预防性和治疗性流感疫苗、抗原、组合物和方法

专利名称：预防性和治疗性流感疫苗、抗原、组合物和方法
技术领域：
无
背景技术：
流感具有很长的历史，其特征为反复不断的大范围流行性、流行性、复发性和爆发性。流感是高度传染性疾病，其在发展中国家和发达国家中会具有同样的破坏性。流感病毒是对人类群体的主要威胁之一。尽管每年都进行疫苗接种工作，但流感感染仍然导致大量发病率和死亡率。虽然几乎每年都会发生流感流行病，但幸运的是大范围流行病并不经常发生。然而，最新流感病毒株已经出现，使得我们再次面对流感大范围流行病的可能性。目前在亚洲以及东欧地区造成家禽流行病的H5N1型禽流感病毒已在全球范围持续传播。感染的快速扩散以及从鸟类到人类个体的跨物种传播增加人类群体爆发和大范围流行病风险的可能性。所述病毒具有高度致病性，导致超过50％的鸟类死亡率以及少数已被确诊的人类病例。如果病毒获得人类向人类传播，那么将有可能会导致快速的大范围疾病和死亡。


发明内容
本发明提供改良的流感抗原(例如流感抗原多肽)、组合物、疫苗和给药方案。本发明提供流感抗原多肽，诸如血细胞凝集素多肽和/或神经氨酸酶多肽。本发明提供包含至少一种植物产流感抗原多肽的亚单位疫苗。本发明的亚单位疫苗通常包含至少一种植物产流感抗原多肽和医药学上可接受的赋形剂。
在一些实施例中，当向个体投予相对低的剂量时，所述疫苗组合物具有免疫原性和/或保护性。
在一些实施例中，用于亚单位疫苗中的植物产流感多肽是从植物材料中纯化而来。在一些实施例中，用于亚单位疫苗中的植物产流感多肽不是从植物材料中纯化而来。
本发明提供在个体中诱导对抗流感感染的保护性免疫反应的方法，其包含向个体投予有效量的包含至少一种植物产流感抗原多肽的疫苗组合物。
本发明提供在植物中产生流感抗原多肽的方法和系统。所述方法一般包括使用病毒表达载体。在一些实施例中，如本文所述，所述方法涉及二元载体(binary vector)，诸如“投放载体(launch vector)”。在一些实施例中，在树苗(例如发芽的籽苗)中产生流感抗原多肽。本发明提供适用于在植物中表达流感抗原多肽的核酸构筑体以及含有所述核酸构筑体的宿主细胞。
定义 氨基酸如本文中所使用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指任何可并入多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施例中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸为合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，这与其是合成制备还是从天然来源获得无关。如本文中所使用，“合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它可改变所述肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的化学基团取代来修饰。氨基酸可能会参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。可从使用术语的上下文明了其是指游离氨基酸还是肽的残基。
动物如本文中所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，所述非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、遗传工程改造动物和/或克隆。
抗体如本文中所使用，术语“抗体”是指天然或完全或部分合成产生的任何免疫球蛋白。其维持特定结合能力的所有衍生物也都包括在所述术语中。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。所述蛋白质可以来源于天然来源，或部分或完全合成产生。抗体可为单克隆或多克隆抗体。抗体可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用，术语“抗体片段”或“抗体的特征性部分”可互换使用并且是指小于全长的任何抗体衍生物。一般来说，抗体片段至少保留全长抗体的特定结合能力的相当大部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv双功能抗体和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式来产生。举例来说，抗体片段可以通过裂解完整抗体以酶促方式或以化学方式产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。其它或另外，抗体片段可以完全或部分合成产生。抗体片段可以任选包含单链抗体片段。其它或另外，抗体片段可以包含例如由二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸且更通常包含至少约200个氨基酸。
约如本文中所使用，术语“约(approximately/about)”在应用于一个或多个所关注值时是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，除非另有规定或另外从上下文显而易见(除了所述数值将超过可能值的100％的情况以外)，否则术语“约”是指处于所述参考值在任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小以内的值范围。
特征性部分如本文中所使用，短语蛋白质或多肽的“特征性部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的部分。各所述连续段一般将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域的技术人员应了解，通常需要至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多氨基酸表现蛋白质的特点。一般来说，特征性部分是除以上所指定的序列特性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。
特征性序列“特征性序列”是存在于多肽或核酸家族的所有成员中的序列，且因此所属领域的技术人员可用来定义家族的成员。
组合疗法如本文中所使用，术语“组合疗法”是指以重叠方案投予两种或两种以上不同医药剂以使个体同时接触两种药剂的那些情形。
给药方案如本文中所使用，“给药方案”是指间隔一定时段个别地投予的一组单位剂量(通常是一个以上)。推荐用于特定医药剂的剂量组(即，投药量、时序、途径等)构成其给药方案。
表达如本文中所使用，核酸序列的“表达”是指一个或多个以下事件(1)从DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如通过拼接、编辑和/或3′末端形成)；(3)将RNA翻译为多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
基因如本文中所使用，术语“基因”具有如所属领域中所了解的含义。所属领域的技术人员应了解，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。应进一步了解，基因的定义包括提及不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子(诸如tRNA)的核酸。为了清楚起见，我们应注意，如本申请案中所使用，术语“基因”一般是指编码蛋白质的核酸的一部分；所属领域的技术人员从上下文可显而易见，所述术语可任选涵盖调控序列。这一定义并不打算排除对不编码蛋白质的表达单元应用术语“基因”，而是澄清在大多数情况下，如本文献中所使用的所述术语是指编码蛋白质的核酸。
基因产物如本文中所使用，术语“基因产物”或“表达产物”一般是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从所述基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。
HA多肽如本文中所使用，术语“血细胞凝集素多肽”或“HA多肽”是指与表1中所列的一种或多种HA多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，HA多肽与所列HA多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，HA多肽与所列HA多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。
同源性如本文中所使用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％一致，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％类似，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。
一致性如本文中所使用，术语“一致性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，两个核酸序列的一致性百分比的计算可通过出于最佳比较目的对准两个序列来进行(例如，可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中以便最佳对准且出于比较目的可以忽略非一致序列)。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接着比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置未被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在那个位置上是一致的。两个序列之间的一致性百分比与所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳对准两个序列需要引入的间隙的数目和各间隙的长度。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法来完成。举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用迈尔(Meyers)和米勒(Miller)(生物科学中的计算机应用(CABIOS)，1989，411-17)的算法来测定，所述算法已并入使用PAM120权数残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4的ALIGN程序(2.0版)中。或者，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定。如本文中所使用，术语“总体一致性”是指一长段序列中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或更多个氨基酸和/或核苷酸中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指指定序列的完整长度中的一致性。
起始如本文中所使用，术语“起始”在应用于给药方案时可用于指第一次向先前未接受医药剂的个体投予所述医药剂。其它或另外，术语“起始”可用于指在患者治疗期间投予特定单位剂量的医药剂。
经分离的如本文中所使用，术语“经分离的”是指已经如下的物质和/或实体(1)与至少一些在最初产生(在自然界中和/或在实验环境中)时与其结合的组分分离；和/或(2)人工产生、制备和/或制造。经分离的物质和/或实体可以与最初与其结合的其它组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或100％分离。在一些实施例中，经分离的药剂的纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、实质上100％或100％。如本文中所使用，如果物质实质上不含其它组分，那么其是“纯的”。如本文中所使用，术语“经分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。
地衣多糖酶(lichenase)多肽如本文中所使用，术语“地衣多糖酶多肽”是指与表3中所列的一种或多种地衣多糖酶多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。
低剂量如本文中提及亚单位疫苗时所使用，术语“低剂量”是指小于100μg植物产抗原(例如流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)和/或包含植物产抗原的疫苗组合物的剂量。在一些实施例中，低剂量是指小于约90μg、小于约80μg、小于约70μg、小于约60μg、小于约50μg、小于约40μg、小于约30μg、小于约25μg、小于约20μg、小于约15μg、小于约5μg、小于约4μg、小于约3μg、小于约2μg或小于约1μg植物产抗原(例如流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)和/或包含植物产抗原的疫苗组合物的剂量。
NA多肽如本文中所使用，术语“神经氨酸酶多肽”或“NA多肽”是指与表2中所列的一种或多种NA多肽显示至少50％总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，NA多肽与所列NA多肽显示至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％一致性。在一些实施例中，NA多肽与所列NA多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。
核酸如本文中所使用，术语“核酸”在其最广泛意义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文中所使用，术语“寡核苷酸”和“聚核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯主链的类似物。举例来说，所属领域中已知且在主链中具有肽键以代替磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选纯化，化学合成等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有指示，否则核酸序列以5′到3′方向呈现。术语“核酸区段”在本文中用于指作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或10个以上残基。在一些实施例中，核酸是以下物质或包含以下物质天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、(N-吡咯基)-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖和己醣)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5′-N-亚磷酰胺键联)。在一些实施例中，本发明可能具体涉及“未经修饰的核酸”，其意思是尚未经化学修饰以促进或实现传递的核酸(例如聚核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。
可操作地连接如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达受另一核酸序列控制、调控、调节等。举例来说，核酸序列的转录受可操作地连接的启动子序列指导；核酸的转录后加工受可操作地连接的加工序列指导；核酸序列的翻译受可操作地连接的翻译调控序列指导；核酸或多肽的转运或定位受可操作地连接的转运或定位序列指导；且多肽的翻译后加工受可操作地连接的加工序列指导。可操作地连接于第二核酸序列的核酸序列可以直接或间接共价连接于所述序列，不过任何有效三维结合都是可接受的。
医花剂如本文中所使用，短语“医药剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理作用的任何药剂。
医药学上可接受的载剂或赋形剂如本文中所使用，术语“医药学上可接受的载剂或赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料或调配助剂。
部分如本文中所使用，短语物质的“部分”或“片段”在最广泛意义上是与相关完整物质共有一定程度的序列和/或结构一致性和/或至少一种功能性特征的部分或片段。举例来说，蛋白质或多肽的“部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的部分。在一些实施例中，各所述连续段一般将含有至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个氨基酸。一般来说，部分是除以上所指定的序列一致性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。在一些实施例中，所述部分可以具有生物活性。
蛋白质如本文中所使用，术语“蛋白质”是指多肽(即，含至少两个由肽键相互连接的氨基酸的链)。蛋白质可以包括非氨基酸部分(例如可为糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以另外经加工或修饰。所属领域的技术人员应了解，“蛋白质”可为由细胞所产生的完整多肽链(有或无信号序列)，或可为其特征性部分。所属领域的技术人员应了解，蛋白质有时可以包括一个以上多肽链，例如由一个或多个二硫键连接或通过其它方式结合。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者而且可以含有所属领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施例中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸的多肽。
相似性如本文中所使用，术语“相似性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合分子彼此的相似性百分比的计算可以与计算一致性百分比相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑如所属领域中所了解的保守性取代以外。
个体如本文中所使用，术语“个体”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的可以投予本发明的组合物的任何生物体。典型个体包括动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类；昆虫；蠕虫；等)。
实质上如本文中所使用，术语“实质上”是指展现全部程度或接近全部程度的所关注特征或性质的定性条件。所属领域的技术人员应了解，生物和化学现象很少(如果发生过的话)达到完全和/或进行到完全或达成或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于记录许多生物和化学现象中所固有的可能的完全性缺乏。
亚单位疫苗如本文中所使用，“亚单位疫苗”是指包含经纯化抗原而非整个生物体的疫苗组合物。在一些实施例中，亚单位疫苗包含从非抗原性组分至少部分纯化的抗原。在一些实施例中，亚单位疫苗的纯度为至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。在一些实施例中，亚单位疫苗包含并未从非抗原性组分至少部分纯化的抗原。在一些实施例中，亚单位疫苗包含正好一种抗原。在一些实施例中，亚单位疫苗包含两种或两种以上(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)抗原。在一些实施例中，向个体投予低剂量的亚单位疫苗。
罹患“罹患”疾病、病症和/或病状的个体已确诊患有所述疾病、病症和/或病状或呈现所述疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未确诊患有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体可能不展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体不会发展所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体为发展特定疾病或病症或其症状的风险(通常基于遗传倾向、环境因素、个人病史或其组合)高于一般群体中所观察到的风险的个体。
治疗有效量术语医药剂或药剂组合的“治疗有效量”欲指在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下对所治疗的个体赋予治疗作用的药剂的量。在一些实施例中，治疗有效量是当投予罹患或易患疾病、病症和/或病状的个体时足以治疗、诊断、预防和/或延缓疾病、病症和/或病状的症状的发作的量。所述治疗作用可为客观的(即，可通过一些测试或标记来测量)或主观的(即，个体声明有作用或感到有作用)。治疗有效量通常以可能包含多个单位剂量的给药方案来投予。对于任何特定医药剂，治疗有效量(和/或有效给药方案中的适当单位剂量)可以例如视投药途径、与其它医药剂的组合而变化。用于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)也可以视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定医药剂的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和/或所用特定医药剂的排泄或代谢速率；治疗持续时间；和如医学技术中熟知的类似因素。
治疗剂如本文中所使用，短语“治疗剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理作用的任何药剂。
治疗如本文中所使用，术语“治疗”是指以任何形式投予生物活性剂，其部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延缓其一种或多种症状或特征发作，预防其一种或多种症状或特征，降低其一种或多种症状或特征的严重程度和/或降低其一种或多种症状或特征的发生率。所述治疗可以用于不展现相关疾病、病症和/或病状的征兆的个体和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期征兆的个体。其它或另外，所述治疗可以用于展现相关疾病、病症和/或病状的一种或多种既定征兆的个体。
单位剂量如本文中所使用，术语“单位剂量”是指通常在给药方案的情形下医药剂的不连续投予。
载体如本文中所使用，“载体”是指可以转运与其所连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体可以在诸如真核和/或原核细胞等宿主细胞中实现与其所连接的核酸的染色体外复制和/或表达。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。



图1.血细胞凝集素(HA)蛋白和蛋白质结构域的示意图。结构域1、2和2、1折叠在一起形成茎干结构域(stem domain，SD)。结构域3为球状结构域(GD)。条目1-6中呈示的范围对应于HA的氨基酸位置。
图2.在植物中制备抗原的策略。将抗原克隆到“投放载体”系统中。接着将投放载体引入农杆菌(Agrobacterium)中并真空渗透到植物中。让抗原表达并积累在植物生物质中。从植物生物质纯化重组HA抗原。
图3.植物产H5HA的表达数据。(A)表达来自四种不同病毒株的H5HA和NA(全长，除了缺乏跨膜锚定区)(即，来自A/安徽(Anhui)/1/2005的HA抗原，“H5HA-A”或“HAA”；来自A/印度尼西亚(Indonesia)/5/05的HA抗原，“H5HA-I”或“HAI”；来自A/斑头雁/青海(Qinghai)/1A/2005的HA抗原，“H5HA-Q”或“HAQ”；和来自A/越南(Vietnam)/04的HA抗原，“H5HA-V”或“HAV”；以及来自相同四种病毒株的相应NA抗原)的四种不同构筑体的例示性表达数据。(B)数种不同的大范围流行性和季节性流感病毒株的例示性表达数据。
图4.植物中产生的HAA、HAI、HAQ和HAV中的每一个的抗原性。这使用ELISA分析显示图3A中所示的植物产抗原的抗原性。这个分析通过用1μg/ml各H5HA蛋白涂布96孔板来进行。接着使用抗A/安徽/01/05雪貂血清、抗A/印度尼西亚/05/2005雪貂血清、抗A/越南/1194/04HA绵羊抗血清或抗A/怀俄明(Wyoming)/03/2003HA绵羊抗血清的1∶6000稀释液来检测抗原。所有植物产H5HA都显示与针对同源H5HA所产生的抗血清而非针对A/怀俄明/03/03H3病毒所产生的抗血清的特异性反应性。
图5.HAA和HAQ的表达。在植物中表达并从植物纯化的H5HA-A和H5HA-Q的库马斯凝胶(Coomassie gel)(左图)和西方印迹法(western blot)(右图)。使用抗His抗体进行西方印迹法。
图6.免疫时程。在10μg Quil A存在下用H5HA-Q或H5HA-A皮下免疫各组8周龄雌性Balb/c小鼠。在第0天、第14天和第28天施以免疫。
图7.血清血细胞凝集-抑制和病毒中和抗体效价。来自用植物中产生的A/安徽/01/05或A/斑头雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清显示显著血细胞凝集抑制(A)和病毒中和(B)抗体效价，即使当用低至5μg剂量的抗原免疫小鼠时。
图8.由用低至1μg的抗原免疫所产生的血清HI抗体效价。用低至2.5μg和1μgHAA的抗原剂量免疫小鼠。植物产HA在低至1μg的剂量下引发高效价的HI。
图9.活体外表征ppH3HAwy。(A)纯化的ppH3HAwy(泳道3)和iA/Wyo(泳道2)的SDS-PAGE，随后为西方印迹法分析。泳道1为分子量标记。(B)使用参考绵羊抗H3HA或抗N2NA对ppH3Hawy进行的ELISA分析。在绵羊抗H3(灰色条柱)和抗N2NA(空条柱)血清的1∶1600稀释度下，数据以平均OD值±标准偏差显示。(C)用单辐射免疫扩散(SRID)进行ppH3HAwy的定量和分析。使用iA/Wyo作为参考抗原。
图10.由ppH3HAwy诱导的流感特异性抗体反应的ELISA分析。显示接受30μg、10μg和5μg剂量的抗原的各组小鼠的IgG效价。数据以平均血清IgG效价±标准偏差显示。
图11.小鼠血清中的IgG亚型的ELISA分析和从经ppH3HAwy免疫的小鼠收集的脾细胞分泌IFNγ或1L-5的ELISPOT分析。在第42天从用5μg剂量的抗原免疫的动物收集的血清中测量IgG亚型反应。数据以平均血清IgG亚型效价±标准偏差(A)显示。经iA/Wyo免疫的小鼠(B)或经ppH3HAwy免疫的小鼠(C)的分泌IFNγ或IL-5的脾细胞的频率是以每106个细胞中斑点形成细胞(SFC)的平均数目±标准偏差显示。
图12.血清血细胞凝集-抑制和病毒中和抗体效价。显示接受30μg、10μg和5μg剂量的抗原的各组小鼠的HI效价(A)和VN效价(B)。在第0天、第28天和第42天收集血清样品。使用iA/Wyo作为对照组。HI效价表示为对8个血细胞凝集素单位的病毒的血细胞凝集产生抑制的血清的最高稀释度的倒数。VN效价表示为对2×103TCID50的病毒产生50％中和的血清的最高稀释度的倒数表示。指定无可检测HI或VN效价的样品的效价为5或10。数据以平均效价±标准偏差显示。
图13.在植物中制备蛋白质的时间安排的示意图。
图14.活体外表征植物产H5HA-I。使用抗His抗体对所表达的H5HA-I进行的(A)库马斯亮蓝和(B)西方印迹法。(C)用针对A/印度尼西亚/05/05的参考雪貂血清或针对A/怀俄明/03/03的绵羊参考血清对H5HA-I进行的ELISA分析。数据以平均OD值±标准偏差显示。
图15.植物产H5HA-I的免疫原性和保护性功效。(A)来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的小鼠的血清显示显著血细胞凝集抑制活性，即使当用低至15μg剂量的抗原免疫小鼠时。(B)来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的小鼠的血清显示显著病毒中和活性，即使当用低至5μg剂量的抗原免疫小鼠时。
图16.植物产H5HA-I的免疫原性和保护性功效。(A)来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的雪貂的血清显示显著血细胞凝集抑制活性。(B)攻毒后雪貂的存活百分比。(C)攻毒后8天雪貂的体重变化百分比。(D)攻毒后4天雪貂鼻洗涤液中的病毒效价。
图17.在植物中制备HA抗原。(A)所制备的HAB1-H3和HAB1-H1蛋白的库马斯亮蓝染色和西方印迹法。各构筑体的总蛋白质表达为每千克植物生物质约800mg。如所指示，使用抗H3N2多克隆抗体或抗His单克隆抗体进行西方印迹法。对于A/布里斯班(Brisbane)/10e/2007，将2μl、5μl或10μl最终产物加载到各凝胶上。对于A/布里斯班/59/07，如下对库马斯染色的凝胶进行加载泳道1分子量标记；泳道20.5μg BSA；泳道31.0μg BSA；泳道42.5μg BSA；泳道50.5μl最终产物；泳道61.0μl最终产物；泳道72.0μl最终产物；泳道85.0μl最终产物。对于A/布里斯班/59/07，如下对西方印迹法的凝胶进行加载泳道1200ng Lic-LF(地衣多糖酶与炭疽致死因子蛋白的融合物)；泳道2100ng Lic-LF；泳道350ng Lic-LF；泳道4分子量标记；泳道5-71.0μl可溶性提取物(3种独立可溶性提取物样品的1×PBS、10mM Dieca和0.1％曲通(Triton)溶液)。(B)所制备的HAB1-B和HAF1-B蛋白的库马斯亮蓝染色和/或西方印迹法。使用抗His抗体进行西方印迹法。S于包含1×PBS和10mM EDTA的缓冲液中的所提取蛋白。P提取S部分后的剩余蛋白质，通过将颗粒再悬浮于2×SDS-SB中并沸腾来获得。HAB1-B的总蛋白质表达为每千克植物生物质约800mg。对于B/佛罗里达(Florida)/4/2006，如下对库马斯染色的凝胶进行加载泳道1分子量标记；泳道2加载到Q-管柱上之前的物质；泳道32.5μl最终产物的1∶10稀释液；泳道41μl最终产物的1∶10稀释液；泳道53μl最终产物的1∶10稀释液；泳道65μl最终产物的1∶10稀释液；泳道7空白；泳道80.3μg BSA；泳道90.5μg BSA；泳道101.0μg BSA；和泳道111.5μg BSA。对于B/佛罗里达/4/2006，如下对西方印迹法的凝胶进行加载泳道1分子量标记；泳道2总蛋白质，15μl 1∶10稀释液；泳道3总可溶性蛋白质，15μl 1∶10稀释液；泳道4从镍管柱流过，15μl 1∶10稀释液；泳道5从镍管柱洗脱，0.75μl 1∶10稀释液；泳道6加载到Q-管柱上之前的物质，0.975μl1∶10稀释液；泳道71μl最终产物的1∶50稀释液；泳道82μl最终产物的1∶50稀释液；和泳道93μl最终产物的1∶50稀释液。HAF1-B的总蛋白质表达为每千克植物生物质约325mg。
图18.免疫时程。用60μg、30μg或15μg来自A/布里斯班/59/07(HAB1-H1)或A/布里斯班/10e/07(HAB1-H3)的植物产HA免疫小鼠。
图19.植物产HAB1-H1的免疫原性。在HAB1-H1抗原的引发、第一次加强和第二次加强后，通过ELISA来测定HA特异性抗体的血清效价。数据以平均抗体效价±标准偏差表示。
图20.由植物产HAB1-H1引发的血清红细胞凝集抑制抗体效价。显示接受60μg、30μg或15μg剂量的抗原的各组小鼠的HI抗体效价。在第0天、第28天和第42天收集血清样品。针对同源A/布里斯班/59/07病毒测量HI效价。
图21.植物产HAB1-H3的免疫原性。在HAB1-H3抗原的引发、第一次加强和第二次加强后，通过ELISA来测定HA特异性抗体的血清效价。数据以平均抗体效价±标准偏差表示。
图22.由植物产HAB1-H3引发的血清红细胞凝集抑制抗体效价。显示接受60μg、30μg或15μg剂量的抗原的各组小鼠的HI抗体效价。在第0天、第28天和第42天收集血清样品。针对同源A/布里斯班/10e/07病毒测量HI效价。

具体实施例方式 流感和流感疗法 对抗流感的主要防御是疫苗接种。流感病毒是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的分段负链RNA病毒。病毒抗原是高效免疫原，能够引发全身性与粘膜抗体反应。通常将流感病毒血细胞凝集素糖蛋白(hemagglutinin glycoprotein，HA)视为刺激中和抗体和疫苗设计的最重要病毒抗原。对于一些疫苗组合物，已显示病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的存在对于产生针对病毒的多臂保护性免疫反应至关重要。已经开发出抑制神经氨酸酶活性的抗病毒剂且其可为另一种对抗感染的抗病毒治疗。离子通道蛋白M2和基质蛋白M1蛋白是有时认为适用于开发流感抗病毒剂和疫苗的其它组分。
利用由抗原性转变(antigenic shift)产生的不同HA和NA命名流感病毒亚型。此外，由抗原性转变或HA或NA分子中产生新的不同抗原决定基的突变作用产生同一亚型的新病毒株。尽管已记录15种HA抗原亚型，但这些亚型中仅三种，即H1、H2和H3在人类中广泛循环。
在工业化和不发达国家中，疫苗接种在追求高品质生活中都已变得极为重要。大多数可获得的疫苗仍遵循模拟感染形态以诱导可防止相关感染的免疫反应的基本原理。然而，各种亚型和组合的减毒病毒的产生可能耗时并且价格不菲。新技术的出现，对病原体分子生物学、发病机制和其与个体免疫系统的相互作用的深入了解已产生疫苗开发和疫苗传递的新方法。因此，尽管技术进步已提高产生改良的流感抗原疫苗组合物的能力，但仍然需要提供疫苗和新抗原的其它来源以便制造疫苗来解决新出现的亚型和病毒株。需要用于流感病毒亚型的改良疫苗设计和开发以及制备和使用所述组合物的方法。
流感抗原 一般来说，流感抗原可以包括引发针对流感病毒的免疫反应的任何免疫原性多肽。根据本发明，所关注的免疫原性多肽可以独立多肽形式、以融合蛋白形式、以经修饰多肽(例如含有其他侧接基团，诸如碳水化合物基团、甲基、烷基[诸如甲基、乙基等]、磷酸酯基、脂质基团、酰胺基、甲酰基、生物素基、血红素基、羟基、碘基、异戊二烯基、十四烷酰基、黄素基、软脂酰基、硫酸酯基、聚乙二醇等)形式提供。在一些实施例中，用于本发明的流感抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的流感多肽序列一致的序列的氨基酸序列；在一些实施例中，流感抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的流感多肽的特征性部分(例如免疫原性部分)一致的序列的氨基酸序列。
在某些实施例中，利用全长蛋白质作为本发明的疫苗组合物中的流感抗原多肽。在一些实施例中，使用流感多肽的一个或多个免疫原性部分。在某些实施例中，以一个或多个单独多肽形式或以一个或多个融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上免疫原性部分。
用于本发明的流感抗原多肽可以包括全长流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。当无论单独还是以融合蛋白形式利用流感蛋白的部分时，所述部分都保留免疫活性(例如与抗流感抗体的交叉反应性)。基于其诱导针对病毒感染的免疫保护反应的能力，血细胞凝集素和神经氨酸酶为在产生疫苗方面受到关注的抗原。诸如膜离子通道M2或基质蛋白M1等其它抗原可能适用于制造疫苗(例如组合疫苗)以提高免疫保护的功效。
因此，本发明提供表达异源蛋白质(例如流感抗原多肽，诸如流感蛋白或其免疫原性部分，或包含流感蛋白或其免疫原性部分的融合蛋白)的植物细胞和植物。本发明的异源蛋白质可以包含所关注的任何流感抗原多肽，包括(但不限于)血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、膜离子通道M2(M2)、基质蛋白M1(M1)、血细胞凝集素(HA)的一部分、神经氨酸酶(NA)的一部分、膜离子通道(M2)的一部分、基质蛋白M1(M1)的一部分、其融合蛋白、其免疫原性部分，或血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、膜离子通道M2(M2)、基质蛋白M1(M1)、血细胞凝集素(HA)的一部分、神经氨酸酶(NA)的一部分、膜离子通道(M2)的一部分和/或基质蛋白M1(M1)的一部分的组合。
所属领域中已知多种不同流感HA、NA、M2和M1蛋白(例如来自不同亚型或病毒株或分离株)的氨基酸序列且其可在诸如基因库(GenBank)等公共数据库中获得。以下表1和2中提供多种流感亚型、病毒株和/或进化枝的HA和NA的例示性全长蛋白质序列。
在某些实施例中，本发明的疫苗组合物中利用全长血细胞凝集素(HA)。在一些实施例中，使用HA的一个或一个以上结构域。在某些实施例中，以一个或多个单独多肽形式或以在一个或多个融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上结构域。表1中呈示例示性HA多肽的序列。
表1例示性HA序列 在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长神经氨酸酶(NA)抗原。在一些实施例中，使用NA的结构域。在某些实施例中，在本发明的抗原中提供两个或三个或三个以上结构域。某些例示性实施例提供包含全长NA但缺乏跨膜锚定肽序列的流感抗原。表2中呈示例示性NA多肽的序列。
表2例示性NA序列 另外，范例提供数种可用于本发明的其他HA多肽序列。
虽然本文提供例示性流感抗原多肽的序列，但应了解可以使用具有HA和/或NA的免疫原性特征的任何序列。在一些实施例中，用于本发明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其与选自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的序列约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。在一些实施例中，所述流感抗原多肽保留免疫原性活性。
在一些实施例中，用于本发明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其包含具有选自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的序列的约100个连续氨基酸。在一些实施例中，流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其与具有选自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的序列的约100个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，用于本发明的流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其包含具有选自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的序列的约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，流感抗原多肽具有如下氨基酸序列其与具有选自由SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的序列的约150个、200个、250个、300个、350个或更多个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
举例来说，与流感抗原多肽具有足够一致性且保留免疫原性特征的序列能够同与本文所提供的一种或多种抗原反应的抗体结合。免疫原性特征常常包括相关氨基酸或侧基的三维呈现。所属领域的技术人员可易于鉴别在序列上具有适度差异的序列(例如在边界和/或某些序列替代物中具有差异，然而仍保留免疫原性特征)。
在一些实施例中，可从流感多肽中删去SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所示任何例示性序列的特定部分和/或结构域。举例来说，HA和NA多肽通常含有跨膜锚定序列。本发明涵盖删去跨膜锚定序列的HA和NA多肽。
我们已利用来自如本文所详述的特定亚型的血细胞凝集素和神经氨酸酶的序列作为例示性抗原。存在各种亚型的流感病毒且当新亚型出现时，其可被持续鉴别出。所属领域的技术人员应了解，本文所提供的方法和组合物可适合于利用其它亚型的序列。本文所提供的方法和组合物涵盖和包涵所述变化。
流感多肽与热稳定性蛋白质的融合物 在某些方面，提供包含融合多肽的流感抗原多肽，所述融合多肽包含可操作地连接于热稳定性蛋白质的流感蛋白(或其部分或变异体)。本发明融合多肽可在所属领域中已知的任何可用表达系统中制备。在某些实施例中，本发明融合蛋白是在植物或其部分(例如植物、植物细胞、根、芽等)中制备。
人类或动物细胞中未天然发现的酶或其它蛋白质尤其适合用于本发明的融合多肽中。当融合时赋予融合产物热稳定性的热稳定性蛋白质是适用的。热稳定性允许所产生的蛋白质保持构形，且将所产生的蛋白质保持在室温下。这一特征有利于以容易、节省时间和节省成本的方式回收融合多肽。适用于本发明的热稳定性酶的代表性家族为葡聚糖水解酶家族。这些酶特异性裂解混合连接型多糖中相邻于1，3-β键联的1，4-β糖苷键(汉(Hahn)等人，1994美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，9110417；以引用的方式并入本文中)。这些酶发现于诸如燕麦和大麦等谷物中，且也在包括热纤梭菌(C.thermocellum)等许多真菌和细菌物种中发现(金科瓦(Goldenkova)等人，2002，分子生物学(Mol.Biol.)36698；以引用的方式并入本文中)。因此，用于本发明的融合多肽中的所需热稳定性蛋白质包括糖苷酶。例示性热稳定性糖苷酶蛋白包括由选自表A中所示的基因库保藏编号的基因库保藏编号表示的蛋白质，各自内容是通过完全并入各参考编号的基因库保藏信息以引用的方式并入本文中。用于本发明的融合蛋白中的例示性热稳定性酶包括热纤梭菌(Clostridivm thermocellum)P29716、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋红嗜热盐菌(Rhodthermus marinus)P45798，其各自以引用其基因库保藏编号的方式并入本文中。代表性融合蛋白利用从热纤梭菌分离的改良热稳定性酶，然而，根据本发明可类似地利用任何热稳定性蛋白质。例示性热稳定性糖苷酶蛋白列于表3中 表3热稳定性糖苷酶蛋白 虽然本文提供例示性热稳定性多肽的序列，但应了解可以使用展现热稳定性的任何序列。在一些实施例中，用于本发明的热稳定性多肽具有如下氨基酸序列其与具有选自由SEQ ID NO44-83组成的群组的序列约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。在一些实施例中，所述热稳定性多肽保留热稳定性。
在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列其包含具有选自由SEQ IDNO44-83组成的群组的序列的约100个连续氨基酸。在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列其与具有选自由SEQ ID NO44-83组成的群组的序列的约100个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列其包含具有选自由SEQ IDNO44-83组成的群组的序列的约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个、约550个、约600个、约650个、约700个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，热稳定性多肽具有如下氨基酸序列其与具有选自由SEQID NO44-83组成的群组的序列的约150个、200个、250个、300个、350个或更多个氨基酸的连续段约60％一致、约70％一致、约80％一致、约85％一致、约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致、约95％一致、约96％一致、约97％一致、约98％一致、约99％一致或100％一致。
当根据本发明设计融合蛋白和多肽时，当然需要保留抗原的免疫原性。此外，在本发明的某些方面需要提供使融合蛋白具有热稳定性的构筑体。这一特征有利于以容易、节省时间和节省成本的方式回收目标抗原。在某些方面，可选择提供其它优势的抗原融合搭配物，所述优势包括增强免疫原性、并入多个疫苗决定子的可能性、缺乏对疫苗接种个体的预先免疫原性暴露。所关注的融合肽的其它有利性质包括使并入一个或一个以上抗原的操作变得容易的蛋白质，以及可能使疫苗制剂的制备、纯化和/或调配变得容易的蛋白质。所属领域的一般技术人员应了解三维呈现可能会影响这些有利特征中的每一种。因此，免疫性或优选性质的保留可能会影响例如融合搭配物的选择和/或融合位置的选择(例如N端、C端、内部、其组合)。其它或另外，优选可能会影响选择用于融合的区段的长度，无论其为抗原长度，还是为所选融合搭配物的长度。
本发明者已证明多种抗原可与热稳定性蛋白质成功融合。举例来说，本发明者已使用又称为地衣多糖酶的热稳定性载体分子LicB来产生融合蛋白。LicB是来自热纤梭菌的1，3-1，4-β葡聚糖酶(LicB)(基因库保藏编号X63355[gi40697]) MKNRVISLLMASLLLVLSVIVAPFYKAEAATVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWAN GSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKA AKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLG FDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWL GRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGVPQDNPTPTPTIAPSTPTNPNLPLKGDVNGDGHVN SSDYSLFKRYLLRVIDRFPVGDQSVADVNRDGRIDSTDLTMLKRYLIRAIPSL(SEQ IDNO82)。LicB属于球状蛋白质家族。基于LicB的三维结构，其N和C端彼此接近地位于表面上，极其接近于活性结构域。LicB还具有暴露于表面上的远离活性结构域定位的环结构。我们已产生构筑体以使得蛋白质的环结构和N和C端可用作流感抗原多肽的插入位点。流感抗原多肽可表达为N或C端融合物或插入表面环中的插入物。重要的是，LicB在低pH值和高温下(高达75℃)保持其酶活性。因此，使用LicB作为载体分子提供优势，包括可能增强目标特异性免疫原性、并入多个疫苗决定子的可能性和直接调配可以经鼻、经口或非经肠传递的疫苗。此外，在植物中制备LicB融合物应会降低动物或人类病原体的污染风险。参见本文所提供的实例。
本发明的包含流感抗原多肽的融合蛋白可在包括活体外与活体内系统等多种表达系统的任一种中制备。所属领域的技术人员将易于理解通常需要优化核酸序列以用于特定表达系统。举例来说，提供用于在植物中表达流感抗原-LicB融合物的例示性优化序列并且以SEQ ID NO83显示 5’

GGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYE VRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEY LHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIG VDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGrsklVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWAN GSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYvd

3’(SEQ IDNO83). 应注意在SEQ ID NO83中，粗体/下划线部分对应于信号序列，斜体/下划线部分对应于6×His标签和内质网滞留序列，而呈小写字母形式的两个部分对应于限制性位点。
因此，编码本发明的流感抗原多肽、融合蛋白和其免疫原性部分的任何相关核酸都打算涵盖在本发明的核酸构筑体中。
对于在植物系统中制备，可利用表达流感抗原(例如流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)的转基因植物。其它或另外，可使用所属领域中熟知的产生稳定生产作物的方法来制备转基因植物。另外，可使用利用短暂表达系统的植物来制备流感抗原多肽。当利用植物表达系统时，不管是利用在植物中转基因还是短暂表达，都可根据系统对所需抗原的适用性，利用细胞核表达、叶绿体表达、线粒体表达或病毒表达中的任一种。此外，可利用其它表达系统来制备本发明的抗原和融合蛋白。举例来说，可使用哺乳动物表达系统(例如哺乳动物细胞系[例如CHO等])、细菌表达系统(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫表达系统(例如杆状病毒)、酵母表达系统和活体外表达系统(例如网状组织溶解产物)来表达本发明的抗原和融合蛋白。
制备流感抗原 根据本发明，可在任何所需系统中制备流感抗原(包括流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)；制备不限于植物系统。载体构筑体和表达系统为所属领域中所熟知且可适合于结合使用本文所提供的流感抗原多肽。举例来说，流感抗原多肽可在已知表达系统中制备，所述表达系统包括哺乳动物细胞系统、转基因动物、微生物表达系统、昆虫细胞系统和植物系统(包括转基因和短暂植物系统)。具体来说，如果以融合蛋白形式制备流感抗原多肽，那么可能需要在非植物系统中制备所述融合蛋白。
在一些实施例中，希望在植物系统中制备流感抗原多肽。植物相对易于遗传操作，且具有数种优于诸如人类流体、动物细胞系、重组微生物和转基因动物等替代源的优点。植物对于蛋白质具有类似于哺乳动物的完善的翻译后修饰机构(但应注意到在植物与哺乳动物之间糖基化模式存在某些差异)。这使得能够在植物组织中制备生物活性试剂。同时，植物可经济地产生极大量的生物质，而无需复杂的设施。此外，植物不受动物病原体污染。如脂质体和微囊一般，预期植物细胞对抗原通过胃肠道提供保护。
可经由使用各种制备系统，利用植物来制备异源蛋白质。一种所述系统包括使用转基因/遗传改造植物，其中将编码目标产物的基因永久地并入到植物的基因组中。转基因系统可产生作物制备系统。多种外来蛋白质(包括许多哺乳动物来源的蛋白质和许多疫苗候选抗原)已在转基因植物中表达且显示具有功能活性。(塔科特(Tacket)等人，2000，传染病杂志(J.Infect.Dis.)，182302；和山瓦拉(Thanavala)等人，2005，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，1023378；两者都以引用的方式并入本文中)。另外，向未经免疫的人类志愿者投予表达乙型肝炎主要表面抗原的未经处理的转基因植物导致发生免疫反应(库塔(Kapusta)等人，1999，美国实验生物学联合会会志(FASEBJ.)，131796；以引用的方式并入本文中)。
一种用于在植物中表达多肽的系统利用经工程改造以表达外来序列(例如短暂表达)的植物病毒载体。这种方法允许使用健康非转基因植物作为快速制备系统。因此，遗传工程改造植物和经重组植物病毒感染的植物可充当“绿色工厂”以迅速产生和制备所关注的特定蛋白质。植物病毒具有某些使得其作为用于制备外来蛋白质的表达载体具有吸引力的优势。已充分表征植物RNA病毒的数个成员，且感染性cDNA克隆可用来促进遗传操作。感染性病毒遗传物质进入易感宿主细胞后，其复制成高含量且迅速传遍整个植物。存在数种使用植物病毒表达载体来制备目标多肽的方法，包括将目标多肽并入病毒基因组中。一种方法包括工程改造感染细菌、动物或植物的病毒的外壳蛋白以充当抗原性肽的载体分子。所述载体蛋白具有装配和形成在表面上呈现所需抗原性抗原决定基的重组病毒样粒子的能力。由于疫苗候选物的微粒性质有利于以容易且节省成本的方式从植物组织中回收，因此这种方法允许以节省时间的方式制备疫苗候选物。其它优势包括目标特异性免疫原性增强，并入多个疫苗决定子的可能性和易于调配成可以经鼻、经口或非经肠传递的疫苗。举例来说，含有带有与外壳蛋白融合的病毒的抗原决定基的重组植物病毒粒子的菠菜叶在投予后产生免疫反应(莫德斯卡(Modelska)等人，1998，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，952481；和友斯博(Yusibov)等人，2002，疫苗(Vaccine)，19/203155；两者都以引用的方式并入本文中)。
植物表达系统 本发明的教示适用于多种不同植物。一般来说，任何适于表达如本文所述的所引入构筑体的植物都适用于本发明。在许多实施例中，将需要使用幼苗来提高蛋白质/多肽产生的速度。如本文所指示，在许多实施例中，利用发芽的籽苗。如所属领域中已知，大多数芽生长迅速，从而由贮藏种子长出可食用植物。然而，所属领域的普通技术人员应了解，术语“发芽的籽苗”在本文中在较普遍情形下用于指幼苗，而不管品种是否通常归类为“芽”。生长足够长时间从而具有足够绿色生物质以便允许引入和/或表达如本文所提供的表达构筑体的任何植物(应认识到相关时间可以视表达构筑体的传递和/或表达模式而变化)在本文中可以视为“发芽的籽苗”。
在许多实施例中，利用可食用植物(即欲投予蛋白质或多肽的个体可食用(对所述个体无毒)的植物)。
根据本发明可利用容易并入和/或维持异源核酸且能够产生异源蛋白质的任何植物。一般来说，通常需要利用能够在指定条件下(例如在温室中和/或在水性系统中)生长的植物。可能需要选择通常不由人类或驯养动物食用的植物和/或通常不为人类食物链的部分的植物，以便其可在外界生长而无需考虑可能不当摄取所表达的多核苷酸。然而，在一些实施例中，可能需要使用可食用植物。在特定实施例中，将需要利用在植物的可食用部分累积所表达的多肽的植物。
通常，某些所需植物特征将由所欲表达的特定多核苷酸确定。仅举数个实例，当多核苷酸编码欲以高产量产生的蛋白质时(例如当将表达抗原蛋白时，情况通常如此)，通常需要选择具有相对高的生物质的植物(例如烟草，其具有其它优势，即其高度容易感染病毒，具有短生长期且不在人类食物链中)。如果多核苷酸编码完全活性要求特定翻译后修饰(或受特定翻译后修饰抑制)的抗原蛋白，那么某些植物物种完成相关修饰(例如特定糖基化)的能力(或无法完成)可指导选择。举例来说，植物能够完成某些翻译后修饰(例如糖基化)，然而，植物将不会产生哺乳动物翻译后修饰中所见的唾液酸化(sialyation)模式。因此，抗原的植物制备可能导致产生不同于替代系统中所产生的相同蛋白质序列的实体。
在某些实施例中，利用作物植物或作物相关植物。在某些特定实施例中，利用可食用植物。
用于本发明的植物包括被子植物(Angiosperm)、苔藓植物(Bryophyte)(例如苔纲(Hepaticae)、藓纲(Musci)等)、蕨类植物(Pteridophyte)(例如蕨类、楔叶类、石松植物)、裸子植物(Gymnosperm)(例如针叶树、苏铁(cycase)、银杏(Ginko)、买麻藤(Gnetale))和藻类(Algae)(例如绿藻纲(Chlorophyceae)、褐藻纲(Phaeophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Myxophyceae)、黄藻纲(Xanthophyceae)和裸藻纲(Euglenophyceae))。例示性植物为以下各科的成员豆科(Leguminosae)(豆科(Fabaceae)；例如豌豆、紫花苜蓿、大豆)；禾本科(Gramineae)(禾本科(Poaceae)；例如玉米、小麦、稻谷)；茄科(Solanaceae)，尤其西红柿属(Lycopersicon)(例如西红柿)、茄属(Solanum)(例如马铃薯、茄子)、番椒属(Capsium)(例如胡椒)或烟草属(Nicotiana)(例如烟草)；伞形科(Umbelliferae)，尤其胡萝卜属(Daucus)(例如胡萝卜)、旱芹属(Apium)(例如芹菜)或芸香科(Rutaceae)(例如橙)；菊科(Compositae)，尤其莴苣属(Lactuca)(例如莴苣)；十字花科(Brassicaceae/Cruciferae)，尤其芸苔属(Brassica)或芥子属(Sinapis)。在某些方面，本发明的植物可为芸苔属或拟南芥属(Arabidopsis)物种。一些例示性十字花科成员包括油菜(Brassica campestris)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleraceae)、撒哈拉芥(B.tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)和萝卜(Raphanussativus)。一些适于转化且发芽籽苗可食用的适合植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶状植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、可食用花(诸如向日葵)等。
多种植物物种可能适合于实施本发明。多种不同豆类和其它物种可以适于由从农杆菌构筑体(例如通过农杆菌渗透(agroinfiltration)引入)投放的病毒载体产生异源蛋白质，所述豆类和其它物种包括例如赤豆、紫花苜蓿、大麦、西兰花、比尔跳豆(billjumppea)、荞麦、卷心菜、花椰菜、三叶草、羽衣甘蓝、胡芦巴、亚麻、鹰嘴豆、青豆、日本菠菜、无头甘蓝、卡姆小麦(kamut)、甘蓝、大粒豌豆、绿豆、芥菜叶、斑豆、萝卜、红三叶草、大豆、斑点豌豆、向日葵、芜菁、黄夹豆和其他植物。在一些实施例中，比尔跳豆、青豆、大粒豌豆、斑点豌豆和/或黄夹豆特别适用于本发明的这一方面。因此，在某些实施例中，本发明提供在一种或一种以上所述植物中使用投放编码所关注的相关蛋白质或多肽的病毒构筑体(即具有植物病毒特征的RNA)的农杆菌载体制备蛋白质或多肽(例如抗原)。在一些实施例中，RNA具有AlMV的特征(和/或包括AlMV的序列)。在一些实施例中，RNA具有TMV的特征(和/或包括TMV的序列)。
应了解，一方面，本发明提供表达所关注的目标蛋白质或多肽的幼苗(例如发芽的籽苗)。在一些实施例中，幼苗是由转基因种子长出；本发明还提供可产生和/或用于本文所述的方法的种子。可使转有任何所关注基因的转基因种子发芽且任选诱导产生所关注的蛋白质或多肽。举例来说，可使能够表达任何所关注基因的种子发芽且通过以下方式诱导i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)含有病毒基因组的细菌。可使能够表达任何单克隆抗体的重链或轻链的转基因的种子发芽且通过以下方式诱导以产生全长分子i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)用含有病毒基因组的细菌接种。可使能够表达包含多个组分的复合分子(诸如sIgA)中的一种或一种以上组分的转基因的种子发芽，且通过以下方式使用以便产生全功能分子i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)用含有病毒基因组的细菌接种。可使来自健康非转基因植物的种子发芽且通过以下方式使用以便产生目标序列i)病毒感染；ii)农杆菌渗透；或iii)用含有病毒基因组的细菌接种。
在一些实施例中，幼苗是由非转基因的种子长出。通常，所述幼苗将包含指导所关注的蛋白质或多肽表达的病毒序列。在一些实施例中，所述植物还可包含农杆菌序列，任选包括“投放”病毒序列的序列。
将载体引入植物中 一般来说，可根据已知技术将载体传递到植物中。举例来说，可将载体本身直接施用到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种、真空渗透、粒子轰击或电穿孔)。其它或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒粒子，且可根据已知技术将其施用到其它植物。
已知多种感染各种植物物种的病毒，且可用于本发明的多核苷酸表达(参见例如，病毒分类和命名法(The Classification and Nomenclature of Viruses)，“国际病毒分类委员会第6次报告(Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses)”，(摩非(Murphy)等人编)，施普林格(Springer Verlag)纽约，1995；格日森(Grierson)等人，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，布莱克(Blackie)，伦敦，第126-146页，1984；格鲁兹曼(Gluzman)等人，分子生物学通讯病毒载体(Communications inMolecular BiologyViral Vectors)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约，第172-189页，1988；和马修(Mathew)，植物病毒在线(Plant Viruses Online)；所述文献全部都以引用的方式并入本文中)。在某些实施例中，传递共同允许病毒载体的复制(和任选细胞间移动和/或长距离移动)的多种不同载体，而不是向植物细胞传递单一病毒载体。转基因植物的基因组可编码一些或所有蛋白质。在本文中进一步详述的某些方面，这些系统包括一种或多种病毒载体组分。
载体系统包括两种异源植物病毒的组分以获得易于感染多种植物类型但仅造成极低感染传播风险或无感染传播风险的系统。先前已描述例示性系统(参见例如PCT公开案WO 00/25574和美国专利公开案2005/0026291，两者都以引用的方式并入本文中)。如本文所述，在本发明的特定方面，例如通过渗透或机械接种、喷雾等将病毒载体施用到植物(例如植物、植物的一部分、芽等)。如果欲通过将病毒基因组直接施用到植物来实现感染，那么可使用任何可用技术来制备基因组。举例来说，许多适用于本发明的病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或复制RNA拷贝来制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及保持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录来制备本发明的ssRNA载体。
在某些实施例中，引入多种不同病毒载体，而不是将单一病毒载体类型引入植物中。所述载体可例如关于诸如复制、细胞间移动和/或长距离移动等功能彼此反式互补。载体可含有编码本发明流感抗原多肽的不同多核苷酸。可如上文对于单一多核苷酸或多肽所述，对表达编码一种或多种流感抗原多肽的多种多肽的植物或其部分进行选择。
植物组织表达系统 如以上所讨论，根据本发明，流感抗原多肽可在任何所需系统中制备。载体构筑体和表达系统为所属领域中所熟知且可适合于结合使用本文所提供的流感抗原多肽。举例来说，已知转基因植物制备且可根据所属领域中已知的技术改适构筑体的产生和植物制备。在一些实施例中，需要植物中的短暂表达系统。这些系统中的两种包括克隆根和克隆植物系统和其衍生物的制备，以及发芽籽苗系统的制备。
克隆植物 克隆根经长时间和多个次培养均匀地在整个根中保持RNA病毒表达载体且稳定产生目标蛋白质。与植物不同，如果在细胞间移动或长距离移动期间经由重组消除目标基因，那么在根培养物中病毒载体的完整性得以保持且目标蛋白质随时间的产生量与在初始筛选期间所观察到的量相似。克隆根允许容易地制备用于抗原和疫苗组合物的口服调配物的异源蛋白质材料。先前已描述用于产生多种从植物获得且适用于制备抗原(例如本发明的抗原蛋白)的克隆实体的方法和试剂且其为所属领域中所已知(参见例如PCT公开案WO 05/81905；其以引用的方式并入本文中)。克隆实体包括能够产生抗原(例如本发明的抗原蛋白)的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物。本发明进一步提供用于在从各种植物组织(例如根、叶)获得的克隆细胞系和从单细胞获得的完整植物(克隆植物)中表达抗原多核苷酸和多肽产物的方法和试剂。所述方法通常是基于使用各种类型的植物病毒载体。
举例来说，一方面，本发明提供获得表达编码本发明的流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根系的方法，其包含以下步骤(i)将包含编码本发明的流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体引入植物或其部分中；和(ii)从植物产生一种或多种克隆根系。可例如通过用引起发根形成的农杆菌(例如发根农杆菌(A.rhizogenes))感染植物或植物部分(例如所收集的叶片)来产生克隆根系。可以各种方法筛选克隆根系以鉴别保持病毒的根系、以高水平表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的根系等。本发明进一步提供克隆根系，例如根据本发明的方法所产生的克隆根系，且进一步涵盖使用克隆根系表达多核苷酸和制备编码本发明流感抗原多肽的多肽的方法。
本发明进一步提供产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根细胞系的方法，其包含以下步骤(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将细胞保持在适于根细胞增殖的条件下。本发明提供克隆根细胞系和使用克隆根细胞系表达多核苷酸和制备多肽的方法。
一方面，本发明提供产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将培养物中的细胞保持在适于植物细胞增殖的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物细胞系的方法，其包含以下步骤(i)将包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体引入保持在培养物中的植物细胞系的细胞中；和(ii)富集含有病毒载体的细胞。可通过例如以下步骤来进行富集(i)从培养物中移出一部分细胞；(ii)稀释所移出的细胞以便降低细胞浓度；(iii)使所稀释的细胞增殖；和(iv)筛选含有病毒载体的细胞。可使用克隆植物细胞系制备本发明的流感抗原多肽。
本发明包括多种用于产生克隆植物的方法，所述植物的细胞含有包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体。举例来说，本发明提供产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤(i)产生克隆根系，其细胞含有基因组包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体；(ii)从克隆根系释放个别细胞；和(iii)将所释放细胞保持在适于形成植物的条件下。本发明进一步提供产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆植物的方法，其包含以下步骤(i)产生克隆植物细胞系，其细胞含有基因组包含编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体；和(ii)将细胞保持在适于形成植物的条件下。一般来说，本发明的克隆植物可表达任何编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸。可使用所述克隆植物制备抗原多肽。
如上文所述，本发明提供用于在克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系(例如从叶、茎等获得的细胞系)和克隆植物中表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的系统。使用基因组包括编码本发明流感抗原多肽且可操作地连接于启动子(即在启动子控制下)的多核苷酸的植物病毒载体将编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸引入植物祖细胞中。根据以下进一步描述的数种技术中的任一种，由含有病毒的细胞建立克隆根系或克隆植物细胞系。可通过感染、用病毒转录物或感染性cDNA克隆接种、电穿孔、T-DNA介导的基因转移等，将植物病毒载体或其部分引入植物细胞中。
以下部分描述用于产生表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和克隆植物的方法。“根系”与“根细胞系”的区别之处在于，根系产生实际根样结构或根，而根细胞系由不形成根样结构的根细胞组成。打算使用术语“系”来表明所述系的细胞可增殖且将遗传信息传递给后代细胞。细胞系的细胞通常在培养物中增殖而不会成为诸如那些在完整植物中发现的组织结构的一部分。打算使用术语“根系”来表明根结构中的细胞可增殖而不会成为完整植物的一部分。应注意术语“植物细胞”涵盖根细胞。然而，为区分本发明的用于产生根系和根细胞系的方法与那些用于从非根组织直接产生植物细胞系的方法(与从克隆根系或从克隆根系获得的克隆植物产生克隆植物细胞系相对比)，如本文所使用的术语“植物细胞”和“植物细胞系”通常是指由非根植物组织组成的细胞和细胞系。植物细胞可为例如叶、茎、芽、花部分等。应注意可从如本文中所获得产生的克隆植物获得种子。所述种子与从所述种子获得的植物一样可能含有病毒载体。用于获得种子储备物的方法为所属领域中所熟知(参见例如美国专利公开案2004/093643；以引用的方式并入本文中)。
克隆根系 本发明提供用于产生克隆根系的系统，在所述克隆根系中使用植物病毒载体来指导编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的表达。根据多种已知方法中的任一种，将一个或多个包括编码本发明流感抗原多肽且可操作地连接于启动子的多核苷酸的病毒表达载体引入植物或其部分中。举例来说，可用病毒转录物接种植物叶。可将载体本身直接施用到植物(例如经由研磨剂接种、机械化喷雾接种、真空渗透、粒子轰击或电穿孔)。其它或另外，可(例如从已感染植物)制备病毒粒子或可根据已知技术将病毒粒子施用到其它植物。
如果通过将病毒基因组直接施用到植物来实现感染，那么可使用任何可用技术来制备病毒基因组。举例来说，许多根据本发明适用的病毒具有ssRNA基因组。可通过在活体内或活体外转录基因组的DNA拷贝或复制RNA拷贝来制备ssRNA。考虑到易于使用的活体外转录系统(例如SP6、T7、网状组织溶解产物等)的易获得性，以及保持RNA载体的DNA拷贝的便利性，预期通常将通过尤其使用T7或SP6聚合酶的活体外转录来制备本发明的ssRNA载体。可使用感染性cDNA克隆。可根据所属领域中已知的方法，使用例如农杆菌渗透，使用农杆菌介导的基因转移将诸如病毒载体(整个病毒基因组或其部分)等病毒核酸转移到植物细胞。
接着可在适于病毒转录物复制的条件下保持(例如培养或生长)植物或植物部分。在某些实施例中，病毒传播到初始接种的细胞外，例如从细胞到细胞局部地传播和/或从初始接种的叶系统地传播到其它叶。然而，在一些实施例中，病毒不传播。因此，病毒载体可含有编码功能性MP和/或CP的基因，但可能缺乏所述基因中的一种或两种。一般来说，将病毒载体引入植物或其部分中的多个细胞中(感染所述细胞)。
将病毒载体引入植物中后，收集叶。一般来说，可在引入病毒载体后的任何时间收集叶。然而，将病毒载体引入植物中后，可能需要将植物保持一段时间，例如对于病毒复制和任选病毒从初始引入其的细胞传播来说足够的一段时间。通过例如以下进一步描述的已知方法来制备克隆根培养物(或多个培养物)。
一般来说，可使用任何可用方法从已引入病毒载体的植物或植物组织制备克隆根培养物。一种所述方法使用存在于某些细菌质粒中的基因。在感染多种生物体且将DNA转移到多种生物体的各种农杆菌物种中发现这些质粒。作为一个属，农杆菌可将DNA转移到一大组不同的植物类型，其包括许多双子叶与单子叶被子植物物种和裸子植物(参见例如，戈尔文(Gelvin)，2003，微生物与分子生物学评论(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)，6716和其中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。植物细胞的遗传转化的分子基础是从细菌转移且整合到存在于各种农杆菌物种中的大肿瘤诱导(Ti)或生根(Ri)质粒的区域的植物核基因组中。当存在于质粒中时，将这一区域称为T区，且当从质粒切除时称为T-DNA。通常，单链T-DNA分子在天然存在的农杆菌感染中转移到植物细胞中且最终并入(以双链形式)基因组中。基于Ti质粒的系统广泛用于将外来遗传物质引入植物中和制备转基因植物。
用各种农杆菌物种感染植物和转移T-DNA具有许多影响。举例来说，根癌农杆菌(A.tumefaciens)造成冠瘿病，而发根农杆菌造成在感染部位出现发根，即称为“发根病”的病状。各根是从单一遗传转化的细胞形成。因此，根中的根细胞为克隆细胞，且各根代表一个克隆细胞群体。发根农杆菌感染所产生的根的特征为高生长速率和遗传稳定性(格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotech.Adv.)，181和其中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。另外，所述根能够再生遗传稳定植物(格里(Giri)2000，见上)。
一般来说，本发明涵盖使用能够诱导由植物细胞形成根的任何农杆菌菌株，尤其任何发根农杆菌菌株。如上文所述，Ri质粒的一部分(Ri T-DNA)是引起发根病的原因。尽管将Ri质粒的这一部分转移到植物细胞宜通过用含有Ri质粒的农杆菌感染来实现，但本发明涵盖使用将相关区域引入植物细胞中的替代性方法。所述方法包括将遗传物质引入植物细胞中的任何可用方法，其包括(但不限于)基因枪、电穿孔、PEG介导的DNA吸收、Ti基载体等。可通过使用病毒载体将Ri T-DNA的相关部分引入植物细胞中。Ri基因可包括在含有编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的同一载体中，或可与含有编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的载体为相同或不同类型的不同病毒载体中。应注意，如所属领域中所已知，产生发根可能不需要整个Ri T-DNA，且本发明涵盖使用部分Ri T-DNA，但是所述部分含有足以诱导根形成的遗传物质。可将其它遗传物质(例如存在于Ri质粒而不是T-DNA中的基因)转移到本发明的植物细胞中，尤其是表达产物有利于T-DNA整合到植物细胞DNA中的基因。
为制备某些实施例的克隆根系，使所收集的叶部分在适于感染和转化的条件下与发根农杆菌接触。将叶部分保持在培养物中以让发根发育。各根为克隆根，即根中的细胞是来源于转移有Ri T-DNA的单一祖细胞。根据本发明，一部分所述祖细胞将含有病毒载体。因此，来源于所述祖细胞的根中的细胞可能含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传递。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意，由于克隆根内的子细胞遗传得到病毒载体，因此将病毒载体保持在整个根中并不需要病毒载体在根内移动。可从叶部分移出个别克隆发根并进一步培养。所述根在本文中又称为根系。分离后，分离出的克隆根继续生长。
已使用本发明的方法产生多种不同克隆根系。使用含有编码本发明流感抗原多肽(例如编码流感多肽、其融合物和/或其免疫原性部分)的多核苷酸的病毒载体产生这些根系。通过西方印迹法(Western blot)检验根系。根系呈现多种不同表达水平的各种多肽。选择呈现高表达的根系并进一步培养。随后再次检验这些根系且其显示长时间保持高表达水平，此表明稳定性。表达水平与以用于产生克隆根系的相同病毒载体感染的完整植物的表达相当或更大。另外，根系表达的稳定性优于用相同病毒载体感染的植物中所获得的稳定性。2-3次继代后，高达80％的所述病毒感染的植物恢复为野生型。(所述继代包括用转录物接种植物，允许感染(局部或系统性)形成，获得叶样品并接种新鲜植物，随后检验所述新鲜植物的表达)。
可大规模培养根系以制备如下文进一步讨论的本发明多肽的抗原。应注意通常可将克隆根系(和从克隆根系获得的细胞系)保持在不包括通常用于培养根和植物细胞的各种化合物(例如植物生长激素，诸如植物生长素(auxin)、细胞分裂素(cytokinin)等)的培养基中。这一特征大大地降低与组织培养相关的费用，且本发明者预期其将显著促进使用植物制备蛋白质的经济可行性。
可用多种方法中的任一种来选择表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆根。西方印迹法、ELISA分析等可用于检测所编码的多肽。在诸如GFP等可检测标记的情况下，可执行诸如目视筛选等替代性方法。如果使用含有编码可选择性标记的多核苷酸的病毒载体，那么可进行适当选择(例如，可在适当抗生素或营养条件和经鉴别且分离的存活根存在下，培养由此获得的叶材料和/或根)。某些病毒载体含有两种或两种以上编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸，例如两种或两种以上编码不同多肽的多核苷酸。如果这些多核苷酸中的一种为可选择或可检测标记，那么通过选择或检测标记的表达而选择或检测的克隆根将具有高度的也表达第二种多核苷酸的可能性。也可以使用PCR和其它核酸检测方法来进行含有特定多核苷酸的根系的筛选。
其它或另外，可通过接种由于病毒感染而形成局部病变的宿主植物(例如告敏感性宿主植物)来筛选存在病毒的克隆根系。举例来说，可在50μl磷酸盐缓冲液中将5mg根组织均质化且用以接种单一烟草植物叶。如果病毒存在于根培养物中，那么在2到3天内所感染的叶上将会出现特征性病变。这意谓根系含有带有编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的重组病毒。如果无局部病变形成，那么不存在病毒，且根系作为阴性而不被接受。这一方法高度节省时间和成本。初始筛选病毒的存在后，可通过例如西方印迹法或ELISA对含有病毒的根进行第二次筛选以选择高表达者。可应用其它筛选，例如筛选迅速生长、特定培养基中或特定环境条件下的生长等。一般来说，这些筛选方法可应用在本文所述的克隆根系、克隆根细胞系、克隆植物细胞系和/或克隆植物的任一个的发育中。
如对于所属领域的技术人员将显而易见，可对本发明方法的描述进行多种修改以用于产生含有病毒载体的克隆根系。所述修改处于本发明的范围内。举例来说，尽管通常需要在引入Ri T-DNA基因前将病毒载体引入完整植物或其部分中，但在某些实施例中，在引入病毒载体前引入Ri-DNA。另外，有可能使完整植物与发根农杆菌接触，而不是收集叶部分，然后使其暴露于细菌。
可使用从含有病毒载体的植物或其部分的单一细胞产生克隆根系的其它方法(即，不使用发根农杆菌或来自Ri质粒的遗传物质的方法)。举例来说，已知用某些植物激素或植物激素的组合处理会导致从植物组织产生根。
从克隆根系获得的克隆细胞系 如上文所述，本发明提供用于产生克隆根系的方法，其中根系中的细胞含有病毒载体。如所属领域中所熟知，可从根产生多种不同细胞系。举例来说，可使用多种已知方法从由根获得的个别根细胞产生根细胞系。可从根中的各种不同根细胞类型获得所述根细胞系。一般来说，收集根材料并解离(例如以物理方式和/或酶促消化)以释放个别根细胞，然后进一步培养。通常不必形成完整原生质体。需要时，可在极稀细胞浓度下涂铺根细胞，以便从单一根细胞获得根细胞系。以此方式获得的根细胞系为含有病毒载体的克隆根细胞系。因此，所述根细胞系展现编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的稳定表达。可通过例如在适当植物激素存在下培养解离的根细胞，以类似方式从克隆根获得克隆植物细胞系。可使用筛选和连续几轮富集来鉴别以高水平表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的细胞系。然而，如果获得细胞系的克隆根系已以高水平表达，那么所述其它筛选可能就不需要了。
如在克隆根系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆根细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意由于克隆根细胞系内的子细胞遗传得到病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体在细胞间移动。如下文所述，可使用克隆根细胞系来制备编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸。
克隆植物细胞系 本发明提供用于产生克隆植物细胞系的方法，在所述克隆植物细胞系中，使用植物病毒载体指导编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的表达。根据本发明方法，将一个或多个包括编码本发明流感抗原多肽且可操作地连接于启动子的多核苷酸的病毒表达载体引入保持在细胞培养物中的植物细胞系的细胞中。所属领域中已知来自各种植物类型的许多植物细胞系，可使用其中任一种。可根据用于实施本发明的已知方法来产生新近获得的细胞系。根据许多方法中的任一种，将病毒载体引入植物细胞系的细胞中。举例来说，可制备原生质体，然后用电穿孔将病毒转录物引入到细胞中。可使用其它将植物病毒载体引入植物细胞系的细胞中的方法。
一种用于产生本发明的克隆植物细胞系和适于引入植物细胞(例如原生质体)中的病毒载体的方法可如下使用在引入病毒载体后，可将植物细胞系保持在组织培养物中。此时，病毒载体可能会复制，且编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸可能得到表达。通过例如连续富集法，从培养物获得克隆植物细胞系。举例来说，可任选在稀释的同时，从培养物中移出样品以便细胞浓度较低，且以个别液滴形式涂铺于皮氏培养皿(Petridish)中。然后，保持液滴以让细胞分裂。
应了解，视培养物的初始密度和稀释量而定，液滴可含有可变数目的细胞。如果需要在仅一轮富集后获得表达编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的克隆细胞系，那么可稀释细胞以使得大多数液滴含有0或1个细胞。然而，选择使得各液滴中存在多个细胞的浓度并随后筛选液滴以鉴别那些含有表达细胞的液滴可能更为有效。一般来说，可采用任何适当筛选程序。举例来说，可使用诸如GFP等可检测标记的选择或检测。可使用西方印迹法或EL1SA分析。个别液滴(100μl)含有过量细胞以用于进行这些分析。进行多轮富集以连续分离较高表达的细胞系。可使用用于单细胞克隆的标准方法，通过进一步限制稀释来产生单克隆植物细胞系(即，从单一祖细胞获得的群体)。然而，不必分离个别克隆系。可使用含有多个克隆细胞系的群体来表达编码一种或多种本发明流感抗原多肽的多核苷酸。
一般来说，上述用于产生克隆根系的某些考虑因素适用于克隆植物细胞系的产生。举例来说，可使用多种含有一个或多个编码本发明流感抗原多肽的多核苷酸的病毒载体，也可使用多个不同载体的组合。可使用类似筛选法。如在克隆根系和克隆根细胞系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物细胞系的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意由于克隆植物细胞系内的子细胞遗传得到病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体在细胞间移动。如下文所述，可使用克隆植物细胞系来制备编码本发明流感抗原多肽的多肽。
克隆植物 可从根据上述各种方法所产生的克隆根、克隆根细胞系和/或克隆植物细胞系产生克隆植物。用于从根、根细胞系和植物细胞系(诸如本文所述的克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系)产生植物的方法为所属领域中所熟知(参见例如皮尔斯(Peres)等人，2001，植物细胞、组织、有机培养物(Plant Cell，Tissue，Organ Culture)，6537；以引用的方式并入本文中；和本文别处所引用的关于植物分子生物学和生物技术的标准参考著作)。因此，本发明提供一种产生克隆植物的方法，其包含以下步骤(i)根据上述本发明方法中的任一种产生克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物细胞系；和(ii)从克隆根系、克隆根细胞系或克隆植物产生完整植物。克隆植物可根据标准方法繁殖和生长。
如在克隆根系、克隆根细胞系和克隆植物细胞系的情况下一般，从含有病毒载体的单一祖细胞获得克隆植物的细胞，且其因此也将含有病毒载体，因为病毒载体将在细胞分裂期间复制和传播。因此，高比例(例如至少50％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％)、全部(100％)或实质上全部(至少98％)的细胞将含有病毒载体。应注意由于克隆植物内的子细胞遗传得到病毒载体，因此保持病毒载体并不需要病毒载体的移动。
芽和发芽籽苗植物表达系统 根据本发明，可使用多种不同系统中的任一种来在幼苗(例如发芽的籽苗)中表达蛋白质或多肽。在一些实施例中，产生转基因细胞系或种子，接着发芽和生长一段时间以便在幼苗组织中(例如在发芽的籽苗中)产生转基因序列中所包括的蛋白质或多肽。用于制备转基因植物细胞和/或种子的典型技术包括根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移和微弹轰击(microprojectile bombardment)或电穿孔。
先前已描述用于产生多种适用于制备本发明流感抗原多肽的芽和发芽籽苗的系统和试剂且其为所属领域中所已知(参见例如PCT公开案WO 04/43886；以引用的方式并入本文中)。本发明进一步提供可食用的发芽籽苗作为含有流感抗原多肽的生物质。在某些方面，直接提供生物质以供食用含有抗原的组合物。在某些方面，生物质在食用前通过例如均质化、粉碎、干燥或提取进行加工。在某些方面，从生物质纯化流感抗原多肽且调配成医药组合物。
另外提供用于在可以活体食用或收集的发芽籽苗(例如芸苔属的芽、发芽籽苗)中制备流感抗原多肽的方法。在某些方面，本发明包括使种子在封闭的可调节环境中(例如在室内、在容器中等)生长为可食用的发芽籽苗。种子可为含有编码流感抗原多肽的表达盒的遗传工程改造种子，所述流感抗原多肽的表达由外源诱导型启动子驱动。可使用可由例如光、热、植物激素、营养素等诱导的多种外源诱导型启动子。
在相关实施例中，本发明提供在发芽籽苗中制备流感抗原多肽的方法，所述方法首先通过使用农杆菌转化系统用编码流感抗原多肽的表达盒转化植物来产生发芽籽苗的种子储备物，其中流感抗原多肽的表达是由诱导型启动子驱动。可从转化植物获得转基因种子，使其在封闭的可调节环境中生长并诱导以表达流感抗原多肽。
在一些实施例中，提供包括用编码流感抗原多肽的病毒表达盒感染发芽籽苗的方法，所述流感抗原多肽的表达可由病毒启动子或诱导型启动子中的任一种驱动。使发芽籽苗在封闭的可调节环境中生长2到14天或至少直到已获得对食用或收集来说足量的流感抗原多肽。
本发明进一步提供在发芽籽苗中制备流感抗原多多肽的系统，所述系统包括可控制气候的容纳单元和含有编码一个或多个流感抗原多肽的表达盒的发芽籽苗，其中表达是由组成型或诱导型启动子驱动。系统可提供优于不可控制的室外环境或温室的独特优点。因此，本发明使得生长物能够精确安排流感抗原多肽表达的诱导。这可大大降低制备流感抗原多肽的时间和成本。
在某些方面，短暂转染的芽含有编码本发明流感抗原多肽的病毒载体序列。使籽苗生长一段时间以允许在芽中产生病毒核酸，接着生长一段产生多个病毒拷贝的时间，从而导致产生流感抗原多肽。
在某些方面，使含有编码流感抗原多肽的核酸的遗传工程改造的种子或胚芽在封闭的可调节环境中生长到发芽籽苗阶段。所述封闭的可调节环境可为种子可在室内生长的容纳单元或房间。封闭的可调节环境的所有环境因素都可控制。由于芽的生长不需要光，且光照费用较高，因此可使遗传工程改造的种子或胚芽在不存在光的情况下在室内生长到发芽籽苗阶段。
本发明的封闭的可调节环境中可调节的其它环境因素包括温度、湿度、水分、营养素、气体(例如，O2或CO2含量或空气循环)、化学物质(小分子，诸如糖和糖衍生物；或激素，诸如植物激素赤霉酸或脱落酸等)等。
根据本发明的某些方法，编码流感抗原多肽的核酸的表达可由外源诱导型启动子控制。使外源诱导型启动子响应于外部而不是内部刺激来增加或降低核酸表达。多种环境因素可充当遗传工程改造芽的表达盒所带的核酸的表达的诱导物。启动子可为热诱导型启动子，诸如热休克启动子(heat-shock promoter)。举例来说，使用热休克启动子，可简单地使封闭环境的温度上升来诱导核酸表达。其它启动子包括光诱导型启动子。如果封闭的可调节环境中的光总是开启的，那么可保持光诱导型启动子作为组成型启动子。其它或另外，可在发育期间的特定时间通过简单地开启光来启动核酸表达。启动子可为用于诱导核酸表达的化学诱导型启动子。根据这些实施例，可简单地将化学物质喷洒或喷雾在种子、胚芽或籽苗上以诱导核酸表达。可精确控制喷雾和喷洒且引导到预定目标种子、胚芽或籽苗上。封闭环境缺乏会使化学物质分散偏离预定目标的风流或气流，从而化学物质停留在预定目标上。
根据本发明，可选择诱导表达的时间以使得到收集时间时发芽籽苗中流感抗原多肽的表达最大。在特定生长阶段的胚芽中诱导表达、例如在萌发后特定天数时的胚芽中诱导表达可在收集时间时使得流感抗原多肽的合成最大。举例来说，在萌发后4天的启动子诱导表达可使得蛋白质合成比3天后或5天后的启动子诱导表达多。所属领域的技术人员应了解可由常规实验达成表达最大化。在某些方法中，在萌发后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天或12天时收集发芽的籽苗。
在表达载体具有组成型启动子而不是诱导型启动子的情况下，可在发芽籽苗转化后的某一时间收集发芽籽苗。举例来说，如果发芽籽苗在发育初期阶段(例如胚芽阶段)用病毒转化，那么可在转化后表达达到其最大值的时间，例如转化后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天收集发芽的籽苗。视种子的萌发而定，芽在转化后可能发育1、2、3个月或3个月以上。
一般来说，流感抗原多肽的表达开始后，允许种子、胚芽或发芽籽苗生长直到表达足量的流感抗原多肽。在某些方面，足量是当生食所收集的生物质时将向患者提供治疗益处的量。其它或另外，足量是可从生物质浓缩或纯化流感抗原多肽并将所述流感抗原多肽调配成在投予后向患者提供治疗益处的医药组合物的量。流感抗原多肽通常不是自然界中在发芽籽苗中所表达的蛋白质。无论如何，流感抗原多肽通常以高于自然界中发芽籽苗中会存在的浓度的浓度表达。
诱导流感抗原多肽表达后，允许继续生长直到发芽籽苗阶段，此时收集发芽的籽苗。可收集活的发芽籽苗。收集活的发芽籽苗具有数个优点，包括工作量和破坏最小。可以水栽法培养本发明的发芽籽苗，从而使得收集成为从水栽法溶液中取出发芽籽苗的简单事情。虽然本发明的发芽籽苗的生长不需要土壤，但如果所属领域的技术人员认为有必要或需要，那么可以提供土壤。因为芽可以无土生长，所以在收集时不需要清洗发芽籽苗材料。能够在不洗涤或擦洗的情况下直接从水栽法环境中收集发芽籽苗使对所收集材料的破坏最小。植物的破坏和枯萎诱发细胞凋亡。在细胞凋亡期间，某些蛋白水解酶变得具有活性，其会降解发芽籽苗中所表达的医药蛋白质，从而导致蛋白质的治疗活性降低。细胞凋亡诱导的蛋白水解可能会显著降低成熟植物的蛋白质产量。使用本发明的方法，当不进行收集时可避免细胞凋亡直到从植物提取蛋白质时为止。
举例来说，可研磨、粉碎或掺合活的芽以制备发芽籽苗生物质于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中的浆液。可将缓冲液维持在约4℃下。在一些方面，将发芽籽苗生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。如同在成熟植物中一般，这些方法中的一些方法(诸如风干)可能导致医药蛋白质的活性损失。然而，因为发芽籽苗极小且具有大的表面积与体积的比率，所以这很可能不会发生。所属领域的技术人员应了解，可利用许多使所表达蛋白质的蛋白水解最小的收集生物质的技术，且可将这些技术应用于本发明。
在一些实施例中，发芽的籽苗可食用。在某些实施例中，收集后(例如收集后立即、在收集后最短时间内)食用表达足量流感抗原多肽的发芽籽苗以使得在食用发芽的籽苗前绝对未进行加工。以此方式，使在向需要治疗的患者投予流感抗原多肽前流感抗原多肽的任何收集诱导的蛋白水解分解最小。举例来说，可向患者直接传递准备食用的发芽籽苗。其它或另外，向需要治疗的患者交付遗传工程改造的种子或胚芽并由患者培养到发芽籽苗阶段。一方面，向患者或治疗患者的医生提供一批遗传工程改造的发芽籽苗，以便可培养表达某些所需流感抗原多肽的发芽籽苗的连续储备物。这对无法承担或交付昂贵药物的发展中国家的人群来说可能特别有价值。培养本发明的发芽籽苗的容易性使得本发明的发芽籽苗尤其合乎所述发展中国家人群的需要。
封闭环境的可调节性质赋予本发明优于在室外环境中培养植物的优点。一般来说，培养在植物中表达医药蛋白质的遗传工程改造的发芽籽苗可提供相比于培养遗传工程改造的植物生长较快且工作量、风险和调节考虑因素较少的医药产品。本发明所使用的封闭的可调节环境降低或消除自然界中植物异花受粉的风险。
举例来说，热诱导型启动子可能不能在室外使用，因为室外温度无法控制。室外温度上升到超过某一水平的任何时间，启动子都将开启。类似地，每当室外温度下降时，启动子都将关闭。所述温度转变可能会在一天内发生，例如白天开启表达而在晚上关闭表达。热诱导型启动子(诸如本文中所述的那些启动子)甚至将不适合用于易受几乎与室外相同程度的气候转变影响的温室中。遗传工程改造植物在温室中的培养成本相当高。相比之下，在本发明系统中，每个变量都可控制，从而每次收集都可获得最大量的表达。
在某些实施例中，可在发芽籽苗发育期间的任何时间浇水、喷雾或喷洒的盘中培养本发明的发芽籽苗。举例来说，盘可配备有一个或多个可在发芽籽苗发育期间在特定时间且以精确量传递和/或去除水、营养素、化学物质等的浇水、喷雾、喷洒和排水设备。举例来说，种子需要足够水分来保持潮湿。过量水分穿过盘孔排出且进入房间地面的排水沟中。通常在将排出水排回到环境中之前，将其酌情处理以去除有害化学物质。
盘的另一个优点在于其可容纳在极小的空间内。因为发芽籽苗的生长不需要光，所以含有种子、胚芽或发芽籽苗的盘可一个叠一个地垂直紧密堆叠，从而在为了达到这些目的而特定构造的容纳设施中每单位占地面积提供大量生物质。另外，盘的堆叠可在容纳单元内以水平行排列。籽苗生长到适于收集的阶段(约2到14天)后，将个别籽苗盘人工地或以自动方式(诸如传送带)移到加工设施中。
本发明的系统的独特之处在于其提供作为流感抗原多肽来源的发芽籽苗生物质。无论直接食用还是加工成医药组合物形式，因为发芽籽苗是在封闭的可调节环境中生长，所以发芽籽苗生物质和/或从生物质获得的医药组合物都可以低成本提供给消费者。另外，可控制发芽籽苗的生长条件的事实使得产品品质和纯度一致。本发明的封闭的可调节环境避免可能阻止科学家在室外培养遗传工程改造的农产品的环境保护局(EPA)的许多安全规程。
转化芽 可使用多种方法转化植物细胞并产生遗传工程改造的发芽籽苗。两种可利用的要求在活体外产生转基因植物细胞系，接着使细胞系再生成完整植物的转化植物的方法包括根癌农杆菌介导的基因转移和微弹轰击或电穿孔。在一些实施例中，利用短暂表达系统。在植物组织中产生蛋白质或多肽的短暂表达的典型技术利用植物病毒。病毒转化提供在获得所需产物之前不会发生实验或生育滞后，更快速且不太昂贵的转化可收集的胚芽和发芽籽苗的方法。对于这些技术中的任一种，所属领域的技术人员应了解如何调整和优化传统上已经用于植物、种子、胚芽或发芽籽苗的转化方案。
本发明提供具有病毒表达系统(例如快速表达、高产生量)和农杆菌转化(例如控制投药)的优点的表达系统。具体来说，如以下所详细讨论，本发明提供农杆菌构筑体(即，在农杆菌中复制且因此可通过传递农杆菌而传递到植物细胞的构筑体)包括引入植物中后指导带有所关注蛋白质或多肽的基因的病毒序列(例如包括病毒复制序列)表达的植物启动子的系统。这一系统允许蛋白质或多肽在植物中以受控方式高水平短暂表达。
以下更详细地个别讨论表达系统的多个不同实施例，其中一些产生转基因植物而其它提供短暂表达。对于这些技术中的任一种，阅读本说明书的所属领域的技术人员应了解如何调整和优化用于在幼苗组织(例如发芽籽苗)中表达蛋白质或多肽的方案。
农杆菌转化 农杆菌是革兰氏阴性根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性属。这一物种造成植物肿瘤，诸如冠瘿病和发根病。在作为肿瘤特征的去分化植物组织中，农杆菌产生称为冠瘿碱(opine)的氨基酸衍生物并由植物分解代谢。负责冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的便利来源。根据本发明，可使用农杆菌转化系统产生仅早于成熟植物收集的幼苗(例如发芽籽苗，包括可食用发芽籽苗)。农杆菌转化方法可容易地应用于再生表达流感抗原多肽的发芽籽苗。
一般来说，用农杆菌转化植物包括通过与带有植物/细菌载体的根癌农杆菌共培养来转化在组织培养物中生长的植物细胞。所述载体含有编码流感抗原多肽的基因。农杆菌将载体转移到植物宿主细胞中，然后使用抗生素处理来清除农杆菌。选择表达流感抗原多肽的转化植物细胞，使其分化并最终再生成为完整小植物(海伦斯(Hellens)等人，2000，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)，42819；皮龙·史密兹(Pilon-Smits)等人，1999，植物生理学(Plant Physiolog.)，119123；巴菲尔德(Barfield)等人，1991，植物细胞报告(Plant Cell Reports)，10308；和瑞瓦(Riva)等人，1998，生物技术杂志(J.Biotech)，1(3)；全部都以引用的方式并入本文中)。
用于本发明中的农杆菌表达载体包括设计用于在植物中操作的编码流感抗原多肽的基因(或表达盒)以及表达盒的上游和下游的伴随序列(companion sequence)。伴随序列通常具有质粒或病毒来源且向载体提供必要的特征以将DNA从细菌转移到所需植物宿主中。
可能希望基本细菌/植物载体构筑体能提供广泛宿主范围的原核生物复制起点、原核生物可选择标记。合适的原核生物可选择标记包括针对诸如氨苄西林(ampicillin)或四环素(tetracycline)等抗生素的抗性。载体中可存在所属领域中熟知的编码其它功能的其它DNA序列。
农杆菌介导的将DNA转移到植物染色体需要农杆菌T-DNA序列。通常在构建农杆菌表达构筑体期间去除T-DNA的肿瘤诱导基因并用编码流感抗原多肽的序列置换。保留T-DNA边界序列，因为其启动T-DNA区域整合到植物基因组中。如果流感抗原多肽的表达不易被检测到，那么细菌/植物载体构筑体可包括适于确定植物细胞是否已转化的可选择标记基因，例如npt II卡那霉素(kanamycin)抗性基因。Ti序列位于同一或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上。Ti序列包括编码一组负责T-DNA切除、转移和整合到植物基因组中的蛋白质的毒性基因(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，2371176-86；以引用的方式并入本文中)。适于允许异源序列整合到植物基因组中的其它序列可包括用于同源重组的转座子序列(transposon sequence)等。
Ti序列位于同一或不同细菌/植物载体(Ti质粒)上。Ti序列包括编码一组负责T-DNA切除、转移和整合到植物基因组中的蛋白质的毒性基因(谢尔(Schell)，1987，科学(Science)，2371176-83；以引用的方式并入本文中)。适于允许异源序列整合到植物基因组中的其它序列也可包括用于同源重组的转座子序列(transposon sequence)等。
某些构筑体将包括编码抗原蛋白的表达盒。在指定转化中可使用1个、2个或更多个表达盒。除含有流感抗原多肽编码序列外，重组表达盒还含有至少以下元件启动子区域、植物5′非翻译序列、起始密码子(视所表达基因是否自身具有而定)以及转录和翻译终止序列。另外，本发明的表达盒或嵌合基因中可包括转录和翻译终止子。表达盒中酌情可包括允许蛋白质加工和易位的信号分泌序列。
多种启动子、信号序列以及转录和翻译终止子例如在劳顿(Lawton)等人(1987，植物分子生物学(Plant Mol Biol)，9315-24；以引用的方式并入本文中)和美国专利5,888,789(以引用的方式并入本文中)中有所描述。另外，通常利用抗生素抗性的结构基因作为选择因子(弗雷利(Fraley)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，804803-7；以引用的方式并入本文中)。表达盒的5′和3′末端的独特限制酶位点允许容易地插入预先存在的载体中。
用于农杆菌介导转化且带有至少一个T-DNA边界序列的其它二元载体系统在PCT公开案WO 2000/020612(以引用的方式并入本文中)中有所描述。对农杆菌介导转化的进一步讨论见于戈尔文(Gelvin)(2003，微生物与分子生物学评论(Microbiol Mol BiolRev.)，6716-37；和其中的参考文献；全部都以引用的方式并入本文中)和劳伦思(Lorence)和费尔波尔特(Verpoorte)(2004，分子生物学方法(Methods Mol Biol)，267329-50；以引用的方式并入本文中)中。
在某些实施例中，使用除农杆菌以外的细菌将核酸序列引入植物中。参见例如布鲁斯特(Broothaerts)等人(2005，自然(Nature)，433629-33；以引用的方式并入本文中)。
由已受农杆菌(或其它细菌)感染以便引入编码所关注的蛋白质或多肽的所需异源基因的植物制备种子。收集、干燥、清洁所述种子并检验其存活力和所需基因产物的存在和表达。这一点被测定后，通常就将种子储备物储存在适当温度、湿度、卫生和安全条件下以供必要时使用。然后可从所培养的原生质体再生完整植物，例如如伊维恩斯(Evans)等人(植物细胞培养手册(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷，麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.)，纽约(New York，NY)，1983；以引用的方式并入本文中)和瓦斯尔(Vasil)(编，植物细胞培养和体细胞遗传学(Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants)，学术出版社(Acad.Press)，佛罗里达州奥兰多(Orlando，FL)，第I卷，1984和第III卷，1986；以引用的方式并入本文中)所述。在某些方面，植物仅再生到发芽籽苗阶段。在一些方面，再生完整植物以产生种子储备物且从种子储备物的种子产生发芽的籽苗。
在某些实施例中，植物不再生成成熟植物。举例来说，在一些实施例中，植物仅再生到发芽籽苗阶段。在其它实施例中，再生完整植物以产生种子储备物且从所述种子储备物的种子产生本发明中所使用的幼苗(例如发芽的籽苗)。
可根据本发明用农杆菌转化原生质体可分离和培养以产生完整再生植物的所有植物，以回收含有转移基因的完整植物。已知几乎所有植物都可从培养的细胞或组织再生，包括(但不限于)产生可食用芽的植物的所有主要物种。一些合适的植物包括紫花苜蓿、绿豆、萝卜、小麦、芥菜、菠菜、胡萝卜、甜菜、洋葱、大蒜、芹菜、大黄、叶状植物(诸如卷心菜或生菜)、水田芹或水芹、草本植物(诸如欧芹、薄荷或三叶草)、花椰菜、西兰花、大豆、小扁豆、可食用花(诸如向日葵)等。
从转化细胞再生植物的方式随植物物种的不同而变化。然而，所属领域的技术人员应了解通常首先提供含有异源基因拷贝的转化原生质体的悬浮液。形成愈伤组织且可从愈伤组织诱导出芽，随后生根。其它或另外，可从原生质体悬浮液诱导胚芽形成。这些胚芽如同天然胚芽一样萌发形成植物。将种子浸泡在水中或用水喷雾种子以使种子的水分含量增加到35-45％之间，从而启始萌发。为使萌发继续进行，通常在控制温度和气流条件下将种子保持在饱含水分的空气中。培养基通常将含有各种氨基酸和激素，诸如植物生长素和细胞分裂素。宜向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸，尤其对诸如紫花苜蓿等物种来说。芽和根通常同时发育。有效再生将视培养基、基因型和培养历史而定。如果这三个变量受到控制，那么再生完全可再现和可重复。
使从转化植物细胞长成的成熟植物自花授粉并鉴别非隔离纯合转基因植物。近亲繁殖的植物产生含有本发明抗原编码序列的种子。可使所述种子萌发并生长到发芽籽苗阶段以产生本发明的流感抗原多肽。
在相关实施例中，转基因种子(例如带有编码流感抗原多肽的转移基因，通常整合到基因组中)可形成为种子产品并与关于如何使幼苗生长到适当阶段(例如发芽籽苗阶段)以收集和/或投予或收集到医药组合物中的说明书一起出售。在一些相关实施例中，可从本发明的近亲繁殖植物发展体现所需性状的杂交品种或新品种。
直接整合 还可通过微弹轰击或电穿孔将DNA片段直接整合到植物细胞的基因组中来将编码流感抗原多肽的表达构筑体引入到本发明的植物组织中(参见例如，奇科特(Kikkert)等人，1999，植物组织培养协会杂志(PlantJ.Tiss.Cult.Assoc.)，3543；和巴特斯(Bates)，1994，分子生物技术(Mol.Biotech.)，2135；两者都以引用的方式并入本文中)。更具体来说，可利用多种技术将表达本发明的流感抗原多肽的载体引入植物细胞中。如上文所述，载体可包括用于植物细胞中的可选择标记。载体可包括允许在二级宿主中选择和传播的序列，诸如含有复制起点和可选择标记的序列。二级宿主通常包括细菌和酵母。在一些实施例中，二级宿主是细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)，复制起点为colE1型复制起点)而可选择标记是编码氨苄西林抗性的基因。所述序列为所属领域中所熟知且可购得(例如克隆泰克公司(Clontech)，加利福尼亚州帕洛阿尔托(Palo Alto，CA)；或斯群他根公司(Stratagene)，加利福尼亚州拉霍亚(La Jolla，CA))。
本发明的载体可修饰为含有与根癌农杆菌载体具有同源性的区域、来自根癌农杆菌的T-DNA边界区域和上述嵌合基因或表达盒的中间植物转化质粒。其它载体可包括根癌农杆菌的卸甲(disarmed)植物肿瘤诱导质粒。
根据一些实施例，本发明载体的直接转化可能包括通过使用微量吸液管机械转移重组DNA来将载体直接微量注入植物细胞中(参见例如，克罗斯威(Crossway)，1985，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)，202179，以引用的方式并入本文中)。可使用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中(参见例如，克莱恩斯(Krens)等人，1982，自然(Nature)，29672；以引用的方式并入本文中)。另一种将核酸引入植物中的方法是通过小珠粒或粒子的基质内或表面上具有核酸的小粒子的高速弹道渗透(参见例如，克莱因(Klein)等人，1987，自然(Nature)，32770；和克努德森(Knudsen)等人，植物(Planta)，185330；两者都以引用的方式并入本文中)。另一种引入方法是使原生质体与其它实体(小型细胞、细胞、溶酶体或其它可融合脂质表面体)融合(参见例如，费雷利(Fraley)等人，1982，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，791859；以引用的方式并入本文中)。可通过电穿孔将本发明的载体引入植物细胞中(参见例如，佛姆(Fromm)等人，1985，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，825824；以引用的方式并入本文中)。根据这一技术，在含有基因构筑体的质粒存在下电穿孔植物原生质体。高磁场强度的电脉冲可逆地渗透生物膜，从而允许引入质粒。电穿孔植物原生质体重新形成细胞壁分割且形成植物愈伤组织，愈伤组织可再生以形成本发明的发芽籽苗。所属领域的技术人员应了解如何利用这些方法转化可用于产生可食用发芽籽苗的植物细胞。
病毒转化 类似于常规表达系统，可使用植物病毒载体制备全长蛋白质，包括全长抗原。根据本发明，可使用植物病毒载体感染种子、胚芽、发芽籽苗等并在其中产生抗原。在这点上，感染包括将病毒基因组或其部分引入细胞中的任何方法，包括(但不限于)病毒的天然感染方法、擦伤、接种等。所述术语包括将基因组RNA转录物或其cDNA拷贝引入细胞中。病毒基因组不需要完整基因组，但通常将含有足以允许复制的序列。基因组可以编码病毒复制酶且可以含有复制所必需的任何顺式作用核酸元件。编码短肽以及大的复杂蛋白质的外源基因的高水平表达(例如通过烟草花叶病毒载体)已有描述(参见例如，麦克考米克(McCormick)等人，1999，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，96703；库玛盖(Kumagai)等人，2000，基因(Gene)，245169；和维奇(Verch)等人，1998，免疫方法杂志(J.Immunol Methods)，22069；其全部都以引用的方式并入本文中)。因此，植物病毒载体具有已证明的表达短肽以及大的复杂蛋白质的能力。
在某些实施例中，利用宿主/病毒系统产生表达流感抗原多肽的幼苗(例如芽)。由病毒感染产生的幼苗提供已经证明安全的转基因蛋白质来源。举例来说，芽未受动物病原体污染。不同于例如烟草，来自可食用芽的蛋白质至少在理论上可不经纯化而用于经口应用，因此成本显著降低。
另外，病毒/幼苗(例如芽)系统提供简单得多、价格较低廉的扩大规模和制造的途径，因为相关基因(编码所关注的蛋白质或多肽)是被引入到病毒中，而所述病毒可在数日内生长到商业规模。相比之下，转基因植物在足够的种子或植物材料可供大规模试验或商业化利用之前可能需要长达5-7年。
根据本发明，植物RNA病毒具有某些优点，这使其作为外来蛋白质表达的载体而引人注意。多种植物RNA病毒的分子生物学和病理学已经充分表征，且存在相当多的关于病毒生物学、遗传学和调控序列的知识。大多数植物RNA病毒具有小基因组且感染性cDNA克隆可用于促进遗传操纵。感染性病毒物质进入易感宿主细胞后，其复制到高含量且快速传遍整个发芽籽苗(接种后1到10天，例如接种后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或10天以上)。病毒粒子可容易且经济地从受感染的发芽籽苗组织回收。病毒具有广泛宿主范围，从而使得能够使用单一构筑体来感染数种易感物种。这些特征可容易地转移到芽上。
通常可通过用所需序列置换一个病毒基因、通过将外来序列插入病毒基因组中的适当位置或通过使外来肽与病毒的结构蛋白融合，从植物RNA病毒表达外来序列。此外，可组合任何这些方法以通过反向互补病毒的重要功能来表达外来序列。存在许多不同策略作为使用烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)、紫花苜蓿花叶病毒(alfalfamosaic virus，AlMV)和其嵌合体在病毒感染的植物中表达外来序列的手段。
AlMV的基因组是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)的代表性病毒且由三个基因组RNA(RNA1-3)和亚基因组RNA(RNA4)组成。基因组RNA1和2分别编码病毒复制酶蛋白P1和P2。基因组RNA3编码细胞间移动蛋白P3和外壳蛋白(coat protein，CP)。CP是从由基因组RNA3合成的亚基因组RNA4翻译，且为起始感染所需。研究已证明CP与多种功能有关，包括基因组活化、复制、RNA稳定性、症状形成和RNA衣壳化(encapsidation)(参见例如波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，4673；范德沃森(Van Der Vossen)等人，1994，病毒学(Virology)，202891；俞斯波维(Yusibov)等人，病毒学(Virology)，208405；俞斯波维(Yusibov)等人，1998，病毒学(Virology)，2421；波尔(Bol)等人，(综述，100篇参考文献(Review，100refs.))，1999，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)，801089；德格拉夫(De Graaff)，1995，病毒学(Virology)，208583；贾斯帕斯(Jaspars)等人，1974，病毒研究进展(Adv.Virus Res.)，1937；洛谢费里斯(Loesch-Fries)，1985，病毒学(Virology)，146177；尼尔曼(Neeleman)等人，1991，病毒学(Virology)，181687；尼尔曼(Neeleman)等人，1993，病毒学(Virology)，196883；范德库衣(Van Der Kuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，183731；和范德库衣(Van DerKuyl)等人，1991，病毒学(Virology)，185496；其全部都以引用的方式并入本文中)。
使病毒从种子、胚芽或发芽籽苗的接种部分长距离移动到未接种部分和系统性感染通常需要病毒粒子衣壳化。根据本发明，接种可在植物发育的任何阶段进行。在胚芽和芽中，接种病毒的传播将非常快。AlMV病毒粒子由独特的CP(24kD)衣壳化，形成1种以上类型的粒子。粒子的尺寸(长度为30到60nm且直径为18nm)和形状(球形、椭球形或杆状)视衣壳化RNA的尺寸而定。组装后，认为AlMV CP的N端位于病毒粒子的表面上且似乎不干扰病毒组装(波尔(Bol)等人，1971，病毒学(Virology)，673；以引用的方式并入本文中)。另外，在N端具有另一38个氨基酸的肽的ALMV CP在活体外形成粒子且保留生物活性(俞斯波维(Yusibov)等人，1995，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol)，77567；以引用的方式并入本文中)。
AlMV具有广泛宿主范围，包括大量农业上有价值的作物植物，包括植物种子、胚芽和芽。这些特征一起使ALMV CP成为载体分子的极佳候选物，并使AlMV成为在发育的芽阶段在植物中表达外来序列的有吸引力的候选载体。此外，从诸如TMV等异源载体表达后，AlMV CP在不干扰病毒感染性的情况下衣壳化TMV基因组(俞斯波维(Yusibov)等人，1997，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci，USA)，945784；以引用的方式并入本文中)。这允许使用TMV作为与外来序列融合的AlMV CP的载体病毒。
烟草花叶病毒的原型TMV具有由经17.0kD CP衣壳化的单一正义RNA组成的基因组，其产生杆状粒子(长度为300nm)。CP是TMV的唯一结构蛋白且为病毒在受感染宿主中衣壳化和长距离移动所需(塞托(Saito)等人，1990，病毒学(Virology)，176329；以引用的方式并入本文中)。从基因组RNA翻译出183kD和126kD蛋白质且所述蛋白质为病毒复制所需(石川(Ishikawa)等人，1986，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，148291；以引用的方式并入本文中)。30kD蛋白质是病毒的细胞间移动蛋白(美什(Meshi)等人，1987，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)，62557)。从亚基因组mRNA翻译出移动蛋白和外壳蛋白(亨特(Hunter)等人，1976，自然(Nature)，260759；布鲁宁(Bruening)等人，1976，病毒学(Virology)，71498；和比奇(Beachy)等人，1976，病毒学(Virology)，73498；其全部都以引用的方式并入本文中)。
可用于将编码流感多肽的基因引入植物细胞中的其它方法包括转化植物的花。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的转化可通过将植物花浸泡在根癌农杆菌的溶液中来实现(库提斯(Curtis)等人，2001，转基因研究(Transgenic Res.)，10363；和青(Qing)等人，2000，分子育种植物改良中的新策略(Molecular BreedingNew Strategies in PlantImprovement)，167；两者都以引用的方式并入本文中)。在“浸泡”植物所产生的种子群体中形成转化植物。在花发育期间的特定时点，子房壁中存在小孔，根癌农杆菌能穿过小孔进入子房内部。进入子房内部后，根癌农杆菌使个别胚珠增殖并转化(德斯菲克斯(Desfeux)等人，2000，植物生理学(Plant Physiology)，123895；以引用的方式并入本文中)。转化胚珠遵循子房内种子形成的典型路径。
农杆菌介导的短暂表达 如本文所说明，在本发明的许多实施例中，需要在植物中快速(例如短暂)表达蛋白质或多肽的系统。本发明提供一种达成所述在植物(尤其在幼苗，例如发芽的籽苗)中快速表达的有效系统，其利用农杆菌构筑体来传递编码流感多肽的病毒表达系统。
具体来说，根据本发明，制备“投放载体”，其含有包括复制序列的农杆菌序列且还含有带有编码所关注的蛋白质或多肽的基因的植物病毒序列(包括自我复制序列)。优选通过允许实质上系统性传递的农杆菌渗透法，将投放载体引入植物组织中。对于短暂转化来说，投放载体的未整合T-DNA拷贝暂时保持存在于核中并且转录，引起载运基因的表达(卡普拉(Kapila)等人，1997，植物科学(Plant Sci.)，122101-108；以引用的方式并入本文中)。与病毒载体不同，农杆菌介导的短暂表达无法使所关注基因的表达系统性传播。这一系统的一个优势在于可克隆长于2kb的基因以产生无法利用病毒载体获得的构筑体(韦因尼特(Voinnet)等人，2003，植物杂志(Plant J.)，33949-56；以引用的方式并入本文中)。此外，使用所述技术，可用一种以上转基因来转化植物，以使得能够表达并组装多聚蛋白质(例如复合蛋白质的抗体亚单位)。此外，可通过分别渗透或使用混合培养基来利用通过与不同农杆菌共渗透而进行多种转基因共表达的可能性。
在某些实施例中，投放载体包括允许在农杆菌中进行选择(或至少检测)以及在渗透组织中进行选择/检测的序列。此外，投放载体通常包括在植物中转录引起病毒RNA产生，随后产生病毒蛋白质的序列。此外，病毒蛋白质和病毒RNA的产生引起快速产生多个拷贝的编码所关注医药活性蛋白质的RNA。所述产生使得在相对短的时间内快速产生所关注的目标蛋白质。因此可产生用于制备蛋白质的高效系统。
利用病毒表达载体的农杆菌渗透技术可用于制备有限量的所关注蛋白质，以便在确定其是否值得产生转基因植物之前检验表达水平。其它或另外，利用病毒表达载体的农杆菌渗透技术适用于快速产生能够作为主要生产平台而产生大量蛋白质的植物。因此，这种短暂表达系统可以工业规模使用。
进一步提供可在本发明的这些和其它方面使用的多种不同农杆菌质粒、二元质粒或其衍生物中的任一种，诸如pBIV、pBI1221、pGreen等。大量合适载体为所属领域中所已知且可根据所属领域中已知的方法或本文所述的方法加以引导和/或修饰，以便能够用于本文所提供的所述方法中。
例示性投放载体pBID4含有花椰菜花叶病毒(DNA植物病毒)的35S启动子，其驱动重组病毒基因组在引入植物中后的初始转录；和nos终止子，即农杆菌胭脂碱(nopaline)合成酶的转录终止子。所述载体进一步含有包括用于病毒复制(126/183K)和细胞间移动(MP)的基因的烟草花叶病毒基因组序列。载体进一步含有插入烟草花叶病毒基因组序列内的独特克隆位点处且转录受外壳蛋白亚基因组mRNA启动子控制的编码所关注多肽的基因。由于这一“目标基因”(即编码所关注的蛋白质或多肽的基因)置换TMV外壳蛋白的编码序列，故所得病毒载体为相比于含CP载体不易经历重组且无法在环境中有效传播和存活的自我复制裸RNA。左和右边界序列(LB和RB)划定在利用带有载体的重组农杆菌渗透植物后转移到植物细胞中的投放载体区域的界限。在将带有这一载体的农杆菌引入植物组织中(通常通过农杆菌渗透法进行，但或者可通过注射或其它方式进行)后，产生多个LB与RB之间的序列的单链DNA(ssDNA)拷贝并于数分钟内释放。随后通过病毒复制来扩增这些所引入的序列。目标基因的翻译导致在短时间内积累大量目标蛋白质或多肽。
在一些实施例中，农杆菌介导的短暂表达每千克植物组织产生多达约5g或更多目标蛋白质。举例来说，在一些实施例中，每千克植物组织产生多达约4g、约3g、约2g、约1g或约0.5g目标蛋白质。在一些实施例中，每千克植物组织产生至少约20mg到约500mg或约50mg到约500mg目标蛋白质，或约50mg到约200mg、或约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、约1000mg、约1500mg、约1750mg、约2000mg、约2500mg、约3000mg或更多目标蛋白质。
在一些实施例中，这些表达水平在从渗透起约6周、约5周、约4周、约3周或约2周内达到。在一些实施例中，这些表达水平在从引入表达构筑体起约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或甚至约1天内达到。因此，从引入(例如渗透)到收集的时间通常小于约2周、约10天、约1周或更短时间。这允许在从选择氨基酸序列起约8周或更短时间内(甚至包括“预备”表达研究的时间)制备蛋白质。每一批蛋白质通常也可在约8周、约6周、约5周或更短时间内产生。所属领域的技术人员应了解，这些数值可视所使用的植物类型而略有变化。大部分芽(包括豌豆)将在指定数值的范围内。然而，本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)因生长较慢(来自小得多的种子)，而可能生长较长时间(尤其在渗透之前)。所属领域的技术人员根据所利用的特定植物的生物学将清楚其它预期的调节。
本发明者已使用投放载体系统在多种不同幼苗中制备多种目标蛋白质和多肽。在一些实施例中，包括例如大粒豌豆、比尔跳豆、黄夹豆、斑点豌豆和青豆的某些豌豆品种尤其适用于实施本发明的这一方面。
本发明者还发现，各种烟草属植物尤其适用于实施本发明的这一方面，尤其包括本塞姆氏烟草。所属领域的技术人员应了解，烟草属植物通常不被视为“芽”。尽管如此，本发明仍教示，烟草属幼苗(尤其本塞姆氏烟草幼苗)适用于实施本发明。一般来说，在一些实施例中，本塞姆氏烟草植物在渗透(例如传递含有投放载体的农杆菌)之前生长一段足以允许适量生物质发育的时间。通常，所述植物在渗透之前生长大于约3周、更通常大于约4周或约5到约6周的时间以积累生物质。
本发明者还意外地发现，尽管证实TMV与AlMV序列可在所述投放载体构筑体内有效，但在一些实施例中，AlMV序列对于确保高水平制备所传递的蛋白质或多肽特别有效。
因此，在本发明的某些特定实施例中，在豌豆幼苗或烟草属幼苗(例如本塞姆氏烟草)中由指导带有所关注基因的AlMV序列产生的投放载体制备所关注的蛋白质或多肽。
表达构筑体 适用于本发明的表达构筑体的许多特征将特别针对如上文所讨论的所用的特定表达系统。然而，可能适用于不同表达系统的某些方面将在此更详细地讨论。
举一例来说，在本发明的许多实施例中，将需要所关注的蛋白质或多肽(或核酸)的表达是可诱导的。在许多所述实施例中，编码所关注的蛋白质或多肽的RNA的产生(和/或反义RNA的产生)是在诱导型(例如外源诱导型)启动子的控制下。外源诱导型启动子可响应外部而非内部刺激来增加或减少转录物的表达。许多环境因素可充当所述外部刺激。在某些实施例中，转录受热诱导型启动子(诸如热休克启动子)控制。
外部诱导型启动子可尤其适用于受控的可调节生长环境的情形。举例来说，使用热休克启动子，可简单地使封闭环境的温度上升来诱导相关转录物的表达。当然，应了解，由于室外温度无法控制，故在室外从不使用热诱导型启动子。室外温度上升到超过某一水平的任何时间，启动子都将开启。类似地，每当室外温度下降时，启动子都将关闭。所述温度转变可在一天内发生，例如白天开启表达而晚上关闭表达。热诱导型启动子(诸如本文所述的那些启动子)甚至将不适合用于易受几乎与室外相同程度的气候转变影响的温室中。遗传工程改造植物在温室中的培养成本相当高。相比之下，在本发明系统中，每个变量都可控制，从而每次收集都可实现最大量的表达。
用于本发明的其它外部诱导型启动子包括光诱导型启动子。如果封闭的可调节环境中的光总是开启的，那么可保持光诱导型启动子作为组成型启动子。或者，可在发育期间的特定时间通过简单地开启光来启动相关转录物的表达。
在其它实施例中，使用化学诱导型启动子来诱导相关转录物的表达。根据这些实施例，可简单地将化学物质喷洒或喷雾在种子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上以诱导相关转录物的表达。可视需要精确控制喷雾和喷洒且引导到特定种子、胚芽或幼苗(例如籽苗)上。封闭环境缺少会使化学物质分散偏离预定接受者的风流或气流，因此化学物质停留在预定接受者上。
抗原的制备和分离 一般来说，可使用所属领域中已知的标准方法培养或生长本发明的植物、植物细胞和/或植物组织(例如克隆植物、克隆植物细胞、克隆根、克隆根系、芽、发芽的籽苗、植物等)以制备抗原。已采用多种培养基和生物反应器来培养发根细胞、根细胞系和植物细胞(参见例如，格里(Giri)等人，2000，生物技术进展(Biotechnol.Adv.)，181；雷奥(Rao)等人，2002，生物技术进展(Biotechnol Adv.)，20101；和前述两者中的参考文献，其全部都以引用的方式并入本文中)。可以任何合适的方式培养克隆植物。
在某一实施例中，本发明的流感抗原多肽可通过任何已知方法制备。在一些实施例中，在植物或其部分中表达流感抗原多肽。根据所属领域中已知的常规条件和技术来分离和纯化蛋白质。这些技术包括诸如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等方法。本发明涉及使用所属领域中已知和本文所提供的多种植物表达系统(包括本文所述的病毒植物表达系统)中的任一种来纯化流感抗原多肽并以能承担的规模制备流感抗原多肽。
在本发明的许多实施例中，将需要分离流感抗原多肽以用于疫苗产品。当本发明的蛋白质从表达其的植物组织或其部分(例如根、根细胞、植物、植物细胞)制备时，对于从植物材料部分或完全分离中的任一情况来说，可使用本文进一步详述的方法或所属领域中已知的任何适用方法。当需要将表达产物从表达所述表达产物的一些或所有植物细胞或组织中分离时，可采用任何可用的纯化技术。所属领域的技术人员熟悉多种分级分离和分离程序(参见例如，斯考普斯(Scopes)等人，蛋白质纯化原理与实践(ProteinPurificationPrinciples and Practice)，第3版，杰逊(Janson)等人，1993；蛋白质纯化原理、高分辨率方法和应用(Protein PurificationPrinciples，High Resolution Methods，andApplications)，威利-VCH(Wiley-VCH)，1998；施普林格(Springer-Verlag)，纽约(NY)，1993；和罗意(Roe)，蛋白质纯化技术(Protein Purification Techniques)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2001；其各自以引用的方式并入本文中)。通常将需要使产物的纯度高于约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。关于适用于从植物组织或流体纯化物质的某些方法的讨论，参见例如美国专利6,740,740和6,841,659(两者都以引用的方式并入本文中)。
所属领域的技术人员应了解，获得所需流感抗原多肽产物的方法是提取。可提取植物材料(例如根、叶等)以从残余生物质中移出所需产物，从而增加产物的浓度和纯度。可在缓冲溶液中提取植物。举例来说，可将植物材料转移到一定量的已用例如磷酸盐缓冲液缓冲的冰冷水(彼此重量比为1∶1)中。需要时可添加蛋白酶抑制剂。可通过用力掺合或研磨使植物材料碎裂，同时悬浮于缓冲溶液中，且通过过滤或离心移出所提取的生物质。可通过其它步骤来进一步纯化溶液中所带有的产物或通过冷冻干燥或沉淀转化为干粉。提取可通过挤压来进行。植物或根可通过在压榨机中挤压或通过将其穿过间距紧密的滚筒时粉碎来提取。根据所属领域中熟知的方法收集和加工从粉碎植物或根中挤出的流体。通过挤压来提取使得产物以更浓的形式释放。然而，产物的总体产率可能比在溶液中提取产物时低。
在一些实施例中，所制备的蛋白质或多肽不从植物组织分离，而是在活植物(例如发芽的籽苗)的情形下提供。在一些实施例中，当植物可食用时，直接提供含有所表达的蛋白质或多肽的植物组织供食用。因此，本发明提供含有所表达的蛋白质或多肽的可食用幼苗生物质(例如可食用发芽籽苗)。
当可食用植物(例如发芽的籽苗)表达足量的医药蛋白质或多肽且活体食用时，在一些实施例中，在食用发芽的籽苗前绝对不进行收集。以此方式，确保在向需要治疗的患者投予医药蛋白质之前医药蛋白质不存在收集诱导的蛋白水解分解。举例来说，可直接向患者传递准备食用的幼苗(例如发芽的籽苗)。或者，向需要治疗的患者传递遗传工程改造的种子或胚芽并由患者培养到发芽籽苗阶段。在一些实施例中，向患者或治疗患者的医生提供一批遗传工程改造的发芽籽苗，以便可培养表达某些所需医药蛋白质的发芽籽苗的连续储备物。这对无法承担或交付昂贵药物的发展中国家的人群来说可能特别有价值。培养本发明的发芽籽苗的容易性使得本发明的发芽籽苗尤其合乎所述发展中国家人群的需要。
在一些实施例中，植物生物质在食用或调配前通过例如均质化、粉碎、干燥或提取进行加工。在一些实施例中，从生物质分离或纯化所表达的蛋白质或多肽并调配成医药组合物。
举例来说，可研磨、粉碎或掺合活植物(例如芽)以产生生物质于含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中的浆液。所述缓冲液优选处于约4℃。在某些实施例中，将生物质风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥。如同在成熟植物中一般，这些方法中的一些方法(诸如风干)可能导致医药蛋白质或多肽的活性损失。然而，因为植物(例如发芽的籽苗)可能极小且通常具有大的表面积与体积的比率，所以这很可能不会发生。所属领域的技术人员应了解，可利用许多使医药蛋白质或多肽的蛋白水解最小的收集生物质的技术，且可将这些技术应用于本发明。
疫苗 本发明提供包含至少一种流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的疫苗组合物，希望其在投予个体后引发生理作用。疫苗蛋白可具有对抗病症或疾病的恢复治愈或缓和性质且可投予用于改善缓解、减轻疾病或病症、延迟疾病或病症的发作、逆转或降低疾病或病症的症状或严重程度。包含流感抗原多肽的疫苗可具有预防性质且可用于预防或延迟疾病发作，或降低所述疾病、病症或病理学病状出现时的严重程度。用本发明的抗原治疗个体所引发的生理作用可包括有效免疫反应，以致生物体感染受阻。在标题为“投药”的部分中更详细地讨论关于向有需要的个体投予流感抗原多肽的考虑因素。
一般来说，有效疫苗接种包括使个体的免疫系统暴露于一种或多种视为不需要、非所需和/或外来的且引发内源性免疫反应的药剂。通常，所述免疫反应导致抗原特异性天然淋巴细胞活化，接着产生分泌抗体的B细胞或抗原特异性效应细胞和记忆T细胞或两者。这一方法会产生长久的保护性免疫性，所述免疫性可不时地通过重复暴露于相同抗原性物质而加强。
在一些实施例中，包含至少一种流感抗原多肽的疫苗组合物为亚单位疫苗。一般来说，亚单位疫苗包含纯化抗原而非完整生物体。亚单位疫苗不具有感染性，因此其可安全地提供给免疫抑制的人员，且其很少会诱导不利免疫反应和/或其它不良副作用。亚单位疫苗的一个潜在缺点是，抗原可能不会保留其天然构形，以致针对亚单位所产生的抗体可能不会识别病原体表面上的相同蛋白质；且经分离的蛋白质不会刺激免疫系统以及完整生物体疫苗。因此，在一些情形下，可能需要以高于全药剂疫苗(例如活减毒疫苗、灭活病原体疫苗等)的剂量投予亚单位疫苗以便达到相同治疗作用。相比之下，全药剂疫苗(诸如利用活减毒病原体或灭活病原体的疫苗)通常产生剧烈免疫反应，但其使用具有限制。举例来说，活疫苗病毒株有时会引起感染性病理学，尤其当投予免疫功能不全的接受者时。此外，许多病原体，尤其病毒(诸如流感)在其基因组中经历连续快速突变，这使其逃脱对抗原性不同的疫苗病毒株的免疫反应。
在一些实施例中，本发明的亚单位疫苗包含植物产流感抗原多肽(例如如本文所述的HA和/或NA多肽)可以极低剂量投予且刺激免疫反应。在一些实施例中，可使用小于约100μg、小于约90μg、小于约80μg、小于约70μg、小于约60μg、小于约50μg、小于约40μg、小于约35μg、小于约30μg、小于约25μg、小于约20μg、小于约15μg、小于约5μg、小于约4μg、小于约3μg、小于约2μg或小于约1μg的植物产流感抗原多肽和/或其免疫原性部分刺激免疫反应和/或预防流感感染、延迟流感感染的发作和/或提供针对流感感染的防御。
在一些实施例中，本发明提供针对流感的亚单位疫苗。在一些实施例中，亚单位疫苗包含至少部分从非抗原性组分纯化的抗原。举例来说，亚单位疫苗可为流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物体(诸如植物、病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞、蛋等)中表达，但至少部分从活生物体的非抗原组分纯化。在一些实施例中，亚单位疫苗至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％从表达抗原的生物体的非抗原组分纯化。在一些实施例中，亚单位疫苗可为化学合成的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。
在一些实施例中，亚单位疫苗可为流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在活生物体(诸如植物、病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞、蛋等)中表达，但并不至少部分从活生物体的非抗原组分纯化。举例来说，亚单位疫苗可为流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其是在直接投予个体以引发免疫反应的活生物体中表达。在一些实施例中，亚单位疫苗可为在如本文所述的植物中表达的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其中将植物材料直接投予个体以引发免疫反应。
本发明提供医药流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分，其作为治疗性和/或预防性治疗流感感染的亚单位疫苗具有活性。在某些实施例中，流感抗原多肽可由本发明的植物或其部分(例如根、细胞、芽、细胞系、植物等)产生。在某些实施例中，所提供的流感抗原多肽是在植物、植物细胞和/或植物组织(例如芽、发芽的籽苗、根、根培养物、克隆细胞、克隆细胞系、克隆植物等)中表达，且可从植物直接使用或部分纯化或纯化为用于医药学上投予个体的制剂。
本发明提供表达流感抗原多肽的植物、植物细胞和植物组织，其在投予有需要的个体时保持医药活性。例示性个体包括脊椎动物(例如哺乳动物，诸如人类)。根据本发明，个体包括兽医学个体，诸如牛、羊、犬、猫等。在某些方面，将治疗有效量的可食用植物或其部分(例如芽、根)经口投予个体。在一些方面，以如本文所述的医药制剂提供一种或多种流感抗原多肽。
当需要调配包含植物材料的流感疫苗时，通常将需要利用对相关接受者(例如人类或其它动物)无毒的植物。在适当考虑保持表达产物的活性的情况下，可根据所属领域中已知的技术简单地收集和加工相关植物组织(例如细胞、根、叶)。在某些实施例中，需要在可食用植物中(且具体来说是在植物的可食用部分中)具有所表达的流感抗原多肽以便可随后食用所述材料。举例来说，如果经口传递后(适当调配时)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中产生抗原蛋白且调配所表达的流感抗原多肽以便与一些或所有表达蛋白质的植物材料一起经口传递。
本发明的疫苗组合物包含一种或多种流感抗原多肽。在某些实施例中，所投予的疫苗组合物中包括正好一种流感抗原多肽。在某些实施例中，所投予的疫苗组合物中包括至少两种流感抗原多肽。在一些方面，组合疫苗可包括一种包含流感抗原多肽的热稳定性融合蛋白；在一些方面，提供两种或两种以上包含流感抗原多肽的热稳定性融合蛋白。
在一些实施例中，疫苗组合物包含正好一种HA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好一种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好两种HA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好两种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好三种HA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好三种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。
在一些实施例中，疫苗组合物包含正好一种HA多肽和正好一种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好两种HA多肽和正好两种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好三种HA多肽和正好三种NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽和四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含正好一种HA多肽和两种或两种以上(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。在一些实施例中，疫苗组合物包含两种或两种以上(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽和正好一种NA多肽。
在一些实施例中，疫苗组合物包含两种或两种以上流感抗原多肽和/或其免疫原性部分的多胞形(即两个或两个以上氨基酸序列的串联融合物)。举例来说，在一些实施例中，多胞形包含正好一种HA多肽。在一些实施例中，多胞形包含包含正好一种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好两种HA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好两种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好三种HA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好三种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽。在一些实施例中，多胞形包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。
在一些实施例中，多胞形包含正好一种HA多肽和正好一种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好两种HA多肽和正好两种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好三种HA多肽和正好三种NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽和四种或四种以上(例如4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含正好一种HA多肽和两种或两种以上(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)NA多肽。在一些实施例中，多胞形包含两种或两种以上(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种或更多种)HA多肽和正好一种NA多肽。
当利用组合疫苗时，应了解流感抗原多肽的任何组合都可用于所述组合。组合物可包括多种流感抗原多肽，包括本文所提供的多种抗原。此外，组合物可包括本文所提供的一种或多种抗原以及一种或多种其它抗原。流感抗原多肽的组合包括从一种或多种各种亚型或病毒株获得的流感抗原多肽以使免疫作用赋予针对一种以上感染类型的免疫反应。流感抗原多肽的组合可包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或更多种从不同亚型或病毒株获得的抗原。在一些组合中，将至少两种或至少三种来自不同亚型的抗原组合于一种疫苗组合物中。此外，组合疫苗可利用流感抗原多肽和来自一种或多种独特感染剂的抗原。
其它疫苗组分 本发明的疫苗组合物可另外包括任何合适的佐剂以在投予个体时增强疫苗的免疫原性。举例来说，所述佐剂可包括(但不限于)皂角苷，诸如皂树(Quillaja saponaria，QS)提取物，包括食品级QS的纯化子部分，诸如Quil A和QS21；明矾；金属盐粒子(氢氧化铝、磷酸铝等)；矿物油；MF59；Malp2；不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′sadjuvant)；完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)；3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)；脂质A；百日咳杆菌(Bortadella pertussis)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)(新泽西州罗韦的默克公司(Merck andCompany，Inc.，Rahway，NJ))；角鲨烯；病毒颗粒；水包油乳液(例如SBAS2)；脂质体调配物(例如SBAS1)；等。其它佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如如WO 96/02555中所揭示的未甲基化CpG序列。预期诸如上文提及的佐剂等不同佐剂的组合提供作为TH1细胞反应的优选刺激剂的佐剂。举例来说，QS21可与3D-MPL一起调配。QS213D-MPL的比率通常将为约1∶10到10∶1、1∶5到5∶1，且通常实质上为1∶1。最佳协同作用的所需范围可为2.5∶1到1∶1的3D-MPLQS21。适用于人类疫苗调配物的纯化QS提取物的剂量为每千克体重0.01mg到10mg。
应注意某些热稳定性蛋白质(例如地衣多糖酶)本身可显示免疫反应增强活性，使得所述蛋白质无论是在与流感抗原多肽融合使用时还是分开使用时都可考虑作为佐剂使用。因此，本发明的疫苗组合物可进一步包含一种或多种佐剂。某些疫苗组合物可包含两种或两种以上佐剂。此外，视调配物和投药途径而定，特定调配物和/或组合中可能需要某些佐剂。
在某些情况下，可能需要通过减缓皮下或肌肉内注射的疫苗产品(例如蛋白质)的一种或多种组分的吸收来延长本发明疫苗的作用。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。产品的吸收速率则视其溶解速率而定，而溶解速率又可视大小和形式而定。其它或另外，通过将产品溶解或悬浮于油性媒剂中来实现非经肠投予的产品的延迟吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解聚合物中形成蛋白质的微胶囊基质来制备可注射储积形式。视产品与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质而定，可控制释放速率。可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可通过将产品裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储积式可注射调配物。口服调配物可使用替代聚合物传递媒剂。举例来说，可使用诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等可生物降解、生物相容性聚合物。可将抗原或其免疫原性部分调配成微粒，例如与聚合物传递媒剂组合。
可将疫苗抗原的经肠投予制剂以固体、半固体、悬浮液或乳液形式引入，且可与任何医药学上可接受的载剂(诸如水、悬浮剂和乳化剂)混合。可借助于泵或持续释放形式投予抗原，尤其当作为预防措施投予时，以便预防个体中疾病的发展或改善或延迟已确诊的疾病。可将补充活性化合物，例如针对欲治疗的疾病或临床病状独立地具有活性的化合物，或增强本发明化合物的活性的化合物并入组合物中或与组合物一起投予。可使用香料和着色剂。
任选与植物组织一起，本发明的疫苗产品尤其充分适合于以医药组合物形式经口投予。可使用口服液体调配物且其对于儿童群体可具有特别效用。视所需治疗产品的性质和其所需形式而定，可以多种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任一种来加工所收集的植物材料。可经口单独摄取或与食物或饲料或饮料一起摄取如上所述的所述组合物。用于经口投予的组合物包括植物；植物提取物，和以干粉、食物、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的从感染植物纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，其包括生理食盐水和缓冲中间非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液(Ringer′sdextrose solution)、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。干粉的实例包括任何已干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的植物生物质。举例来说，可通过将植物置于商业风干机中约120°F下风干植物，直到生物质含有小于5重量％的水分。可贮存所干燥的植物以供进一步加工成大块固体或通过研磨进一步加工成具有所需目数大小的粉末。其它或另外，冷冻干燥可用于对风干敏感的产物。可通过将产物置于真空干燥器中并在真空下干燥冷冻来冷冻干燥产物，直到生物质含有小于约5重量％的水分。可如本文所述进一步加工干燥的材料。
可将从植物获得的材料以一种或多种草本制剂形式投予或与一种或多种草本制剂一起投予。适用的草本制剂包括液体和固体草本制剂。草本制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)、粉末(例如冻干粉末)和液体。可在诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂量等任何标准传递媒剂中提供草本制剂。所属领域的技术人员应了解各种可适用于本发明的传递草本制剂的调配物和形式。
本发明的医药调配物可另外包含医药学上可接受的赋形剂，如本文中所使用，所述赋形剂包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。雷氏药学科学与实践(Remington′s The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，A.R.杰纳罗(A.R.Gennaro)(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott，Williams & Wilkins)，马里兰州巴尔的摩(Baltimore，MD)，2006)揭示用于调配医药组合物的各种赋形剂和其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物都不相容，诸如产生任何不合需要的生物作用或另外以有害方式与医药组合物的任何其它组分相互作用，否则其使用涵盖在本发明的范围内。
在一些实施例中，医药学上可接受的赋形剂的纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，赋形剂获准用于人类和兽医用途。在一些实施例中，赋形剂经美国食品药物管理局(United States Food and DrugAdministration)批准。在一些实施例中，赋形剂为医药级赋形剂。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(United States Pharmacopoeia，USP)、欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia，EP)、英国药典(British Pharmacopoeia)和/或国际药典(InternationalPharmacopoeia)的标准。
用于制造医药组合物的医药学上可接受的赋形剂包括(但不限于)惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油类。所述赋形剂可任选包括在调配物中。根据调配者的判断，诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂等赋形剂可存在于组合物中。
例示性稀释剂包括(但不限于)碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
例示性成粒剂和/或分散剂包括(但不限于)马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶(guar gum)、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯吡咯烷酮)(交联聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素(croscarmellose))、甲基纤维素、预胶凝化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝

月桂基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。
例示性表面活性剂和/或乳化剂包括(但不限于)天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄芪胶、角叉菜(chondrux)、胆固醇、三仙胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶态粘土(例如膨润土[硅酸铝]和
)、长链氨基酸衍生物、高分子量醇(例如硬酯醇、鲸蜡醇、油醇、三乙酸甘油酯单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(carbomer)(例如羧基聚亚甲基、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧基乙烯基聚合物)、角叉菜胶(carrageenan)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、粉末状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯

聚氧乙烯脱水山梨糖醇

聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯

脱水山梨糖醇单棕榈酸酯

脱水山梨糖醇单硬脂酸酯

脱水山梨糖醇三硬脂酸酯

甘油单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯

)、聚氧乙烯酯(例如聚氧乙烯单硬脂酸酯

聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基蓖麻油、聚氧化亚甲基硬脂酸酯和

)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如

)、聚氧乙烯醚、(例如聚氧乙烯月桂基醚

)、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、二乙二醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、油酸钠、油酸钾、油酸乙酯、油酸、月桂酸乙酯、月桂基硫酸钠、


西曲溴铵(cetrimonium bromide)、氯化十六烷基吡锭、氯苄烷铵(benzalkonium chlorid)、多库酯钠(docusate sodium)等和/或其组合。
例示性粘合剂包括(但不限于)淀粉(例如玉米淀粉、淀粉糊等)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇等)；天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰藓(Irish moss)提取物、潘瓦树胶(panwar gum)、印度树胶(ghatti gum)、艾萨普(isapol)外皮的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝

落叶松阿拉伯半乳聚糖(larcharabogalactan)等)；海藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇等；和其组合。
例示性防腐剂可包括(但不限于)抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。例示性抗氧化剂包括(但不限于)α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。例示性螯合剂包括乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、柠檬酸单水合物、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、依地酸(edetic acid)、反丁烯二酸、苹果酸、磷酸、乙二胺四乙酸钠、酒石酸和/或乙二胺四乙酸三钠。例示性抗微生物防腐剂包括(但不限于)氯苄烷铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯甲醇、溴硝丙二醇(bronopol)、西曲溴铵、氯化十六烷基吡锭、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪唑烷基脲(imidurea)、苯酚、苯氧基乙醇、苯基乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。例示性抗真菌防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。例示性醇防腐剂包括(但不限于)乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚系化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯基乙醇。例示性酸性防腐剂包括(但不限于)维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括(但不限于)生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去铁胺(deteroxime mesylate)、西曲溴铵、丁基化羟基大茴香醚(butylated hydroxyanisol，BHA)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluened，BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(sodiumlauryl sulfate，SLS)、月桂基醚硫酸钠(sodium lauryl ether sulfate，SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、

对羟基苯甲酸甲酯、

KATHONTM和/或
例示性缓冲剂包括(但不限于)柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、缓血酸胺、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原质水、等渗生理食盐水、林格氏溶液、乙醇等和/或其组合。
例示性润滑剂包括(但不限于)硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等和其组合。
例示性油类包括(但不限于)扁桃油、杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油(babassu)、香柠檬油、黑加仑籽油、琉璃苣油、杜松油、春黄菊油、菜籽油、苋蒿子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鳕肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、苦瓜油、葡萄籽油、榛果油、海索草油、十四烷酸异丙酯、荷荷芭油(jojoba)、夏威夷核果油(kukui nut)、杂薰衣草油(lavandin)、熏衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油(macadamia nut)、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、深海鱼油(orange roughy)、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、茶梅油、香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅酮油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、岩兰草油、胡桃油和小麦胚芽油。例示性油类包括(但不限于)硬脂酸丁酯、辛酸三酸甘油酯、癸酸三酸甘油酯、环甲聚硅氧烷、癸二酸二乙酯、二甲聚硅氧烷360、十四烷酸异丙酯、矿物油、辛基十二醇、油醇、硅酮油和/或其组合。
用于经口和非经肠投予的液体剂型包括(但不限于)医药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性剂外，液体剂型还可包含所属领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，诸如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在用于非经肠投予的某些实施例中，将组合物与诸如

醇、油类、改性油类、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合等增溶剂混合。
可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性悬浮液)可根据已知技术，使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来调配。无菌可注射制剂可为非经肠可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒剂和溶剂包括水、林格氏溶液、U.S.P.及等渗氯化钠溶液。无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。诸如油酸等脂肪酸可用于制备可注射剂。
可注射调配物可例如通过经由截留细菌的过滤器和/或通过并入杀菌剂来杀菌，呈在使用之前可溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。
用于经直肠或经阴道投予的组合物通常为栓剂，其可通过将组合物与在环境温度下为固体但在体温下为液体且因此在直肠或阴道腔中熔融并释放活性成分的合适无刺激性赋形剂(诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备。
用于经口投予的固体剂型包括胶囊、片剂、药丸、粉末和颗粒。在所述固体剂型中，活性成分与以下各物混合至少一种医药学上可接受的惰性赋形剂，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙；和/或填充剂或增量剂(例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)；粘合剂(例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)；保湿剂(例如甘油)；崩解剂(例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)；溶解延迟剂(例如石蜡)；吸收促进剂(例如季铵化合物)；湿润剂(例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)；吸附剂(例如高岭土和膨润土)；和润滑剂(例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠)；和其混合物。在胶囊、片剂和药丸的情况下，剂型可包含缓冲剂。
类似类型的固体组合物可以用作使用诸如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的经填充的软和硬明胶胶囊中的填充剂。片剂、糖衣药丸、胶囊、药丸和颗粒的固体剂型可使用涂层和外壳(诸如肠溶衣)和医药调配技术中所熟知的其它涂层来制备。其可任选包含遮光剂且可具有任选以延迟方式仅或优先在肠道的某一部分中释放活性成分的组成。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物和蜡。类似类型的固体组合物可以用作使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的经填充的软和硬明胶胶囊中的填充剂。
任选与植物组织一起，疫苗产品尤其充分适合于以医药组合物形式经口投予。可使用口服液体调配物且其对于儿童群体可具有特别效用。视所需治疗产品的性质和其所需形式而定，可以多种方式(例如风干、冷冻干燥、提取等)中的任一种来加工所收集的植物材料。可经口单独摄取或与食物或饲料或饮料一起摄取如上所述的所述组合物。用于经口投予的组合物包括植物；植物提取物；和以干粉、食物、水性或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的从感染植物纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载剂包括水、水醇溶液、乳液或悬浮液，其包括生理食盐水和缓冲中间非经肠媒剂，包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖溶液、右旋糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或不挥发性油。干粉的实例包括任何已干燥(例如冷冻干燥、风干或喷雾干燥)的植物生物质。举例来说，可通过将植物置于商业风干机中约120°F下来风干植物，直到生物质含有小于5重量％的水分。可贮存所干燥的植物以供进一步加工成大块固体或通过研磨进一步加工成具有所需目数大小的粉末。其它或另外，冷冻干燥可用于对风干敏感的产物。可通过将产物置于真空干燥器中且在真空下干燥冷冻来冷冻干燥产物，直到生物质含有小于约5重量％的水分。可如本文所述进一步加工干燥的材料。
可将从植物获得的材料以一种或多种草本制剂形式投予或与一种或多种草本制剂一起投予。适用的草本制剂包括液体和固体草本制剂。草本制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如水性提取物、醇提取物)、煎剂、干燥制剂(例如风干、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)、粉末(例如冻干粉末)和液体。可在诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂量等任何标准传递媒剂中提供草本制剂。所属领域的技术人员应了解各种可适用于本发明的传递草本制剂的调配物和形式。
在一些方法中，将表达本发明的流感抗原多肽的植物或其部分或其生物质以医用食物形式经口投予。如果呈固体形式，那么通常通过生食来食用所述可食用组合物，或如果呈液体形式，那么通过饮用来食用。可在无预先加工步骤的情况下或在最小限度的烹饪制备后，直接摄取植物材料。举例来说，可使疫苗抗原在可直接食用的芽中表达。举例来说，疫苗抗原在紫花苜蓿芽、绿豆芽或菠菜或莴苣叶芽等中表达。在一些实施例中，可加工植物生物质且摄取加工步骤后回收的材料。
适用于本发明的加工方法为常用于食品或饲料工业的方法。所述方法的最终产品通常包括实质量的所表达抗原且其适宜食用或饮用。可将最终产品与诸如盐、载剂、风味增强剂、抗生素等其它食物或饲料形式混合，且以固体、半固体、悬浮液、乳液或液体形式食用。所述方法可包括保存步骤，例如巴氏消毒法(pasteurization)、蒸煮或添加保存和防腐剂。在本发明中可使用和加工任何植物以产生可食用或可饮用植物物质。可通过所属领域中的标准方法(例如凝胶电泳、ELISA或西方印迹法分析)，使用探针或产物特异性抗体来测试从植物获得的制剂中流感抗原多肽的量。可使用这一测定将所摄取的疫苗抗原蛋白的量标准化。举例来说，可通过例如混合具有不同含量的产物的多批产物来确定和调节疫苗抗原的量，以便待饮用或食用以摄取单次剂量的材料量可得到标准化。然而，本发明的封闭的可调节环境应使进行所述标准化程序的需要最小。
植物细胞或组织中所产生且由个体食用的疫苗蛋白可优选由消化系统吸收。摄取仅经最低限度地加工的植物组织的一个优势是使蛋白质囊封或隔离在植物细胞中。因此，产物在到达胃或肠之前可能会受到至少一些保护以防在上消化道中消化，且较高比例的活性产物将可供吸收。
用于局部和/或经皮投予本发明化合物的剂型可包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉末、溶液、喷雾、吸入剂和/或贴片。通常，在可能需要时，在无菌条件下将活性成分与医药学上可接受的赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲剂混合。另外，本发明涵盖使用经皮贴片，其通常具有使化合物受控传递至身体的额外优点。例如通过将化合物溶解和/或分散于适当介质中来制备所述剂型。其它或另外，可通过提供速率控制膜和/或通过将化合物分散于聚合物基质和/或凝胶中来控制速率。
适合用于传递本文所述的皮内医药组合物的装置包括短针装置，诸如美国专利4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235、5,141,496和5,417,662中所述的装置。皮内组合物可通过限制针刺入皮肤内的有效长度的装置来投予，诸如PCT公开案WO 99/34850中所述的装置和其功能等效物。通过液体射流注射器和/或通过刺入角质层且产生到达真皮的射流的针将液体疫苗传递到真皮的射流注射装置是合适的。射流注射装置例如在以下专利中有所描述美国专利5,480,381；5,599,302；5,334,144；5,993,412；5,649,912；5,569,189；5,704,911；5,383,851；5,893,397；5,466,220；5,339,163；5,312,335；5,503,627；5,064,413；5,520,639；4,596,556；4,790,824；4,941,880；4,940,460；和PCT公开案WO 97/37705和WO 97/13537。使用压缩气体来加速粉末形式的疫苗穿过皮肤外层到达真皮的冲击式粉末/粒子传递装置是合适的。其它或另外，常规注射器可用于皮内投药的典型曼托方法(mantoux method)中。
适合于局部投予的调配物包括(但不限于)液体和/或半液体制剂，诸如擦剂、洗剂、水包油和/或油包水乳液(诸如乳膏、软膏和/或糊剂)和/或溶液和/或悬浮液。可局部投予的调配物可例如包含约1％到约10％(w/w)活性成分，不过活性成分的浓度可高达溶剂中活性成分的溶解度极限。用于局部投予的调配物可进一步包含一种或多种本文所述的其它成分。
本发明的医药组合物可以适合于通过口腔经肺投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可包含干燥粒子，其包含活性成分且直径在约0.5nm到约7nm或约1nm到约6nm的范围内。所述组合物宜呈使用包含可引导推进剂流以分散粉末的干粉储集器的装置和/或使用自动推进溶剂/粉末分配容器(诸如在密封容器中包含溶解和/或悬浮于低沸点推进剂中的活性成分的装置)投予的干粉形式。所述粉末包含至少98重量％的粒子具有大于0.5nm的直径且至少95％的粒子(以数目计)具有小于7nm的直径的粒子。或者，至少95重量％的粒子具有大于1nm的直径且至少90％的粒子(以数目计)具有小于6nm的直径。干粉组合物可包括固体细粉稀释剂(诸如糖)且宜以单位剂型提供。
低沸点推进剂一般包括在大气压下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可构成组合物的50％到99.9％(w/w)，且活性成分可构成组合物的0.1％到20％(w/w)。推进剂可进一步包含其它成分，诸如液体非离子性和/或固体阴离子性表面活性剂和/或固体稀释剂(其可具有差不多与包含活性成分的粒子一样的粒度)。
调配用于经肺传递的本发明的医药组合物可提供呈溶液和/或悬浮液液滴形式的活性成分。所述调配物可以任选为无菌的且包含活性成分的水溶液和/或稀醇溶液和/或悬浮液形式制备、包装和/或销售，且宜使用任何雾化和/或喷雾装置来投予。所述调配物可进一步包含一种或多种其它成分，包括(但不限于)调味剂(诸如糖精钠)、挥发性油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(诸如羟基苯甲酸甲酯)。由这一投药途径提供的液滴可具有在约0.1nm到约200nm范围内的平均直径。
适用于经肺传递的本文所述的调配物适用于鼻内传递医药组合物。另一适合于鼻内投予的调配物为包含活性成分且平均粒子为约0.2μm到500μm的粗粉。以如下方式投予所述调配物采用用鼻子吸，即通过经由鼻腔从保持在鼻子附近的容器快速吸入粉末。
适合于经鼻投予的调配物可例如包含约少到0.1％(w/w)且多到100％(w/w)的活性成分，且可包含一种或多种本文所述的其它成分。本发明的医药组合物可以适合于颊内投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可例如呈使用常规方法制备的片剂和/或锭剂的形式且可例如0.1％到20％(w/w)为活性成分，其余部分包含经口可溶解和/或可降解的组合物和任选一种或多种本文所述的其它成分。或者，适合于颊内投予的调配物可包含含有活性成分的粉末和/或烟雾状和/或雾化溶液和/或悬浮液。所述粉末状、烟雾状和/或烟雾状调配物在分散时可具有在约0.1nm到约200nm范围内的平均粒子和/或液滴尺寸，且可进一步包含一种或多种本文所述的其它成分。
本发明的医药组合物可以适合于眼部投予的调配物形式制备、包装和/或销售。所述调配物可例如呈包括例如0.1/1.0％(w/w)活性成分于水性或油性液体赋形剂中的溶液和/或悬浮液的滴眼剂的形式。所述滴剂可进一步包含缓冲剂、盐和/或一种或多种本文所述的其它成分。其它适用的可眼部投予调配物包括呈微晶形式和/或呈脂质体制剂形式的包含活性成分的调配物。预期滴耳剂和/或滴眼剂在本发明的范围内。
在某些情况下，可能需要通过减缓皮下或肌肉内注射的疫苗产品(例如蛋白质)的一种或多种组分的吸收来延长疫苗的作用。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或非晶形材料的液体悬浮液来实现。产品的吸收速率则视其溶解速率而定，而溶解速率又可视大小和形式而定。其它或另外，通过将产品溶解或悬浮于油性媒剂中来实现非经肠投予的产品的延迟吸收。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等可生物降解聚合物中形成蛋白质的微胶囊基质来制备可注射储积形式。视产品与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质而定，可控制释放速率。可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可通过将产品裹在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储积式可注射调配物。口服调配物可使用替代聚合物传递媒剂。举例来说，可使用诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸等可生物降解、生物相容性聚合物。可将抗原或其免疫原性部分调配成微粒，例如与聚合物传递媒剂组合。
关于调配和/或制造医药剂的总体考虑可例如见于雷氏药学科学与实践(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，第21版，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams & Wilkins)，2005中。
投药 本发明提供亚单位疫苗。在一些实施例中，本发明的亚单位疫苗可以低剂量投予个体以便刺激免疫反应和/或赋予保护性。如本文中所使用，术语“低剂量疫苗”一般是指当以低剂量投予个体时具有免疫原性和/或保护性的疫苗。根据本发明，投予低剂量疫苗包含投予包含小于100μg流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的亚单位疫苗组合物。
在一些实施例中，投予低剂量亚单位疫苗包含向有需要的个体投予包含小于约100μg、小于约90μg、小于约80μg、小于约70μg、小于约60μg、小于约50μg、小于约40μg、小于约35μg、小于约30μg、小于约25μg、小于约20μg、小于约15μg、小于约5μg、小于约4μg、小于约3μg、小于约2μg或小于约1μg植物产流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分的亚单位疫苗。在一些实施例中，植物产流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分已至少部分从如本文所述的非抗原性组分纯化。在一些实施例中，植物产流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分尚未至少部分从如本文所述的非抗原性组分纯化。在以上标题为“疫苗”的部分中更详细地描述适合于投予个体的疫苗组合物。
本发明的流感抗原多肽、其融合物和/或其免疫原性部分和/或其医药组合物(例如疫苗)可使用有效用于治疗的任何量和任何投药途径来投予。
所需的精确量将在个体之间变化，其视个体的物种、年龄和总体状况、感染的严重程度、特定组合物、其投药模式、其活性模式等而定。为了便于剂量的投予和均一性，通常将流感抗原多肽调配成单位剂型。然而，应了解，本发明的组合物的总日用量将在正确医学判断范围内由主治医生决定。用于任何特定个体或生物体的特定治疗有效剂量将视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所使用的特定流感抗原多肽的活性；所投予的特定医药组合物；投予后组合物的半衰期；个体的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和所使用的特定化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；和医学技术中熟知的类似因素。
本发明的医药组合物(例如疫苗)可通过任何途径来投予。在一些实施例中，通过多种途径投予本发明的医药组合物，包括经口(PO)、静脉内(IV)、肌肉内(IM)、动脉内、髓内、鞘内、皮下(SQ)、心室内、透皮、经皮、皮内、经直肠(PR)、经阴道、腹膜内(IP)、胃内(IG)、局部(例如采用粉末、软膏、乳膏、凝胶、洗剂和/或滴剂)、经粘膜、鼻内、颊内、肠内、玻璃体、舌下；通过气管内滴注、支气管滴注和/或吸入；以口服喷雾、鼻用喷雾和/或气溶胶形式；和/或通过门静脉导管。一般来说，最适当投药途径将视多种因素而定，包括所投予药剂的性质(例如其在胃肠道环境中的稳定性)、个体状况(例如个体是否能够耐受特定投药模式)等。
在一些实施例中，通过多种投药途径(例如通过皮下注射和通过鼻内吸入)传递本发明的疫苗。对于包括两个或两个以上剂量的疫苗来说，不同剂量可通过不同途径来投予。
在一些实施例中，通过皮下注射来传递本发明的疫苗。在一些实施例中，通过肌肉内和/或静脉内注射来投予本发明的疫苗。在一些实施例中，通过鼻内吸入来传递本发明的疫苗。
在一些实施例中，通过经口和/或经粘膜途径来传递本发明的疫苗。经口和/或经粘膜传递具有防止粘膜组织感染(许多病原体感染的首要途径)的可能性。经口和/或经粘膜传递会引发全身性免疫反应。在用于经口投予刺激粘膜免疫系统并会引发全身性免疫的抗原的异源表达系统的开发方面已取得相当大的进展。然而，对于传递口服疫苗的先前尝试已证明获得功效需要大量抗原。因此，大量目标抗原的经济制备是产生有效口服疫苗的前提。发展表达抗原(包括热稳定性抗原)的植物是解决所述难题的较实际方法。
在某些实施例中，通过向个体直接投予植物来向个体经口投予在植物或其部分中表达的流感抗原多肽。在一些方面，提取和/或纯化在植物或其部分中表达的疫苗蛋白，并用于制备医药组合物。可能需要调配所述经分离的产物以用于其预定用途(例如作为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中，可能需要将产物与一些或所有表达其的植物组织一起调配。
在某些实施例中，通过向个体直接投予植物来向个体经口投予在植物或其部分中表达的流感抗原多肽。在一些方面，提取和/或纯化在植物或其部分中表达的疫苗蛋白，并用于制备医药组合物。可能需要调配所述经分离的产物以用于其预定用途(例如作为医药剂、疫苗组合物等)。在一些实施例中，可能需要将产物与一些或所有表达其的植物组织一起调配。
植物细胞或组织中所产生且由个体食用的疫苗蛋白可优选由消化系统吸收。摄取仅经最低限度地加工的植物组织的一个优势是使蛋白质囊封或隔离在植物细胞中。因此，产物在到达胃或肠之前可能会受到至少一些保护以防在上消化道中消化，且较高比例的活性产物将可供吸收。
当需要将产物与植物材料一起调配时，通常将需要利用对相关接受者(例如人类或其它动物)无毒的植物。在适当考虑保持表达产物的活性的情况下，可根据所属领域中已知的技术简单地收集和加工相关植物组织(例如细胞、根、叶)。在某些实施例中，需要在可食用植物中(且具体来说是在植物的可食用部分中)具有所表达的流感抗原多肽以便可随后食用所述材料。举例来说，如果经口传递后(适当调配时)疫苗抗原具有活性，那么可能需要在可食用植物部分中产生抗原蛋白且调配所表达的流感抗原多肽以与一些或所有表达蛋白质的植物材料一起经口传递。
在某些实施例中，本发明的流感抗原多肽和/或本发明的其医药组合物(例如疫苗)可以足以传递每日每千克个体体重约0.001mg到约100mg、约0.01mg到约50mg、约0.1mg到约40mg、约0.5mg到约30mg、约0.01mg到约10mg、约0.1mg到约10mg或约1mg到约25mg的剂量来投予以获得所需治疗作用。所需剂量可每日传递超过三次、每日传递三次、每日传递两次、每日传递一次、每隔一日、每三日、每周、每两周、每三周、每四周、每两个月、每六个月或每十二个月传递。在某些实施例中，所需剂量可使用多次投予(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14次或更多次投予)来传递。
以获得所需结果必需的量和时间来投予组合物。在某些实施例中，医药组合物的“治疗有效量”为有效治疗、减弱或预防个体疾病的量。因此，如本文中所使用，“有效治疗、减弱或预防疾病的量”是指治疗、减弱或预防任何个体的疾病的医药组合物的无毒但足够的量。举例来说，“治疗有效量”可为治疗、减弱或预防感染(例如流感感染)的量。
应了解本发明的流感抗原多肽和/或其医药组合物可用于组合疗法中。组合方案中采用的疗法(例如治疗剂或程序)的特定组合通常将考虑所需治疗剂和/或程序与欲获得的所需治疗作用的相容性。应了解所采用的疗法对于相同目的(例如，可将适用于治疗、预防流感感染和/或延迟流感感染发作的流感抗原多肽与另一适用于治疗、预防流感感染和/或延迟流感感染发作的药剂同时投予)可达成所需作用，或其可达成不同作用(例如控制任何不良作用)。本发明涵盖医药组合物与可提高其生物可用性、降低和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其在身体中的分布的药剂的组合传递。
本发明的医药组合物可单独投予或者与一种或多种其它治疗剂组合投予。“与...组合”打算意味药剂必须同时投予和/或调配用于一起传递，不过这些传递方法在本发明的范围内。组合物可与一种或多种其它所需治疗剂或医学程序同时投予、在所述其他治疗剂或程序之前或之后投予。应了解组合中所用的治疗活性剂可同时以单一组合物形式投予或分别以不同组合物形式投予。一般来说，各药剂将按照对于所述药剂所规定的剂量和/或时间进度来投予。
一般来说，预期组合利用的药剂的利用含量不超过其个别利用时的含量。在一些实施例中，组合利用的含量将低于个别利用的含量。
在某些实施例中，与其它流感疫苗组合投予包含至少一种流感抗原多肽的疫苗组合物。在某些实施例中，与其它流感治疗剂组合投予包含至少一种流感抗原多肽的疫苗组合物。在某些实施例中，与抗病毒药物组合投予包含至少一种流感抗原多肽的疫苗组合物，所述抗病毒药物为诸如神经氨酸酶抑制剂(例如奥司他伟(oseltamivir)

扎那米韦(zanamivir)

和/或M2抑制剂(例如金刚烷、金刚烷衍生物、金刚乙胺等)。
试剂盒 一方面，本发明提供包括本发明的流感抗原多肽的医药包装或试剂盒。在某些实施例中，医药包装或试剂盒在一个或多个任选填充有本发明的医药组合物的一种或多种其它成分的容器中包括产生本发明流感抗原多肽的植物、植物细胞和/或植物组织，或含有疫苗的制剂、提取物或医药组合物。在一些实施例中，医药包装或试剂盒在一个或多个任选填充有本发明的医药组合物的一种或多种其它成分的容器中包括包含本发明的经纯化流感抗原多肽的医药组合物。在某些实施例中，医药包装或试剂盒包括其它获准用作组合疗法的治疗剂(例如流感抗原多肽、流感疫苗、流感治疗剂)。任选与所述容器相关联的可为呈由管理医药产品的制造、使用或销售的政府机关所指定形式的告示，所述告示反映政府机关对用于人类投药的制造、使用或销售的批准。
提供包括治疗剂和/或预防剂的试剂盒。仅作为一个非限制性实例，可提供流感疫苗(例如以口服、可注射和/或鼻内调配物形式)并作为疗法投予。可在试剂盒中提供关于投予罹患流感感染或处于流感感染风险中的个体的医药剂量或其说明书。
以下代表性实例打算帮助说明本发明，而不打算，也不应解释为限制本发明的范围。实际上，根据本文献的全部内容，包括以下实例和本文中所引用的科学和专利文献的参考，本发明的各种修改和除本文所示并描述的实施例外的许多其它实施例对于所属领域的技术人员将显而易见。以下实例含有在本发明的各种实施例和其等效物中可适合于实施本发明的信息、例证和指南。
例证 实例1来自两种H5N1流感病毒株的重组血细胞凝集素(HA)抗原 在本实例中，评估来自H5N1流感病毒株A/安徽/1/2005和A/斑头雁/青海/1A/2005的两种重组血细胞凝集素(HA)抗原作为疫苗候选物的免疫原性。这些植物产HA抗原具有免疫原性，在小鼠中产生高效价的血清血细胞凝集抑制(hemagglutination inhibition，HI)和病毒中和(virus neutralizing，VN)抗体。
根据图2中呈示的流程在植物中制备HA抗原。将HA抗原克隆到“投放载体”系统中(参见例如，谬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza andOther Respiratory Viruses)，119-25；和PCT公开案WO 07/095304；两者都以引用的方式并入本文中)，具体来说克隆到载体pGR-D4中(除了越南和怀俄明病毒株，pBI-D4)。来自克隆到投放载体中的A/安徽/1/2005(DQ371928)的HA的核苷酸序列为 5’


GATCAGATATGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACG TGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTG CGATCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCTGGATGG CTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATA TTGTGGAGAAGGCTAACCCAGCTAACGATCTTTGCTACCCAGGAAACTTCAACGA TTACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAG ATTATTCCAAAGTCATCTTGGAGTGATCACGAGGCTTCATCTGGTGTTTCTTCAGC TTGCCCATACCAAGGTACTCCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGA AGAACAACACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAG ATTTGCTTATTCTTTGGGGAATTCACCACTCTAATGATGCTGCTGAACAGACTAA GTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAG AGGCTTGTGCCAAAGATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGG ATGGATTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAA CGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAAGGTGATAG TGCTATTGTGAAGTCTGAGGTGGAGTACGGAAACTGTAACACTAAGTGCCAGAC TCCAATTGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTA TTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAAGTTGGTGCTTGCTACTGGACT TAGGAACTCTCCACTTAGAGAGAGAAGAAGAAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTAT TGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATA CCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAG AAAGCTATTGATGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACA CTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGATTGAGA ACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTG AGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGT GAAGAACCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAAGAGCT TGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCATGGAATCT GTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAG AGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGAACTTACCAGATTC


TGA 3’(SEQ IDNO84). 应注意对于以上SEQ ID NO84，对于说明书中的所有序列来说，粗体/下划线部分对应于信号肽序列，而斜体/下划线部分对应于6×His标签和内质网(endoplasmicreticulum，ER)滞留信号。对于具有信号肽序列、6×His标签或ER滞留信号中的一个或多个的所有序列来说，本发明涵盖缺乏信号肽序列、6×His标签、ER滞留信号、信号肽序列与6×His标签两者、信号肽序列与ER滞留信号两者、6×His标签与ER滞留信号两者、和/或信号肽序列、6×His标签和ER滞留信号中全部三个的这些序列的任一个。
由SEQ ID NO84编码的蛋白质序列为 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYQGTP SFFRNVVWLIKKNNTYPTIKRSYNNTNQEDLLILWGIHHSNDAAEQTKLYQNPTTYIS VGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMDFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIV KKGDSAIVKSEVEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVLAT GLRNSPLRERRRKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKEST QKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIFNLNKKMEDGFLDVWTYNAE LLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESV RNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQ IDNO85). 来自克隆到投放载体中的A/斑头雁/青海/1A/2005(DQ137873)的HA的核苷酸序列为 5’


GATCAAAT CTGCATTGGTTACCATGCTAACAATTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAA AAGAATGTGACTGTGACTCATGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCATAATGGAA AGTTGTGCGATCTTGATGGTGTTAAGCCTCTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCT GGTTGGTTGCTTGGAAATCCTATGTGCGATGAGTTCCTTAATGTGCCTGAGTGGT CTTACATTGTGGAGAAGATTAATCCTGCTAATGATCTTTGCTACCCTGGAAATTTC AATGATTACGAAGAGCTTAAACATCTTCTTTCTAGGATTAATCATTTCGAGAAGA TTCAGATTATTCCTAAGTCATCTTGGAGTGATCATGAGGCTTCATCTGGTGTTTCT TCAGCTTGCCCTTATCAGGGAAGGTCATCTTTCTTCAGGAATGTTGTTTGGCTTAT TAAGAAGAATAACGCTTACCCTACTATTAAGAGGTCTTACAACAATACTAATCAG GAGGATCTTCTTGTTCTTTGGGGTATTCATCATCCTAATGATGCTGCTGAACAGAC TAGGCTTTACCAGAATCCTACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAATC AGAGGCTTGTGCCTAAGATTGCTACTAGGTCTAAAGTGAATGGTCAGTCTGGAAG GATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAATGATGCTATTAATTTCGAGTCTA ATGGAAATTTCATTGCTCCTGAGAATGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGTGATAG TACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGTAATTGCAATACTAAGTGCCAGACT CCTATTGGTGCTATTAATTCTTCTATGCCTTTCCATAATATTCATCCTCTTACTATT GGTGAGTGCCCTAAGTACGTGAAGTCTAATAGGCTTGTGCTTGCTACTGGTCTTA GGAATTCTCCTCAGGGTGAAAGAAGAAGAAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTA TTGCTGGTTTTATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTA CCATCATTCTAATGAGCAGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAG AAAGCTATTGATGGTGTTACTAATAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAATA CTCAGTTCGAGGCTGTTGGTAGAGAGTTCAACAATCTTGAGAGAAGGATTGAGA ATCTTAATAAGAAAATGGAAGATGGTTTCCTTGATGTGTGGACTTACAATGCTGA GTTGCTTGTGCTTATGGAAAATGAGAGGACTCTTGATTTCCATGATTCTAATGTG AAGAATCTTTACGATAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAATGCTAAAGAACTT GGAAATGGTTGCTTCGAGTTCTACCATAGATGCGATAATGAGTGCATGGAATCTG TGAGGAATGGTACTTACGATTACCCTCAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAG GGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTACTTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO86). 由SEQ ID NO86编码的蛋白质序列为

DQICIGYHANNSTEQVDTIM EKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEW SYIVEKINPANDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACP YQGRSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQ NPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPE NAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSN RLVLATGLRNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGY AADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERIENLNKKMEDGFLDV WTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDN ECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQIDNO87). 接着将投放载体引入农杆菌中并真空渗透到本塞姆氏烟草中。让HA抗原表达并在收集前在植物生物质中积累5-7天。
从植物生物质纯化重组HA抗原。简单来说，在50mM NaPi(pH 8.0)、0.5M NaCl和20mM咪唑中溶解植物细胞。添加曲通(Triton)到0.5％的最终浓度并在4℃下培育20分钟。在4℃下在78,000×g下离心提取物30分钟或在4℃下在48,000×g下离心40分钟。通过神奇滤布(Miracloth)过滤上清液，随后加载到Ni-NTA管柱上。在一些情况下，利用切向流动过滤(tangential flow filtration，TFF)微量过滤步骤(0.1μm-0.2μm孔径)再进行任选澄清。将澄清的提取物加载到Ni-NTA管柱(用溶解缓冲液预平衡)上，并用缓冲液A(50mM NaPi(pH 7.5)、0.5M NaCl、20mM咪唑和0.5％曲通)充分洗涤管柱，随后用缓冲液A1(与缓冲液A相同，但无曲通)洗涤。用咪唑洗脱蛋白质。任选进一步使用阴离子交换色谱法(Q管柱)或超滤法纯化洗脱的蛋白质。
图3A呈示表达来自四种不同病毒株的全长H5HA(即，来自A/安徽/1/2005的H5抗原，“H5HA-A”或“HAA”；来自A/印度尼西亚/5/05的H5抗原，“H5HA-I”或“HAI”；来自A/斑头雁/青海/1A/2005的H5抗原，“H5HA-Q”或“HAQ”；和来自A/越南/04的H5抗原，“H5HA-V”或“HAV”)的四种不同构筑体的例示性表达数据。
来自克隆到投放载体中的A/印度尼西亚/5/05(ISDN125873)的HA的核苷酸序列为 5’


GATCAAATCTGCATTG GTTACCATGCTAACAATTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAATGT GACTGTGACTCATGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCATAATGGAAAGTTGTGC GATCTTGATGGTGTTAAGCCTCTTATTCTTAGGGACTGCAGTGTTGCTGGTTGGTT GCTTGGAAATCCTATGTGCGATGAGTTCATTAATGTGCCTGAGTGGTCTTACATT GTGGAGAAGGCTAATCCTACTAATGATCTTTGCTACCCTGGTTCTTTCAATGATTA CGAAGAGCTTAAACATCTTCTTTCTAGGATTAATCATTTCGAGAAGATTCAGATT ATTCCTAAGTCATCTTGGAGTGATCATGAGGCTTCATCTGGTGTTTCTTCAGCTTG CCCTTACCTTGGATCTCCTTCTTTCTTCAGGAATGTTGTTTGGCTTATTAAGAAGA ATTCTACTTACCCTACTATTAAGAAGTCTTACAACAATACTAATCAGGAGGATCT TCTTGTTCTTTGGGGTATTCATCATCCTAATGATGCTGCTGAACAGACTAGGCTTT ACCAGAATCCTACTACTTACATTTCTATTGGTACTTCTACTCTTAATCAGAGGCTT GTGCCTAAGATTGCTACTAGGTCTAAAGTGAATGGTCAGTCTGGAAGGATGGAA TTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAATGATGCTATTAATTTCGAGTCTAATGGAAA TTTCATTGCTCCTGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAAGGTGATAGTGCTATT ATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGTAATTGCAATACTAAGTGCCAGACTCCTATGG GTGCTATTAATTCTTCTATGCCTTTCCATAATATTCATCCTCTTACTATTGGTGAGT GCCCTAAGTACGTGAAGTCTAATAGGCTTGTGCTTGCTACTGGTCTTAGGAATTC TCCTCAGAGAGAGTCTAGAAGAAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGG TTTTATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGTTGGTATGGTTACCATCAT TCTAATGAGCAGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATAAGGAATCTACTCAGAAAGCTA TTGATGGTGTTACTAATAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAATACTCAGTT CGAGGCTGTTGGTAGAGAGTTCAACAATCTTGAGAGAAGGATTGAGAATCTTAA TAAGAAAATGGAAGATGGTTTCCTTGATGTGTGGACTTACAATGCTGAGTTGCTT GTGCTTATGGAAAATGAGAGGACTCTTGATTTCCATGATTCTAATGTGAAGAATC TTTACGATAAAGTGAGACTTCAGCTTAGGGATAATGCTAAAGAACTTGGAAATG GTTGCTTCGAGTTCTACCATAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAATCTATTAGGAA TGGTACTTACAATTACCCTCAGTACTCTGAAGAAGCTAGGCTTAAGAGGGAAGA GATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGAACTTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO88). 由SEQ ID NO88编码的蛋白质序列为 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPTNDLCYPGSFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSP SFFRNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYI SIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIV KKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLA TGLRNSPQRESRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKE STQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYN AELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECME SIRNGTYNYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQI

3’(SEQIDNO89). 来自克隆到投放载体中的A/越南/04的HA的核苷酸序列为 5’


GATCAAATCTGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAAAAGAACG TGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTG CGATCTTGATGGTGTTAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGC TTCTTGGAAACCCAATGTGTGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATAT TGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGTTACCCTGGTGATTTCAACGAT TACGAAGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGA TTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCT TGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTTTGGCTTATTAAGA AGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAAG ATTTGCTTGTTCTTTGGGGAATTCACCACCCAAATGATGCTGCTGAACAGACTAA GTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAG AGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGG ATGGAATTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTA ACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGTGATA GTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAA CTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACT ATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGAC TTAGGAATTCTCCACAGAGAGAAAGAAGAAGAAAGAAAAGGGGACTTTTCGGA GCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAGGGAATGGTTGATGGATGGTAT GGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGACAAAGAATCT ACTCAGAAAGCTATTGACGGTGTTACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGA TGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGAGAGTTCAACAACCTTGAGAGAAGGA TTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAAGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACA ACGCTGAGTTGCTTGTGCTTATGGAAAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTC TAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAA AGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAACGAGTGCAT GGAATCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAAGAAGCTAG GCTTAAGAGGGAAGAGATTTCTGGTGTTAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAG ATT

TGA 3’(SEQ ID NO90). 由SEQ ID NO90编码的蛋白质序列为 5’

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVT VTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEK ANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKS SFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYI SVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKI VKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVL ATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADK ESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTY NAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECM ESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI

3’(SEQ ID NO91). 来自克隆到投放载体中的类B/马来西亚/2506/2004的HA的核苷酸序列为 5’


ATCTGCACTGGAATTA CTTCATCTAACTCTCCACACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGGGTGAAGTTAACGT GACTGGTGTTATTCCACTTACTACTACTCCAACTAAGTCTCACTTCGCTAACCTTA AGGGAACTGAGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCAAAGTGCCTTAACTGCACTGATC TTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCAAAGTGCACTGGAAACATTCCATCTGCTAGGGT GTCAATTCTTCACGAAGTGAGGCCAGTTACTTCTGGATGCTTCCCAATTATGCAC GATAGGACTAAGATTAGGCAGCTTCCAAACCTTCTTAGGGGATACGAGCACATT AGGCTTTCTACTCACAACGTGATTAACGCTGAGAATGCTCCAGGTGGACCATACA AGATTGGAACTTCAGGATCTTGCCCAAACGTGACTAACGGAAACGGATTCTTCGC TACTATGGCTTGGGCTGTGCCAAAGAACGATAACAACAAGACTGCTACAAACTC TCTTACTATTGAGGTTCCTTACATCTGTACTGAGGGTGAAGATCAGATTACTGTGT GGGGATTCCACTCTGATAACGAGACTCAGATGGCTAAGTTGTACGGTGATTCTAA GCCACAGAAGTTCACTTCATCTGCTAACGGTGTTACTACTCACTACGTGTCTCAG ATTGGAGGATTCCCAAACCAGACTGAGGATGGTGGACTTCCACAATCTGGAAGG ATTGTGGTGGATTACATGGTTCAGAAGTCTGGAAAGACTGGAACTATTACTTACC AGAGGGGTATTCTTCTTCCACAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGAAGGTCTAAAGT GATTAAGGGATCTCTTCCACTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAAGTAC GGTGGACTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCTATTG GAAACTGCCCAATTTGGGTTAAGACTCCACTTAAGTTGGCTAACGGAACTAAGTA TAGGCCACCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGCTGGA TTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGATATACTTCTC ATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAAGAGGCTATT AACAAGATTACTAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAACCTTC AGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTTGATGA GAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACAATTTCTTCTCAGATTGAGCTTGCTGTG CTTCTTTCTAACGAGGGAATTATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCTCTTGA GAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGACCATCTGCTGTTGAGATTGGAAACGGTTG CTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAACCAGACTTGCCTTGATAGAATTGCTGCTGGA ACTTTCGATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCAACTTTCGATTCTCTTAACATTACTGC TGCTTCTCTTAACGATGATGGACTTGATAACCACACT


TGA 3’(SEQ ID NO92). 由SEQ ID NO92编码的蛋白质序列为 5’

ICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTG VIPLTTTPTKSHFANLKGTETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSARVSILHE VRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPN VTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQM AKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGK TGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEH AKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHG YTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILEL DEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFE TKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT
3’(SEQ ID NO93). 图3B呈示数种大范围流行性和季节性流感病毒株的例示性表达数据。图4使用ELISA分析证明图3A中所示的植物产抗原的抗原性。这个分析通过用1μg/ml各H5HA蛋白涂布96孔板来进行。接着使用抗A/安徽/01/05雪貂血清、抗A/印度尼西亚/05/2005雪貂血清、抗A/越南/1194/04HA绵羊抗血清或抗A/怀俄明/03/2003HA绵羊抗血清的1∶6000稀释液检测抗原。所有植物产H5HA都显示与针对同源H5HA产生的抗血清而非针对A/怀俄明/03/03H3病毒产生的抗血清的特异性反应性。这些结果表明植物产抗原经适当折叠且显示确实的抗原性。
图5呈示在植物中表达并从植物纯化的两种H5HA抗原(即H5HA-A和H5HA-Q)的库马斯凝胶和西方印迹法。具体来说，用投放载体渗透7天后，H5HA-Q和H5HA-A分别积累到每千克新鲜叶生物质478mg和836mg。提取蛋白质并利用西方印迹分析法，使用针对来自A/越南/1194/2004的HA所产生的绵羊血清进行表征。
在10μg Quil A存在下用H5HA-Q或H5HA-A皮下免疫各组8周龄雌性Balb/c小鼠(图6)。在第0天、第14天和第28天施以免疫。在第21天和第35天，从小鼠分离血清并进行血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析(基本上如以下实例2中所述进行)。如图7A中所示，来自用植物中产生的A/安徽/01/05或A/斑头雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清显示显著血细胞凝集抑制活性，即使当用低至5μg剂量的抗原免疫小鼠时。如图7B中所示，来自用植物中产生的A/安徽/01/05或A/斑头雁/青海/1A/05HA免疫的小鼠的血清显示显著病毒中和活性，即使当用低至5μg剂量的抗原免疫小鼠时。也用低至2.5μg和1μg HAA剂量的抗原免疫小鼠。图8显示植物产HA在低至1μg的剂量下引发高效价的HI。
实例2作为季节性流感疫苗候选物的植物表达的H3HA 将全长血细胞凝集素(HA)蛋白工程改造，表达并从植物中的流感A/怀俄明/03/03(H3N2)病毒株纯化(图9)。通过ELISA和单辐射免疫扩散(single-radialimmunodiffusion，SRID)分析证实植物产HA的抗原性(图9)。用植物产HA免疫小鼠会产生HA特异性体液(IgG1、IgG2a和IgG2b)和细胞(IFNγ和IL-5)免疫反应(图10和11)。另外，使用低至5μg的抗原剂量获得显著血清血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)抗体效价(图12)。这些结果证明植物产HA蛋白具有抗原性且可在小鼠中诱导与保护有关的免疫反应。
材料与方法 流感HA的克隆、表达和纯化 优化编码流感病毒的A/怀俄明/03/03病毒株的氨基酸17-532的HA序列以供在植物中表达且所述序列由GENEART AG(德国雷根斯堡(Regensburg，Germany))合成。在合成期间，将编码内质网滞留信号(KDEL)和多聚组氨酸亲和纯化标签(6×His)的序列包括在C端中。接着将所得NA序列H3HAwy克隆到投放载体pBID4中(谬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza and Other RespiratoryViruses)，1∶1；以引用的方式并入本文中)，获得pBID4-H3HAwy。接着通过电穿孔将pBID4-H3HAwy引入根癌农杆菌菌株GV3101中。通过用含有pBID4-H3HAwy的GV3101进行农杆菌渗透来达成H3HAwy在温室生长的6周龄本塞姆氏烟草叶中的表达。在农杆菌渗透后7天收集组织并相继采用固定金属离子亲和色谱法和阴离子交换色谱法纯化植物产H3HAwy(ppH3HAwy)。
克隆到投放载体中的来自A/怀俄明/03/03(AAT08000)的HA的核苷酸序列为 5’


T GCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCA AACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCT ACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGA TTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTG CGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTA CTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGG CTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGGAGTTACT CAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTCTA GGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTAT GCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTT ACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTC TACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTG AGGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATA TTCTTCTTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATT AGGAGTGGAAAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAC TCTGAGTGCATTACTCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACG TGAACAGGATTACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTA AGTTGGCTACTGGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCG GAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGT ACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGT CTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAA GACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAG GATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTAC AACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGACTGATTC TGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGA GGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATT GAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTA ACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGA TTCTT

TGATGA(SEQ ID NO94). 由SEQ ID NO94编码的蛋白质序列为 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHH AVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCD GFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQN GTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDS DQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGN LIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVK QNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAA DLKSTQAAINQINGKL NRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY NAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIES IRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL

(SEQ ID NO95). 纯化的ppH3HAwy的西方印迹法分析和ELISA 为表征植物产HA，将从经渗透的本塞姆氏烟草叶纯化的ppH3HAwy在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯膜(马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA))上并用0.5％I-block(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems，Foster City，CA))阻断。接着将所述膜相继与针对HA(NIBSC，编号03/212)所产生的绵羊抗血清和结合辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)的兔抗绵羊抗体(亚拉巴马州蒙哥马利的贝斯实验室公司(BethylLaboratory Inc.，Montgomery，TX))一起培育。使用SuperSignal West Pico化学发光底物(伊利诺斯州洛克福特的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))显现与抗HA抗体反应的蛋白质。使用GeneGnome上的GeneSnap软件(马里兰州弗雷德里克的凝胶成像公司(Syngene Bioimaging，Frederick，MD))记录结果。使用鸡蛋产生且经福尔马林(formalin)灭活的A/怀俄明/03/03病毒(iA/Wyo，NIBSC，英国赫特福德(Hertforshire UK)，编号03/220)作为阳性对照组。对于ELISA，用1μg/ml纯化的ppH3HAwy或用iA/Wyo涂布96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))。将培养板与针对来自A/怀俄明/03/03病毒的HA(NIBSC，编号03/212)或NA(NIBSC，编号04/258)所产生的绵羊抗血清的1∶1600稀释液一起培育并使用兔抗绵羊IgG-HRP抗体(贝斯实验室公司(Bethyl Laboratory Inc.))检测。
单辐射免疫扩散分析(SRID) 使用略微修改的如席尔德(Schild)等人(1975，世界卫生组织公报(Bull.WorldHealth Org.)，52223-31；以引用的方式并入本文中)所述的SRID分析测定ppH3HAwy的浓度。使用针对纯化的A/怀俄明/03/03HA和iA/Wyo(含有50μg/ml HA)所产生的绵羊抗血清作为参考试剂。用连续稀释的1％(w/v)两性洗涤剂3-14(美国拉霍亚的卡氏生物化学-贝林公司(Calbiochem-Behring，La Jolla，USA))处理ppH3HAwy和iA/Wyo，加载到含有参考绵羊抗HA血清的预制备的1％琼脂糖凝胶的孔中，并让其扩散48小时。在室温下在PBS中培育琼脂糖凝胶24小时以去除未结合的抗原和血清组分。接着用库马斯蓝(伊利诺斯州洛克福特的皮尔斯公司(Pierce，Rockford，IL))将凝胶染色，测量沉淀环的直径，并测定抗原浓度。
用ppH3HAwy免疫小鼠 以2周时间间隔，在第0天、第14天、第28天，用ppH3HAwy皮下免疫各组8周龄Balb/c小鼠(每组6只小鼠)。测试三种不同抗原剂量每剂30μg、10μg和5μgppH3HAwy。对照组动物接受iA/Wyo(每剂约5μgHA)或PBS。通过添加10μg Quil A(纽约州韦斯特伯里的精细化学公司(Accurate Chemical，Westbury，NY))来进行所有免疫。在每次免疫之前和在第三次剂量后两周收集血清样品。
表征免疫反应 血清抗体反应 利用ELISA，使用涂有1.0μg/ml iA/Wyo的96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))测量HA特异性血清抗体反应。用连续四倍稀释液检验血清样品并使用结合HRP的山羊抗小鼠IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson Immunoresearch Laboratory Inc.，West Grove，PA.))检测抗原特异性抗体(图10)。使用与HRP结合的山羊抗小鼠IgG1、IgG2a或IgG2b作为二次抗体(阿拉巴马州伯明翰的南方生物技术联合公司(Southern Biotechnology AssociatesInc.，Birmingham，AL))来测定IgG抗体亚型的效价(图11)。产生三倍于来自1∶50稀释度下免疫前血清的值的平均OD值的血清稀释度的倒数确定为终点效价。
ELISPOT分析 通过略微修改的如齐切斯特(Chichester)等人(2006，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，30999-107；以引用的方式并入本文中)中所述的ELISPOT分析来自经pptH3HAwy免疫的小鼠的脾细胞中分泌干扰素-γ(interferon-γ，IFNγ)和白细胞介素-5(interleukin-5，IL-5)的细胞的频率(图11)。简单来说，在第42天从经iA/Wyo或ppH3HAwy免疫的小鼠收集脾并均质化成单细胞悬浮液。使用ACK缓冲液溶解红细胞。将脾细胞涂铺在涂有IFNγ或抗IL-5单克隆抗体(马萨诸塞州贝德福德的密理博公司(Millipore，Bedford，MA))的MultiScreen-IP板(加利福尼亚州圣地亚哥的BDPharmingen公司(BD Pharmingen，San Diego，CA))中并在活体外用5μg/ml昆虫细胞产生的A/怀俄明/03/03HA(康涅狄格州梅里登的蛋白质科学公司(Protein Sciences，Meriden，CT))进行刺激。在37℃下培育培养板48小时，随后丢弃细胞并将生物素标记的抗IFNγ或抗IL-5(BD Pharmingen)添加到各孔中。相继使用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶和NBT/BCIP(皮尔斯公司(Pierce))显现斑点。数据以每106个细胞中斑点形成细胞(spot-forming cell，SFC)的平均数目表示。
血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析 用破坏受体的酶(receptor-destroying enzyme，RDE；日本东京的生研公司(DenkaSeiken Co.Ltd.，Tokyo，Japan))处理来自经免疫小鼠的血清样品并如先前所述用0.75％火鸡红细胞进行HI分析(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。如先前所述(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)，但经以下改变，进行微量中和分析。将MDCK细胞以每孔3×104个细胞涂铺在96孔组织培养板中，并在37℃下培育18小时。同时，连续稀释经RDE处理的血清样品并与等体积的2×103TCID50/ml的A/怀俄明/03/03流感病毒混合。在37℃下培育1小时后，将血清-病毒混合物添加到所涂的MDCK细胞中并进一步培育18小时。接着用PBS洗涤培养板并用80％丙酮固定。如先前所述，通过ELISA测定各样品的中和终点效价(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。
统计分析 使用方差相等的双尾t检验(two-tailed t test)进行数据的统计分析且在p值＜0.05时认为有显著性。指定无可检测IgG、HI或VN效价的样品的统计分析值为25、5或10(检测极限分别为50、10或20)。
结果和讨论 ppH3HAwy的表达和活体外表征 为了鉴别目标表达的峰值和测定收集生物质的最佳时间，执行如下时程。渗透后7天，将ppH3HAwy积累到每千克新鲜叶组织约200mg的时候确定为收集时间。接着纯化目标蛋白质且用西方印迹法、ELISA和SRID来表征。图9A(泳道3)展示尺寸为约83kDa的蛋白质条带，其由绵羊抗HA血清特异性识别。进行ELISA和SRID以进一步表征ppH3HAwy的抗原性。在ELISA分析中，ppH3HAwy显示与针对同源HA而非NA所产生的绵羊抗血清具有特异性反应性(图9B)。如图9C中的SRID凝胶所示，ppH3HAwy扩散环的尺寸等于加载有iA/Wyo的孔周围的扩散环，这表明ppH3HAwy有抗原性活性。这些数据共同证明ppH3HAwy经适当折叠且显示确实的抗原性。
ppH3HAwy的活体内表征 在小鼠中评估ppH3HAwy的免疫原性。分析在第二剂和第三剂抗原后收集的血清样品的目标特异性抗体反应。如图10中所示，对于所测试的所有剂量，在第一次抗原加强后都观察到高血清IgG效价。在第二次抗原加强后这些效价进一步增强，达到与iA/Wyo所观察到的水平相当的水平。由30、10或5μg剂量的ppH3HAwy引发的血清IgG水平没有显著不同。由于这些发现，免疫反应的进一步表征限于那些用5μg剂量的抗原免疫的动物。对A/怀俄明/03/03具有特异性的血清IgG亚型的分析揭露用ppH3HAwy进行免疫会产生IgG1、IgG2a和IgG2b抗体反应(图11A)，从而表明Th1与Th2反应都得到刺激。这进一步由ELISPOT数据支持，ELISPOT数据显示在活体外用昆虫细胞产生的同源HA再刺激后来自经ppH3HAwy免疫的小鼠的脾细胞产生IFNγ和IL-5(图11B和11C)。在流感病毒感染中，IgG1抗体亚型在病毒中和和保护中起关键作用，而IgG2a抗体亚型与病毒清除相关(休伯(Huber)等人，2006，临床疫苗免疫(Clin.Vaccine Immunol.)，13981-90；以引用的方式并入本文中)。因此，刺激IgG1与IgG2a对于有效流感疫苗开发都很重要。攻毒研究将进一步说明IgG亚型对针对流感感染的保护性免疫性的潜在帮助。
为检验由ppH3HAwy所产生的抗体的功能性功效，对来自接种疫苗小鼠的血清样品进行HI和VN分析。在第一次抗原加强后所有接受30μg ppH3HAwy的动物都具有高于40的血清HI效价(图12A)，而在接受10μg或5μg剂量的抗原的各组小鼠中，6只动物中有5只具有高于40的血清HI抗体效价。第二次抗原加强后，所有用ppH3HAwy免疫的组中的所有动物都具有高于160的血清HI抗体效价(图12A)，并且在一些动物中效价达到2560。
为进一步表征由ppH3HAwy所产生的免疫反应，测量血清VN抗体效价(图12B)。血清VN效价与血清HI效价相关性良好。第二次加强后，所有用ppH3HAwy免疫的小鼠针对A/怀俄明/03/03病毒的VN效价都大于等于640，达到与来自用iA/Wyo免疫的小鼠的血清所观察到的水平类似的水平(图12B)。当在第二次加强后1个月评估时，HI和VN抗体效价保持在这一高水平。这些数据证明ppH3HAwy在小鼠中具有免疫原性，诱导针对低至5μg剂量的同源H3N2流感病毒的HI和VN抗体反应。高于40的HI效价通常视为与在人类中的保护性免疫性一致的最小效价(霍布森(Hobson)等人，1972，卫生学杂志(J.Hyg.)(伦敦(Lond.))，70767-77；以引用的方式并入本文中)。由于由ppH3HAwy所产生的免疫反应的品质，尤其是甚至在第一次抗原加强后都能观察到高HI和VN效价，因此本发明涵盖如下认识，植物产抗原可适用于开发有效用于人类的流感疫苗。ppH3HAwy显示确实的抗原性且当与Quil A一起投予时诱导小鼠的抗病毒抗体反应。Quil A广泛用作兽医疫苗中的佐剂且已显示增强细胞以及体液免疫反应(片山(Katayama)和麦恩(Mine)，2006，农业与食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)，543271-6；以引用的方式并入本文中)。另外，已提出将基于皂角苷的佐剂(诸如QuilA)用于人类且目前正在临床试验中进行评估(巴乌克(Mbawuike)等人，2007，疫苗(Vaccine)，253263-9；和萨巴蒂尼(Sabbatini)等人，2007，临床癌症研究(Clin.CancerRes.)，134170-7；两者都以引用的方式并入本文中)。然而，本发明涵盖如下认识，可利用诸如明矾或铝胶等任何佐剂。实际上，在本发明的研究中，共投予铝胶与ppH3HAwy产生低血清IgG和HI效价。
总的来说，本发明涵盖如下认识，植物产HA抗原可适用于开发流感疫苗。
实例3来自A/印度尼西亚/05/05的植物产HA保护雪貂免受同源攻毒感染 本实例证明本塞姆氏烟草植物中产生的来自A/印度尼西亚/5/2005的重组HA的免疫原性和保护性功效。这种植物产HA抗原在小鼠中诱导血清血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)抗体效价。此外，用这种植物产HA免疫雪貂可防止同源病毒攻毒。因此，本发明涵盖如下认识，植物产HA抗原可适用于开发用于人类的流感疫苗。
图13概述在植物中制备HA抗原的通用流程。通常如图2和实例1中所示，在植物中制备H5HA-I抗原。将H5HA-I抗原克隆到“投放载体”系统中(参见例如，谬斯克(Musiychuk)等人，2007，流感和其它呼吸病毒(Influenza and Other RespiratoryViruses)，119-25；和PCT公开案WO 07/095304；两者都以引用的方式并入本文中)，具体来说克隆到载体pGR-D4中。接着将投放载体真空渗透到本塞姆氏烟草中并让HA抗原表达并积累在植物生物质中。用投放载体渗透后7天，H5HA-I积累到每千克新鲜叶生物质约800mg。
基本上如实例1中所述，从植物生物质纯化重组HA抗原。提取蛋白质并通过库马斯染色(图14A)，通过使用小鼠抗His抗体的西方印迹法分析法，(图14B)，和通过使用针对A/印度尼西亚/05/05的雪貂抗血清或针对A/怀俄明/03/03的绵羊抗血清的ELISA(图14C)来表征。
以2周时间间隔，在第0天、第14天和第28天，用每剂45μg、30μg、15μg或5μg植物产H5HA-I皮下免疫小鼠。在第21天和第35天，从小鼠分离血清并进行血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析(基本上如以下实例2中所述进行)。如图15A中所示，来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的小鼠的血清显示显著血细胞凝集抑制活性，即使当用低至15μg剂量的抗原免疫小鼠时。如图15B中所示，来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的小鼠的血清显示病毒中和活性，即使当用低至15μg剂量的抗原免疫小鼠时。
以2周时间间隔，在第0天、第14天和第28天，用每剂90μg或45μg的H5HA-I皮下免疫雪貂。在最后免疫后10天，用10FLD50的A/印度尼西亚/05/05对雪貂进行鼻内攻毒。如图16A中所示、来自用植物中产生的A/印度尼西亚/05/05HA免疫的雪貂的血清显示显著血细胞凝集抑制活性。图16B展示攻毒后雪貂的存活百分比。图16C展示攻毒后8天雪貂的体重变化百分比。图16D展示攻毒后4天雪貂鼻洗涤液中的病毒效价。
总之，来自A/印度尼西亚/05/05的重组HA(H5HA-I)成功地在植物中制备。植物产H5HA-I在小鼠中诱导高效价的血清HI和VN抗体。用植物产H5HA-I进行免疫可保护雪貂免受A/印度尼西亚/05/05的攻毒感染。基于这些数据，本发明涵盖如下认识，植物产HA抗原可适用于开发用于人类的疫苗。
实例4来自布里斯班病毒株的重组血细胞凝集素(HA)抗原 将全长血细胞凝集素(HA)蛋白工程改造，表达并从植物中的流感的A/布里斯班/10e/2007(“HAB1-H3”)、A/布里斯班/59/07(“HAB1-H1”)、B/布里斯班/3/07(“HAB1-B”)和B/佛罗里达/4/2006(“HAF1-B”)病毒株纯化(图17)。用植物产HAB1-H3和HAB1-H1免疫小鼠(图18)会导致产生IgG抗体(图19和21)，以及显著血清血细胞凝集抑制(HI)(图20和22)和病毒中和(VN)抗体效价。这些结果证明植物产HA蛋白具有抗原性且可在小鼠中诱导与保护有关的免疫反应。
材料与方法 在植物中制备蛋白质 克隆到投放载体中的来自A/布里斯班/10e/2007(“HAB1-H3”)的HA的核苷酸序列为 5’


CAAAAGTTGCCTGGA AACGATAATTCTACCGCTACCCTTTGCCTTGGTCATCATGCTGTTCCTAACGGAAC CATTGTGAAAACCATTACCAACGATCAGATTGAGGTGACCAATGCTACTGAGCTT GTTCAGTCATCTTCTACCGGTGAAATTTGCGATTCTCCTCACCAGATTCTTGATGG TGAAAACTGCACCCTTATTGATGCTTTGCTTGGTGATCCTCAGTGTGATGGTTTCC AGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTTGAGAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTA CCCTTACGATGTTCCTGATTACGCTTCTCTTAGATCACTTGTGGCTTCATCTGGAA CCCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAATTGGACTGGTGTTACCCAGAACGGTAC TTCTTCTGCTTGCATTAGAAGGTCTAACAACTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGC TTACCCACCTTAAGTTCAAGTACCCTGCTCTTAATGTGACCATGCCTAACAACGA GAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCATCACCCTGGTACTGATAATGAT CAGATTTTCCCTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACCAAGAGGT CACAGCAGACTGTGATTCCTAACATTGGTTCTAGGCCAAGAGTGAGGAACATTCC TTCTAGGATTTCTATCTACTGGACCATTGTGAAGCCTGGTGATATTCTTCTTATTA ACTCTACCGGTAACCTTATTGCTCCTAGGGGATACTTCAAGATTAGAAGTGGAAA GTCATCTATTATGAGATCAGATGCTCCTATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATT ACCCCTAACGGTTCTATTCCTAACGATAAGCCTTTCCAGAACGTGAACAGGATTA CTTATGGTGCTTGCCCTAGATACGTGAAGCAGAACACCCTTAAGTTGGCTACTGG AATGAGGAATGTGCCTGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGG TTTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTTCAGGCAT CAGAACTCTGAAGGTATTGGACAGGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGCTGCTA TTGATCAGATTAACGGTAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACCAATGAGAAGT TCCACCAGATTGAGAAAGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTG AGAAGTACGTGGAGGATACCAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGTTGCT TGTGGCTCTTGAGAATCAGCACACCATTGATCTTACCGATTCTGAGATGAACAAG TTGTTCGAAAAGACCAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGTAAT GGTTGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGGTTCTATTAGGA ACGGAACCTACGATCATGATGTGTACAGGGATGAGGCTCTTAATAACAGGTTCC AGATTAAGGGTGTTGAGCTTAAGTCTGGTTACAAGGAT


TGATGA 3’(SEQ ID NO96). 由SEQ ID NO96编码的蛋白质序列为 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTI VKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACI RRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFPYA QASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKL ATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQA AIDQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVA LENQHTIDLTDSEMNKLFEKTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYD HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD

3’(SEQ IDNO97). 克隆到投放载体中的来自A/布里斯班/59/07(“HAB1-H1”)的HA的核苷酸序列为 5’


GATACCATCTGCATTG GTTACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACCGTGCTTGAGAAGAATGT GACTGTGACCCACTCTGTGAACCTTTTGGAGAACTCTCACAACGGTAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGTATTGCTCCTCTTCAGCTTGGAAATTGCTCTGTGGCTGGATGGAT TCTTGGAAATCCTGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAAAGAGTCTTGGTCTTACATTG TGGAGAAGCCTAATCCTGAGAACGGTACTTGCTACCCTGGTCACTTTGCTGATTA CGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGATTT TCCCTAAAGAGTCATCTTGGCCTAATCATACTGTGACTGGTGTGTCTGCTTCTTGC TCTCATAACGGTGAGTCATCTTTCTACAGGAACCTTCTTTGGCTTACCGGAAAGA ACGGTCTTTACCCTAACCTTTCTAAGTCTTACGCTAACAACAAAGAGAAAGAGGT TTTGGTTCTTTGGGGTGTTCATCACCCTCCTAACATTGGTGATCAGAAGGCTCTTT ACCATACCGAGAACGCTTACGTTTCTGTGGTGTCATCTCACTACTCTAGGAAGTT CACCCCTGAGATTGCTAAGAGGCCTAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGATTAA CTACTACTGGACCCTTCTTGAACCTGGTGATACCATTATTTTCGAGGCTAACGGT AACCTTATTGCTCCTAGATACGCTTTCGCTCTTTCTAGAGGTTTCGGTTCTGGTAT TATTAACTCTAACGCTCCTATGGATAAGTGTGATGCTAAGTGCCAGACTCCTCAG GGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCTTTCCAGAATGTGCACCCTGTTACTATTGGTGA GTGCCCTAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACCGGTCTTAGGAA CATTCCTTCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGTTTTATTGAGG GAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTACCATCATCAGAATGAGC AGGGTTCTGGTTATGCTGCTGATCAGAAGTCTACCCAGAACGCTATTAACGGTAT TACCAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACCCAGTTCACTGCTGTT GGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGAAAGT GGATGATGGTTTCATTGATATTTGGACCTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTCTTG AGAATGAGAGGACCCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGAGA AGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGCTTCG AGTTCTACCACAAGTGCAACGATGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGAACCT ACGATTACCCTAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATTGATG GTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TGA 3’(SEQ ID NO98). 由SEQ ID NO98编码的蛋白质序列为 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVT VTHSVNLLENSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKP NPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESS FYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQKALYHTENAY VSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFAL SRGFGSGIINSNAPMDKCDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMV TGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTYNAELLVL LENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTY DYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ ID NO99). 克隆到投放载体中的来自B/布里斯班/3/07(“HAB1-B”)的HA的核苷酸序列为 5’


GATAGAAT CTGCACCGGTATTACCTCTTCTAACTCTCCTCACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGG GTGAAGTTAATGTGACCGGTGTTATTCCTCTTACTACCACCCCTACCAAGTCTTAC TTCGCTAACCTTAAGGGTACTAAGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCTGATTGCCTTA ATTGCACCGATCTTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCTATGTGTGTTGGTACTACCCCT TCTGCTAAGGCTTCTATTCTTCACGAAGTGAGACCTGTTACTTCTGGTTGCTTCCC TATTATGCACGATAGGACCAAGATTAGGCAGCTTGCTAACCTTCTTAGGGGTTAC GAGAACATTAGGCTTTCTACCCAGAACGTGATTGATGCTGAAAAGGCTCCTGGTG GTCCTTATAGGCTTGGAACCTCTGGTTCTTGCCCTAATGCTACCTCTAAGTCTGGT TTCTTCGCTACTATGGCTTGGGCTGTGCCTAAGGATAACAACAAGAACGCTACCA ATCCTCTTACTGTGGAGGTGCCATATATCTGTACCGAGGGTGAAGATCAGATTAC TGTGTGGGGTTTCCACTCTGATGATAAGACCCAGATGAAGAACCTTTACGGTGAT TCTAACCCTCAGAAGTTCACCTCTTCTGCTAATGGTGTTACCACCCACTACGTGTC TCAGATTGGTGGTTTCCCTGATCAAACTGAGGATGGTGGACTTCCTCAGTCTGGA AGGATTGTGGTGGATTACATGATGCAAAAGCCTGGAAAGACCGGAACTATTGTG TATCAGAGGGGAGTTCTTCTTCCTCAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGTAGGTCTA AAGTGATTAAGGGTTCTCTTCCTCTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAA GTACGGTGGTCTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCT ATTGGAAACTGCCCTATTTGGGTTAAGACCCCTCTTAAGTTGGCTAACGGTACTA AGTATAGGCCTCCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGC TGGTTTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGTTATACT TCTCATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGAAG CTATTAACAAGATTACCAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAA CCTTCAGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTT GATGAGAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACCATTTCTTCTCAGATTGAGCTTG CTGTGCTTCTTTCTAACGAGGGTATCATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCT CTTGAGAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGTCCTTCTGCTGTGGATATTGGAAATG GTTGCTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAATCAGACTTGCCTTGATAGGATTGCTGC TGGAACTTTCAATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCTACCTTCGATTCTCTTAACATTA CCGCTGCTTCTCTTAACGATGATGGTCTTGATAAT


TGA3’(SEQ IDNO100). 由SEQ ID NO100编码的蛋白质序列为 5’

DRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNV TGVIPLTTTPTKSYFANLKGTKTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASIL HEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLANLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGS CPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKT QMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKP GKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTG EHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGW HGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEIL ELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNG CFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT


3’(SEQ IDNO101). 克隆到投放载体中的来自B/佛罗里达/4/2006(“HAF1-B”)(ACA33493)的HA的核苷酸序列为 5’


GATAGAAT CTGCACCGGTATTACCTCTTCTAACTCTCCTCACGTGGTTAAGACTGCTACTCAGG GTGAAGTTAATGTGACCGGTGTTATTCCTCTTACTACCACCCCTACCAAGTCTTAC TTCGCTAACCTTAAGGGTACTAGGACTAGAGGAAAGTTGTGCCCTGATTGCCTTA ATTGCACCGATCTTGATGTTGCTCTTGGAAGGCCTATGTGTGTTGGTACTACCCCT TCTGCTAAGGCTTCTATTCTTCACGAGGTGAAGCCTGTTACTTCTGGTTGCTTCCC TATTATGCACGATAGGACCAAGATTAGGCAGCTTCCTAACCTTCTTAGGGGTTAC GAGAACATTAGGCTTTCTACCCAGAACGTGATTGATGCTGAAAAGGCTCCTGGTG GTCCTTATAGGCTTGGAACCTCTGGTTCTTGCCCTAATGCTACCTCTAAGTCTGGT TTCTTCGCTACTATGGCTTGGGCTGTGCCTAAGGATAACAACAAGAACGCTACCA ATCCTCTTACTGTGGAGGTGCCATATATCTGTACCGAGGGTGAAGATCAGATTAC TGTGTGGGGTTTCCACTCTGATGATAAGACCCAGATGAAGAACCTTTACGGTGAT TCTAACCCTCAGAAGTTCACCTCTTCTGCTAATGGTGTTACCACCCACTACGTGTC TCAGATTGGTTCTTTCCCTGATCAAACTGAGGATGGTGGACTTCCTCAGTCTGGA AGGATTGTGGTGGATTACATGATGCAAAAGCCTGGAAAGACCGGAACTATTGTG TATCAGAGGGGAGTTCTTCTTCCTCAGAAAGTGTGGTGTGCTTCTGGTAGGTCTA AAGTGATTAAGGGTTCTCTTCCTCTTATTGGAGAGGCTGATTGCCTTCATGAGAA GTACGGTGGTCTTAACAAGTCTAAGCCTTACTACACTGGTGAACACGCTAAGGCT ATTGGAAACTGCCCTATTTGGGTTAAGACCCCTCTTAAGTTGGCTAACGGTACTA AGTATAGGCCTCCTGCTAAGTTGCTTAAAGAGAGGGGATTCTTCGGAGCTATTGC TGGTTTTCTTGAGGGAGGATGGGAGGGAATGATTGCTGGATGGCACGGTTATACT TCTCATGGTGCTCACGGTGTTGCTGTTGCTGCTGATCTTAAGTCTACCCAGGAAG CTATTAACAAGATTACCAAGAACCTTAACTCTCTTTCTGAGCTTGAGGTGAAGAA CCTTCAGAGACTTTCTGGTGCTATGGATGAGCTTCACAACGAGATTCTTGAGCTT GATGAGAAAGTGGATGATCTTAGGGCTGATACCATTTCTTCTCAGATTGAGCTTG CTGTGCTTCTTTCTAACGAGGGTATCATTAACTCTGAGGATGAGCACCTTCTTGCT CTTGAGAGGAAGTTGAAGAAGATGCTTGGTCCTTCTGCTGTGGAGATTGGAAATG GTTGCTTCGAGACTAAGCACAAGTGCAATCAGACTTGCCTTGATAGGATTGCTGC TGGAACTTTCAATGCTGGTGAGTTCTCTCTTCCTACCTTCGATTCTCTTAACATTA CCGCTGCTTCTCTTAACGATGATGGTCTTGATAAT


TGA 3’(SEQ ID NO102). 由SEQ ID NO102编码的蛋白质序列为 5’

DRICTGITSSNSPHVVKTAT QGEVNVTGVIPLTTTPTKSYFANLKGTRTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTP SAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYR LGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGF HSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDY MMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKS KPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEG MIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDE LHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAV EIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHT


3’(SEQ ID NO103). 克隆到投放载体中的来自A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99(AAP34324)的HA的核苷酸序列为 5’


GATACAATCTGCATTG GATACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACTGTTCTTGAGAAGAACGT GACTGTGACTCACTCTGTGAACCTTTTGGAGGATTCTCACAACGGAAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGAATTGCTCCACTTCAACTTGGAAACTGCAGTGTGGCTGGATGGA TTCTTGGAAATCCAGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAAAGAGTCTTGGTCTTACATT GTGGAGACTCCAAATCCAGAGAACGGAACTTGTTACCCAGGATACTTCGCTGATT ACGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGAT TTTCCCAAAAGAGTCATCTTGGCCAAACCACACTGTTACTGGTGTTTCTGCTTCTT GCTCTCATAACGGTAAGTCATCTTTCTACAGGAACCTTCTTTGGCTTACTGGAAA GAACGGACTTTACCCAAACCTTTCTAAGTCTTACGTGAACAACAAAGAGAAAGA GGTTTTGGTTCTTTGGGGAGTTCATCACCCACCAAACATTGGAAATCAGAGGGCT CTTTACCATACTGAGAACGCTTACGTGTCTGTGGTTTCTTCTCACTACTCTAGAAG GTTCACTCCAGAGATTGCTAAGAGGCCAAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGAT TAACTACTACTGGACTCTTCTTGAGCCAGGTGATACAATTATTTTCGAGGCTAAC GGAAACCTTATTGCTCCATGGTACGCTTTTGCTTTGTCTAGGGGATTCGGATCTGG AATTATTACTTCTAACGCTCCAATGGATGAGTGTGATGCTAAGTGCCAAACTCCA CAGGGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCATTCCAGAACGTTCACCCAGTTACTATTGG AGAGTGCCCAAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACTGGACTTAG GAACATTCCATCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTG AGGGAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCATCAGAATG AGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATCAGAAGTCTACTCAGAACGCTATTAACG GAATTACTAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACTCAGTTCACTGC TGTGGGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGA AAGTGGATGATGGATTCCTTGATATTTGGACTTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCT TCTTGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTAC GAGAAGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGC TTCGAGTTCTACCACAAGTGCAACAACGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGT ACTTACGATTACCCAAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATT GATGGTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TAA 3’(SEQ ID NO104). 由SEQ ID NO104编码的蛋白质序列为 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVT VTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETP NPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKS SFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENA YVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAF ALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLR MVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQ NAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAEL LVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKN GTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ IDNO105). 克隆到投放载体中的来自A/所罗门群岛(Solomon Islands)/3/2006(ABU99109)的HA的核苷酸序列为 5’


GATACCATCTGCATTG GTTACCACGCTAACAACTCTACTGATACTGTGGATACCGTGCTTGAGAAGAATGT GACTGTGACCCACTCTGTGAACCTTTTGGAGGATTCTCACAACGGTAAGTTGTGC CTTCTTAAGGGTATTGCTCCTCTTCAGCTTGGAAATTGCTCTGTGGCTGGATGGAT TCTTGGAAATCCTGAGTGCGAGCTTCTTATTTCTAGAGAGTCTTGGTCTTACATTG TGGAGAAGCCTAATCCTGAGAACGGTACTTGCTACCCTGGTCACTTTGCTGATTA CGAAGAGCTTAGAGAGCAGCTTTCTTCTGTTTCTTCTTTCGAGAGATTCGAGATTT TCCCTAAAGAGTCATCTTGGCCTAACCATACCACTACTGGTGTTTCTGCTTCTTGC TCACACAACGGTGAGTCATCTTTCTACAAGAACCTTCTTTGGCTTACCGGAAAGA ACGGTCTTTACCCTAACCTTTCTAAGTCTTACGCTAACAACAAAGAGAAAGAGGT TTTGGTTCTTTGGGGTGTTCATCACCCTCCTAACATTGGTGATCAGAGGGCTCTTT ACCACAAAGAGAACGCTTACGTTTCTGTGGTGTCATCTCACTACTCTAGGAAGTT CACCCCTGAGATTGCTAAGAGGCCTAAAGTGAGGGATCAAGAGGGAAGGATTAA CTACTACTGGACCCTTCTTGAACCTGGTGATACCATTATTTTCGAGGCTAACGGT AACCTTATTGCTCCTAGATACGCTTTCGCTCTTTCTAGAGGTTTCGGTTCTGGTAT TATTAACTCTAACGCTCCTATGGATGAGTGTGATGCTAAGTGTCAGACTCCTCAG GGTGCTATTAACTCTTCTCTTCCTTTCCAGAATGTGCACCCTGTTACTATTGGTGA GTGCCCTAAGTATGTGAGATCAGCTAAGTTGAGGATGGTGACCGGTCTTAGGAA CATTCCTTCTATTCAGTCTAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGTTTTATTGAGG GAGGATGGACTGGAATGGTTGATGGTTGGTACGGTTACCATCATCAGAATGAGC AGGGTTCAGGTTATGCTGCTGATCAGAAGTCTACCCAGAACGCTATTAACGGTAT TACCAACAAGGTGAACTCTGTGATTGAGAAGATGAACACCCAGTTCACTGCTGTT GGAAAAGAGTTCAACAAGTTGGAGAGAAGGATGGAAAACCTTAACAAGAAAGT GGATGATGGTTTCATTGATATTTGGACCTACAACGCTGAGTTGCTTGTGCTTCTTG AGAATGAGAGGACCCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGAGA AGGTGAAGTCTCAGCTTAAGAACAACGCTAAAGAGATTGGAAACGGTTGCTTCG AGTTCTACCACAAGTGCAACGATGAGTGCATGGAATCTGTGAAGAACGGAACCT ACGATTACCCTAAGTACTCTGAAGAGTCTAAGTTGAACAGAGAAAAGATTGATG GTGTTAAGTTGGAGTCTATGGGAGTGTACCAGATT


TGATGA 3’(SEQ ID NO106). 由SEQ ID NO106编码的蛋白质序列为 5’

DTICIGYHANNSTDTVDTV LEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISRESWS YIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTTTGVSASCS HNGESSFYKNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALY HKENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIA PRYAFALSRGFGSGIINSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVR SAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGALAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAAD QKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFIDIWTY NAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECME SVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQI

3’(SEQ IDNO107). 克隆到投放载体中的来自A/威斯康星(Wisconsin)/67/2005的HA的核苷酸序列为 5’


CAAAAGTTGCCAGGA AACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAA CTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCT TGTTCAGTCATCTTCTACTGGTGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATG GTGAAAACTGCACTCTTATTGATGCTTTGCTTGGAGATCCACAGTGTGATGGATT CCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTTGAGAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGC TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGATCACTTGTGGCTTCATCTGG AACTCTTGAGTTCAACGATGAGTCTTTCAACTGGACTGGTGTTACTCAGAACGGA ACTTCATCTTCATGCAAGAGGAGGTCTAACAACTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTG GCTTACTCACCTTAAGTTCAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCCAAACAAC GAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATAATG ATCAGATTTTCCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAG GTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATCTAGGCCAAGGATTAGGAACATT CCATCTAGGATTTCTATTTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGTGATATTCTTCTTAT TAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGAAGTGGA AAGTCATCTATTATGAGATCAGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCA TTACTCCAAACGGTTCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGAT TACTTATGGTGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACT GGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCT GGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGG CATCAAAACTCTGAGGGAATTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTG CTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAATGAGA AGTTCCACCAGATTGAGAAAGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATC TTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGTT GCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATCTTACTGATTCTGAGATGAAC AAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGA AATGGATGCTTCAAGATTTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGGATCTATTA GGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACAGAGATGAGGCTCTTAACAACAGGT TCCAGATTAAGGGTGTTGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGAT


TGA 3’(SEQ ID NO108). 由SEQ ID NO108编码的蛋白质序列为 5’

QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTI VKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSSC KRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGY FKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKL ATGMRNVPEKQTRGIFGALAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGIGQAADLKSTQA AINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKiDLWSYNAELLVA LENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYD HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGY 3’(SEQ ID NO109) 基本上如实例1中所述，在植物中制备抗原。
纯化的植物产H3HA或H1HA的ELISA 通过ELISA表征来自A/布里斯班/10/07(H3N2)和A/布里斯班/59/07(H1N1)的植物产HA。用1μg/ml来自A/布里斯班/10/07、A/布里斯班/59/07、灭活A/布里斯班/10/07(健康与老龄部治疗用物品管理局(Department of Health and Ageing Therapeutic GoodsAdministration(TGA))，批号2007/79B，澳大利亚(Australia))或灭活A/布里斯班/59/07(国家生物学标准和管制所(National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC))，编号08/100，英国(UK))的纯化HA涂布96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))。将培养板与针对来自A/布里斯班/10/07(TGA，批号AS393)或A/布里斯班/59/07(NIBSC，编号08/112)的HA所产生的绵羊抗血清的1∶1600稀释液一起培育并使用兔抗绵羊IgG-HRP抗体(贝斯实验室公司(Bethyl Laboratory Inc.))检测。
用植物产H3HA或H1HA免疫小鼠 以2周时间间隔，在第0天、第14天、第28天，用植物产H3HA或H1HA皮下免疫各组6周龄Balb/c小鼠(每组6只小鼠)。测试三种不同抗原剂量每剂60μg、30μg和15μg。对照组动物接受PBS。通过添加10μg Quil A(纽约州韦斯特伯里的精细化学公司(Accurate Chemical，Westbury，NY))来进行所有免疫。在每次免疫之前和在第三次剂量后两周收集血清样品。
表征免疫反应 通过ELISA，使用涂有灭活A/布里斯班/10/07或A/布里斯班/59/07病毒的96孔MaxiSorp板(能肯公司(NUNC)，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))测量HA特异性血清抗体反应。用连续四倍稀释液测试血清样品并使用结合HRP的山羊抗小鼠IgG(宾夕法尼亚州西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson Immunoresearch LaboratoryInc.，West Grove，PA.))检测抗原特异性抗体。产生三倍于来自1∶50稀释度下免疫前血清的值的平均OD值的血清稀释度的倒数确定为终点效价。
血细胞凝集抑制(HI)和病毒中和(VN)分析 用破坏受体的酶(RDE；日本东京的生研公司(Denka Seiken Co.Ltd.，Tokyo，Japan))处理来自经免疫小鼠的血清样品并如先前所述用0.75％火鸡红细胞进行HI分析(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43；以引用的方式并入本文中)。如先前所述(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)，但经以下改变，进行微量中和分析。将MDCK细胞以每孔3×104个细胞涂铺在96孔组织培养板中，并在37℃下培育18小时。同时，连续稀释经RDE处理的血清样品并与等体积的2×103TCID50/ml的A/布里斯班/10/07或A/布里斯班/59/07流感病毒混合。在37℃下培育1小时后，将血清-病毒混合物添加到所涂的MDCK细胞中并进一步培育18小时。接着用PBS洗涤培养板并用80％丙酮固定。如先前所述，通过ELISA测定各样品的中和终点效价(罗(Rowe)等人，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)，37937-43)。
统计分析 使用方差相等的双尾t检验进行数据的统计分析且在p值＜0.05时视为有显著性。指定无可检测IgG、HI或VN效价的样品的统计分析值为25、5或10(检测极限分别为50、10或20)。
结果和讨论 HAB1-H3、HAB1-H1、HAB1-B和HAF1-B抗原都成功地在植物中制备。图17A展示所制备的HAB1-H3和HAB1-H1蛋白的库马斯亮蓝染色和西方印迹法。各构筑体的总蛋白质表达为每千克植物生物质约800mg。图17B展示所制备的HAB1-B和HAF1-B蛋白的库马斯亮蓝染色和/或西方印迹法。HAB1-B的总蛋白质表达为每千克植物生物质约800mg。HAF1-B的总蛋白质表达为每千克植物生物质约325mg。
用60μg、30μg或15μg来自A/布里斯班/59/07(HAB1-H1)或A/布里斯班/10e/07(HAB1-H3)的植物产HA免疫小鼠。参见图18。在抗原的引发、第一次加强和第二次加强后，通过ELISA来测定HA特异性抗体的血清效价。数据以平均抗体效价±标准偏差表示(图19和21)。
使用同源(图20)以及异源(表4)H1N1病毒测量来自用HAB1-H1免疫的小鼠的血清的HI抗体效价。用来自经30μgHAB1-H1免疫的组(第二次加强后)的汇集血清进行针对异源病毒的HI分析。结果展示于图20和表4中 表4使用异源病毒测量的HI抗体效价 使用同源(图22)以及异源(表5)H1N1病毒测量来自用HAB1-H1免疫的小鼠的血清的HI抗体效价。用来自经30μgHAB1-H3免疫的组(第二次加强后)的汇集血清进行针对异源病毒的HI分析。结果展示于图22和表5中 表5使用异源病毒测量的HI抗体效价 等效物和范围 所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不希望限于以上实施方式，而实际上如随附权利要求书中所述。
所属领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效物。本发明的范围不希望限于以上实施方式，而实际上如随附权利要求书中所述。
在权利要求书中，除非相反地指出或另外从本文显而易见，否则诸如“一”和“所述”等冠词可能意思是一个或一个以上。除非相反地指出或另外从本文显而易见，否则如果群组成员中的一个、一个以上或全部存在于、用于指定产物或方法中或以其他方式与指定产物或方法有关，那么认为满足群组中的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求书或实施方式。本发明包括正好群组中的一个成员存在于、用于指定产物或方法中或以其他方式与指定产物或方法有关的实施例。本发明包括群组成员中的一个以上或全部存在于、用于指定产物或方法中或以其他方式与指定产物或方法有关的实施例。此外，应了解本发明涵盖所有变化、组合和变更，其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等引入另一权利要求中。举例来说，依赖于另一权利要求的任何权利要求可修改成包括依赖于同一基础权利要求的任何其它权利要求中所见的一个或多个限制。此外，当权利要求书描述组合物时，应了解除非另有指示或除非所属领域的普通技术人员将明显知道会出现矛盾或不一致，否则包括出于本文所揭示的任一目的使用所述组合物的方法，且包括根据本文所揭示的任一制备方法或所属领域中已知的其它方法制备组合物的方法。
当要素以列表呈现，例如呈马库什(Markush)群组形式时，应了解也揭示所述要素的各亚组，且可从群组中去除任何要素。应了解，一般来说，当本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施例或本发明的方面由所述要素、特征等组成或基本上由所述要素、特征等组成。出于简单的目的，那些实施例在本文中未特定地以那些词进行描述。应注意术语“包含”打算为开放式的且允许包括其他要素或步骤。
当提供范围时，包括端点。此外，应了解除非另有指示或另外从本文和所属领域的普通技术人员的了解显而易见，否则在本发明的不同实施例中以范围形式表示的值可采取所述范围中的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则精确到所述范围的下限单位的十分之一。
另外，应了解属于现有技术的本发明的任何特定实施例可明确地从权利要求书的任一个或多个权利要求中排除。因为认为所述实施例为所属领域的普通技术人员所已知，所以可将其排除在外，即使本文未明确阐明所述排除。出于任何原因，不管是否与现有技术的存在有关，本发明的组合物的任何特定实施例(例如任何流感亚型、进化枝、病毒株等；任何流感多肽抗原；任何表达系统；任何植物制备系统；任何投药方法；等)都可从任一个或多个权利要求中排除。
权利要求
1.一种亚单位疫苗组合物，其包含
植物产流感多肽抗原；和
医药学上可接受的赋形剂；
其中所述亚单位疫苗组合物在投予个体后引发免疫反应。
2.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原为血细胞凝集素多肽。
3.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原为选自由SEQ ID NO1-35、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109组成的群组的血细胞凝集素多肽。
4.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原为神经氨酸酶多肽。
5.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原为选自由SEQ ID NO36-43组成的群组的神经氨酸酶多肽。
6.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过100μg所述植物产流感多肽抗原。
7.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过75μg所述植物产流感多肽抗原。
8.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过50μg所述植物产流感多肽抗原。
9.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过25μg所述植物产流感多肽抗原。
10.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过10μg所述植物产流感多肽抗原。
11.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过5μg所述植物产流感多肽抗原。
12.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中单次剂量的所述亚单位疫苗组合物包含不超过1μg所述植物产流感多肽抗原。
13.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原是从植物材料纯化。
14.根据权利要求13所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原的纯度为约70％。
15.根据权利要求13所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原的纯度为约80％。
16.根据权利要求13所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原的纯度为约90％。
17.根据权利要求13所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原的纯度为约95％。
18.根据权利要求13所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原的纯度为约99％。
19.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原未从植物材料纯化。
20.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述植物产流感多肽抗原是以完整植物或植物提取物的形式投予个体。
21.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其进一步包含至少一种疫苗佐剂。
22.根据权利要求21所述的亚单位疫苗组合物，其中所述佐剂是选自由以下组成的群组明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)、完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)、铝胶(alhydrogel)、3去-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐剂65(Merck Adjuvant 65)、角鲨烯、病毒颗粒、SBAS2、SBAS1和未甲基化CpG序列。
23.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述抗原在选自转基因植物和短暂表达所述抗原的植物中产生。
24.根据权利要求1所述的亚单位疫苗组合物，其中所述抗原在所述植物中从投放载体(launch vector)表达。
25.一种在个体中诱导对抗流感感染的保护性免疫反应的方法，其包含向个体投予有效量的根据权利要求1到24中任一权利要求所述的亚单位疫苗组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中通过供给植物细胞而向所述个体经口投予所述组合物。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述个体为人类。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述个体是选自由鸟、猪和马组成的群组。
30.一种产生流感抗原多肽的方法，其包含
a.制备编码流感抗原多肽的核酸构筑体；
b.将步骤a的所述核酸引入植物细胞中；和
c.在有利于表达所述流感抗原多肽的条件下培育所述植物细胞；
从而产生所述流感抗原多肽。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述抗原蛋白的表达受病毒启动子的控制。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸构筑体进一步包含载体核酸序列。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述载体为二元载体(binary vector)。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述核酸构筑体进一步包含编码病毒蛋白质的序列。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞是选自由以下组成的群组紫花苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芹、大豆、小麦向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、西红柿、马铃薯、烟碱、菠菜和小扁豆细胞。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述植物细胞是属于选自芸苔属(Brassicagenus)、烟草属(Nicotiana genus)和矮牵牛属(Petunia genus)的属。
37.根据权利要求30所述的方法，其中在发芽的籽苗中产生所述流感抗原多肽。
38.根据权利要求30所述的方法，其进一步包含回收部分纯化或纯化的所产生的流感抗原多肽。
39.一种经分离的核酸构筑体，其包含编码流感抗原多肽的核酸序列，其中所述流感抗原多肽包含如SEQ ID NO1-43、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中的任一者所示的序列。
40.根据权利要求39所述的经分离的核酸构筑体，其进一步包含载体核酸序列。
41.根据权利要求39所述的经分离的核酸构筑体，其进一步包含病毒启动子核酸序列。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述载体为二元载体。
43.根据权利要求39所述的方法，其进一步包含编码病毒蛋白质的核酸序列。
44.一种宿主细胞，其包含根据权利要求39所述的核酸构筑体。
45.根据权利要求44所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
46.根据权利要求45所述的植物细胞，其中所述植物细胞是选自由以下组成的群组紫花苜蓿、萝卜、芥菜、绿豆、西兰花、水田芹、大豆、小麦向日葵、卷心菜、三叶草、矮牵牛、西红柿、马铃薯、烟碱、菠菜和小扁豆。
47.根据权利要求45所述的植物细胞，其中所述植物细胞是属于选自芸苔属、烟草属和矮牵牛属的属。
全文摘要
本发明涉及免疫学和蛋白质工程的交叉领域，且具体来说涉及适用于预防流感病毒感染的抗原和疫苗。提供重组蛋白抗原、组合物以及制备和使用所述抗原和亚单位疫苗组合物的方法。在一些实施例中，流感抗原包括血细胞凝集素多肽神经氨酸酶多肽和/或其组合。
文档编号A61K39/145GK101820903SQ200880111076
公开日2010年9月1日 申请日期2008年8月20日 优先权日2007年8月20日
发明者维达季·尤西波夫 申请人:美国弗劳恩霍夫股份有限公司