专利名称：人巨细胞病毒中和抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有中和人巨细胞病毒(hCMV)的高效力(potency)且特异性针对 hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的组合的抗体，以及产生该单克隆抗体的永生化B细胞。 本发明还涉及通过hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合确定的、该抗体所结合的表面 抗原，以及该抗体和表位在筛选方法以及疾病的诊断、预防和治疗中的用途。
背景技术：
人巨细胞病毒(hCMV)是一种广泛分布的病原体，其可在免疫抑制的成人中和胎 儿感染后导致严重的病理，并参与例如动脉粥样硬化的慢性疾病。hCMV感染多种细胞类型， 包括成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和造血细胞[1]。正在被开发作为候选疫苗的体外繁 殖的hCMV减毒菌株已经丧失了内皮细胞的向性(tropism)，但是仍然保留感染成纤维细胞 的能力[2]。hCMV的细胞向性被认为是由两种病毒糖蛋白复合物调控的。例如gH、gL和g0 的糖蛋白的复合物似乎是感染成纤维细胞所需要的，而gH、gL和由UL131-ULU8基因编码 的蛋白质的复合物参与内皮细胞、上皮细胞和树突细胞的感染[2-8]。超免疫球蛋白已被商业化用于预防移植相关的hCMV疾病，并且最近的证据表明 它们对孕妇有治疗效果[9]。该治疗方法受限于可被递送的中和抗体的量低，因而非常需要 获得具有高中和能力的人抗体(如人单克隆抗体)。然而，hCMV中和抗体的靶点仍尚待确 定。尽管一些针对gH、gB以及ULU8和UL130基因产物的抗体在体外表明具有中和活性[7， 10，11]，且针对gH的抗体已经在临床试验中进行了评估(由于缺乏治疗效果被终止了)，但 分离的单克隆抗体的中和效力至今仍一般，因为在抗体浓度范围是0. 5-20mg/ml时才可以 观察到中和作用。此外，目前的方法通常使用成纤维细胞作为目标细胞来测定抗-hCMV抗 体的中和效力。然而，已知hCMV通过感染其他细胞类型(例如内皮细胞、上皮细胞以及白 细胞)也能引起病理。已知的针对UL 1 和UL 130的抗体显示在中和内皮细胞感染中的 效力很低[7]，且看起来不存在可用的能够以高效力中和目标非成纤维细胞的感染的单克 隆抗体。因此，需要能够以高价中和目标非成纤维细胞的hCMV感染的抗体，以及阐明该抗 体结合的靶点。发明概述本发明部分是基于能够以高效力中和hCMV感染的新抗体以及本发明的这些抗体 所结合的新表位的发现。因此，在一个实施方式中，本发明包括具有中和hCMV的高效力 的中和抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和 UL131A的组合。在另一个实施方式中，本发明包括编码本发明抗体或抗体片段的核酸分子。在再一个实施方式中，本发明包括含有编码本发明抗体或抗体片段的核酸分子的载体。在另一个实施方式中，本发明包括含有包含本发明核酸分子的载体的细胞。在另一个实施方式中，本发明包括表达具有中和hCMV的高效力的抗体的永生化B 细胞克隆，其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的组合。在再一个实施方式中，本发明包括与本发明的抗体相结合的表位。在进一步的实施方式中，本发明包括包含与本发明的抗体相结合的表位的免疫原 性多肽。在另一个实施方式中，本发明包括与结合本发明的抗体的表位相结合的配体。在进一步的实施方式中，本发明包括用于制备具有中和hCMV的高效力的抗体的 方法，其中所述的抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合。该方法包括 (i)培养表达本发明抗体的永生化B细胞克隆和(ii)从B细胞分离抗体。在另一个实施方式中，本发明包括一种包含本发明抗体或抗体片段、本发明的核 酸、表达本发明抗体的永生化B细胞克隆，或包含与本发明的抗体或抗体片段相结合的表 位的免疫原性多肽的药物组合物。在进一步的实施方式中，本发明包括具有中和hCMV的高效力的抗体或抗体片段 (其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的组合)、编码具有中和hCMV 的高效力的抗体或抗体片段的核酸(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白质UL128、UL130 和UL131A的组合)、表达具有中和hCMV的高效力的抗体的永生化B细胞克隆(其中所述抗 体特异性针对hCMV蛋白质ULU8、UL130和UL131A的组合)，或包含结合具有中和hCMV的 高效力的抗体的表位的免疫原性多肽(其中所述抗体特异性针对hCMV蛋白质UL128、UL130 和UL131A的组合)在治疗或诊断中的应用。在另一个实施方式中，本发明包括一种用于诊断hCMV感染的试剂盒，其包含本发 明抗体或抗体片段、编码本发明的抗体或抗体片段的核酸，或结合本发明抗体的表位。在另一个实施方式中，本发明包括用于制备重组细胞的方法。该方法包括(i)对 来自表达本发明抗体的永生化B细胞克隆的核酸进行测序和(ii)利用获自步骤(i)的序 列信息来制备用于插入至表达宿主以允许在该宿主中表达目的抗体的核酸。在进一步的实施方式中，本发明包括用于制备具有中和hCMV的高效力并且特异 性针对hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的组合的抗体的方法。该方法包括培养或传代培 养通过上述方法获得的表达宿主，且任选地纯化目的抗体。在另一个实施方式中，本发明包括筛选可诱导针对hCMV的免疫应答的多肽的方 法，包括利用本发明的抗体或抗体片段筛选多肽库。附图简述
图1显示了表明人单克隆抗体(mAb)6G4识别通过hCMV蛋白ULU8、UL130和 UL131A的组合所确定的表位的FACS分析。图2显示了抗体6G4的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。⑶R序列为粗体。发明详述本发明是基于中和hCMV感染和具有中和hCMV感染的特别高的效力的抗体和抗体 片段的制备的。这些抗体是令人想要的，因为仅需低浓度就能中和一定量的病毒。施用较 低量的抗体就能有利于高水平的保护。人单克隆抗体和分泌这些抗体的永生化B细胞克隆也同样包含在本发明的范围之内。本发明人发现了针对hCMV蛋白ULU8、UL130和UL131A的组合的抗体在中和hCMV 中是特别有效的。不希望局限于任何理论，该组合可以是形成由抗体识别的独特表位的 UL128.UL130和UL131A的精确复合物。本发明还涉及对抗体所结合的表位的表征以及表位在提高免疫应答中的用途。本发明还涉及不同的涉及本发明抗体和它们结合的表位的方法和用途。本发明的抗体本发明提供了具有中和hCMV的特别高的效力的单克隆抗体或重组抗体。本发明 还提供了这些单克隆或重组抗体的片段，特别是保留了所述抗体的抗原结合活性的片段。 在本说明书中，“中和hCMV的高效力”是指本发明的抗体分子在标准检测中以比本领域公知 的抗体(例如与MSL-109、8F9或3E3相比)低得多的浓度中和hCMV。在一个实施方式中，本发明的抗体分子能以0. 16μ g/ml或更低的浓度(即0. 15、 0.125,0.1,0.075,0.05,0.025,0.02,0.015,0.0125,0.01,0.0075,0.005,0.004,0.003、 0.002或更低)中和hCMV。在另一个实施方式中，该抗体能以0.016 μ g/ml或更低(即以 比例如KT8 MUO-MUOiMUO-nMUO—MUOWM更低的抗体浓度)的浓度中和hCMV。这意 味着，与中和相同效价的hCMV所需的公知抗体(例如MSL-109、8F9或3E3)的浓度相比，体 外中和50%的hCMV临床分离物只需要非常低的抗体浓度。在另一个实施方式中，体外中 和50%的hCMV临床分离物中内皮细胞、上皮细胞和树突细胞感染所需的本发明抗体的浓 度比MSL-109、8F9或3E3所需的浓度低10倍或更高(即25、50、75、100、150、200或更高)。 可采用本领域的标准中和检测测定该效力。本发明的抗体能够中和几种细胞类型的hCMV感染。在一个实施方式中，本发明抗 体防止树突细胞的感染。本发明的抗体也可防止上皮细胞(例如视网膜细胞和骨髓细胞 (例如树突细胞))的感染。这些抗体经适当配制后可用作预防或治疗性制剂，或可用作诊断工具。“中和抗体”是能中和病原体在宿主中开始和/或保持感染的能力的抗体。本发明 提供了中和性人单克隆抗体，其中，该抗体识别来自hCMV的抗原。具体而言，根据本发明的抗体特异性针对hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组
口 O在一个实施方式中，根据本发明的抗体是在本文中被称为6G4的单克隆抗体。从 hCMV感染的供体分离的该抗体，通过被称为6G4的永生化B细胞克隆制备。该抗体中和内 皮细胞、上皮细胞(例如视网膜细胞和骨髓细胞(例如树突细胞))的hCMV感染。6G4的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示，且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。抗体重链的⑶R分别被称为⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3。类似的，抗体轻链的⑶R分别 被称为CDRLUCDRL2和CDRL3。根据IMGT编号系统[12，13，14]将CDR氨基酸的位置限定 为CDR1-IMGT 位置 27 至 38，CDR2-IMGT 位置 56 至 65 和 CDR3-IMGT 位置 105 至 117。该抗体⑶R的氨基酸序列如表1所示。表 权利要求
1.一种具有中和人巨细胞病毒(hCMV)的高效力的中和抗体，其中所述抗体特异性针 对 hCMV 蛋白 UL128、UL130 和 UL131A 的组合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包括SEQID NO :1_6中的一个或多个。
3.根据权利要求1所述的抗体，其包括包含SEQID NO :1-3中的一个或多个的重链。
4.根据权利要求1所述的抗体，其含有包含SEQID NO :1的⑶RH1、SEQ ID NO :2的 CDRH2 及 SEQ ID NO 3 的 CDRH3 的重链。
5.根据权利要求1所述的抗体，其包括包含SEQID NO :4_6中的一个或多个的轻链。
6.根据权利要求1所述的抗体，其含有包含SEQID NO :4的⑶RL1、SEQ ID NO :5的 CDRL2 及 SEQ ID NO 6 的 CDRL3 的轻链。
7.根据权利要求3所述的抗体，其中所述重链具有SEQID NO :7所示的序列。
8.根据权利要求5所述的抗体，其中所述轻链具有SEQID NO :8所示的序列。
9.根据前述任一项所述的抗体，其中所述抗体为人单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体6G4。
11.与能够结合前述任一项权利要求所述的抗体的表位相结合的抗体。
12.前述任一项权利要求所述的抗体的片段，其中所述片段特异性针对hCMV蛋白 UL128、UL130 和 UL131A 的组合。
13.根据权利要求12所述的抗体片段，其为Fab、Fab，、F(ab')2或Fv片段。
14.编码前述任一项权利要求所述的抗体或抗体片段的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述核酸分子包括SEQID NO :9_16中的 任一个。
16.包含权利要求14或权利要求15所述的核酸分子的载体。
17.包含权利要求16所述的载体的细胞。
18.表达权利要求1-11中任一项所述的抗体的永生化B细胞克隆。
19.结合权利要求1-11中任一项所述的抗体的表位。
20.包含权利要求19所述的表位的免疫原性多肽。
21.结合权利要求19所述的表位的配体。
22.根据权利要求21所述的配体，其为抗体。
23.一种用于制备权利要求1-11中任一项所述的抗体的方法，包括(i)培养权利要求 18所述的永生化B细胞克隆和(ii)从B细胞分离抗体。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权 利要求14或权利要求15所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20 所述的免疫原性多肽。
25.根据权利要求M所述的药物组合物，其包含特异性针对通过hCMV蛋白UL128、 UL130和UL131A的组合确定的表位的第一抗体或抗体片段，以及特异性针对第二表位的第 二抗体或片段。
26.根据权利要求M或权利要求25所述的药物组合物，其进一步包含药学上可接受的 稀释剂或载体。
27.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15 所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20所述的免疫原性多肽在治疗或诊断中的用途。
28.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段、权利要求14或权利要求15 所述的核酸、权利要求18所述的永生化B细胞克隆或权利要求20所述的免疫原性多肽在 ⑴制备用于治疗hCMV感染的药物或(ii)疫苗中的用途。
29.根据权利要求1-13或22中任一项所述的第一抗体或抗体片段以及特异性针对第 二表位的第二抗体或抗体片段在制备用于治疗hCMV感染的药物中的用途。
30.根据权利要求观或权利要求四所述的用途，其中所述患者对抗hCMV的常规治疗 是不应性的。
31.根据权利要求观或权利要求四所述的用途，其中所述患者被预施用、后施用或同 时施用抗病毒剂。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述抗病毒剂选自更昔洛韦、膦甲酸或西多福韦。
33.根据权利要求观或权利要求四所述的用途，其中所述患者是免疫受损的。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述患者患有HIV或是移植患者。
35.权利要求18或22所述的组合物或用途，其中所述第二抗体或抗体片段特异性针对 hCMV蛋白质。
36.根据权利要求观所述的组合物或用途，其中所述hCMV蛋白是糖蛋白。
37.根据权利要求观所述的组合物或用途，其中所述hCMV蛋白质是gB、gH、gL、gM、gN、 g0、UL128、UL130、UL131A 或其组合。
38.根据权利要求28所述的组合物或用途，其中所述第二抗体或抗体片段特异性针对 由MSL-109、8F9或3E3识别的表位。
39.一种用于治疗受试者的方法，包括施用权利要求M46或35-38中任一项所述的药 物组合物的步骤。
40.一种用于诊断hCMV感染的试剂盒，其包含权利要求1-13或22中任一项所述的抗 体或抗体片段、权利要求14或权利要求15所述的核酸或权利要求19所述的表位。
41.一种制备重组细胞的方法，其包括步骤(i)对来自权利要求18所述的B细胞克隆 的核酸进行测序；(ii)利用获自步骤(i)的序列信息来制备用于插入至表达宿主以允许在 所述宿主中表达目的抗体的核酸。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述核酸在步骤(i)和(ii)之间被操作来导入 限制性位点、改变密码子选择、和/或优化转录和/或翻译调控序列。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述表达宿主是真核细胞。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述真核细胞为酵母细胞、动物细胞或植物细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述动物细胞为CH0、NS0或人细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人细胞为PER.C6细胞、HEK293T细胞或 HKB-Il 细胞。
48.一种制备权利要求1-11或22中任一项所述抗体的方法，包括在目的抗体表达的条 件下培养或传代培养通过权利要求41所述的方法获得的表达宿主；以及任选地，纯化目的抗体。
49.一种筛选可诱导针对hCMV的免疫应答的多肽的方法，包括利用权利要求1-13或 22中任一项所述的抗体或片段筛选多肽库。
50.权利要求1-13或22中任一项所述的抗体或抗体片段在通过检查疫苗中抗原是否 含有正确构象的正确表位来监控抗hCMV疫苗的质量中的用途。
51.根据权利要求观-34中任一项所述的用途，其中所述抗体预防内皮细胞、上皮细胞 和骨髓细胞的感染。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述抗体预防视网膜细胞和树突细胞的感染。
53.特异性结合权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗体片段的表位在(i)治疗、 ( )制备用于治疗hCMV感染的药物，或(iii)作为疫苗中的用途。
54.特异性结合权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗体片段的表位在筛选能够中 和hCMV感染的配体中的用途。
全文摘要
本发明涉及特异性针对中和人巨细胞病毒(hCMV)的中和抗体，特别是特异性针对于hCMV蛋白UL128、UL130和UL131A的组合的抗体。本发明的抗体以高效力中和感染。本发明还涉及产生该抗体的永生化B细胞、该抗体所结合的表位，以及该抗体和表位在筛选方法以及疾病的诊断和治疗中的用途。
文档编号A61K39/395GK102143974SQ200880130982
公开日2011年8月3日 申请日期2008年7月16日 优先权日2008年7月16日
发明者A·兰扎维希雅, A·玛卡格诺 申请人:胡马斯有限公司