制备和使用流感蛋白质的组合物和方法

专利名称：制备和使用流感蛋白质的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及病毒领域，特别地涉及流感病毒和含有多种流感蛋白质的组合物。这 些组合物对诱导针对流感的免疫应答、降低来自流感感染的风险、和/或改善流感病毒感 染的症状是有用的。
背景技术：
如由世界卫生组织(WHO)规定，甲型流感病毒和乙型流感病毒二者均是急性呼吸 疾病的常见原因。尽管两类病毒都可引起相当大的发病率和死亡率的流行病，乙型流感感 染通常局限于局部的爆发，然而甲型流感病毒是大流行病的主要原因，包括遍及世界的大 流行病。流感病毒是正黏病毒家族的成员，且具有广泛的个体范围，包括人、马、狗、鸟类和 猪。它是由编码10种病毒蛋白质的8个RNA区段产生的有包膜、负义RNA病毒。病毒在受 感染的个体细胞的核中复制。流感病毒对年纪小的个体和老年个体或者免疫应答能力低下 的个体是最危险的。病毒可在鸡蛋中繁殖成高滴度，所述鸡蛋作为用于流感疫苗生产的病 毒产生的载体。目前使用两种类型的流感疫苗。较常规的疫苗是灭活疫苗(含有死病毒)，其通过 注射给予，一般注射于臂中。最常见的人疫苗是含有来自三种病毒株的纯化和灭活物质的 三价流感疫苗(TIV)。一般来说，这种疫苗包括来自两种甲型流感病毒亚类和一种乙型流 感病毒株的物质。第二种疫苗，称为鼻喷雾流感疫苗(有时称减毒活流感疫苗为LAIV)，于 2003年得到批准且含有通过鼻喷雾施用的减毒(弱毒)活病毒。甲型流感病毒的表面抗原经历频繁的改变，然而乙型流感病毒改变较不频繁。由 一种毒株感染引起的免疫可能不会完全地保护以抵抗后来的抗原变体。因此，每年需要 设计针对流感的新疫苗以对抗最可能引起下次流行的流行毒株。所以，WHO每年收集基于 人与人之间传播的最流行的流感毒株的监测数据，并为流感疫苗组合物提供建议。当前， 在疫苗中，疫苗包括两种甲型流感病毒的亚类和一种乙型流感病毒。该疫苗一般保护约 50% -80%的健康成人免于临床疾病。尽管流感疫苗的有效性，但是在儿童、老年人和某些高风险群体中的患病率仍然 显著，且在发展中国家，接种疫苗可能是时有时无的或者是不存在的。在发达国家，生产足 够的流感疫苗以提供给接受群体由于生产困难、使用现行技术产生疫苗所需的高费用和时 间而受到阻碍。此外，新病毒株的威胁和未来大流行病的可能性产生了对更有效的流感疫 苗以及更高效率产生流感疫苗的兴趣。多个小组已经对一些流感蛋白质进行了研究，如基质，以确定其免疫原性以及用 作针对流感的疫苗的部分的可能。参见，如Filette等人，Vaccine，24 =6597-601 (2006)和 Liu等人，Vaccine，23 366-371 (2004)。然而，到目前为止，缺乏针对流感的通用疫苗，特别 是缺乏在个体中诱导体液和细胞免疫应答的通用疫苗。因此，需要针对流感病毒的多个毒 株提供持久和有效保护的改良流感疫苗。发明的简要概述本发明提供了包含流感蛋白质的组合物和疫苗以及制备和使用它们的方法。在一些实施方案中，组合物和疫苗额外地包含含有免疫刺激序列(ISS)的免疫调节化合物 (IMC)。在一个方面，本发明提供了包含流感基质蛋白胞外结构域(M2e)的多聚体的组合 物，所述多聚体以多聚体展示而呈递给免疫系统并能在个体中诱导免疫应答。在一些例子 中，多聚体展示通过与非蛋白质载体缔合来实现。在一个实施方案中，多聚体包含至少两个 拷贝的M2e。在另一实施方案中，M2e多聚体与IMC缔合。在其它方面中，M2e多聚体或M2e/IMC多聚体额外地包含核蛋白(NP)。在一个实 施方案中，多聚体是包含NP和M2e的融合蛋白质。在另一实施方案中，M2e与NP共价地或 者离子地连接。在一些实施方案中，M2e位于NP的羧基端侧。在其它实施方案中，M2e位于 NP的氨基端侧。在其它实施方案中，M2e位于NP的氨基端侧和羧基端侧两者。在其它实施 方案中，M2e位于NP内部。在另一实施方案中，M2e/IMC多聚体与NP缔合。在另一实施方 案中，M2e/IMC多聚体与NP/IMC缔合。在其它实施方案中，M2e/NP多聚体与IMC缔合。在 一些实施方案中，IMC选自1018、B型寡核苷酸、嵌合的免疫调节化合物和C型寡核苷酸。在另一方面，本发明提供了额外地包含载体的上述任一组合物。在一些实施方案 中，载体选自矾、微粒、脂质体和纳米颗粒(nanoparticle)。在另一方面，本发明提供了包含以多聚体展示呈递给免疫系统且能在个体中诱导 免疫应答的M2e多聚体的组合物的疫苗。在一些实施方案中，组合物进一步包含IMC、佐剂 或载体。在其它实施方案中，组合物进一步包含NP。在其它实施方案中，组合物是包含至 少2个拷贝的M2e和NP的融合蛋白质。在其它实施方案中，上述任一组合物进一步包含 IMC。在其它实施方案中，疫苗进一步包含选自矾、微粒、脂质体和纳米颗粒的载体。在其它 实施方案中，疫苗包含选自1018IMC、B型寡核苷酸、嵌合的免疫调节化合物和C型寡核苷 酸的IMC。在另一实施方案中，上述任一疫苗进一步包含至少一种三价灭活流感疫苗(TIV) 的一种或多种成分。在一些实施方案中，TIV选自Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、 FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax。在另一方面，本发明提供了通过向个体施用包含以多聚体展示呈递给免疫系统的 流感基质蛋白胞外结构域(M2e)的多聚体的疫苗来改善个体中与流感病毒感染相关的一 种或多种症状的方法，且其中所述多聚体能在个体中诱导免疫应答。在一个实施方案中，疫 苗进一步包含NP。在一些实施方案中，疫苗进一步包含IMC。在另一方面，本发明提供了用于降低个体中感染流感病毒的可能性的方法，所述 方法包括向个体施用(a)包含至少两个拷贝的M2e的疫苗和(b) TIV的一种或多种组分。 在一个实施方案中，疫苗进一步包含NP。在其它实施方案中，疫苗进一步包含IMC。在其它
TIV it 自 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac
和 Fluvax0在另一方面，本发明提供了用于降低个体中感染流感病毒的可能性的方法，所述 方法包括向个体施用(a)包含至少两个拷贝的M2e的疫苗和(b)单价灭活疫苗的一种或 多种组分。附图简述

图1描述了人、猪和禽类的共有M2e序列，以及多株甲型流感分离株中M2e表位的 保守性。对流感病毒的不同毒株也显示了共有序列的变体。
图 2 描述了 1990-2005 共有 NP 序列与 A/ 波多黎哥(Puerto Rico)/8/34 (HlNl) 的NP序列的比较。基于氨基酸相似性矩阵，将保守改变如虚框所示进行突出，中性改变是 单线框和非保守改变是双线框。发明详述本发明提供了包含流感蛋白质的组合物和/或疫苗以及制备和使用它们的方法。 这些组合物和疫苗对诱导流感病毒感染的个体中的免疫应答是有用的。此外，组合物和疫 苗对改善与流感病毒感染相关的症状以及降低流 感病毒感染的风险是有用的。一般方法除非另外说明，本发明的实施将使用本领域技术范围内的分子生物学(包括重 组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这类技术在 文献中是充分说明的，如 Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第二版(Sambrook 等 人，1989 年)禾口 MolecularCloning :A Laboratory Manual,第三版(Sambrook 禾口 Russel, 2001 年)，(在本文中联合地或分别地称为“Sambrook”)。Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait 编辑，1984 年)；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 编辑，1987 年)；Handbook of Experimental Immunology (D. Μ· Weir&C. C. Blackwell 编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller&M. P. Calos 编辑，1987 年)；Current Protocols in Molecular BiologY(F. M. Ausubel 等人编辑，1987 年，包括 2001 年期间的副刊)；PCR ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis 等人编辑，1994 年)；Current Protocolsin Immunology(J. Ε. Coligan 等人编■，1991 年)；The ImmunoassayHandbook(D. Wild ^m 辑，Stockton Press,纽约，1994 年)；BioconjugateTechniques(Greg Τ· Hermanson 编 辑，Academic Press,1996 年)；Methodsof Immunological Analysis(R. Masseyeff, W. H. Albert 和 N.A.Staines 编辑，Weinheim :VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993 年),Harlow 禾口 Lane (1988 年)Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborPublications, M^],以及Harlow禾口 Lane (1999年)Using Antibodies :ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, Mitl (在本文中联合 地或分别地称为“Harlow 和 Lane” )，Beaucage 等人编辑，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley&Sons 公司，纽约，2000 年)；禾口 Agrawal 编辑，Protocols forOligonucIeotides and Analogs, Synthesis and Properties Humana Press 公司，New Jersey,1993 年)。^X如本文中所用，“疫苗”是用于诱导个体中免疫应答的抗原制备物。疫苗可具有多 种抗原成分。如本文中所用，“多聚体展示”指分子，如基质(M2e)呈递的方式。在一个实施方 案中，其指分子展示给个体的免疫系统的方式。多聚体展示包括但不限于，与聚合物、或具 有或者不具有间隔区的线性(如末端到末端)展示的分子的重复单元、和以非线性方式展 示(如径向展示、分子的随机取向等)的分子的多重单元缔合。可将多重单元通过与载体 或者任一类型的平台分子缔合来进行物理展示，所述载体或任一类型的平台分子包括但不 限于其它流感蛋白质(如核蛋白)、非流感蛋白质或非蛋白质平台分子如微载体、铝盐、其 它无机盐、微粒、纳米颗粒、病毒样颗粒、树状聚体、微团、天然的或合成的聚合物和脂质体。
如本文中所用，“非蛋白质载体”是不为蛋白质的且可用于实现流感基质和/或核 蛋白的多聚体展示的载体。如在本文中可互换的使用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括单链 DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)、单链RNA (ssRNA)和双链RNA (dsRNA)、经修饰的寡核苷酸和 寡核苷、或它们的组合。核酸可以是线性构型的或环形构型的，或者寡核苷酸可含有线性区 段和环形区段二者。核酸是连接的核苷的聚合物，如通过磷酸二酯键或备选键如硫代磷酸 酯连接。核苷由与糖连接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或者其衍生物)碱基或嘧啶 (胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或者其衍生物)碱基组成。在DNA中，四种核苷 单元(或碱基)称做脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸是核苷的磷酸酯。本文中所用的术语“ISS”或“免疫刺激序列”指在体外、体内和/或间接体内(ex Vivo)测量时，影响可测量的免疫应答的多核苷酸序列。可测量的免疫应答的例子包括但 不限于抗原特异的抗体生产、细胞因子的分泌、淋巴细胞群体如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、 ⑶8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等的活化或扩增。优选地，ISS序列优先地活化Thl型应答。本 发明中所用的多核苷酸含有至少一个ISS。如本文中所用，“ISS”也是含ISS的多核苷酸的 简写术语。本文中所用的术语“免疫调节化合物”或“ IMC"指具有免疫调节活性且包含含有 免疫刺激序列或ISS的核酸部分的分子。IMC可由包含多于一种ISS的核酸部分组成、由 ISS组成，或者其自身不具有免疫调节活性。IMC可由寡核苷酸组成(“寡核苷酸IMC”)或 者其可以包含额外的部分。因此，术语IMC包括掺入有两个或多个核酸部分的嵌合的免疫 调节化合物(“《(”)，其中至少一个核酸部分包含序列5’-06-3’，共价地与非核苷酸间隔 部分连接。术语“免疫调节的”可指微粒组合物和/或多核苷酸。因此，本发明的免疫 调节组合物可显示出免疫调节活性，即使当组合物中含有的多核苷酸具有当仅以多核 苷酸呈递时不显示出可比较的免疫调节活性的序列。在一些实施方案中，当本发明 的免疫调节组合物的多核苷酸单独呈递时，不具有“分离的免疫调节活性(isolated immunomodulatory activity) "" χ δ(inferior isolated immunomodulatoryactivity)，，(即，当与微粒组合物比较时)。多核苷酸的“分离的免疫调 节活性”通过使用指示免疫应答的至少一个方面的标准测定法，如由本文中所描述的那些， 测量具有相同核酸骨架(如硫代磷酸酯、磷酸二酯、嵌合的)的分离的多核苷酸的免疫调节 活性来确定。术语“缀合物”指复合物，其中IMC与多聚体是连接的。这类缀合键合包括共价键 合和/或非共价键合。术语“与......缔合”可指共价相互作用以及非共价相互作用二者。例如，M2e可
通过与IMC共价键合以及与IMC非共价相互作用来与IMC缔合。“佐剂”指当添加至免疫原性剂如抗原时，在暴露于该混合物的受试者个体中非特 异性提高或增强对该免疫原性剂的免疫应答的物质。术语“微载体”指不溶于水的且具有小于约150 μ m、120 μ m或100 μ m,更通常地小 于约50-60 μ m,且可能小于约10 μ m或甚至小于约5 μ m大小的微粒组合物。微载体包括 “纳米载体”，所述“纳米载体”是具有小于约1 μ m，优选地小于约500nm大小的微载体。微载体包括固相颗粒，此类颗粒由生物相容的天然存在的聚合物、合成的聚合物或合成的共 聚物形成，虽然由琼脂糖或交联的琼脂糖形成的微载体可能包括或者排除于本文所定义的 微载体以及本领域已知的其它生物可降解材料。固相微载体是由在哺乳动物生理条件下不 易蚀的和/或不可降解的聚合物或其它材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、二氧化硅、陶瓷、聚丙烯 酰胺、金、乳胶、羟磷灰石和铁磁材料和顺磁材料形成。生物可降解的固相微载体可以由在 哺乳动物生理条件下可降解的聚合物(如聚(丙醇酸)、聚(乙醇酸)和其共聚物如聚(D， L-丙交酯-共-乙交酯)或易侵蚀的聚合物(如聚(原酸酯)例如3，9-二亚乙基-2，4， 8，10-四氧杂螺[5. 5]十一烷(DETOSU)或聚(酐)如癸二酸的聚(酐))形成。微载体一 般是球形的形状，但偏离球形的微载体也是可接受的(如椭圆形的、杆状的等)。由于它们 的不可溶性质，一些固相微载体是从水和基于水的(含水的)溶液中可滤过的(如使用0. 2 微米滤器)。微载体也可是液相(如基于油或基于脂质)，如脂质体、iscorns (免疫刺激复 合物，其是胆固醇、磷脂和佐剂活性皂苷(adjuvant-active saponin)的无抗原的稳定复合 物)或在水包油乳剂或油包水乳剂中发现的小滴或者微团如MF59。生物可降解的液相微载 体一般掺入到生物可降解的油中，其中许多是本领域已知的，包括鲨烯和植物油。如本文中 所用的术语“非生物可降解的”指在正常哺乳动物的生理条件下不降解或不腐蚀的微载体。 一般来说，如果在37°C、正常人血清中孵育72小时后，微载体不降解(即，损失少于其质量 或平均聚合物长度的5% )，则认为其是非生物降解的。“个体”或“受试者”是脊椎动物，如禽类，优选地是哺乳动物，如人。哺乳动物包 括但不限于人、非人灵长类、农场用动物、运动用动物、实验动物、啮齿类动物(如小鼠和大 鼠)和宠物。物质的“有效量”或“足够量”是足以实现期望的生物学效应，如有利的结果包括临 床结果的量，且，因此，“有效量”取决于使用其的情况。在本发明的情况下，包含流感基质蛋 白胞外结构域(M2e)的多聚体的组合物的有效量的例子是足以诱导个体中免疫应答的量。 有效量可以以一次或多次施用进行施与。本文所用的术语“共施用”指在时间上足够接近地施用至少两种不同物质以调节 免疫应答。优选地，共施用指同时施用至少两种不同的物质。免疫应答如体液免疫应答或细胞免疫应答的“刺激”意指应答的增加，其可产生自 引发应答和/或增强应答。如本文中所用，且由本领域完全理解，“治疗”是用于获得有利的或期望的结果，包 括临床结果的方法。为了本发明的目的，有利的或期望的临床结果包括但不限于，可检测或 不可检测地减轻或改善一种或者多种症状、减小感染的程度、稳定(即，不恶化)感染的状 态、改善或减缓感染状态、和(部分或全部)缓和。“治疗”也可意指与如果不接受治疗的预 期存活相比较而言延长的存活。流感蛋白质的组合物基质蛋白Ml和基质蛋白M2由甲型流感病毒的第7基因组编码。这种甲型流感M2 蛋白质的胞外部分也称为M2e且是23个氨基酸长度。其在感染和常规的接种期间是最小 免疫原性的，且在所有人甲型流感毒株中具有高的序列保守性。M2e作为抗原的一个优点是 其序列的保守性，所述M2e的序列自1933年分离了第一个流感病毒以来几乎没有改变，尽 管经历了许多次流行和数次大流行。
本发明提供了包含流感基质蛋白胞外结构域(M2e)的多聚体的组合物，其中所述 多聚体能诱导个体中的免疫反应。在一个方面，M2e蛋白质的多聚体包含至少两个拷贝的 M2e。不被理论所束缚，因为M2e的多拷贝允许M2e以多聚体展示呈递给个体的免疫系统， 所以M2e的多拷贝对诱导个体中的免疫应答是重要的。因此，在一个实施方案中，组合物包 含两个拷贝的M2e。在其它实施方案中，组合物包含3个、4个或5个拷贝的M2e。又在其 它实施方案中，组合物包含6个、7个或8个拷贝的M2e。又在其它实施方案中，组合物包含 9个、10个、11个或12个拷贝的M2e。又在其它实施方案中，组合物包含多于12个拷贝的 M2e。如本文中更详细地描述，M2e多聚体也可与包含免疫刺激序列(IMC)的IMC连接。多 聚体也可通过本领域技术人员已知的任一方法制备，包括但不限于使用平台分子。实施例 阐述了本领域技术人员如何能制备和使用本发明多聚体的一些实施方案。本发明也提供了包含多种序列M2e的多聚体的组合物。多聚体可包括相同序列 或不同序列的M2e拷贝。人M2e的共有序列是SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO :7)。 猪M2e的共有序列是SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(SEQ ID NO :8)。禽类M2e的共有序列是 SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD(SEQ ID NO :9)。图1显示了这些共有序列以及猪和禽类动物的 共有序列。然而，如图1所描述，在甲型流感中存在许多分离株，且在一些分离株中存在共 有序列的一个或多个氨基酸变异。本发明考虑了使用任一这些分离株的组合以在组合物中 产生M2e的多聚体(任选地与IMC —起产生)。然后，如本文中所描述，可将组合物制剂以 用作疫苗和/或以合适的形式用来向个体施用。具体而言，组合物可包含具有来自重大公 共卫生利益的分离株的序列的M2e蛋白质。在一个方面，本发明提供了包含来自H5W毒株 M2e的多聚体的组合物以在需要其的个体中诱导免疫应答。这些组合物可预防地使用以降 低禽流感病毒感染的可能性或治疗与禽流感病毒感染相关的症状。在本发明的其它方面，组合物包含M2e和核蛋白(NP)的一个或多个多聚体。图2 显示了核蛋白和其变体的共有序列。在存在于GenBank中的815种全长人流感NP序列中， 76%源自1990年-2005年间分离的病毒。在这段时间，82% (503种序列)来自H3N2分离 株。共有NP序列是基于来自1990-2005分离株的所有全长人NP序列产生的(图2)。将 A/波多黎哥/8/34(Hmi)序列与1990后的共有序列比较发现存在92%的氨基酸序列同一 性。A/波多黎哥/8/34(HlNl)NP序列与该共有序列具有98%的序列相似性。基于Blosum 45氨基酸相似性矩阵，发现了 12个氨基酸差异是非保守的或中性替代。共有H3N2序列在 98位置处、146位置处和197位置处具有3个独特的氨基酸替代，在每种情况下，替代是保 守的。考虑了 NP可用单拷贝或以多拷贝进行表达。在一个实施方案中，NP表达为二聚体。 在另一实施方案中，NP缔合成高级结构，如三聚体。在另一方面，M2e拷贝和NP表达为融合蛋白质。可将M2e多核苷酸序列克隆入任 一合适的表达载体中并用于表达对组合物是期望的蛋白质序列。实施例公开了用M2e和NP 构建的融合蛋白质的多核苷酸序列和蛋白质序列二者，其可用于实施本发明的这一方面。 组合物也可以以非融合蛋白质的方式，如通过共价键合、离子键合或通过其它物理力(如 范德瓦耳斯力)相互缔合来包含M2e和NP。本发明也提供了包含以不同方向排列的M2e和核蛋白(NP)的一个或多个多聚体 的组合物和融合蛋白质。这些融合蛋白质可在其羧基端额外地包含一个或多个组氨酸残基 (“his标签”)，优选地是六个组氨酸残基。在一个方面，一个或多个M2e蛋白质位于NP的氨基端侧。在另一方面，一个或多个M2e蛋白质位于NP的羧基端侧。在另一方面，一个或 多个M2e蛋白质位于NP的氨基端侧和羧基端侧二者。在其它方面，M2e位于NP序列的内 部。又在其它方面，M2e与NP相互交替。在特别优选的实施方案中，4个或8个拷贝的M2e 蛋白质位于NP的氨基端或者羧基端。在一个特别优选的实施方案中，4个拷贝的M2e蛋白 质位于NP的氨基端和羧基端二者。在所有的实施方案中，在一个或多个拷贝的M2e蛋白质 后任选地包括间隔序列。不被理论所束缚，使用NP能帮助诱导可有助于控制流感感染的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和干扰素(如IFN γ)应答。M2e能帮助诱导针对流感病毒的抗体应答。CTL 应答和抗体应答能协同作用以提高个体的免疫到比任何单独一个应答更大的程度。此外， NP也可提供可以导致提高M2e抗体应答的辅助T淋巴细胞表位。作为多聚体M2e或多聚体M2e/NP的本发明的组合物可额外包含含有免疫刺激序 列的免疫调节化合物(IMC)，这将在下文中进行更详细的描述。在一个优选的实施方案中， 多聚体表达为融合蛋白质。多聚体任选地与IMC缔合。将M2e和NP表达为融合蛋白质且将 融合蛋白质与IMC缀合的一个优点是更易于生产。将两种蛋白质同时表达并与IMC缀合，而 不是将每一种流感蛋白质表达为单独的蛋白质并分别地缀合它们，因此简化了生产过程。免疫调节化合物(IMC)和免疫刺激序列(ISS)本发明的组合物和方法可利用包含免疫刺激序列(IMC)的任一类型的免疫调节 化合物(IMC)。本文中所用的术语“IMC”指在体外、体内和/或间接体内测量时，影响可测量 的免疫应答的寡核苷酸序列。IMC含有非甲基化的胞嘧啶、鸟嘌呤二核苷酸序列(如“CpG” 或含有胞嘧啶随后是鸟苷且通过磷酸酯键连接的DNA)并刺激免疫系统。确定免疫系统的 刺激的多种方法描述如下。免疫刺激序列和/或免疫刺激核酸已经描述于本领域中。例 如，免疫刺激核酸已经描述于美国专利号6，194, 388 ；6，207，646和6，239，116中。IMC已 经描述于多个公开物中。参见，如美国公开号20060058254 ;W0 2004/058179 ；美国专利号 6，589，940 ；美国公开号 20040006034 ；美国公开号 20070027098 ；WO 98/55495。此外，称为 嵌合的免疫调节化合物(CIC)的这一类免疫刺激核酸也可与本发明的多聚体一起使用。参 见，如美国专利号7，255，868 ；美国公开号20030199466 ；美国公开号20070049550 ；美国公 开号 20030225016 ；美国公开号 20040132677 和 WO 03/000922。一般来说，IMC可是大于8个碱基或碱基对的任一长度。在其它实施方案中，IMC 是至少10个、15个或20个碱基长度或碱基对长度。在一些实施方案中，IMC是最多30个、 50个、60个、80个或100个碱基长度或碱基对长度。IMC含有通式5'-X1X2CGX3X4I'代表的 〇 6基序，其中^2、&和\是核苷酸。在一个方面，本发明的IMC可以包括a)含有至少1 个CG 二核苷酸的至少8个碱基长度的回文序列和b)在或靠近多核苷酸的5’末端的至少一 个TCG三核苷酸。IMC含有含至少一个CG 二核苷酸的至少8个碱基长度的至少一个回文序 列。IMC也可在或靠近多核苷酸的5’末端含有至少一个TCG三核苷酸序列(即，5’-TCG)。 在一些例子中，回文序列和5’-TCG由IMC中的0个、1个或2个碱基隔开。在一些例子中， 回文序列包括所有或部分5’ -TCG。这些IMC更详细地描述于美国公开号20060058254和 WO 2004/058179 中。在另一方面，本发明的IMC包含八聚体IMC，其包含含有CG的通常八聚体序列 5’ -嘌呤、嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、(胞嘧啶或鸟嘌呤)_3’的序列。为本领域技术人员显而易见的，这类序列包括如下序列GACGTTCC ；GACGCTCC ；GACGTCCC ； GACGCCCC；AGCGTTCC；AGCGCTCC；AGCGTCCC；AGCGCCCC；AACGTTCC；AACGCTCC；AACGTCCC； AACGCCCC；GGCGTTCC；GGCGCTCC；GGCGTCCC ；GGCGCCCC ；GACGTTCG ；GACGCTCG ；GACGTCCG ； GACGCCCG ；AGCGTTCG ；AGCGCTCG ；AGCGTCCG ；AGCGCCCG ；AACGTTCG ；AACGCTCG；AACGTCCG； AACGCCCG ；GGCGTTCG ；GGCGCTCG ；GGCGTCCG ；GGCGCCCG。IMC 也可包含选自 AACGTTCC、 AACGTTCG、GACGTTCC和GACGTTCG的八聚体。在一个实施方案中，IMC八聚体包含5’-嘌呤、 嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤_3’或IMC八聚体包含5’ -嘌呤、嘌呤、胞 嘧啶、鸟嘌呤、嘧啶、嘧啶、胞嘧啶、胞嘧啶-3’。IMC八聚核苷酸也可包含5’-GACGTTCG-3’、 5， -GACGTTCC-3，、5， -AACGTTCG-3，或 5， -AACGTTCC-3，。在另一方面，包含1018IMC或由1018IMC组成的IMC可与本发明的M2e或M2e/ NP多聚体(共价或非共价)缔合来使用。1018IMC的结构已经公开于多篇科学文章以及 专利中。参见，如 Hessel 等人(2005) J. Exp. Med. ,202(11) :1563。一般来说，1018IMC 是 (5，-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3，) (SEQ ID NO 10)。IMC如嵌合的免疫调节化合物(“CIC”)也可与本发明的M2e或M2e/NP多聚体一 起使用。CIC一般包含一个或多个核酸部分以及一个或多个非核酸部分。具有多于一个核 酸部分的CIC中的核酸部分可以是相同的或不同的。具有多于一个非核酸部分的CIC中的 非核酸部分可以是相同的或不同的。因此，在一个实施方案中，CIC包含两个或多个核酸部 分和一个或多个非核酸间隔部分，其中至少一个非核酸间隔部分与两个核酸部分是共价连 接的。在一个实施方案中，至少一个核酸部分包含序列5’ -CG-3’。在一个实施方案中，至 少一个核酸部分包含序列5’ -TCG-3’。M2e或M2e/NP多聚体的递送在一个实施方案中，M2e或M2e/NP多聚体通过其自身递送到个体中。在另一实施 方案中，多聚体与一种或多种IMC—起递送。在一个实施方案中，多聚体与作为缀合物的 IMC进行共施用。在另一实施方案中，多聚体与IMC在分别的载体中进行施用。多聚体的施 用可与IMC同时或同步。下文讨论IMC的递送也考虑了多聚体与IMC —起的递送。流感多聚体和/或多聚体/IMC也可与其它流感疫苗一起施用以增强流感疫苗的 功效。考虑的与流感多聚体和/或多聚体/IMC —起使用的流感疫苗的类型包括但不限于
(whole virus vaccine)、>t __i￡l& (split virus vaccine) 的病毒疫苗、重组亚单位病毒疫苗和重组病毒疫苗。此外，多聚体或多聚体/IMC也可与多价流感疫苗(如，单价流感疫苗、二价流感疫 苗或三价流感疫苗)的一种或多种组分一起递送。在一个方面，多聚体或多聚体/IMC的组 合物与三价灭活流感疫苗(TIV)的一种或多种组分一起递送。TIV的标准组分包括来自三 种不同流感病毒株的血细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶。可使用的TIV的例子包括但不限于 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0 TIV 使用的 量已经通过食品和药品管理局(FDA)批准使用。二价流感疫苗(DIV)可含有来自两种不同 流感毒株的血细胞凝集素。单价流感疫苗(MIV)可含有来自仅一种流感毒株如H5W的血 细胞凝集素和神经氨酸酶。TIV、DIV、MIV也可仅含有来自不含有神经氨酸酶组分的三种、 两种或一种流感毒株的血细胞凝集素。此外，多聚体或多聚体/IMC也可与含有来自多于三 种分别的流感毒株的血细胞凝集素和神经氨酸酶的流感疫苗(四价流感疫苗或更高价的流感疫苗)一起递送。这些TIV、DIV和MIV可与多聚体或多聚体/IMC组合物一起同时施 用或者在施用多聚体或多聚体/IMC组合物之前或者之后隔一段时间地施用。在一个方面， 可将多聚体或多聚体/IMC在施用TIV、DIV或MIV之前施用给个体以增强对含血细胞凝集 素的疫苗的应答。在一个实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在TIV、DIV或MIV前约1天施 用。在其它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在TIV、DIV或MIV前约2天、3天、4天、5天 或6天施用。在其它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在TIV、DIV或MIV前约1周施用。 在其它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在TIV、DIV或MIV前约1. 5周或2周施用。在其 它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在TIV、DIV或MIV前约2. 5周、3周、3. 5周 或4周施 用。多聚体或多聚体/IMC也可与单价灭活疫苗(MIV)，如针对H5W毒株的单价灭活疫 苗一起施用。MIV含有来自仅一种流感毒株的血细胞凝集素和神经氨酸酶。这些MIV可与 多聚体或多聚体/IMC组合物一起同时施用或者在施用多聚体或多聚体/IMC组合物之前或 者之后隔一段时间地施用。在一个方面，可将多聚体或多聚体/IMC在施用MIV前施用给个 体以增强MIV的应答。在一个实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在MIV前约1天施用。在 其它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在MIV前约2天、3天、4天、5天或6天施用。在其 它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在MIV前约1周施用。在其它实施方案中，多聚体或 多聚体/IMC在MIV前约1. 5周或2周施用。在其它实施方案中，多聚体或多聚体/IMC在 MIV前约2. 5周、3周、3. 5周或4周施用。M2e、M2e/NP、M2e/IMC和M2e/NP/IMC构建体可掺入到递送载体如质粒、黏端质粒、 病毒或反转录病毒中，其可顺序地编码治疗上有利的多肽，如细胞因子、激素和抗原。将IMC 掺入到此种载体中没有不利地影响它们的活性。胶态分散系统可用于靶向地递送组合物到发炎的组织，如鼻膜。胶态分散系统包 括高分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和包括水包油乳剂、微团、混合微团和脂质体在内的 基于脂质的系统。在一个实施方案中，本发明的胶态系统是脂质体。脂质体是在体外和体内用作递送运载体的人工膜小泡。已经显示，大小为 0.2μπι-4.0μπι的大单层脂质体(LUV)能包封相当高百分数的含有大高分子的含水缓 冲液。可将RNA、DNA和完整病毒体包封在含水的内部并以生物学活性形式递送给细胞 (Fraley等人，Trends Biochem. Sci.，6 :77，1981)。除哺乳动物细胞外，脂质体也已经用于 在植物、酵母和细菌细胞中的多核苷酸递送。为了使脂质体成为有效的基因转移运载体，应 当存在以下表征(1)高效地包封编码反义多核苷酸的基因但不损害其生物学活性；(2)与 非靶细胞比较，优先地并基本上与靶细胞结合；(3)高效地递送运载体的含水内含物给靶 细胞；和(4)准确的和有效的表达基因信息(Mannino等人，Biotechniques，6 :682，1988)。脂质体的组合物通常是磷脂的组合，特别是高相变温度磷脂的组合，通常是与类 固醇组合，尤其是与胆固醇组合。也可使用其它磷脂或其它脂质。脂质体的物理特征取决 于PH、离子强度和二价阳离子的存在。在脂质体产生中有用的脂质的例子包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆 碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。特别有用的脂质的例子是二 酰磷脂酰甘油，其中脂质部分含有14个至18个碳原子，特别地含有16个至18个碳原子， 且是饱和的。阐示性的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰胆碱。脂质体的靶向可基于解剖学的因素和机理的因素进行分类。解剖学的分类是基于 选择性例如器官特异的、细胞特异的和细胞器特异的水平。机理的靶向可基于靶向是被动 的还是主动的来区别。被动靶向使用脂质体的天然趋向来散播给含有窦状毛细血管的器官 中网状内皮系统(RES)的细胞。在另一方面，主动靶向涉及通过将脂质体与特异性配体如 单克隆抗体、糖类、糖脂或蛋白质偶联或者通过改变组合物或者脂质体的大小来改变脂质 体，以达到靶向不是天然存在的定位位置的器官和细胞类型。靶向的递送系统的表面可以以多种方式进行修饰。在脂质体靶向递送系统的情 形时，可将脂质基团掺入到脂质体的脂质双层中，以维持靶向配体与脂质体双层的稳定缔 合。多种熟知的连接基团可用于脂质链与靶向配体的结合(参见，如Yanagawa等人，Nuc. Acids Symp. Ser. , 19 189 (1988) ；Grabarek ^A,Anal. Biochem. , 185 131 (1990) ；Staros 等人，Anal. Biochem.，156 220(1986)和 Boujrad 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 5728(1993))。多聚体或多聚体/IMC的靶向递送也可通过将IMC与病毒表面和非病毒重组 表达载体、与抗原或其它配体、与单克隆抗体或者与具有期望的结合特异性的任一分子缀 合来达到。本领域普通技术人员也熟悉或能容易地确定在制备寡核苷酸-肽缀合物中有用 的方法。缀合可在IMC寡核苷酸的任一末端或在内部位置中合适的修饰的碱基(如胞嘧 啶或尿嘧啶)处完成。作为参考，用于寡核苷酸与蛋白质和与Ig的寡糖部分缀合的方法 是已知的(参见，如 0' Shannessy 等人，J. Applied Biochem. ,7 =347(1985) 另一有用的 参考文献是 Kessler “ Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids“,在 Kricka() Nonisotopic DNA Probe Techniques(Acad. Press,1992)巾)。肽药物与根据本发明的寡核苷酸IMC的共施用也可通过将IMC顺式或反式地掺 入到编码任一治疗上有利的、可通过重组表达载体递送的蛋白质的重组表达载体(质粒、 黏端质粒、病毒或反转录病毒)中来达到。如果将寡核苷酸IMC掺入到用于实践本发明 的表达载体中是期望的，那么该掺入可使用不需要对本领域普通技术人员详细说明的常 规技术来完成。然而，对于参考，普通技术人员可希望参考Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology,同上。简而言之，重组表达载体(包括不编码任一蛋白质并用作寡核苷酸IMC的携带者 的那些重组表达载体)的构建使用标准的连接技术。为了分析以证实构建的载体中的正 确序列，可将连接混合物用于转化个体细胞，并根据需要，通过抗生素抗性选择成功的转化 体。制备来自转化体的载体，通过限制性分析，和/或通过如Messing等人的方法(Nucleic Acids Res.，9 :309，1981)、Maxam 等人的方法(Methods in Enzymology, 65 :499，1980)或 者本领域技术人员已知的其它合适方法进行测序。剪切片段的大小分离使用常规凝胶电泳 进行，如由 Maniatis 等人，(Molecular Cloning，133 页-134 页，1982)所描述。个体细胞可用表达载体转化并培养于常规的改进为适合于诱导启动子、选择转化 体或扩增基因的营养培养基中。培养条件如温度、PH等是以前用于表达挑选的个体细胞的 培养条件，且对普通技术人员是显而易见的。如果重组表达载体是用作本发明使用的寡核苷酸IMC的携带者，由于质粒和黏端质粒缺乏致病性，因此它们是特别优选的。然而，质粒和黏端质粒在体内易发生比病毒更快的降解，且因此可能不会递送足够剂量的IMC以基本上抑制由全身施用的基因治疗载体发 挥的ISS免疫刺激活性。在病毒载体备选物中，腺伴随病毒拥有低致病性的优点。腺伴随 病毒对外源基因插入的相对低的能力在本文的情况下不会造成困难，因为本发明寡核苷酸 IMC可以合成相对小的长度。在一个实施方案中，DNA疫苗或病毒载体用于表达M2e多聚体 或M2e/NP多聚体(任选地包括寡核苷酸IMC)。
可用于本发明的其它病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、牛痘或RNA病 毒如反转录病毒。反转录病毒载体优选地衍生自鼠反转录病毒、禽类反转录病毒或人HIV 反转录病毒。在反转录病毒载体中可插入单外源基因的反转录病毒载体的例子包括但不限 于莫洛尼鼠白血病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV) 和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多另外的反转录病毒载体可掺入多个基因。所有这些载体能转 移或掺入用于可选择标记的基因以便鉴定和产生转导细胞。由于重组反转录病毒是有缺陷的，它们需要辅助以产生感染的载体颗粒。这种辅 助可以例如通过使用含有在LTR中的调节序列控制下的编码反转录病毒的所有结构基因 的质粒的辅助细胞系来提供。这些质粒缺少能使包装机构识别用于包壳的RNA转录物的核 苷酸序列。已经缺失了包装信号的辅助细胞系包括但不限于如T2、PA317和PA12。由于没 有包装基因组，这些细胞系产生了空的病毒体。如果将反转录病毒载体导入包装信号完整、 但将结构基因用其它目的基因替换的这类辅助细胞中，载体可被包装且载体病毒体也可产 生。通过将一个或多个目标序列与编码如针对特定靶细胞上受体的配体的另一基因一起插 入到病毒载体中，载体能提供目标特异性。反转录病毒载体可通过插入如编码糖、糖脂或蛋 白质的多核苷酸来获得目标特异性。优选的靶向通过使用抗体来实现靶向反转录病毒载 体。本领域技术人员知道或者在无需进行过多实验下能容易地确定能插入到反转录病毒基 因组中以允许含有寡核苷酸IMC的反转录病毒载体的目标特异性递送的特异多核苷酸序 列。多聚体和多聚体/IMC的药物组合物本发明包括包含M2e多聚体、M2e/IMC多聚体、M2e/NP多聚体、和M2e/NP/IMC多聚 体的所有药物组合物。优选地与本发明IMC—起使用的可药用载体可包括无菌的水溶液或 非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注 射的有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲 介质。肠胃外的运载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化的林格或固 定油类。静脉内的运载体包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格葡萄糖的电 解质补充物)等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂 和惰性气体等。根据本发明，也可使用本领域熟知的方法将多聚体或多聚体/IMC低压冻干 用于随后的重构和用途。备选地，如果将多聚体或多聚体/IMC与以液体形式的疫苗(如， TIV)组合使用，那么多聚体或多聚体/IMC也可配制为液体。吸收促进剂、去污剂和化学刺激剂(如，角蛋白水解剂(keritinolyticagent))能 增强IMC组合物到靶组织的传递。对于涉及有关已经在有机药物和基于肽的药物的粘膜 递送中成功使用的吸收促进剂和去污剂的一般原理的参考文献，参见Chien，Novel Drug Delivery Systems,第 4 章(MarcelDekker, 1992)。具体来说，合适的鼻吸收促进剂表述于Chien，同上，于第5章，表2和表3 ；优选地是温和剂(milder agent) 0在本发明的方法中用于粘膜/鼻递送的合适试剂也描述于Chang 等人’ Nasal Drug Delivery,"Treatiseon Controlled Drug Delivery", 第9章和其表3-4B，(Marcel Dekker, 1992)中。已知的经皮肤增强药物吸收的合适试 剂描述于 Sloan, Use ofSolubility Parameters from-Regular Solution Theory to DescribePartitioning-Driven Processes，第 5 章，"Prodrugs :Topical and OcularDrug Delivery”(Marcel Dekker, 1992)中，并描述于文中其它地方。药物组合物也包括制剂用于诱导流感病毒的免疫应答的疫苗。在一个方面，本发 明提供了包含含有至少两个拷贝的M2e的多聚体的组合物的疫苗。疫苗也可额外地包括 NP。在一个实施方案中，疫苗含有包含含NP和至少2个拷贝的M2e的融合蛋白质的组合 物。这些疫苗也可以以文中所述的方式任选地包括IMC。可使用的IMC的例子包括但不限 于1018ISS、7909和其它B型寡核苷酸、CIC如C295和其它、C型寡核苷酸如C792和其它。疫苗也可包括此处所述的运载体。可用的运载体的例子包括但不限于矾、微粒、月旨 质体和纳米颗粒。本发明疫苗也可进一步含有单价、二价或一种三价灭活流感疫苗(TIV) 的一种或多种组分。可使用的单价疫苗的例子是H5大流行病疫苗。可使用的TIV的非限 制性例子是 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0ffl〒續本删綠{本龄碰/IMC白妨本发明的多聚体或多聚体/IMC组合物和疫苗使用适合于药物递送的任一可用的 方法和途径向个体施用。在一个优选的实施方案中，本发明的多聚体或多聚体/IMC组合物 和疫苗与其它标准的流感疫苗一样，通过使用针的注射施用。在一个实施方案中，多聚体与 或不与IMC —起通过本领域技术人员已知的任一递送方法递送到上呼吸道和/或下呼吸 道。在一个优选的实施方案中，多聚体与或不与IMC—起作为疫苗递送。任选地，多聚体与 其它单价、二价或三价流感疫苗一起施用。另一可能的递送方法是鼻内递送。多聚体或多 聚体/IMC另一可能的递送方法是通过吹入法。其它施用方法包括间接体内的方法(即，递 送用多聚体或多聚体/IMC孵育的或转染的细胞)以及全身的或局部的途径。本领域普通 技术人员应当理解，指导将IMC递送到个体中的方法和途径应该避免IMC在体内的降解。鼻内施用方法在处理呼吸疾病如流感病毒感染中特别有用。这类方法包括吸入本 发明的多聚体或多聚体/IMC组合物的喷雾悬浮液。适合于递送多聚体或多聚体/IMC组 合物到鼻粘膜、气管和细支气管的喷雾器设备是本领域熟知的，且因此不在此处详细描述。 对于关于鼻内药物递送的一般综述，本领域一般技术人员可以希望参考Chien，N0Vel Drug DeliverySystems,第 5 章(Marcel Dekker,1992)。在一个方面，本发明的多聚体或多聚体/IMC组合物和疫苗以约0. 1 μ g至约5mg， 更优选地在0. 25 μ g和3mg之间，甚至更优选地在0. 5 μ g和Img之间，甚至更优选地在 0. 75 μ g和500 μ g之间，甚至更优选地在1 μ g和100 μ g之间的剂量施用给需要其的个体。用于实施本发明方法的试剂念为了用于上述方法中，本发明也提供了试剂盒。这类试剂盒可包括以下任一一种 或全部M2e、M2e/NP、M2e/IMC (缀合的或非缀合的)；M2e/NP/IMC (缀合的或非缀合的)的 多聚体；可药用载体(可与IMC预混合)或用于重构冻干的多聚体或多聚体/IMC的悬浮基 质；额外的药物；用于每一 IMC和额外药物的无菌小瓶、或用于其混合物的单一小瓶、用于 向个体递送多聚体或多聚体/IMC的设备；用于检测所寻求的免疫调节效果在受治疗的个体中已经达到的指示物的测定试剂、如何和何时施用多聚体或多聚体/IMC的说明书以及 合适的测定设备。此外，本发明也提供了包含M2e多聚体或M2e/NP多聚体(与或不与IMC缀合)和 流感疫苗(如TIV)的一种或多种组分的试剂盒。本发明的方法本发明的组合物和/或疫苗可用于诱导免疫应答以抗击不同的流感病毒株感染。 可以是免疫应答的靶的示例性流感病毒株显示于图1中。人M2e、禽类M2e和猪M2e以及它 们的变体的共有序列显示于图1中。NP和其变体的共有序列显示于图2中。针对流感病毒 的免疫应答可以是体液应答或细胞免疫应答或者这两种应答的组合。动物或细胞群体中的免疫应答可以以许多方式检测，包括一种或多种IFN-Y、 IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5、IP-10、ISG-54K、MCP-1 的增加表达、或者 以免疫刺激为特征的基因表达谱、以及应答如B细胞增殖和树突细胞成熟的改变。在细胞 群体中刺激免疫应答的能力具有许多用途，如用于免疫抑制剂的测定系统中。对多聚体的免疫应答的分析(定性分析和定量分析二者)可通过本领域已知的任 一方法进行，包括但不限于，测量抗原特异的抗体产生(包括测量特异性抗体+亚类)、淋 巴细胞的特异性群体如⑶4+T细胞、NK细胞或CTLs的活化、细胞因子如IFN- y、IFN- α、 IL-2、IL-4、IL-5、IL-IO或IL-12的产生和/或组胺的释放。用于测量特异性抗体应答的 方法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)且是本领域熟知的。特定类型淋巴细胞如CD4+T细 胞的数量可用如荧光激活的细胞分选术(FACS)测量。细胞毒性测定和CTL测定可例如由 Raz 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 :9519_9523 和 Cho 等人(2000)所述进行。细 胞因子浓度可通过如ELISA进行测量。评价对免疫原的免疫应答的这些测定法和其它测定 法是本领域熟知的。参见，如 SELECTED METHODS IN CELLULARIMMUNOLOGY(1980)Mishell 禾口 Shiigi 编辑，W. H. Freeman and Co.。优选地，Thl型应答是刺激的，S卩引发的和/或增强的。关于本发明，通过与未用多 聚体或多聚体/IMC处理的对照细胞比较，测量来自用多聚体或多聚体/IMC处理的细胞的 细胞因子产生来体外或间接体内地确定刺激的Thl型免疫应答。确定细胞的细胞因子产生 的方法包括本文中所述的和本领域已知的任一那些方法。在应答多聚体或多聚体/IMC处 理中产生的细胞因子的类型表明由细胞产生的Thl型或Th2型偏向的免疫应答。如本文中 所用，术语“Thl型偏向的”细胞因子产生指与刺激不存在时与Thl型免疫应答相关的细胞 因子的产生比较，存在刺激时这类细胞因子的可测量的增加产生。这类Thl型偏向细胞因 子的例子包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-y、IFN-a和TNF-a。相反，“Th2型偏向的细胞 因子”指与Th2型免疫应答相关的那些细胞因子，且包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13。对 确定多聚体或多聚体/IMC活性有用的细胞包括免疫系统细胞、分离自个体的原代细胞和/ 或细胞系，优选地是APC和淋巴细胞(如，巨噬细胞和T细胞)以及脾细胞。刺激的Thl型免疫应答也可在用多聚体或多聚体/IMC治疗的个体中测量，通过本 领域已知的任一方法确定，所述方法包括但不限于(1)在用多聚体或多聚体/IMC治疗之 前和之后测量INF-γ ； (2)在用多聚体或多聚体/IMC治疗之前和之后，IL-12、IL-18和/ 或IFN(a、β或Y)水平的增加；(3)与未用多聚体或多聚体/IMC治疗的对照比较，在多 聚体或多聚体/IMC治疗的个体中的“Thl型偏向”抗体产生。多种这些测定可通过使用本文中所述的或本领域已知的任一方法体外或间接体内测量由脾细胞、APC和/或淋巴细胞 产生的细胞因子得到。一些这些测定可通过使用本文中所述的或本领域已知的任一方法测 量流感特异性抗体的类和/或亚类来得到。对多聚体或多聚体/IMC治疗应答产生的抗原特异性(即流感特异性)抗体的类 和/或亚类表明来自细胞的Thl型偏向的免疫应答或Th2型偏向的免疫应答。如文中所用， 术语“Thl型偏向的”抗体产生指与Thl型免疫应答相关的抗体(即Thl相关的抗体)的可 测量的增加产生。可测量一种或多种Thl相关的抗体。该类Thl型偏向的抗体的例子包括 但不限于人 IgGl 和 / 或 IgG3(参见，如 Widhe 等人(1998) Scand. J. Immunol. 47 :575_581 和 de Martino 等人(1999)Ann. Allergy Asthma Immunol. 83 :160_164)和鼠 IgG2a。相反， "Th2型偏向的抗体”指与Th2型免疫应答相关的抗体，且包括但不限于人IgG2、IgG4和/ 或 IgE (参见，如 Widhe 等人(1998)和 de Martino 等人(1999))和鼠 IgGl 和 / 或 IgE。作为施用多聚体或多聚体/IMC的结果发生的Thl型偏向的细胞因子诱导产生了 增强的细胞免疫应答，如由NK细胞、细胞毒性杀伤细胞、辅助性Thl细胞和记忆细胞进行的 细胞免疫应答。这些应答在用于针对多种流感病毒株的保护性或治疗性接种疫苗中是特别 有利的。因此，本发明的组合物和疫苗可作为通用疫苗接种以抗多种流感病毒株。多聚体和多聚体/IMC的组合物和疫苗还可用于改善个体中与流感病毒感染相关 的一种或多种症状。这通过向个体施用包含流感基质蛋白胞外结构域(M2e)的多聚体的疫 苗实现，其中所述多聚体能在个体中诱导免疫应答。与流感病毒感染相关的症状包括但不 限于，身体疼痛(特别是关节疼痛和咽喉疼痛)、咳嗽和喷嚏、极端的寒冷和发热、疲劳、头 疼、受刺激的眼睛流泪、鼻塞、恶心和呕吐、以及眼睛发红、皮肤发红(尤其是脸发红)、嘴发 红、咽喉发红和鼻子发红。在一个实施方案中，疫苗进一步包含NP。在本发明的其它实施方 案中，疫苗进一步包含IMC。在本发明的另一方面，本发明的组合物和疫苗提供了通过向个体施用(a)包含至 少两个拷贝的M2e的疫苗和(b)单价灭活疫苗、二价灭活疫苗或三价灭活疫苗(TIV)的 一种或多种组分来降低个体中流感病毒感染的可能性的方法。TIV的例子包括但不限于 Fluzone、Fluvirin、Fluarix、FluLaval、FluBlok、FluAd、Influvac 禾口 Fluvax0 在一些实施 方案中，疫苗进一步包含上述的NP。在其它实施方案中，疫苗进一步包含文中以任一方式描 述的并为本领域已知的IMC。提供了以下的实施例以说明本发明的方面，但并不意指以任何方式限制本发明。 实施例实施例1. 8 X (M2e)-NP~6X组氨酸标签(组氨酸标签的N8)的构建在大肠杆菌(E.coli)中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的8个拷贝的 基质2的胞外部分(M2e)基因的构建体。该构建体的核苷酸序列如下(下划线序列表明用 于将基因构建体克隆入质粒载体的限制性酶位点)CATATGTCTCTGTTAACGGAAGTCGAGACACCCATCCGGAATGAGTGGGGTTCCCGTAGTAATGATAGTTCGGATAGCTTACTGACCGAGGTTGAAACACCTATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGGTCAAATGACTCGAGCGATTCGTTGTTGACCGAAGTAGAGACCCCAATCCGCAATGAATGGGGCTCCCGGAGTAACGATAGCAGCGACTCCTTACTGACGGAGGTGG
AAACGCCCATCCGTAACGAGTGGGGTTCTAGAAGTAACGATTCCTCGGATAGCTTATTAACAGAAGTCGAAACGCCTATTCGCAATGAATGGGGTTCGCGTTCGAATGATTCCAGTGATAGCCTGTTAACGGAAGTTGAAACTCCGATCCGTAATGAGTGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACACCAATCCGGAACGAATGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAA
TGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCATCACCATCACCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 1)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVK
GVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQR NLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTE11RMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 2)实施例2. 4 X (M2e)~NP~4X (M2e)~6X组氨酸标签(组氨酸标签的N4/C4)的构津在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的和在3’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的 M2e基因的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACCGAAGTCGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGGGCAGTCGGTCGAACGATAGCTCGGATAGCCTGCTGACGGAGGTGGAAACCCCGATCCGTAACGAGTGGGGCTCTCGTAGTAACGACTCGAGCGATAGCTTACTGACTGAAGTTGAAACTCCAATTCGCAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAATGATAGCAGTGATAGCTTATTAACGGAAGTTGAAACGCCTATCCGGAACGAATGGGGTTCTAGAAGCAACGATAGTAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAA
CGCTGAGGAATATGACAACTCTCTGTTGACTGAAGTAGAGACTCCAATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGTTCTAACGACTCTTCCGACTCTCTGCTCACCGAGGTTGAAACCCCGATTCGCAATGAATGGGGCTCGCGTTCCAATGACTCGAGCGATTCTCTCCTGACGGAGGTTGAGACGCCTATCCGTAATGAGTGGGGTTCCCGGAGCAATGATTCTTCTGATTCTCTGCTGACTGAAGTCGAAACCCCGATTCGGAACGAGTGGGGCAGTCGTTCAAATGACTCGTCGGACCATCATCATCACCATCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 3)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTE11RMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDHHHHHH(SEQ ID NO 4)实施例3. 4X (M2e)-NP~6X组氨酸标签(组氨酸标签的N4)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的M2e基因 的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACGGAGGTGGAAACTCCAATTCGGAATGAATGGGGTTCGCGCAGCAATGATAGCTCGGATAGCTTACTGACCGAAGTCGAAACACCCATCCGTAACGAATGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACCCCGATCCGCAATGAGTGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAATGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGAC
CATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTA
TGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGG
TAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCATCACCATCACCATTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 5)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 6)实施例4. 4X (M2e~间隔区)_NP_6X组氨酸标签(组氨酸标签的N4s)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的M2e基因 和间隔区的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGTCCCTGCTGACGGAAGTAGAAACCCCAATTCGCAATGAATGGGGCAGCCGTAGCAATGACTCTTCTGACGGTTCTGCGAGCGGTAGCTTGCTTACTGAAGTTGAAACTCCTATCCGTAACGAATGGGGTTCCCGTTCTAACGACTCGAGCGACGGCAGCGCGTCCGGTTCTCTGCTGACTGAGGTCGAGACTCCGATTCGTAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAACGATTCTTCCGATGGCTCTGCTTCTGGTTCCTTGTTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCCGCAACGAATGGGGCTCTCGCTCTAATGATAGCTCTGATGGTTCGGCTTCCGGCATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAAC
GGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACCATCACCATCATCACCACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 7)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFffRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMM DQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNHHHHHH(SEQ ID NO 8)实施例5. 8 X (M2e)-NP (非组氨酸标签的N8)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的8个拷贝的M2e基因 的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGTCTCTGTTAACGGAAGTCGAGACACCCATCCGGAATGAGTGGGGTTCCCGTAGTAATGATAGTTCGGATAGCTTACTGACCGAGGTTGAAACACCTATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGGTCAAATGACTCGAGCGATTCGTTGTTGACCGAAGTAGAGACCCCAATC
CGCAATGAATGGGGCTCCCGGAGTAACGATAGCAGCGACTCCTTACTGACGGAGGTGGAAACGCCCATCCGTAACGAGTGGGGTTCTAGAAGTAACGATTCCTCGGATAGCTTATTAACAGAAGTCGAAACGCCTATTCGCAATGAATGGGGTTCGCGTTCGAATGATTCCAGTGATAGCCTGTTAACGGAAGTTGAAACTCCGATCCGTAATGAGTGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACACCAATCCGGAACGAATGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAATGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTA
GCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTA
GCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 9)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNG
DDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN(SEQ ID NO: 10)实施例6. 4X (M2e)~NP~4X (M2e)(非组氨酸标签的N4/C4)的构津在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的和在3’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的 M2e基因的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACCGAAGTCGAGACGCCTATTCGTAATGAATGGGGCAGTCGGTCGAACGATAGCTCGGATAGCC TGCTGACGGAGGTGGAAACCCCGATCCGTAACGAGTGGGGCTCTCGTAGTAACGACTCGAGCGATAGCTTACTGACTGAAGTTGAAACTCCAATTCGCAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAATGATAGCAGTGATAGCTTATTAACGGAAGTTGAAACGCCTATCCGGAACGAATGGGGTTCTAGAAGCAACGATAGTAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCT
AGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTCTCTGTTGACTGAAGTAGAGACTCCAATTCGTAACGAATGGGGTAGCCGTTCTAACGACTCTTCCGACTCTCTGCTCACCGAGGTTGAAACCCCGATTCGCAATGAATGGGGCTCGCGTTCCAATGACTCGAGCGATTCTCTCCTGACGGAGGTTGAGACGCCTATCCGTAATGAGTGGGGTTCCCGGAGCAATGATTCTTCTGATTCTCTGCTGACTGAAGTCGAAACCCCGATTCGGAACGAGTGGGGCAGTCGTTCAAATGACTCGTCGGACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO: 11)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD(SEQ ID NO: 12)实施例7. 4XM2e-NP (非组氨酸标签的N4)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的M2e基因 的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGAGCCTGTTAACGGAGGTGGAAACTCCAATTCGGAATGAATGGGGTTCGCGCAGCAATGATAGCTCGGATAGCTTACTGACCGAAGTCGAAACACCCATCCGTAACGAATGGGGCAGCCGTAGCAACGACTCGAGCGACTCCCTGCTCACTGAGGTTGAGACCCCGATCCGCAATGAGTGGGGCTCGCGCTCGAACGATTCTTCCGATTCTCTGCTGACCGAAGTAGAAACTCCTATTCGTAATGAATGGGGTTCCCGTTCCAATGATAGCAGCGATATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAACACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCG
TATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCC
AGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 13)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIffHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDN(SEQ ID NO 14)实施例8. 4X (M2e~间隔区)-NP(非组氨酸标签的N4s)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在5’的与核蛋白基因融合的4个拷贝的具有间隔 区的M2e基因的构建体。该构建体的核苷酸序列如下CATATGTCCCTGCTGACGGAAGTAGAAACCCCAATTCGCAATGAATGGGGCAGCCGTAGCAATGACTCTTCTGACGGTTCTGCGAGCGGTAGCTTGCTTACTGAAGTTGAAACTCCTATCCGTAACGAATGGGGTTCCCGTTCTAACGACTCGAGCGACGGCAGCGCGTCCGGTTCTCTGCTGACTGAGGTCGAGACTCCGATTCGTAATGAGTGGGGTAGCCGCAGCAACGATTCTTCCGATGGCTCTGCTTCTGGTTCCTTGTTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCCGCAACGAATGGGGCTCTCGCTCTAATGATAGCTCTGATGGTTCGGCTTCCGGCATGGCTTCCCAGGGTACTAAACGTAGCTATGAACAGATGGAAACCGATGGTGAACGTCAGAACGCGACTGAAATCCGTGCTAGCGTAGGTAAAATGATCGGTGGTATCGGTCGTTTCTACATCCAGATGTGCACTGAACTTAAACTTAGCGACTATGAAGGTCGTCTGATCCAGAATTCTCTGACCATTGAACGTATGGTTCTTAGCGCGTTTGATGAACGTCGTAACAAATACCTTGAAGAAC
ACCCGTCTGCTGGTAAAGACCCTAAAAAAACTGGTGGTCCGATCTATCGTCGTGTTAACGGTAAATGGATGCGTGAACTGATCCTGTATGACAAAGAAGAAATCCGTCGTATTTGGAGACAGGCTAACAATGGTGATGACGCGACCGCTGGACTGACCCACATGATGATTTGGCACAGCAACCTGAACGATGCGACCTACCAGCGTACCCGTGCGTTAGTACGTACCGGTATGGACCCGCGTATGTGTAGCCTGATGCAAGGTAGCACTCTGCCTCGTCGTTCTGGTGCGGCTGGTGCGGCGGTTAAAGGTGTGGGTACTATGGTTATGGAACTGGTTCGTATGATTAAACGTGGTATCAACGATCGTAACTTTTGGCGTGGTGAAAATGGTCGTAAAACCCGTATCGCGTATGAACGTATGTGCAACATCCTTAAAGGTAAATTTCAGACCGCAGCGCAGAAAGCTATGATGGACCAGGTTCGTGAATCTCGTAATCCGGGTAATGCTGAGTTCGAAGACCTGACCTTCCTGGCTCGTTCTGCACTGATCCTGCGTGGTAGCGTAGCGCACAAATCTTGCCTGCCAGCGTGTGTTTACGGTCCGGCGGTTGCTAGCGGTTATGACTTCGAACGTGAAGGTTACTCTTTGGTTGGTATTGACCCGTTCCGACTGCTCCAGAACTCCCAGGTTTACTCTCTGATCCGTCCTAACGAAAACCCGGCGCATAAATCTCAGTTAGTTTGGATGGCTTGTCACTCTGCGGCGTTTGAAGACCTGCGTGTTCTGAGCTTCATTAAAGGTACTAAAGTTCTGCCGCGTGGTAAACTGTCTACCCGTGGTGTTCAGATCGCTAGCAATGAAAACATGGAAACTATGGAATCTAGCACCCTAGAACTGCGTAGTCGTTATTGGGCGATCCGTACCCGTAGCGGTGGTAATACCAACCAGCAGCGTGCGAGCGCGGGTCAGATTAGCATCCAGCCGACCTTTAGCGTTCAGCGTAACCTGCCGTTTGACCGTACCACCATCATGGCTGCGTTTAACGGTAACACTGAAGGTCGTACCAGTGACATGCGTACTGAAATCATCCGTATGATGGAATCTGCTCGACCGGAAGACGTGAGCTTTCAGGGTCGTGGTGTTTTTGAACTTAGCGATGAAAAAGCTGCTAGCCCGATCGTTCCTAGCTTTGACATGTCTAACGAAGGTAGCTACTTCTTCGGTGACAACGCTGAGGAATATGACAACTAATAAGGATCC(SEQ ID NO 15)以下是融合蛋白质的蛋白质序列MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDGSASGMASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTE
GRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDN (SEQ ID NO 16)实施例9. NP-8X (M2e)(非组氨酸标签的C8)的构建在大肠杆菌中制备并表达含有在3’的与核蛋白基因融合的8个拷贝的M2e基因 的构建体。以下是融合蛋白质的蛋白质序列MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIffRQ
ANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLSTRGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPFDRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFDMSNEGSYFF⑶NAEEYDNSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLLTEVETPIRNEffGSRSNDSSD(SEQ ID NO: 18)实施例10. NP、M2e和IMC的共价缀合物和非共价缀合物该实施例描述了包含制备的NP、M2e和IMC的多种共价缀合物和非共价缀合物。 “双缀合物”通过将乙酰化M2e肽与3’硫代295ISS缀合来制备。然后，将多(包括单)拷 贝与NP蛋白质顺序地缀合。将“竞争性结合缀合物"NP蛋白质同时与NHS活化的M2e肽和 NHS活化的3，295ISS缀合。通过同时添加所有反应物，IMC和M2e肽竞争地结合至NP蛋 白质上的相同部位。“离子缔合缀合物”通过使用NP蛋白质中的天然RNA结合口袋非共价 地捕获M2e-IMC缀合物的IMC组分来制备。过量的M2e_IMC缀合物与游离的NP蛋白质反 应，结果形成非共价的蛋白质缀合的肽复合物。t施例11.与IMC缀合的M2e flt用矾递送时i秀导强的杭体应答将10只BALB/c小鼠为一组通过使用仅代表流感M2蛋白质的胞外结构域(M2e) 的合成肽(5yg)、与 1018ISS(20y g)混合的 M2e (5 μ g)、缀合到 1018ISS (约 20 μ g)的 M2e(5 μ g)、或者与矾结合的M2e-1018ISS缀合物，以两周间隔地肌肉注射两次进行免疫。 第二次免疫后两周，将小鼠抽血并通过ELISA测量抗M2e肽IgGl抗体滴度和抗M2e肽IgG2a 抗体滴度。仅M2e是没有免疫原性的且没有诱导出可检测的IgGl抗体或IgG2a抗体。类 似地，与1018ISS混合的M2e是没有免疫原性的。M2e_1018ISS缀合物有免疫原性且分别 诱导了 IgGl和化62￡1的约21，000和10，000的抗M2e几何平均滴度。与矾结合递送的 M2e-1018ISS缀合物有极高的免疫原性且分别诱导了 IgGl和IgG2a的94，000和39，500的 抗M2e滴度。实施例12. M2e~1018ISS綴合物与矾或DOTAP递送时是有免疫原性的且添加NP影 响Μ2θ应答将10只BALB/c小鼠为一组通过使用与1018ISS (约20 μ g)缀合的M2e (5 μ g)、或者与流感核蛋白(NP，10yg)混合的M2e-1018ISS缀合物、与矾结合的M2e-1018ISS 缀合物、与矾结合并与NP混合的M2e-1018ISS缀合物、或用阳离子脂质DOTAP递送的 M2e-1018ISS缀合物、或者与NP混合并用DOTAP递送的M2e_1018ISS缀合物，以两周间隔地 肌肉注射两次进行免疫。第二次免疫后两周，将小鼠抽血并通过ELISA测量抗M2e肽IgGl 抗体滴度和抗M2e肽IgG2a抗体滴度。如在实施例1中，M2e-1018ISS缀合物是有免疫原 性的且分别诱导了 IgGl和IgG2a相对低的约6，600和2，000的抗M2e几何平均滴度。与 仅M2e-1018ISS缀合物比较，与NP混合的M2e_1018ISS缀合物产生了降低的抗M2e IgGl 滴度(几何平均值为1，000)，但产生了非常相似的IgG2a滴度(2，200)。在矾上以聚合的构型递送M2e-IMC缀合物诱导了显著地高于仅用M2e-1018ISS缀合物诱导的抗M2e IgGl 滴度和抗M2e IgG2a滴度二者(几何平均值分别为21，OOO和14，000)。此外，添加NP到 M2e-1018ISS缀合物+矾制剂降低约50%的所得抗M2e IgGl滴度并2倍增加所得的抗M2e IgG2a滴度。以DOTAP制剂递送M2e_1018ISS诱导了与M2e_1018ISS+矾制剂相似的IgGl 滴度，但诱导了显著地低于矾制剂诱导的IgG2a应答。实施例13. M2e~1018ISS矾制剂的免疫原件将5只BALB/c小鼠为一组通过使用用矾递送的与1018ISS (约20 μ g)缀合的M2e(5y g)、用矾递送的与1018ISS(20y g)混合的M2e (5 μ g)、用矾递送的 与1018ISS (20 μ g)和NP (10 μ g)混合的M2e (5 μ g)、或者与NP (10 μ g)和矾混合的 M2e-1018ISS缀合物，以两周间隔地肌肉注射两次进行免疫。第二次免疫后两周，将小鼠 抽血并通过ELISA测量抗M2e肽IgGl抗体滴度和抗M2e肽IgG2a抗体滴度。用矾递送的 M2e-1018ISS诱导了显著地高于与1018ISS混合并用矾递送的M2e诱导的抗M2eIgGl应答 (分别为266，000对比17，000)。添加NP到非IMC缀合的M2e+矾急剧地降低了对M2e的 IgGl (17，000到700)应答和IgG2a应答(13，000到< 600) 二者。与实施例2—致，添加NP 到M2e-1018ISS缀合物+矾制剂轻微地减少了抗M2e IgGl应答(187，000对比266，000) 并约2倍增加抗M2e IgG2a应答(40，000对比15，500)。实施例14. M2e和NP的融合蛋白质能诱导对M2e和NP 二者的抗体应答如实施例5中所述的融合蛋白质N8 (非His标签的N8)按照其中所述进行构建。 将5只BALB/c小鼠为一组通过使用仅N8融合蛋白质(10 μ g)、最初注射用完全弗氏佐剂 (CFA)和第二次注射用不完全弗氏佐剂(IFA)递送的N8融合蛋白质(10 μ g)、或者使用用 矾递送的M2e-1018ISS缀合物(5 μ gM2e肽、20 μ g 1018ISS)，以两周间隔地肌肉注射两次 进行免疫。第二次免疫后两周，将小鼠抽血并通过ELISA测量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗 体滴度和IgG2a抗体滴度。仅用N8融合蛋白质产生了低的但是可测量的对M2e的IgGl应答和IgG2a应答 (分别为5，600和2，000)。与仅用抗原递送比较，当N8融合蛋白质用CFA/IFA递送时，抗 M2e IgGl滴度增加约17倍(95，000)且抗M2e IgG2a滴度增加约4倍(9，400)。用N8M2e/ NP诱导的抗M2e IgGl滴度与用M2e肽-IMC缀合物+矾制剂产生的IgGl滴度相似，但是 IgG2a滴度约5倍降低(分别为118，000和48，000)。N8M2e/NP融合蛋白质产生了强的与 用和不用CFA/IFA佐剂相似的抗NP IgGl滴度(分别为104，000和110，000)。对于N8融 合蛋白质用或不用CFA/IFA佐剂，抗NP IgG2a应答是相似的且低于IgGl滴度约6倍。正 如预期，M2e肽-IMC缀合物+矾制剂产生了对NP的不可测量到的抗体应答。实施例15.用不同佐剂的Μ2θ/ΝΡ融合蛋白质的免疫原件将融合蛋白质N8 (非组氨酸标签的N8)(如在实施例5中所述)和N4/C4 (非组氨 酸标签的N4/C4)(如在实施例6中所述)按照其中所述进行构建。将5只BALB/c小鼠为一 组通过使用用矾递送的N4/C4融合蛋白质(10 μ g)、用矾递送的N8融合蛋白质(10yg)、用 Iscomatrix佐剂递送的N4/C4融合蛋白质(10 μ g)、用Iscomatrix递送的N8融合蛋白质 (10 μ g)、用矾递送的与 1018ISS(10y g)或与 M2e 肽-1018ISS 缀合物(5 μ g M2e 肽、20μ g 1018ISS)混合的N8融合蛋白质(10 μ g)，以两周间隔地肌肉注射两次进行免疫。第二次免 疫后两周，将小鼠抽血并通过ELISA测量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗体滴度和IgG2a抗体滴度。用矾或用Iscomatrix递送的N8融合蛋白质和N4/C4融合蛋白质都产生了相似的抗M2e IgGl滴度，且这些滴度与用M2e肽-1018ISS+矾制剂产生的范围和滴度是相同的 (45，000-56，000对比 74，500)。N8+1018ISS制剂产生了非常低的抗M2e IgGl 滴度(1，000)。 用Iscomatrix或1018ISS递送的融合蛋白质和M2e肽-IMC+矾制剂都产生了高于融合蛋白 质+矾制剂的抗M2e IgG2a滴度(4，200到19，000对比1，500)。这与已知的Iscomatrix 和1018ISS佐剂在小鼠中诱导Thl应答来导致IgG2a产生的能力是一致的。N8+矾制剂和N4/C4+矾制剂二者均诱导了针对NP的强的IgGl应答和低的IgG2a 应答(分别为 29，000 和 49，000)。N8+Iscomatrix 制剂和 N4/C4+Iscomatrix 制剂二者均 诱导了比矾制剂更均衡的针对NP的IgGl/IgG2a应答(分别地IgGl为16，000和9，000 ；以 及IgG2a为28，000和16，000)。N8+1018ISS制剂诱导了低的针对NP的IgGl应答和IgG2a 应答。正如预期，M2e肽制剂没有诱导出可测量到的针对NP的抗体应答。t施仿I丨16.用不同佐布丨递送的Μ2θ/ΝΡ融合蛋白质的免,疮原十牛将5只BALB/c小鼠为一组通过使用仅递送N8融合蛋白质(25 μ g)、用矾递送的 N8融合蛋白质、用MF59佐剂递送的N8融合蛋白质、用MF59+1018ISS (25 μ g)递送的N8融 合蛋白质、或用1018ISS(25yg)递送的N8融合蛋白质、或者使用用矾递送的N4/C4融合蛋 白质(25 μ g)，以两周间隔地肌肉注射两次进行免疫。对照组的5只小鼠仅接受PBS。第二 次免疫后两周，将小鼠抽血并通过ELISA测量抗M2e肽和抗NP的IgGl抗体滴度和IgG2a 抗体滴度。第二次免疫后四周，将小鼠处死，获取脾并将脾细胞使用ELISP0T测定法来确定 产生IFN γ的NP特异的T细胞数量。仅用N8融合蛋白质产生了低水平的M2e特异的IgGl抗体和M2e特异的IgG2a抗 体二者(分别为2，700和< 600)。用矾递送的N8融合蛋白质、用MF59递送的N8和用矾 递送的N4/C4都产生了相似的IgGl占优势地高于IgG2a的抗M2e抗体滴度(分别地IgGl 为 33，000,21, 500 和 40，000 对比 IgG2a 为< 600,800 和 1000)。在 N8+MF59 制剂中包括 1018ISS降低了约50%的抗M2e IgGl滴度，但28倍增加IgG2a滴度(分别为10，000对比 21，000)。N8+1018ISS制剂产生了低的抗M2e IgGl滴度和抗M2eIgG2a滴度二者(900和 2，400)。仅用N8融合蛋白质产生了强的IgGl占优势地高于IgG2a的抗NP滴度(分别为 115，000和9，000)。使用矾或MF59佐剂约2倍增加这些应答。N4/C4+矾产生的抗NP滴度 与用N8+矾产生的抗NP滴度相似。用MF59+1018ISS递送N8诱导了抗体应答的转变，导致 非常高的IgG2a应答和远低于矾或MF59制剂的IgGl应答(分别为413，000和49，000)。 用1018递送N8显示出从IgGl向IgG2a的转变(分别为2，600和40，000)，但总滴度远低 于N8+MF59+1018ISS组中的总滴度。使用ELISP0T测定法，仅用N8、用N8+矾制剂、N8+MF59制剂和N8+1018ISS制剂在 用对BALB/c小鼠NP特异的⑶8肽或用涵盖全部NP氨基酸序列的肽库再刺激后都产生了 相似数量的IFN γ斑点形成细胞(每IO6个细胞60-90sfu)。NP特异的IFN γ斑点形成细 胞数在接受C8+MF59+1018ISS组中实质上高于其它组(每IO6个细胞180_290sfu)。实施例17.动物实验将BALB/c小鼠(每组10只)用上面所示的NP/M2e构建体免疫两次(例如，在0周和2周时)，将NP/M2e构建体与IMC或对照材料缀合(仅NP和M2e、NP_IMC、和M2e_IMC/ 矾)。第二次免疫后两周，将小鼠抽血并测定血清以确定NP和M2e特异的抗体反应。获取 小鼠的脾并将脾细胞使用IFN-Y和IL-4ELISP0T、和/或细胞因子ELISA体外测定NP特异 的细胞介导的免疫应答。实施例18.用多聚体和TIV免疫将存在流感感染风险的个体或需要诱导免疫应答的个体用一种或者多种以下组 合进行接种(l)M2e/IMC多聚体+三价灭活疫苗(TIV) ； (2)M2e/IMC和NP/IMC多聚体 +TIV ； (3)M2e/NP/IMC多聚体+TIV。个体可在接种疫苗前或后任选地监测以确定免疫应答 (如，体液应答和/或细胞应答)和/或生理反应(如，与流感感染相关的症状的减轻)。所 用多聚体的量是1 μ g到100 μ g之间且与TIV —起联合使用来降低流感病毒感染的风险。
为了明确和理解的目的，尽管上述发明已经通过图例和实施例的方式进行了详细 地描述，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明实施某些改变和修改。因此， 描述和实施例不应理解为限制本发明的范围。本文中所引用的所有专利、专利申请和出版物为了所有的目的以相同的程度以其 整体引入作为参考，就如同每一出版物、专利或专利申请被明确和单独地引入作为参考一样。
权利要求
组合物，其包含流感基质蛋白胞外结构域(M2e)的多聚体，其中所述M2e是以多聚体展示呈递给免疫系统并能在个体中诱导免疫应答。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述多聚体展示通过将至少两个拷贝的M2e与非蛋 白质平台分子缔合来实现。
3.权利要求1或2所述的组合物，其进一步包含含有免疫刺激序列(ISS)的免疫调节 化合物(IMC)。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述IMC与多聚体缔合。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其进一步包含核蛋白(NP)。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述多聚体展示通过将至少两个拷贝的M2e与NP共 价地或离子地连接来实现。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述多聚体展示通过包含至少两个拷贝的M2e和NP 的融合蛋白质来实现。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述M2e的拷贝位于NP的羧基末端侧。
9.权利要求7所述的组合物，其中所述M2e的拷贝位于NP的氨基末端侧。
10.权利要求7所述的组合物，其中所述M2e的拷贝位于NP的氨基端侧和羧基端侧这 两侧。
11.权利要求5至10中任一项所述的组合物，其进一步包含与NP缔合的含有ISS的IMC。
12.权利要求1至11中任一项所述的组合物，其进一步包含运载体。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述运载体选自矾、微粒、脂质体和纳米颗粒。
14.疫苗，其包含权利要求1至13中任一项所述的组合物。
15.权利要求14所述的疫苗，其进一步包含佐剂。
16.权利要求14或15所述的疫苗，其进一步包含至少一种三价灭活流感疫苗(TIV)的 一种或多种组分。
17.用于改善个体中与流感病毒感染相关的一种或多种症状的方法，所述方法包括向 个体施用权利要求14至16中任一项所述的疫苗。
18.用于降低个体中流感病毒感染的可能性的方法，所述方法包括向个体施用权利要 求14至16中任一项所述的疫苗。
19.用于降低个体中流感病毒感染的可能性的方法，所述方法包括向个体施用权利要 求14至15中任一项所述的疫苗和单价灭活疫苗的一种或多种组分。
全文摘要
本发明提供了以多聚体展示呈递给个体的免疫系统以诱导免疫应答的流感蛋白质如基质蛋白和核蛋白的组合物。组合物任选地与任一类型的包含免疫刺激序列(ISS)的免疫调节化合物(IMC)缔合。本发明进一步提供了能诱导细胞免疫应答和/或体液免疫应答的流感基质蛋白和核蛋白的组合物。本发明也提供了制备和使用这些组合物例如作为疫苗来改善与流感病毒感染相关的症状或用于降低流感病毒感染的风险的方法。
文档编号A61K39/145GK101835487SQ200880112341
公开日2010年9月15日 申请日期2008年8月21日 优先权日2007年8月21日
发明者B·D·利文斯顿, D·A·希金斯, G·罗斯, G·范奈斯特 申请人:戴纳瓦克斯技术公司