专利名称：一种灵芝孢子的破壁方法
技术领域：
本发明涉及灵芝孢子的破壁技术，特别是用生物的方法对灵芝孢子进行 破壁。
(二)
背景技术：
灵芝是一种很名贵的药用和食用菌，俗称"灵芝草"，古代称为长生不老 的"仙草"。据我国最早的两部医学巨著《神农本草经》及《木草纲目》介绍， 灵芝分为六种，按色泽分别为赤芝、青芝、白芝、黑芝、黄芝、紫芝，其 中最常见的和药效较好的为赤芝，即红灵芝。我国灵芝物种资源丰富，有"灵 芝王国"之尊称。位于青藏高原东南部的西藏，灵芝种类亦多，有"野生灵 芝故乡"之美誉。这里广阔的生态环境是灵芝繁殖生长的优越场地，同时也 是灵芝的物种资源库。我国西藏已知灵芝达13种，占全国己知种数的15%。 因此对西藏野生灵芝的开发具有丰富的资源优势。
我国己于2000年首次将灵芝中的赤灵芝(Ganodermalucidum)、紫灵芝 (Ganoderma sinense)正式列入2000年版《中华人民共和国药典》，肯定 了灵芝的药效并作为法定的中药药材。卫生部批准灵芝作为我国新资源食品， 灵芝现代研究应用引起了国内外高度重视，美国承认灵芝药效并将灵芝列入 "草药药典"。具有数千年文化内涵的灵芝将进一步开发应用于保健食品及药
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灵芝孢子有一层极难被人体胃酸消化的几丁质构成的双层外壁，只有打 开这层外壁，由外壁紧裹的有效成分才能最大程度地被人体利用吸收。破壁 后人体对灵芝孢子粉的吸收率可提高45倍之多，多糖的含量可提高1. 69倍。
目前灵芝的破壁技术有物理、化学、生物及综合法。
生物法包括酶解法、菌溶法以及激活孢子。酶解法使用纤维素酶、
半纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、溶菌酶、蜗牛酶、几丁质酶使灵芝孢子壁降
解，达到破壁的目的；菌溶法使用醉母菌等进行灵芝孢子的发醉处理，破 坏灵芝孢子壁；激活孢子利用孢子萌发力破坏灵芝孢子壁。这类方法的优 点是能量消耗小、破碎效果好，缺点是作用时间很长，应用外源的酶和破壁 菌，去除产品中的酶或菌十分困难。化学法包括溶剂浸泡、酸降解、碱降解等方法。这种方法的优点与生 物法类似，缺点是往往导致有效成分变性，产品中的有害残留较高且难以去 除，很难保证产品的有效性和安全性。
物理法使用低温、超临界、匀浆、冷冻(脆化)超声波、微波等物理 作用破坏灵芝孢子壁。 一般来说，这类方法破壁率不高，或者设备投资较大。
机械法通过碾压、挤压、喷射粉碎、气流粉碎撞击等机械作用破坏灵 芝孢子壁。优点是简单易行，缺点是机械设备结构复杂、价格高、运行成本 高。
综合法综合以上各种方法加以利用。
发明内容
本发明要解决的问题就是针对以上不足而提供一种分离灵芝内生菌后以 灵芝内生菌作为灵芝溶壁菌而对灵芝进行有效、安全破壁的方法。它包括以 下步骤
1) 从灵芝中分离、纯化灵芝内生细菌；
2) 筛选菌株；
3) 制备酶液；
4) 将酶液加入已灭好菌的粉状灵芝孢子中，35 37"C下静止酶解2 3
天；
5) 将经过酶解的粉状灵芝孢子过滤，滤液浓縮，喷雾干燥成粉末；将过
滤后的沉淀干燥，再与滤液干燥成的粉末合并，制得灵芝孢子粉。
灵芝内生细菌的分离、筛选方法包括以下步骤
1) 分离内生细菌
将新鲜西藏野生灵芝表面灭菌，切成小段再次灭菌，然后用无菌刀片将
组织表皮削去切成小块贴放到培养基上，置35 37。C恒温箱中培养3 20天， 待培养基上各植物组织周围长出菌落后挑取边缘部分转移至新的培养基上， 继续置35 37。C恒温箱中培养3-7天；
2) 菌株的纯化
采用挑取法对所分离的内生细菌划线纯化，挑取单个菌落，置35 37。C 恒温箱中培养，再挑取少许置显微镜下观察，挑取单一纯化菌落保存，将已 纯化的菌株分别转移至斜面培养基上，每株保存两支斜面，35 37。C恒温箱 中培养3-7天，待菌株生长旺盛时，取出置4。C保藏，30 60天后转接入新的斜面培养基上，接种数次继代。 3)菌株的筛选
将已纯化的灵芝内生细菌，接种于几丁质筛选培养基中，置35 37"C恒 温箱中培养3 7天，根据透明圈的有无，筛选相应的内生细菌；
将已纯化的灵芝内生细菌，接种于纤维素筛选培养基中，置35 37'C恒 温箱中培养3 7天，染色后，根据透明圈的有无，筛选相应的破壁酶；
酶液的制备方法是
将接种纯化好的灵芝内生细菌接种于培养基内，置35 37X:摇床，200 300转/分，摇到0D值0.5 0.7 ，得菌液，将摇好的菌液离心，取上清液过 滤，即得酶液。
用本发明方法分离出的灵芝内生细菌为马阔里类芽孢杆菌 (尸ae/ /》acjf7/ws 边ac^/arie力sj's) -B22 CGMCC No: 2918。现保藏在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2009年 2月23日，保藏编号为CGMCC No: 2918。
用本发明方法分离出的灵芝内生细菌细胞呈杆状，革兰氏染色阳性、阴性 或可变，以周生鞭毛运动。在膨大胞囊内有椭圆形芽孢，在营养琼脂上无可 溶性色素。兼性厌氧或严格好氧。除了幼虫类芽孢杆菌的两个亚种，几乎所 有种的接触酶为阳性。氧化酶反应可变。
与现有技术相比本发明具有如下有益效果
1、 本发明根据共生理论，从西藏野生灵芝的新鲜子实体及其宿主的微生 态环境中，分离筛选出能够生物破壁的共生菌(溶壁菌)。利用灵芝本身的共 生菌对灵芝的孢子及子实体进行发酵，使灵芝的有效成份从胞内更易逸出， 人体能够顺利吸收、消化，有效成份能够充分利用。因为溶壁菌来自灵芝本 身，可以消除因引如外来菌而带来的难以去除生物残留的困难，确保产品的 安全性。
2、 本发明同时利用体外酶对溶壁菌的代谢产物中的破壁酶也进行了筛 选，本发明集菌溶破壁、酶破壁技术于一身，提高了灵芝孢子多糖的萃取率 (测得灵芝干浸膏多糖含量在0. 9%)，降低或杜绝了有害生物残留。
3、 不与有机试剂接触，工艺过程自然、环保。
4、 本法耗能低，设备简单，操作简便，环保、可持续利用。
5、 直接获得有效成分，缩短工艺流程。
6(四)
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图l,为本发明工艺流程图。
(五)
具体实施例方式
参见图1，本发明方法包括以下步骤 1、从灵芝中分离、纯化灵芝内生细菌
1) 分离灵芝内生细菌先用自来水将新鲜灵芝表面洗净，先用升汞浸泡 3分钟，然后用自来水冲洗灭菌，稍干后切成适宜长度的小段在75%酒精中
浸泡3 5min，用无菌水冲洗3 4次再次灭菌，无菌滤纸吸干,然后用无菌 刀片将组织表皮削去切成0. 5cmX0. 5cinX0. lcm的小块贴放到牛肉膏蛋白胨 培养基上，置35 37。C恒温箱中培养3 20天，待培养基上各植物组织周围 长出菌丝后挑取边缘部分转移至新的牛肉膏蛋白胨平板培养基上，继续置 35 37'C恒温箱中培养3-7天。
2) 菌株的纯化采用挑取法对所分离的内生细菌划线纯化，挑取单个菌 落，置35 37t:恒温箱中培养，再挑取少许置显微镜下观察，挑取单一纯化 菌落保存，将己纯化的菌株分别转移至牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，每株保 存两支斜面，35 37'C恒温箱中培养3-7天，待菌株生长旺盛时，取出置4 t:保藏，30 60天后转接入新的牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，接种数次继代。
上述牛肉膏蛋白胨培养基的制备方法是将牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂15 20g加入1000ml蒸馏水中调匀，调pH7.2 7.6。
3) 菌株的筛选
将已纯化的灵芝内生细菌，于无菌条件下接种于几丁质筛选培养基中， 置35 37"C恒温箱中培养3 7天，细菌分泌几丁质分解酶，能溶解菌落周 围的几丁质而呈透明圈状。根据透明圈的有无，筛选相应的内生细菌。几丁 质筛选培养基的制备方法是将牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaCl 5g、琼脂15 20g、几丁质2g (将几丁质磨成细粉后用少量醋酸或盐酸助溶)加入1000ml 蒸馏水中制成，调pH 7.2 7.6。
将己纯化的灵芝内生细菌，于无菌条件下接种于纤维素筛选培养基中， 置35 37t恒温箱中培养3 7天，用5mg/1刚果红染色5min后，倾去染液， 根据透明圈的有无，筛选相应的破壁酶，有透明圈就表明有溶壁活性，可以 保存留用。此方法为筛选灵芝内生细菌代谢产物中的破壁酶。纤维素筛选培 养基的制备方法是将CMC-Na 10g、 (NH4)2S04 2g、KH2P04 0. 5g 、MgS04 '7仏0 0. 5g，蛋白胨lg、琼脂15 20g加入1000ml蒸馏水中制成，加热溶解，调匀。
2、 酶液的制备
将纯化好的灵芝内生细菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基内，置35 37 。C摇床，200 300转/分，摇到0D值0.5 0.7 ，得菌液，将摇好的菌液经 12000转/分离心5分，弃沉淀，取上清液在0.22nm条件下过滤，即得酶液。 牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法是将牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaC15g 加入1000ml蒸馏水中，调pH7.2 7.6，加热溶解，调匀。
3、 对灵芝孢子破壁将已灭好菌的粉状灵芝孢子按10% (w/V)加入酶液， 轻轻摇匀后，35 37t:下静止酶解2 3天。
4、 将经过酶解的粉状灵芝孢子过滤，滤液浓縮，喷雾干燥成粉末；将过 滤后的沉淀干燥，再与滤液干燥成的粉末合并，制得破壁的灵芝孢子粉。
灵芝干浸膏多糖测定
分别精密量取对照品溶液0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2ml放置編
具塞试管里，加水定容到2ml。精密加入硫酸蒽酮溶液6ml，摇匀后置水浴加 热15min后，取出冰浴15min。以相应的试剂为空白，用紫外分光光度计检 测。在波长625nm处测定吸光度。绘制标准曲线。 供试品溶液的制备
取本发明产品破壁灵芝孢子粉末2g，精密称定，放入索氏提取器中加水 90ml，加热回流提取至无色。提取液转移至100ml量瓶中，加水定容，摇匀， 精密量取10ml，加入乙醇150ml，摇匀。在4。C放置12h，取出，离心，倾弃 上清液，沉淀加水溶解并转移到50ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀既得。
测定方法
精密量取供试品2ml，放置到10ml具塞试管中，操作过程同对照品加入 硫酸蒽酮溶液后操作。依法测定吸光度。 测得供试品灵芝干浸膏多糖含量在0. 9%。
权利要求
1、一种灵芝孢子的破壁方法，其特征在于包括以下步骤1)从灵芝中分离、纯化灵芝内生细菌；2)筛选菌株；3)制备酶液；4)将酶液加入已灭好菌的粉状灵芝孢子中，35～37℃下静止酶解2～3天；5)将经过酶解的粉状灵芝孢子过滤，滤液浓缩，喷雾干燥成粉末；将过滤后的沉淀干燥，再与滤液干燥成的粉末合并，制得灵芝孢子粉。
2、 根据权利要求1所述灵芝孢子的破壁方法，其特征在于.-灵芝内生细菌的分离、筛选方法包括以下步骤1) 分离内生细菌将新鲜西藏野生灵芝表面灭菌，切成小段再次灭菌，然后用无菌刀片将 组织表皮削去切成小块贴放到培养基上,置35 37'C恒温箱中培养3 20天， 待培养基上各植物组织周围长出菌落后挑取边缘部分转移至新的培养基上， 继续置35 37°。恒温箱中培养3-7天；2) 菌株的纯化采用挑取法对所分离的内生细菌划线纯化，挑取单个菌落，置35 37'C 恒温箱中培养，再挑取少许置显微镜下观察，挑取单一纯化菌落保存，将已 纯化的菌株分别转移至斜面培养基上，每株保存两支斜面，35 37。C恒温箱 中培养3-7天，待菌株生长旺盛时，取出置4"保藏，30 60天后转接入新 的斜面培养基上，接种数次继代。3) 菌株的筛选将已纯化的灵芝内生细菌，接种于几丁质筛选培养基中，置35 37t恒 温箱中培养3 7天，根据透明圈的有无，筛选相应的内生细菌；将已纯化的灵芝内生细菌，接种于纤维素筛选培养基中，置35 37t恒 温箱中培养3 7天，染色后，根据透明圈的有无，筛选相应的破壁酶；酶液的制备方法是将接种纯化好的灵芝内生细菌接种于培养基内，置35 37t:摇床，200 300转/分，摇到0D值0.5 0.7 ，得菌液，将摇好的菌液离心，取上清液过滤，即得酶液。
3、 根据权利要求2所述灵芝孢子的破壁方法，其特征在于培养基是牛肉 膏蛋白胨培养基，其原料包括牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaCl 5g、琼脂15 20g、蒸馏水1000ml， pH 7. 2 7. 6。
4、 根据权利要求2所述灵芝孢子的破壁方法，其特征在于几丁质筛选培 养基原料包括牛肉膏3g、蛋白胨10g、 NaCl 5g、琼脂15 20g、几丁质2g、 蒸馏水1000ml、 pH 7. 2 7. 6。
5、 根据权利要求2所述灵芝孢子的破壁方法，其特征在于纤维素筛选培 养基原料包括CMC-Na 10g、 (NH4)2S04 2g、 KH2P04 0. 5g 、 MgS04 7H20 0. 5g， 蛋白胨lg、琼脂15 20g、蒸馏水1000ml。
6、 根据权利要求1或2所述灵芝孢子的破壁方法，其特征在于灵芝内生 细菌为马阔里类芽孢杆菌(户ae力j7^cj77iAS巡ac^/arj'e/LSJ's) -B22 CGMCC No: 2918。
全文摘要
本发明涉及灵芝孢子的破壁技术，特别是用生物的方法对灵芝孢子进行破壁。它包括的步骤是从灵芝中分离、纯化灵芝内生细菌；筛选菌株；制备酶液；酶解灵芝孢子；制破壁灵芝孢子粉。本发明利用灵芝本身的共生菌对灵芝的孢子及子实体进行发酵，使灵芝的有效成份从胞内更易逸出，人体能够顺利吸收、消化，有效成份能够充分利用。可以消除因引如外来菌而带来的难以去除生物残留的困难，确保产品的安全性。
文档编号A61K36/06GK101596220SQ200910058858
公开日2009年12月9日 申请日期2009年4月7日 优先权日2009年4月7日
发明者辉 赵 申请人:西藏月王生物技术有限公司