pertactin)的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中进行修饰，所述经修饰的Tohama菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，而所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
[0015]所述插入的prn基因可以位于非功能假基因之内或之间。
[0016]所述prn基因的拷贝可以整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因(pseudo-putative glutathione S-transferase gene)和假定的天冬氨酸消旋酶假基因(pseudo putative aspartate racemase gene)之间。
[0017]所述prn基因的拷贝可 以受控于prn启动子之下.。
[0018]所述菌株可以包含多于一个所述prn基因的插入拷贝，而可以包含至少两个经修饰的ptx操纵子和至少两个prn基因。
[0019]优选所述野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
[0020]根据本发明的第二实施方式，提供了一种生产经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含所述突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因替换标识为Tohama的百日咳博德特氏菌菌株内具有ATCC登记号BAA-589的所述催化亚基SI基因的步骤，其中载体PSS4245用于用所述经修饰的SI基因替换所述未经修饰的SI基因，由此导致整合所述经修饰的基因而未整合抗生素抗性基因并且产生能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
[0021]所述方法可以进一步包括使用载体PSS4245将所述ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤,其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因由此生成具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的ptx操纵子而未整合抗生素抗性基因的经修饰的Tohama菌株,所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒的百日咳毒素。
[0022]所述方法可以进一步包括使用载体PSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区的步骤，由此生产的经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位在所述Tohama染色体中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
[0023]多于一个所述经修饰的ptx操纵子和/或所述prn基因的拷贝可以插入到所述Tohama菌株的染色体中。
[0024]根据本发明的第三实施方式，提供了一种生产百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步骤:
[0025]在培养基中培养以上所述的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而实现所述抗原的表达，其中所述抗原包括通过所述菌株中存在的基因编码的去毒的百日咳毒素(rPT)、百日咳杆菌粘附素和丝状血凝素(Filamentous Hemagglutinin) (FHA);和回收所述抗原。
[0026]所述PT和FHA抗原可以从培养基中回收，而同时所述PRN抗原可通过提取方法如高温处理而部分从培养基中和部分从细胞中回收。
[0027]凝集原2和/或3也可以进行表达并回收。
[0028]根据本发明的第四实施方式，提供了一种由上述方法制备的抗原。
[0029]所述抗原可以用于受试者中预防百日咳感染，具体而言，用于生产预防百日咳感染的无细胞疫苗(acellular vaccine)。
[0030]根据本发明的第四实施方式，提供了一种包含如上所述制备的抗原的无细胞疫苗。所述抗原可以是去毒的百日咳毒素和/或百日咳杆菌粘附素。所述疫苗可以进一步包括用于预防或治疗其它疾病(包括白喉、破伤风、乙型肝炎、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌中的一种或多种)的FHA、凝集原2和/或凝集原3和/或抗原。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1:等位基因交换载体pSS4245的示意性结构。
[0032]图2:用于将经修饰的SI基因构建于所述等位基因交换载体pSS4245中的载体。A:用于通过氯霉素抗性盒(cassette)替换所述SI基因并插入于所述SI侧翼区(Slflanging regions)之间的等位基因交换元件。B:用于将所述经修饰的SI基因恢复到其在所述ptx-ptl操纵子中精确位置的等位基因交换元件。为了获得所述等位基因交换，这些载体经过线性化而插入到PSS4245中，其随后通过从大肠杆菌SMlO接合转移(conjugative transfer)而引入到百日咳博德特氏菌中。
[0033]图3:等位基因交换过程。A:通过氯霉素抗性标记导致SI基因替换的双重组(double recombination)事件。B:导致其原始位置重新插入所述经修饰的SI基因的双重组事件。
[0034]图4:将所述ptx操纵子的第二拷贝插入到所述百日咳博德特氏菌染色体中的载体。A:所述ptx操纵子的第二拷贝的插入位点选择于两个分别携带两个移码突变的遗弃基因(abandoned gene)之间。B:用于将氯霉素标记插入到所选择的位点的等位基因交换元件。C:所述具有其原始启动子的ptx操纵子的示意性结构。所述ptx-ptl终止子经过克隆插入于所述S3基因之后。这个簇(cluster)最终整合到所述SS4245衍生物中而替换所述氯霉素标记并产生插入所述PT结构基因的第二拷贝的所述第二等位基因交换事件。
[0035]图5:所述R9K和E129G突变在Bp-WffC和Bp-WffD中的识别。对于菌株Bp-WffD显示了围绕所述突变的原始序列数据，其具有两个PT结构簇的拷贝。对于百日咳博德特氏菌Tohama(共有序列)及衍生物Bp-WffC和Bp-WffD显示了所述相应的序列比对。
[0036]图6:将所述prn基因的第二拷贝插入百日咳博德特氏菌染色体中的载体。A:所述prn基因的第二拷贝的所述插入位点选择于两个携带移码突变和缺失的遗弃基因之间。B:受控于fha启动子之下并侧接靶整合位点的所述prn基因的示意结构。C:受控于自身的启动子之下并侧接祀整合位点的所述prn基因的示意结构。
[0037]图7:CH0细胞簇聚(cell clustering)测试。所述细胞生长至接近汇合然后加入PT稀释液并在2天之后对所述簇聚评分。A:800ng PT (菌株Βρ-ffffC)。B:对照物，未加PT。C:2.6pg wt PT (菌株Tohama)对应于所述检测阈值。D:43pg wt PT (菌株Tohama)。
【具体实施方式】
[0038]本文中描述了衍生于标识为Tohama的母株的重组百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株通过同源重组使用等位基因交换载体PSS4245而获得[41]。这种载体容许替换部分细菌染色体而不会留下任何附属突变(accessory mutation)。
[0039]对PT、FHA和百日咳杆菌粘附素(PRN)的基因已经进行了克隆和测序[35_39]。百日咳毒素是一种包含6个多肽亚基，通过5个由单个启动子表达的不同结构基因编码的复杂蛋白。其酶促和其大部分的毒性活性都是由其亚基SI介导的，而其细胞结合和促有丝分裂性质是由于其它的亚基所致，这形成B亚基。
[0040]在第一实施方式中，编码PT亚基的SI的片段经过置换而引入两个引起毒性活性失活的突变。在第二实施方式中，具有其启动子和所述Ptl终止子的所述ptx-ptl操纵子并含有上述突变的所述五个PT结构基因的所述ptx簇的所述第二拷贝插入到所述染色体上的其他位置。所述ptx-ptl操纵子中存在的Ptl辅助基因(auxiliary gene)的组织并未修改。这种菌株产生增量的rPT。在第三实施方式中，所述prn基因的第二拷贝插入到所述染色体上。 在这两种情况下，遗弃基因位点选择作为插入位点而避免引入不良遗传改变，并且所述抗原表达通过自身启动子驱动，因而受到所述母本(parent) Tohama菌株中相同的调节。
[0041]PT和更是这样的PRN在高密度培养基中是限制性抗原(limiting antigen),而FHA由百日咳博德特氏菌在这些条件下自然过量生产。然而，PRN能够由重组大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichiapastoris)高收率获得[14，15]，而仅PT亚基能够表达于大肠杆菌中，但未能组装成成熟毒素，且免疫原性不足以视为潜在候选疫苗[16]。现在应该理解的是，成熟毒素的组装和分泌需要几个在稍后阶段发现的辅助基因，其是所述ptx-ptl操纵子的ptl部分的部件(part) [17]。
[0042]虽然已经报道通过操纵基因拷贝数增强生产而提高细菌毒素的生产[18，19]，具体而言是PT[20]，但是这主要用于多拷贝质粒载体或基因是串联重复的。这可能具有关于菌株遗传稳定性(特别是在生产环境中)的后果。例如，使用多拷贝质粒载体通过文献Leeet al.[40]产生的所述百日咳博德特氏菌菌株并没有显示出PT生产的任何提高，而所述质粒却进行了重排，所述PT操纵子删除或所述转移接合子(transconjugant)发生了向无毒相的转化。
[0043]与前面在百日咳博德特氏菌中使用的等位基因交换载体相反，PSS4245在所述染色体上不需要或留下附属突变，特别是由早期等位基因交换方法中所需要的自发链霉素抗性突变体的选择所导致的影响rpsL的所述突变[22]。这种影响看家(housekeeping)基因的突变可能会伤及毒力而因此危及毒力因子包括PT、FHA和PRN的表达。本发明的菌株会产生恒定水平的其它抗原，特别是FHA，并能够用于生产不太昂贵的(承担得起的)无细胞百日咳疫苗。
[0044]结果
[0045]百日咳博德特氏菌染色体中SI基因的突变
[0046]为了将所述两个突变R9K和E129G引入亚基SI中，使用了两步法，以避免所述两个突变之间的区域内重组的可能性,这种重组会导致所述突变之一丢失。这种方法还允许通过选择性培养基上的简单复制平板培养选择所述所需的菌落。首先两个大肠杆菌载体构建于氯霉素抗性基因(CmK)取代了野生型SI基因(图2A)或由包括所需突变的经修饰的SI基因取代了野生型SI基因(图2B)的pBluescript II SK+中，两者侧接1.2-1.5kB所述SI上游和下游区域。这 些载体随后经过加工处理而将其插入物引入到PSS4245中。这些衍生物转移到大肠杆菌SMlO中进行接合转移并等位基因交换到百日咳博德特氏菌菌株Tohama中。所述质粒pSS5Cm3通过所述0]/标记产生了所述SI基因替代(图3A)。质粒pSS5S13-9K-129G将所述SI基因恢复至其原始位置，现在具有所述两个所需的突变(图3B)。在选择性培养基上选择分离物之后，所述CmK和经修饰的SI基因在预期位置的整合通过PCR扩增(数据未显示)进行验证。所述突变的SI基因在预期位置的整合，正如通过PCR采用能够结合所述SI基因上游5’和3’下游侧翼区和内部(数据未示出)的特异性引物进行验证，是显而易见的。在选择用于进一步阐述的所述克隆的所述SI基因中的突变通过DNA测序验证。所述新菌株标识为Bp-ffffC。
[0047]第二组PT结构基因的第二整合位点的插入
[0048]最初试图通过在与百日咳博德特氏菌相容的多拷贝质粒上插入整个ptx-ptl操纵子而提高PT表达，却未能提供有用的菌株，这间接表明PT过度表达有潜在的毒性，并必须保持在一定限度内才能获得能存活的菌株。为了增加所述PT毒素产率，第二组PT结构基因引入到Bp-WffC染色体中。为了识别插入靶位点，所述百日咳博德特氏菌Tohama基因组的序列经过扫描而识别了许多假基因。假定的铵转运子基因和假定的自主转运子基因之间的所述 DNA 序列选择用于插入(posn.2，903，988-2，905，228 和 2，905，291-2，908，277)。这些基因每一个都携带会断送其功能的移码突变(图4A)。遵照以上部分中列出的通用策略。首先，所述大肠杆菌载体pSKPD5Cm3通过将所述CmK基因插入到侧接所选整合位点的区域内进行构建(图4B)。在将所关注的序列插入到PSS4245中后，等位基因交换通过所述CmK#记进行选择。所述CmK基因在所设计的位置的整合通过PCR(数据未显示)进行验证。在所述第二载体中所述5个PT结构基因S1...S3与ptx启动子和所述ptl终止子一起继S3基因之后插入到相同的侧翼区而产生在SI中包含所述两个突变的载体pSKptxter(图4C)。等位基因交换进入靶整合位点将所述PT结构基因的功能簇的第二拷贝插入到Bp-WffC菌株中。所述新菌株标识为Bp-WffD。整合的结果使用结合到ptx操纵子上游或下游区域及内部的引物进行扩增而验证，这证实了预期的整合而未干扰发生重组的所述区域。
[0049]所述SI基因的测序和所述R9K和E129G突变的识别
[0050]应用自动测序验证所需突变的存在。在具有所述SI基因的两个整合拷贝的菌株Bp-WffD的情况下，原则上PCR扩增会产生所述两个基因的拷贝的混合物。在所述插入之一中一个意想不到的点突变将会作为对应位置的双核苷酸分配(assignment)出现。在R9K和E129G位置的荧光信号的单峰指示Bp-WffC上的正确序列并指示Bp-WffD中SI的两个拷贝具有相同的突变。围绕两个所需突变的序列报道于图5中，该图显示了菌株Bp-WffD的测序记录和所述wt Tohama> Βρ-ffffC和Bp-WffD的序列比对。
[0051]所述PRN基因的第二拷贝插入到Bp-WWD菌株中
[0052]由于PRN生产的限制，受控于所述fha启动子和其自身终止子之下的prn结构基因的第二拷贝引入到假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶的两个假基因之间的Bp-WffD染色体中(图6A)。所述pSKPD2Cm3大肠杆菌载体构建于所述CmK基因插入所述侧接所选插入位点的上游和下游区域之间。另一载体使用所述相同侧翼区和所述受控于所述FHA启动子的prn基因进行构建(图6B)。在将所述CmK标记插入所需位置后，所述CmK基因使用通常的等位基因交换选择和筛选程序替换成所述prn功能块(functionalblock,功能元件)。
[0053]从这种构建体中分离出来的所述百日咳博德特氏菌菌株并不表达PRN而其它抗原的水平最终无法检测。据初步结论，如果在所述较强的FHA启动子控制下过度生产，则所述PRN产物是有毒的并仅仅逃逸已失去生产PRN能力的突变体或所有毒力因子是可行的。因此，决定引入所述天然的prn启动子代替所述fha启动子。pSKPD25FpPRN3用于用所述原始的PRN启动子代替所述FHA启动子而产生具有其自身的天然启动子和终止子的功能块(图6C)。这个功能块通过通常的等位基因交换程序插入到所选择的位点而获得具有在其自身启动子控制之下的所述prn基因的第二非串联重复拷贝的菌株。所述预期的插入通过使用结合于所述prn基因侧接区域和内部的引物的PCR扩增进行验证。这种菌株通常是可行的，并标识为Bp-WffE。
[0054]PT和PRN构建体的遗传稳定性
[0055]所述菌株Bp-WffE经过培养，并连续继代培养于MSS培养基中而达到共计约50代。最后一个培养物经过稀释并接种于MSS-琼脂。三十个分离的菌落随机挑出。三十个菌落对其SI和prn基因通过PCR(数据未示出)进行分析。所述结果表明，所有的菌落在预期的位置上都含有SI和prn基因的两个拷贝。
[0056]PT和FHA在摇瓶中的表达
[0057]PT和FHA在摇瓶培养中的生产通过ELISA进行分析。摇瓶培养物都处于含七(2，6-0-二甲基)-β-环糊精的改良的斯坦纳-斯科尔特(Stainer-Scholte)培养基(MSS)中[23，24]。菌株Bp-WffC和Bp-WffD的结果列于表1和表2中。菌株Bp-WffD中PT的产量相比于Bp-WffC和wt.Tohama大约加倍，表明了所述结构基因簇的表达水平和拷贝数的预期相关性。
[0058]表1:通过菌株Tohama、Bp-WWC和Bp-WffD的PT生产。细胞在MSS培养基中生长于摇瓶中48小时(实验#1)或20-24小时(实验#2)。两独立瓶的结果都对实验#2进行显示。经离心收获后，所述上清液通过直接ELISA采用兔多克隆抗体(实验#1)或通过夹心ELISA使用兔多克隆抗体作为捕获试剂和检测用的S2特异性单克隆(Abcam)进行检测分析。
[0059]
【权利要求】
1.一种经遗传修饰的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)Tohama菌株,其中所述Tohama菌株的ATCC登记号为BAA-589的百日咳毒素SI基因具有Arg9 — Ly s9和Glul29-Glyl29突变并且由于所述突变而不包括整合的抗生素抗性基因，其中所述经修饰的菌株能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)。
2.根据权利要求1所述的经修饰的Tohama菌株，其中载体pSS4245用于引入所述SI突变而不整合抗生素抗性基因。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其标识为Bp-WffC并具有.........登记号.........0
4.根据权利要求1~3中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其已通过使用载体PSS4245将ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株的染色体的非功能区而进一步修饰，其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因，所述经修饰的菌株由此具有两个分开定位于所述Tohama染色体中而无整合的抗生素抗性基因的ptx操纵子，并能够表达相对于仅具有一个ptx操纵子的菌株水平增强的去毒百日咳毒素。
5.根据权利要求4所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于非功能假基因之内或之间。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于假定的铵转运子假基因amtB和假定的自主转运子假基因之间。
7.根据权利要求4~6中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其中所述ptx操纵子的整合的拷贝受控于ptx-ptl操纵子启动子。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其不包含所述ptl操纵子的其它拷贝。
9.根据权利要求4~8中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其包含多于一个的所述经修饰的Ptx操纵子的插入拷贝。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其已通过使用载体PSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株的染色体的非功能区中而进一步修饰，所述经修饰的Tohama菌株由此具有两个分开定位在所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，而所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
11.根据权利要求10所述的经修饰的Tohama菌株，其中所述插入的prn基因位于非功能假基因之内或之间。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其中所述prn基因的拷贝整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之间。
13.根据权利要求10~12中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其中所述prn基因的拷贝受控于prn启动子。
14.根据权利要求10~13中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其包含多于一个的所述prn基因的插入拷贝。
15.根据权利要求10~14中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其包含至少两个经修饰的ptx操纵子和至少两个prn基因。
16.根据权利要求1~15中任一项所述的经修饰的Tohama菌株,其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
17.—种生产经修饰的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因替代标识为Tohama的百日咳博德特氏菌菌株中ATCC登记号为BAA-589的催化亚基SI基因的步骤，其中载体pSS4245用于使用所述经修饰的SI基因代替未经修饰的SI基因，由此导致所述经修饰的基因的整合而未整合抗生素抗性基因，并且产生能够表达去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包括使用载体PSS4245将ptx操纵子的拷贝整合到所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤,其中所述整合的ptx操纵子包含一组S2-S5基因和经修饰而包括所述突变Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因，由此生产经修饰的Tohama菌株,所述经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位在所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的ptx操纵子,所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个Ptx操纵子的菌株水平增强的去毒百日咳毒素。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的方法，其进一步包括使用载体PSS4245将编码百日咳杆菌粘附素的prn基因的拷贝整合至所述经修饰的Tohama菌株染色体的非功能区中的步骤，由此生产经修饰的Tohama菌株,所述经修饰的Tohama菌株具有两个分开定位于所述Tohama染色体中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，所述经修饰的Tohama菌株能够表达相对于仅具有一个prn基因的菌株水平增强的百日咳杆菌粘附素。
20.根据权利要求17~19中任一项所述的方法，其不包括将所述ptl操纵子的拷贝整合至所述经修饰的Tohama菌株的染色体中的步骤,使得所述经修饰的Tohama菌株仅含有单个ptl操纵子。
21.根据权利要求17~20中任一项所述的方法，其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替换或失活。
22.根据权利要求18~21中任一项所述的方法，其中所述ptx操纵子和/或所述prn基因整合于非功能假基因之内或之间。
23.根据权利要求18~22中任一项所述的方法，其中所述ptx操纵子的拷贝整合于假定的铵转运子假基因amtB和假定的自主转运子假基因之间。
24.根据权利要求18~23中任一项所述的方法，其中整合的所述ptx操纵子的拷贝受控于ptx-ptl操纵子启动子。
25.根据权利要求19~24中任一项所述的方法，其中所述prn基因的拷贝整合于假定的谷胱甘肽S-转移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之间。
26.根据权利要求19~25中任一项所述的方法，其中整合的所述prn基因的拷贝受控于所述prn启动子。
27.根据权利要求19~26中任一项所述的方法，其中所述经修饰的ptx操纵子的拷贝和所述prn基因的拷贝插入到所述Tohama菌株的染色体中。
28.根据权利要求18~27中任一项所述的方法，其中多于一个的所述经修饰的ptx操纵子的拷贝插入至所述Tohama菌株的染色体之中。
29.根据权利要求19~28中任一项所述的方法，其中多于一个的所述prn基因的拷贝插入至所述Tohama菌株的染色体之中。
30.一种生产百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步骤: (i)在培养基中培养权利要求1~16中任一项所述的或根据权利要求17~29中任一项所述的方法生产的经遗传修饰的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而实现所述抗原的表达，其中所述抗原包括通过所述菌株中存在的基因所编码的去毒百日咳毒素(rPT)、百日咳杆菌粘附素和丝状血凝素(FHA);和(?)回收所述抗原。
31.根据权利要求30所述的方法，其中从所述培养基中回收至少一些所述抗原。
32.根据权利要求30或31中任一项所述的方法，其中凝集原2和/或3也被表达和回收。
33.通过权利要求30~32中任一项所述的方法而生产的抗原。
34.根据权利要求33所述的抗原，用于预防受试者的百日咳感染。
35.通过权利要求30~32中任一项所述的方法生产的抗原在生产用于预防受试者百日咳感染的无细胞疫苗的方法中的用途。
36.一种无细胞疫苗，包含根据权利要求30~32中任一项所述的方法生产的抗原。
37.根据权利要求36所 述的疫苗，其中所述抗原是去毒的百日咳毒素和/或百日咳杆菌粘附素。
38.根据权利要求37所述的疫苗，其进一步包括FHA、凝集原2和/或凝集原3。
39.根据权利要求36~38中任一项所述的疫苗，其进一步包括用于预防或治疗其它疾病的抗原，包括白喉、破伤风、乙型肝炎、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌中的一种或多种。
【文档编号】A61P31/00GK104024400SQ201280064062
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2011年12月21日
【发明者】臣集·汉奇, 瓦辛·播西, 瓦达那莱·潘班雷德, 吉恩·彼得 申请人:亚洲生物网有限公司